РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
1.1. Етіологія, патогенез та клініка плацентарної недостатності.
Хронічна внутрішньоутробна гіпоксія плоду
Плацентарна недостатність (ПН) - одна з найважливіших проблем акушерства, неонатології та перинатології. Вона є причиною внутрішньоутробної гіпоксії, затримки росту і розвитку плоду, його травм у процесі пологів.
ПН призводить до збільшення перинатальної смертності, 20% випадків перинатальної смертності безпосередньо пов'язані з патологією плаценти. ПН обумовлює високу частоту соматичної та інфекційної захворюваності новонароджених, служить причиною порушень фізичного і розумового розвитку дитини.
Відповідно до основних положень адаптаційно-регуляторної теорії розвитку ПН на початкових етапах впливу несприятливого чинника прогресування захворювання характеризується фазою стійкої гіперфункції. У міру виснаження адаптаційних механізмів - при тривалому впливі несприятливих факторів - розвивається фаза декомпенсації [4, 5, 38].
Виділяють первинну і вторинну ПН
Первинна ПН розвивається у строки формування плаценти (до 16-го тижня вагітності) і з найбільшою частотою зустрічається у жінок, які страждають звичним невиношуванням, а також у вагітних з безпліддям в анамнезі.
Вторинна ПН, як правило, виникає після завершення процесів формування плаценти і зумовлена екзогенними впливами, перш за все - перенесеними під час вагітності захворюваннями. Перебіг як первинної, так і вторинної ПН може бути гострим і хронічним.
Доведено, що при фізіологічно протікає вагітності плацентарні судини перебувають в стані дилатації і не реагують на скорочують стимули. Ця обставина забезпечує рівномірне надходження кисню і поживних речовин до плоду. Рефрактерність судин плаценти і системи кровообігу матері до вазопресорів забезпечується за рахунок зростаючої продукції ендотеліальних факторів релаксації - простацикліну та оксиду азоту (II). Синергічна дію цих факторів є основною умовою адаптації материнських судин до збільшення навантаження на кровотік, забезпечує системну вазодилатацію і зниження артеріального тиску у міру прогресування вагітності [5, 7].
Патологія плацентарного кровообігу розвивається в тих випадках, коли інвазивна здатність трофобласта знижена або процес інвазії охоплює спіральні судини нерівномірно. При цьому у сформованих плацентарних судинах частково зберігається гладком'язових структур, адренергічна іннервація, і, отже - здатність реагувати на вазоактивні стимули. Таким чином, ділянки плацентарних судин, які зберегли ендотеліальні і гладком'язові елементи, стають мішенню для дії медіаторів, які циркулюють в кровотоці. Структурні зміни, що відбуваються у судинах у відповідь на їх розслаблення і скорочення, лежать в основі порушень плацентарного кровообігу [26].
Інтенсивність матково-плацентарного кровоплину служить основним чинником, що визначає надходження кисню до плоду. При недостатньому постачанні плацентарної тканини оксигенированной кров'ю в трофобласті порушується перебіг метаболічних процесів. В умовах, коли кров, що омиває межворсінковое простір, недостатньо насичена киснем, трофобласт компенсує власні метаболічні потреби за рахунок збільшення площі капілярної мережі плодової частини плаценти. Якщо здатність плаценти до розвитку колатерального кровообігу не задовольняє повністю потреб плода, то в недостатньо кровоснабжается ділянках плацентарної тканини розвиваються виражені порушення мікроциркуляції і локальні ішемічні зміни. При пошкодженні 1 / 3 матково-плацентарних судин компенсаторні можливості плодової частини плаценти звичайно не можуть повністю забезпечити зростаючі енергетичні потреби зростаючого плоду. Порушується плацентарна перфузія, створюються умови для відставання темпів росту і розвитку плода [4, 5, 7].
Недостатнє надходження кисню в межворсінковое простір надає шкідливу дію на ендотелій судин ворсинчатого трофобласта, де індукуються процеси вільнорадикального окислення. Посилена васкуляризація фетоплацентарної тканини, яка відбувається в умовах недостатнього надходження кисню і дефіциту продукції ендотеліальних факторів релаксації під впливом кисневих вільних радикалів призводить до виснаження енергетичних резервів клітин і порушення структури судин. У міру виснаження запасів АТФ, судинні клітини реалізують свої енергетичні потреби за рахунок процесів анаеробного гліколізу. Ендогенні джерела енергії (АДФ, аденозин) потребують посиленого притоку Са 2 + в цитозолі клітин з внутрішньоклітинних депо. Збільшення концентрації Са 2 + в цитозолі клітин призводить до вивільнення найпотужнішого ендогенного вазоконстриктора - ендотеліну. Збільшення продукції О 2 - в ендотелії відбувається в період переходу від ішемії до реперфузії, провокує вивільнення ендотеліну і вазоспазм [9].
Таким чином, недостатнє кровопостачання трофобласту служить основним фактором, що приводить до порушення регуляції кровообігу в плаценті. Перепадів тиску в плацентарних судинах внаслідок ішемії-реперфузії належить центральна роль у патогенезі ішемічних ушкоджень плацентарної тканини і життєво важливих органів плода.
До факторів ризику розвитку ПН відносять вплив природних та соціально-економічних умов, стресових ситуацій, важких фізичних навантажень, вживання алкоголю, куріння, різні токсикоманії, вік, конституціональні особливості майбутньої матері, екстрагенітальні захворювання, обтяжений репродуктивний і акушерсько-гінекологічний анамнез, особливості перебігу даної вагітності.
Основною причиною гіпоксії плоду і народження дітей з порушенням мозкового кровообігу є пн Тому вибір оптимальних строків і способу розродження жінок з даною патологією дозволяє істотно знизити перинатальні втрати [4, 7, 13].
Хронічна внутрішньоутробна гіпоксія плоду (ХВГП), порушення матково-плацентарного і плодово-плацентарного кровоплину, показників біофізичного профілю плода служать причиною зниження компенсаторно-пристосувальних реакцій плода та розвитку тяжких перинатальних пошкоджень мозку в процесі пологів. Порушення функціональних зв'язків у системі мати-плацента-плід, характерні для ПН, сприяють розвитку патології скоротливої діяльності матки в пологах (патологічного прелімінарного періоду, несвоєчасного вилиття навколоплідних вод, слабкості і дискоординированной пологової діяльності). Швидкий і стрімкий темп пологів також несприятливий для плоду, що розвивається в умовах тривалої гіпоксії. Тому при складанні плану ведення пологів важливо мати, по-можливості, більш повну інформацію про стан плацентарного кровотоку і здібності плоду до компенсаторних реакцій [36].
ХВГП обумовлена зменшенням або припиненням надходження в організм кисню.
У патогенезі ХВГП основним чинником є фетоплацентарна недостатність при акушерської та екстрагенітальної патології. Порушення структури плаценти і процесів мікроциркуляції в ній при пізніх гестозах вагітності, анеміях, екстрагенітальних захворюваннях призводять до хронічного кисневого голодування плоду. У результаті відбувається порушення функції серцево-судинної і центральної нервової систем, регуляції гомеостазу, зниження імунологічної реактивності організму плода [1, 4, 5, 13].
Гіпоксичні стани пов'язані зі змінами в складній системі мати-плацента-плід. Це свідчить про те, що результат вагітності для плоду і багато в чому для матері залежить від стану компенсаторно-пристосувальних механізмів фетоплацентарного комплексу та раціональної корекції виявлених порушень.
Основні прояви гіпоксії плода: порушення частоти серцевих скорочень, погіршення звучності серцевих тонів: появи аритмії, зниження інтенсивності руху плоду, зміна показників кислотно-основної рівноваги. Наслідками перинатальної гіпоксії можуть бути різні патологічні стани організму дитини: кардіопатії, пороки серця, дитячий церебральний параліч та ін [4, 5, 7, 13].
1.2. Гормони плаценти при фізіологічно протікає вагітності і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода
Фетоплацентарний комплекс відіграє важливу роль у розвитку та підтримці вагітності і синтезує ряд місцевих і гуморальних регуляторів, у тому числі і гормональної природи. До гормонів вагітності належать: стероїдні гормони (прогестерон, естрогени, кортизол), хоріонічний гонадотропін (ХГЛ), плацентарний лактоген (ПЛ), хоріонічний тиреотропний гормон (ХТТГ), хоріонічний адренокортикотропний гормон (ХАКТГ), релаксин, пролактин, кортикотропін-рилізинг-фактор (кортіколіберін, КТРФ), гонадотропін-рилізинг-гормон (ГТ-Рг), тиреотропін-рилізинг-фактор (тіроліберін), соматостатин, альфа-меланоцітстімулірующій гормон (α-МСГ), бета-ліпотропін, ендорфіни, енкефаліни і т.д.
Прогестерон (ПГ) - стероїдний гормон жовтого тіла яєчників і плаценти, необхідний для всіх стадій вагітності.
ПГ утворюється в яєчниках і в невеликій кількості в корі надниркових залоз під впливом лютеотропного гормону. Метаболізується здебільшого в печінці. Під час вагітності синтез ПГ стимулюється ХГЛ. У 1 триместрі вагітності освіта ПГ відбувається в організмі матері; з 2 триместру перші етапи синтезу відбуваються в організмі матері, подальші етапи здійснюються плацентою. ПГ готує ендометрій матки до імплантації заплідненої яйцеклітини, а потім сприяє збереженню вагітності: пригнічує активність гладкої мускулатури матки, підтримує в центральній нервовій системі домінанту вагітності; стимулює розвиток кінцевих секреторних відділів молочних залоз і ріст матки, синтез стероїдних гормонів; надає імунодепресивну дію, пригнічуючи реакцію відторгнення плодового яйця. Для прояву ПГ свого фізіологічного ефекту в жіночому організмі потрібно попередній вплив естрогенів. Головним органом-мішенню ПГ є матка. Гормон викликає секреторну трансформацію пролиферативно-потовщеного ендометрію, тим самим забезпечуючи його готовність до імплантації заплідненої яйцеклітини. Поза вагітністю секреція ПГ починає зростати в предовуляторние періоді, досягаючи максимуму в середині лютеїнової фази. Прогестерон викликає стимуляцію теплового центру та підвищення температури на 0,5 0 С після овуляції в лютеїнову фазу менструального циклу. Концентрація його повертається до вихідного рівня в кінці циклу. Дане різке падіння концентрації ПГ викликає менструальну кровотечу. Визначення рівня ПГ використовують для оцінки адекватності лютеальної фази і контролю ефективності овуляції. Зміст ПГ в крові вагітної жінки збільшується, підвищуються в 2 рази до 7-8 тижні, а потім більш плавно зростає до 37-38-й тижнях [8, 20, 32].
Ще один найважливіший гормон, який поряд з ПГ, надає пріоритетний вплив на діяльність жіночої статевої системи - естроген.
Ці стероїдні гормони виробляються фолікулярним апаратом жінок. У невеликій кількості гормон виробляється корою наднирників, але його кількості незначні у порівнянні з часткою, виробленої яєчниками. Продукція їх знаходиться в прямій залежності від стану матково-плацентарного кровообігу та наявності попередників, що виробляються в організмі матері та плоду.
У жінок у фізіологічних концентраціях естрогени викликають ріст і диференціювання клітин епітелію піхви, сприяють розвитку вторинних статевих ознак, готують репродуктивну систему до вагітності, забезпечують вхід яйцеклітини в статеві шляхи та можливість її запліднення після овуляції. Збереження рН середовища піхви, ритмічні скорочення матки, розвиток молочних залоз, розподіл підшкірного жиру, характерне для жіночого типу, поява лібідо - всі ці ефекти забезпечують у тому числі і естрогени. Вони ж сприяють регулярному відторгнення ендометрію і регулярним кровотеч.
Естрогени «працюють» у парі з ПГ, на противагу одне одному. Порушення цієї рівноваги призводить до ряду важких захворювань. Естрогени у високій концентрації викликають гіперплазію ендометрію і його кістозно-залозисте переродження [20, 32, 48].
Крім стероїдних гормонів у крові матері знаходяться також пептидні гормони. Вони, потрапляючи в кров матері та плоду, викликають зміни в метаболізмі, імунних процесах, беруть участь у регуляції матково-і фетоплацентарного кровотоку.
Для розвитку вагітності важливий плацентарний гормон - хоріонічний гонадотропін. ХГЛ являє собою глікопротеїн, який синтезується клітинами синцитіотрофобласту плаценти. ХГЛ є глікопротеїном-димером. Складається з двох субодиниць: альфа і бета. Альфа-субодиниця ідентична з альфа-субодиницями гормонів гіпофіза: тиреотропним гормоном (ТТГ), фоллікулстімулірующім гормоном (ФСГ) і лютеїнізуючим гормоном (ЛГ). Концентрація бета-ХГЛ в сечі досягає діагностичного рівня на 1-2 дні пізніше, ніж у сироватці крові.
У першому триместрі вагітності ХГЛ забезпечує синтез ПГ і естрогенів, необхідних для підтримки вагітності, жовтим тілом яєчника. ХГЛ діє на жовте тіло подібно лютеїнізуючого гормону, тобто підтримує його існування. Це відбувається до тих пір, поки комплекс плід-плацента не придбає здатність самостійно формувати необхідний гормональний фон. Діючи на плаценту, ХГЛ стимулює вироблення естріолу і прогестерону. У плоду чоловічої статі ХГЛ стимулює клітини Лейдіга, що синтезують тестостерон, необхідний для формування статевих органів за чоловічим типом.
Синтез ХГЛ здійснюється клітинами трофобласта, після імплантації ембріона (з 6-8 дня після запліднення яйцеклітини) і триває протягом усієї вагітності. При нормальному перебігу вагітності, в перші тижні вміст бета-ХГЛ подвоюється кожні 2 дні. Пік концентрації ХГЛ припадає на 10-11 тиждень вагітності, потім його концентрація починає повільно знижуватися. При багатоплідній вагітності вміст ХГЛ збільшується пропорційно кількості плодів. Знижені концентрації ХГЛ можуть говорити про ектопічної вагітності або загрозливому аборті.
Пролактин (Прл) відомий як важливий поліфункціональний гормон гіпофіза, більшість біологічних ефектів якого пов'язане з репродуктивною функцією.
Прл, в основному, синтезується в гіпофізі і після низки подій посттрансляційної процесингу секретується лактотрофамі передньої долі гіпофіза. За структурою і біологічними властивостями пролактин має спільні риси з гіпофізарним гормоном росту (соматотропін), плацентарних лактогенное і проліферіном і об'єднаний з ними в окреме сімейство - сімейство пролактінподобних білків.
Відомо, що опіоїдні пептиди і, особливо, продукт процесингу проопиомеланокортина (ПОМК) - бета-ендорфін входять до числа факторів, що стимулюють синтез препролактіна - попередника пролактину. З іншого боку є дані, що ще один продукт процесингу ПОМК - альфа-МСГ інгібує секрецію Прл.
Більшість біологічних ефектів пролактину пов'язане з репродуктивною функцією: він викликає лактацію у ссавців, проліферацію зобної залози у птахів, підтримує активність жовтого тіла і продукцію прогестерону, діє на ріст і диференціювання тканин. Крім цього пролактин впливає на водносолевой обмін, має анаболічну дію, викликає ряд поведінкових реакцій у ссавців, земноводних і птахів.
У великій кількості за участю надниркових залоз і печінки плода фетоплацентарний комплекс продукує кортизол (Кр). Кр - глюкокортикоїд, який синтезується в корі надниркових залоз. Секреція кортизолу підпорядковується добовому ритму: у дітей під час відсутності стресу концентрація кортизолу в сироватці о 8:00 становить зазвичай 11 ± 2,5 мкг%, а в 23:00 - 3,5 ± 0,15 мкг%. Добовий ритм секреції кортизолу встановлюється до кінця першого року життя, тому у грудних дітей він проявляється не настільки чітко. Цей гормон відіграє важливу роль у розвитку альвеолярного епітелію і секреції сурфактанту, які допомагають розправленні легенів при першому подиху дитини [8, 13].
Плацентарний кортикотропін-рилізинг-фактор виробляється трофобластом, хорионом, амніоном і децидуальної тканиною і виявлений в крові плоду. Крім того він синтезується також гіпофізом. Інкубація плацентарної тканини людини з КТРФ призводить до дозозалежної секреції ендорфіну і меланоцітстімулірующего гормону. Рецептори КТРФ були виявлені в міометрії, де КТРФ надає констрікторний ефект, діючи синергічно з окситоцином. КТРФ стимулює також синтез NO ендотелієм судин плаценти, що призводить до дилатації цих судин і поліпшенню фетоплацентарного кровообігу [8].
Таким чином, що виробляється під час вагітності плацентарний КТРФ бере участь у розвитку гіперкортицизму у матері, забезпеченні адекватного кровопостачання плода (можливо, за рахунок активації NO-синтази в стінці судин фетоплацентарної системи) і потім, безпосередньо перед пологами, у посиленні скоротливості матки. 1.1. Етіологія, патогенез та клініка плацентарної недостатності.
Хронічна внутрішньоутробна гіпоксія плоду
Плацентарна недостатність (ПН) - одна з найважливіших проблем акушерства, неонатології та перинатології. Вона є причиною внутрішньоутробної гіпоксії, затримки росту і розвитку плоду, його травм у процесі пологів.
ПН призводить до збільшення перинатальної смертності, 20% випадків перинатальної смертності безпосередньо пов'язані з патологією плаценти. ПН обумовлює високу частоту соматичної та інфекційної захворюваності новонароджених, служить причиною порушень фізичного і розумового розвитку дитини.
Відповідно до основних положень адаптаційно-регуляторної теорії розвитку ПН на початкових етапах впливу несприятливого чинника прогресування захворювання характеризується фазою стійкої гіперфункції. У міру виснаження адаптаційних механізмів - при тривалому впливі несприятливих факторів - розвивається фаза декомпенсації [4, 5, 38].
Виділяють первинну і вторинну ПН
Первинна ПН розвивається у строки формування плаценти (до 16-го тижня вагітності) і з найбільшою частотою зустрічається у жінок, які страждають звичним невиношуванням, а також у вагітних з безпліддям в анамнезі.
Вторинна ПН, як правило, виникає після завершення процесів формування плаценти і зумовлена екзогенними впливами, перш за все - перенесеними під час вагітності захворюваннями. Перебіг як первинної, так і вторинної ПН може бути гострим і хронічним.
Доведено, що при фізіологічно протікає вагітності плацентарні судини перебувають в стані дилатації і не реагують на скорочують стимули. Ця обставина забезпечує рівномірне надходження кисню і поживних речовин до плоду. Рефрактерність судин плаценти і системи кровообігу матері до вазопресорів забезпечується за рахунок зростаючої продукції ендотеліальних факторів релаксації - простацикліну та оксиду азоту (II). Синергічна дію цих факторів є основною умовою адаптації материнських судин до збільшення навантаження на кровотік, забезпечує системну вазодилатацію і зниження артеріального тиску у міру прогресування вагітності [5, 7].
Патологія плацентарного кровообігу розвивається в тих випадках, коли інвазивна здатність трофобласта знижена або процес інвазії охоплює спіральні судини нерівномірно. При цьому у сформованих плацентарних судинах частково зберігається гладком'язових структур, адренергічна іннервація, і, отже - здатність реагувати на вазоактивні стимули. Таким чином, ділянки плацентарних судин, які зберегли ендотеліальні і гладком'язові елементи, стають мішенню для дії медіаторів, які циркулюють в кровотоці. Структурні зміни, що відбуваються у судинах у відповідь на їх розслаблення і скорочення, лежать в основі порушень плацентарного кровообігу [26].
Інтенсивність матково-плацентарного кровоплину служить основним чинником, що визначає надходження кисню до плоду. При недостатньому постачанні плацентарної тканини оксигенированной кров'ю в трофобласті порушується перебіг метаболічних процесів. В умовах, коли кров, що омиває межворсінковое простір, недостатньо насичена киснем, трофобласт компенсує власні метаболічні потреби за рахунок збільшення площі капілярної мережі плодової частини плаценти. Якщо здатність плаценти до розвитку колатерального кровообігу не задовольняє повністю потреб плода, то в недостатньо кровоснабжается ділянках плацентарної тканини розвиваються виражені порушення мікроциркуляції і локальні ішемічні зміни. При пошкодженні 1 / 3 матково-плацентарних судин компенсаторні можливості плодової частини плаценти звичайно не можуть повністю забезпечити зростаючі енергетичні потреби зростаючого плоду. Порушується плацентарна перфузія, створюються умови для відставання темпів росту і розвитку плода [4, 5, 7].
Недостатнє надходження кисню в межворсінковое простір надає шкідливу дію на ендотелій судин ворсинчатого трофобласта, де індукуються процеси вільнорадикального окислення. Посилена васкуляризація фетоплацентарної тканини, яка відбувається в умовах недостатнього надходження кисню і дефіциту продукції ендотеліальних факторів релаксації під впливом кисневих вільних радикалів призводить до виснаження енергетичних резервів клітин і порушення структури судин. У міру виснаження запасів АТФ, судинні клітини реалізують свої енергетичні потреби за рахунок процесів анаеробного гліколізу. Ендогенні джерела енергії (АДФ, аденозин) потребують посиленого притоку Са 2 + в цитозолі клітин з внутрішньоклітинних депо. Збільшення концентрації Са 2 + в цитозолі клітин призводить до вивільнення найпотужнішого ендогенного вазоконстриктора - ендотеліну. Збільшення продукції О 2 - в ендотелії відбувається в період переходу від ішемії до реперфузії, провокує вивільнення ендотеліну і вазоспазм [9].
Таким чином, недостатнє кровопостачання трофобласту служить основним фактором, що приводить до порушення регуляції кровообігу в плаценті. Перепадів тиску в плацентарних судинах внаслідок ішемії-реперфузії належить центральна роль у патогенезі ішемічних ушкоджень плацентарної тканини і життєво важливих органів плода.
До факторів ризику розвитку ПН відносять вплив природних та соціально-економічних умов, стресових ситуацій, важких фізичних навантажень, вживання алкоголю, куріння, різні токсикоманії, вік, конституціональні особливості майбутньої матері, екстрагенітальні захворювання, обтяжений репродуктивний і акушерсько-гінекологічний анамнез, особливості перебігу даної вагітності.
Основною причиною гіпоксії плоду і народження дітей з порушенням мозкового кровообігу є пн Тому вибір оптимальних строків і способу розродження жінок з даною патологією дозволяє істотно знизити перинатальні втрати [4, 7, 13].
Хронічна внутрішньоутробна гіпоксія плоду (ХВГП), порушення матково-плацентарного і плодово-плацентарного кровоплину, показників біофізичного профілю плода служать причиною зниження компенсаторно-пристосувальних реакцій плода та розвитку тяжких перинатальних пошкоджень мозку в процесі пологів. Порушення функціональних зв'язків у системі мати-плацента-плід, характерні для ПН, сприяють розвитку патології скоротливої діяльності матки в пологах (патологічного прелімінарного періоду, несвоєчасного вилиття навколоплідних вод, слабкості і дискоординированной пологової діяльності). Швидкий і стрімкий темп пологів також несприятливий для плоду, що розвивається в умовах тривалої гіпоксії. Тому при складанні плану ведення пологів важливо мати, по-можливості, більш повну інформацію про стан плацентарного кровотоку і здібності плоду до компенсаторних реакцій [36].
ХВГП обумовлена зменшенням або припиненням надходження в організм кисню.
У патогенезі ХВГП основним чинником є фетоплацентарна недостатність при акушерської та екстрагенітальної патології. Порушення структури плаценти і процесів мікроциркуляції в ній при пізніх гестозах вагітності, анеміях, екстрагенітальних захворюваннях призводять до хронічного кисневого голодування плоду. У результаті відбувається порушення функції серцево-судинної і центральної нервової систем, регуляції гомеостазу, зниження імунологічної реактивності організму плода [1, 4, 5, 13].
Гіпоксичні стани пов'язані зі змінами в складній системі мати-плацента-плід. Це свідчить про те, що результат вагітності для плоду і багато в чому для матері залежить від стану компенсаторно-пристосувальних механізмів фетоплацентарного комплексу та раціональної корекції виявлених порушень.
Основні прояви гіпоксії плода: порушення частоти серцевих скорочень, погіршення звучності серцевих тонів: появи аритмії, зниження інтенсивності руху плоду, зміна показників кислотно-основної рівноваги. Наслідками перинатальної гіпоксії можуть бути різні патологічні стани організму дитини: кардіопатії, пороки серця, дитячий церебральний параліч та ін [4, 5, 7, 13].
1.2. Гормони плаценти при фізіологічно протікає вагітності і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода
Фетоплацентарний комплекс відіграє важливу роль у розвитку та підтримці вагітності і синтезує ряд місцевих і гуморальних регуляторів, у тому числі і гормональної природи. До гормонів вагітності належать: стероїдні гормони (прогестерон, естрогени, кортизол), хоріонічний гонадотропін (ХГЛ), плацентарний лактоген (ПЛ), хоріонічний тиреотропний гормон (ХТТГ), хоріонічний адренокортикотропний гормон (ХАКТГ), релаксин, пролактин, кортикотропін-рилізинг-фактор (кортіколіберін, КТРФ), гонадотропін-рилізинг-гормон (ГТ-Рг), тиреотропін-рилізинг-фактор (тіроліберін), соматостатин, альфа-меланоцітстімулірующій гормон (α-МСГ), бета-ліпотропін, ендорфіни, енкефаліни і т.д.
Прогестерон (ПГ) - стероїдний гормон жовтого тіла яєчників і плаценти, необхідний для всіх стадій вагітності.
ПГ утворюється в яєчниках і в невеликій кількості в корі надниркових залоз під впливом лютеотропного гормону. Метаболізується здебільшого в печінці. Під час вагітності синтез ПГ стимулюється ХГЛ. У 1 триместрі вагітності освіта ПГ відбувається в організмі матері; з 2 триместру перші етапи синтезу відбуваються в організмі матері, подальші етапи здійснюються плацентою. ПГ готує ендометрій матки до імплантації заплідненої яйцеклітини, а потім сприяє збереженню вагітності: пригнічує активність гладкої мускулатури матки, підтримує в центральній нервовій системі домінанту вагітності; стимулює розвиток кінцевих секреторних відділів молочних залоз і ріст матки, синтез стероїдних гормонів; надає імунодепресивну дію, пригнічуючи реакцію відторгнення плодового яйця. Для прояву ПГ свого фізіологічного ефекту в жіночому організмі потрібно попередній вплив естрогенів. Головним органом-мішенню ПГ є матка. Гормон викликає секреторну трансформацію пролиферативно-потовщеного ендометрію, тим самим забезпечуючи його готовність до імплантації заплідненої яйцеклітини. Поза вагітністю секреція ПГ починає зростати в предовуляторние періоді, досягаючи максимуму в середині лютеїнової фази. Прогестерон викликає стимуляцію теплового центру та підвищення температури на 0,5 0 С після овуляції в лютеїнову фазу менструального циклу. Концентрація його повертається до вихідного рівня в кінці циклу. Дане різке падіння концентрації ПГ викликає менструальну кровотечу. Визначення рівня ПГ використовують для оцінки адекватності лютеальної фази і контролю ефективності овуляції. Зміст ПГ в крові вагітної жінки збільшується, підвищуються в 2 рази до 7-8 тижні, а потім більш плавно зростає до 37-38-й тижнях [8, 20, 32].
Ще один найважливіший гормон, який поряд з ПГ, надає пріоритетний вплив на діяльність жіночої статевої системи - естроген.
Ці стероїдні гормони виробляються фолікулярним апаратом жінок. У невеликій кількості гормон виробляється корою наднирників, але його кількості незначні у порівнянні з часткою, виробленої яєчниками. Продукція їх знаходиться в прямій залежності від стану матково-плацентарного кровообігу та наявності попередників, що виробляються в організмі матері та плоду.
У жінок у фізіологічних концентраціях естрогени викликають ріст і диференціювання клітин епітелію піхви, сприяють розвитку вторинних статевих ознак, готують репродуктивну систему до вагітності, забезпечують вхід яйцеклітини в статеві шляхи та можливість її запліднення після овуляції. Збереження рН середовища піхви, ритмічні скорочення матки, розвиток молочних залоз, розподіл підшкірного жиру, характерне для жіночого типу, поява лібідо - всі ці ефекти забезпечують у тому числі і естрогени. Вони ж сприяють регулярному відторгнення ендометрію і регулярним кровотеч.
Естрогени «працюють» у парі з ПГ, на противагу одне одному. Порушення цієї рівноваги призводить до ряду важких захворювань. Естрогени у високій концентрації викликають гіперплазію ендометрію і його кістозно-залозисте переродження [20, 32, 48].
Крім стероїдних гормонів у крові матері знаходяться також пептидні гормони. Вони, потрапляючи в кров матері та плоду, викликають зміни в метаболізмі, імунних процесах, беруть участь у регуляції матково-і фетоплацентарного кровотоку.
Для розвитку вагітності важливий плацентарний гормон - хоріонічний гонадотропін. ХГЛ являє собою глікопротеїн, який синтезується клітинами синцитіотрофобласту плаценти. ХГЛ є глікопротеїном-димером. Складається з двох субодиниць: альфа і бета. Альфа-субодиниця ідентична з альфа-субодиницями гормонів гіпофіза: тиреотропним гормоном (ТТГ), фоллікулстімулірующім гормоном (ФСГ) і лютеїнізуючим гормоном (ЛГ). Концентрація бета-ХГЛ в сечі досягає діагностичного рівня на 1-2 дні пізніше, ніж у сироватці крові.
У першому триместрі вагітності ХГЛ забезпечує синтез ПГ і естрогенів, необхідних для підтримки вагітності, жовтим тілом яєчника. ХГЛ діє на жовте тіло подібно лютеїнізуючого гормону, тобто підтримує його існування. Це відбувається до тих пір, поки комплекс плід-плацента не придбає здатність самостійно формувати необхідний гормональний фон. Діючи на плаценту, ХГЛ стимулює вироблення естріолу і прогестерону. У плоду чоловічої статі ХГЛ стимулює клітини Лейдіга, що синтезують тестостерон, необхідний для формування статевих органів за чоловічим типом.
Синтез ХГЛ здійснюється клітинами трофобласта, після імплантації ембріона (з 6-8 дня після запліднення яйцеклітини) і триває протягом усієї вагітності. При нормальному перебігу вагітності, в перші тижні вміст бета-ХГЛ подвоюється кожні 2 дні. Пік концентрації ХГЛ припадає на 10-11 тиждень вагітності, потім його концентрація починає повільно знижуватися. При багатоплідній вагітності вміст ХГЛ збільшується пропорційно кількості плодів. Знижені концентрації ХГЛ можуть говорити про ектопічної вагітності або загрозливому аборті.
Пролактин (Прл) відомий як важливий поліфункціональний гормон гіпофіза, більшість біологічних ефектів якого пов'язане з репродуктивною функцією.
Прл, в основному, синтезується в гіпофізі і після низки подій посттрансляційної процесингу секретується лактотрофамі передньої долі гіпофіза. За структурою і біологічними властивостями пролактин має спільні риси з гіпофізарним гормоном росту (соматотропін), плацентарних лактогенное і проліферіном і об'єднаний з ними в окреме сімейство - сімейство пролактінподобних білків.
Відомо, що опіоїдні пептиди і, особливо, продукт процесингу проопиомеланокортина (ПОМК) - бета-ендорфін входять до числа факторів, що стимулюють синтез препролактіна - попередника пролактину. З іншого боку є дані, що ще один продукт процесингу ПОМК - альфа-МСГ інгібує секрецію Прл.
Більшість біологічних ефектів пролактину пов'язане з репродуктивною функцією: він викликає лактацію у ссавців, проліферацію зобної залози у птахів, підтримує активність жовтого тіла і продукцію прогестерону, діє на ріст і диференціювання тканин. Крім цього пролактин впливає на водносолевой обмін, має анаболічну дію, викликає ряд поведінкових реакцій у ссавців, земноводних і птахів.
У великій кількості за участю надниркових залоз і печінки плода фетоплацентарний комплекс продукує кортизол (Кр). Кр - глюкокортикоїд, який синтезується в корі надниркових залоз. Секреція кортизолу підпорядковується добовому ритму: у дітей під час відсутності стресу концентрація кортизолу в сироватці о 8:00 становить зазвичай 11 ± 2,5 мкг%, а в 23:00 - 3,5 ± 0,15 мкг%. Добовий ритм секреції кортизолу встановлюється до кінця першого року життя, тому у грудних дітей він проявляється не настільки чітко. Цей гормон відіграє важливу роль у розвитку альвеолярного епітелію і секреції сурфактанту, які допомагають розправленні легенів при першому подиху дитини [8, 13].
Плацентарний кортикотропін-рилізинг-фактор виробляється трофобластом, хорионом, амніоном і децидуальної тканиною і виявлений в крові плоду. Крім того він синтезується також гіпофізом. Інкубація плацентарної тканини людини з КТРФ призводить до дозозалежної секреції ендорфіну і меланоцітстімулірующего гормону. Рецептори КТРФ були виявлені в міометрії, де КТРФ надає констрікторний ефект, діючи синергічно з окситоцином. КТРФ стимулює також синтез NO ендотелієм судин плаценти, що призводить до дилатації цих судин і поліпшенню фетоплацентарного кровообігу [8].
Таким чином, гормонопродуцирующего функція плаценти визначає фізіологічні процеси в системі мати-плацента-плід. Однак, крім участі у розвитку та підтримці вагітності плацентарні гормони можуть бути залучені в патогенез порушень стану фетоплацентарного комплексу.
1.3. Ферменти плаценти при фізіологічному перебігу вагітності і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода
У постачанні плода поживними речовинами та продуктами обміну важливу роль відіграють ферменти плаценти, які локалізуються в основному внутрішньоклітинно. Серед них слід виділити групу дихальних ферментів: оксидази, каталаза, НАД - і НАДФ-діафораз, дегідрогенази (ДГ).
До ферментам плаценти, які беруть участь у вуглеводному обміні, відносять діастазу, інвертазу, лактазу, карбоксилазою, кокарбоксилазу та ін Активність їх у плаценті в 4-8 разів вище, ніж в печінці матері, і підвищується в міру розвитку вагітності і збільшення потреб плода [16 , 28].
У плацентарном цито-і синцитіотрофобласти виявлена амінопептідазу А (АП А, ангіотензіназа). Фермент здійснює перетворення ангіотензину II в ангіотензин III. У міру розвитку вагітності в сироватці крові матері спостерігається підвищення активності АП А. Передбачається участь ангіотензінази в зниженні прессорного відповіді судин на ангіотензин II при ХВГП [28].
Важливу роль у підтримці та розвитку вагітності грає цістінамінопептідаза (ЦАП), найбільша активність якої виявлена в лізосомальної фракції плацентарної тканини. Передбачається її участь у деградації ангіотензину II, завдяки чому ЦАП може залучатися до підтримання кров'яного тиску у матері на нормальному рівні протягом вагітності [11].
У регуляцію імунних процесів під час вагітності залучена плацентарна амінопептідазу N (АП N). Вона бере участь у деградації імуномодулюючих пептидів. Крім того, АП N гідролізує енкефаліни, соматостатин, нейрокинин А, а також лиз-брадикінін, ангіотензин III [8].
Таким чином, більшість амінопептідазу бере участь в обміні вазоактивних пептидів. Ймовірно, ці ферменти перешкоджають звуження плацентарних судин і залучаються до перерозподіл фето-плацентарного кровоплину при ХВГП.
У мікроворсинки плацентарного синцитіотрофобласту у великій кількості міститься ангиотензинпревращающий фермент - компонент ренін-ангіотензинової системи (РАС). Фермент каталізує перетворення ангіотензину I в ангіотензин II, бере участь у деградації брадикініну. Показано, що в нормі вміст ферменту в плазмі крові вагітних постійно наростає до III триместру [16].
Також у мікроворсинки плаценти людини виявлена карбоксипептидаза N. Фермент, будучи компонентом калікреїн-кінінової системи (ККС), головним чином контролює циркуляцію крові в фетоплацентарному комплексі, бере участь у деградації брадикініну в плаценті та сироватці крові. Виявлено, що рівні брадикініну в артеріальній і венозній крові судин пуповини нижче, ніж у крові матері [38].
Різноманітні функції в плацентарної тканини виконують пептідгідролази. Певну роль у розвитку вагітності, особливо в ранні терміни, в період імплантації плодового яйця, грають катепсини, активність яких прогресивно знижується в процесі розвитку вагітності, особливо при переношуванні.
Таким чином, при ускладненнях вагітності відзначаються зміни у функціонуванні ферментних систем плаценти, в тому числі тих, які беруть участь в освіті та інактивації пептидів, що регулюють кровоток у ФПК. Останні, у свою чергу, можуть бути залучені в розвиток численних адаптаційних реакцій. Тому є важливим дослідження активності ферментів обміну біологічних активних пептидів при патологіях вагітності.
1.3.1. Катепсин
Катепсини - (від грец. Kathepso-переварюю), ферменти класу гідролаз, що каталізують гідроліз пептидного зв'язку. Містяться в тканинах тварин і людини. Неспецифічний протеоліз грає важливу роль в регуляції білкового обміну, в ході якого білки організму постійно оновлюються.
За будовою активного центру розрізняють три основні групи катепсинів. До групи катепсинів, що містять в активному центрі залишок серину (так звані серинові амідгідролази), входять катепсин А (серинових карбоксипептидаза A 1) і катепсин G. Велику групу становлять катепсини, що містять в активному центрі цистеїн (тіолові амідгідролази). У цю групу входять катепсини В, С, Н, L, N і S. До катепсину, що містить в активному центрі залишок аспарагінової кислоти (так звані карбоксильні амідгідролази), відносяться катепсин D і катепсин Є. Катепсин С володіє також сильно вираженою транспептідазной активністю - каталізує перенесення олігопептидів на пептиди або амінокислоти. Відомий також катепсин F, який каталізує розщеплення протеогліканів. Він інгібується деякими імуноглобулінами, не чутливий до дії діізопропілфторфосфата, пепстатіна і реагентів, взаємодіючих з групою SH [16, 38].
Під час вагітності спостерігається активація протеолізу. У I триместрі підвищення протеолітичної активності може бути пов'язано з відбуваються в цей період процесами імплантації та плацентації. II триместр характеризується завершенням періоду формування плаценти і вступом її у фазу активного функціонування, що забезпечує імуносупресію. У III триместрі збільшення активності інгібіторного ланки протеолітичної системи може бути пов'язано з наростанням потенціалу згортання крові, гіперкоагуляції. Перед пологами активація протеолізу пов'язана з підвищенням фібринолітичної активності трофобласта. Після пологів спостерігається посилення активності інгібіторів протеаз, що може бути розцінено як захисна компенсаторна реакція [16].
Катепсин D - найважливіша лізосомальних протеиназа, що відображає здатність клітин до ращепленію білків і яка відіграє важливу роль у процесі внутрішньоклітинного протеолізу.
Катепсин D існує у вигляді множинних форм з pI від 5,8 до 7,2 [14, 16]. Максимальна активність відмічена при pH 2,8-4,0.
При гель-фільтрації встановлена Mr 42000, а при аналітичному ультрацентрифугирование - 43300. У плаценті протеиназа локалізована в ворсинах синцитіотрофобласту.
Катепсин D - ендопептидаз, гідроліз пептидних зв'язків, утворені залишками гідрофобних амінокислот, один з яких - ароматичний. Кращим субстратом є гемоглобін. Фермент раcщепляет багато природні субстрати: речовина Р, соматостатин, пролактин, b-ліпотропін, b-ендорфін.
Катепсин D бере участь в регуляції розвитку клітини та її запрограмованої загибелі, що пов'язано з процесами в системі протеоліз-антіпротеоліз, в якій відбувається порушення балансу при ХВГП. Тому становить інтерес вивчення активності катепсину D при патологічному перебігу вагітності.
1.4. Перекисне окислення ліпідів та антиоксидантна система фетоплацентарного комплексу при фізіологічній вагітності та хронічної внутрішньоутробної гіпоксії плода
При фізіологічній вагітності швидкість ініційованого окиснення ліпідів підвищується приблизно в 3 рази. Під час вагітності у зв'язку зі зростанням основного обміну і збільшенням споживання кисню в крові відбувається ряд значних біохімічних змін: підвищується концентрація нейтрального жиру, холестерину і ліпідів [3]. Також збільшується активність фосфоліпази А 2. У результаті її дії в крові збільшується концентрація ненасичених жирних кислот, які є безпосереднім субстратом для перекисного окислення [15]. Порушення в системі перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) і антиоксидантної активності (АОА) є одним з механізмів формування антиоксидантної недостатності внаслідок надмірного посилення ПОЛ. У результаті активації ПОЛ та накопичення вільних радикалів відбувається порушення структурно-функціональної цілісності клітинних мембран, звільнення лізосомальних ферментів, що в кінцевому підсумку призводить до патологічних процесів у клітині і організмі в цілому [2, 3, 33]. В даний час можна вважати в основному розшифрованими механізми альтерації і реакцію клітинних мембран на пошкодження. У кінцевому підсумку вони обумовлені вільно-радикальної агресією і процесами перекисного окислення ліпідів і білків - найважливіших компонентів клітинної стінки [4]. Активатором перекисного окислення служать вільнорадикальні форми кисню. Субстратом ПОЛ є поліненасичені жирні кислоти (ПНЖК). Дефіцит ПНЖК порушує бар'єрну і матричну функції клітинних мембран. Про це свідчить підвищення параметра впорядкованості ліпідного бішару мембрани (мікров'язкості мембран) [37]. Одночасно з цим відзначено виражене зменшення гідрофобності мембран, а, отже, збільшення гідрофіліі ліпідного бішару, і як наслідок - його підвищену проникність. Порушення бар'єрної функції ліпідного бішару мембран пов'язане зі зміною функціонування каналів для іонів, в першу чергу Са 2 +, а також - Na +, K +, Mg 2 +. Масивний вхід Са 2 + в клітину призводить до незворотних змін у ній, зокрема до енергетичного голоду та її загибелі, з одного боку, а з іншого - додатково до м'язової контрактури і вазоспазму. Дієнові кон'югати, що є первинним продуктом перекисного окислення, збільшують полярність гідрофобних вуглеводневих хвостів жирних кислот, які утворюють ліпідний бішар мембрани. При фізіологічному процесі регуляції клітинної активності ділянки вуглеводневих хвостів, полярність яких зросла, витісняються з глибоких шарів мембрани до поверхні, що полегшує процес самооновлення мембрани і впливає на її проникність і іонний транспорт. При надмірному появі вільнорадикальних форм кисню самоускоряющееся ПОЛ призводить до повного руйнування ненасичених ліпідів, порушення структури і функції білків та інших молекул і, як наслідок, до загибелі клітини [3, 15].
Одним з основних способів неспецифічного захисту життєздатності органів і тканин є активність антиоксидантних систем, що забезпечують стійкість живих клітин до вільнорадикального пошкодження [15, 24]. Дослідження останніх років підтвердили, що у жінок з ХВГП напруженість оксидантного стресу, що реєструється по динаміці плазмового рівня загальної оксидантної активності, концентрації перекисних ліпідів і малонового діальдегіду (МДА), прогресивно наростає до кінця 3-го триместру вагітності [3, 5, 33].
В АТ розрізняють ферментативні (оксідоредуктазние ферменти і антіперекісние ферменти) і неферментативного (низькомолекулярні тіоли, аскорбінова кислота, токоферол, вітаміни А, К, Р, убіхінон і ін) ланки. Захист структурних біологічних мембран здійснюється переважно ліпідними біоантіоксідантамі. Активність антиоксидантного ферменту глутатіонпероксидази в еритроцитах істотно не змінена як при фізіологічній вагітності, так і при ризику невиношування в обох критичних терміни. Активність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази в ранніх термінах вагітності підвищується значно. Одночасно рівень токоферолу і ретинолу знижується в плазмі і підвищується в плацентарної тканини. [33]. Важливими ферментами АОС є каталаза і церулоплазмін. Церулоплазмін (ЦП) - Медьсодержащих оксидаза, відноситься до альфа-2-глобулінової фракції плазми крові людини. Особливий інтерес викликають антиоксидантні, иммунорегулирующим, радіопротектівние властивості. Завдяки своїй високій ферроксідазной активності ЦП запобігає неферментативне реакції, що дають початок вільним радикалам і подальшому розвитку ПОЛ. При фізіологічних умовах ЦП крові інгібує ПОЛ на 50%. Придушення ПОЛ досягається за рахунок перехоплення та інактивації супероксидного іон-радикалу О 2 * [3, 5].
Виявлено збільшення концентрації ЦП у вагітних у порівнянні з їх значеннями в невагітних [27, 34]. Мабуть, даний факт пояснюється активацією системи ПОЛ при вагітності, що приводить в свою чергу до активації антиоксидантної системи захисту організму. Крім того, виявлено достовірне зниження активності ЦП при ХВГП і гестозах, що може бути пояснено виснаженням антиоксидантної системи захисту організму в умовах її напруженого функціонування, викликаного розвитком важких ускладнень вагітності [27, 29, 34, 44].
Каталаза - фермент класу оксидоредуктаз, каталізує розкладання перекису водню на воду та молекулярний кисень. При низькій концентрації перекису каталаза проявляє також Пероксидазну активність, окислюючи нижчі спирти, поліфеноли. Однією з основних функцій каталази є захист клітинних мембран від пероксиду водню, що утворюється при перекисном окисленні ліпідів [29].
Таким чином, при патологічно протікає вагітності спостерігається дисбаланс у системі ПОЛ-АОС. При активації вільно-радикальних процесів на тлі зниження антиоксидантної активності ризику підвищеної окисної модифікації піддаються не тільки ліпіди, але й білки. У зв'язку з цим викликає інтерес вивчення показників перекисного окислення ліпідів та антиоксидантної системи в плаценті при ХВГП.
РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали дослідження
Активність катепсину D, зміст пептидів середньої молекулярної маси, активність каталази, церулоплазміну, рівень продуктів перекисного окислення ліпідів (дієнових і тріенових кон'югатів), рівень гідроперекисів визначали в плацентарної тканини, яку отримали відразу після пологів. Для дослідження брали найбільш віддалену від місця прикріплення пуповини тканину. Плацентарну тканину поміщали в охолоджений фізіологічний розчин, очищали від крові і висушували фільтрувальним папером. Тканини зважували, навішування гомогенізували в скляному гомогенизаторе з тефлоновим товкачиком.
2.1.1. Клінічні групи
Було обстежено 16 зразків плацентарної тканини жінок у віці від 20 до 40 років.
Всі породіллі були розділені на 2 групи (рис. 1). Перша група - жінки з фізіологічним перебігом вагітності та пологів (n = 8), друга група - жінки з хронічною внутрішньоутробною гіпоксією плода (n = 8).
Клінічні групи
SHAPE \ * MERGEFORMAT
норма ХВГП
Рис. 1. Клінічні групи
2.2. Методи дослідження
2.2.1. Метод визначення активності катепсину D
Для визначення активності катепсину D використовували 7,5%-ий гомогенат тканини на натрій-ацетатному буфері (рН 3,3). Препарат ферменту (20 мкл) змішували з 60 мкл
2.2.2. Метод визначення кількості пептидів середньої молекулярної маси
Для визначення кількості пептидів середньої молекулярної маси використовували 5%-ий гомогенат тканини. Білки досліджуваної біологічної рідини облягали рівним обсягом
2.2.3. Метод визначення активності каталази
Активність каталази виражається каталазної числом - кількістю мг перекису водню, що може розкласти 1 мкг крові (гомогенату).
У дві колби наливали по 7 мл дистильованої води і додавали в них по 1 мл гомогенату. Вміст контрольної проби кип'ятили 2 - 3 хв. В обидві колби вносили по 2 мл 1% розчину H 2 O 2 і инкубировали 30 хв при кімнатній температурі. Потім доливали по 5 мл 10% H 2 SO 4 і оттітровивалі вміст колб 0,05 н розчином KMnO 4 до рожевого кольору.
Розрахунок: 1мл 0,05 н KMnO 4 відповідає 0,85 г H 2 O 2. Таким чином, різницю в результатах титрування контролю та досвіду множимо на цю величину і отримуємо кількість мг перекису водню, що може розкласти 1 мкл гомогенату.
2.2.4. Метод визначення активності церулоплазміну
Активність церулоплазміну визначали модифікованим методом Ревіна, який базується на окисленні p-фенілендіамін за участі цього ферменту. Ферментативну реакцію зупиняють додаванням фтористого натрію. За оптичної щільності виникають продуктів судять про концентрацію церулоплазміну.
У пробірки вносили по 0,1 мл гомогенату. У контрольну пробу додавали 2 мл розчину NaF (з метою інактивації ферментативної активності церулоплазміну). Потім в контроль і досвід додавали по 8 мл ацетатного буфера та по 1 мл р-фенілендіамін (використовуваного в якості субстрату). Пробірки струшували і инкубировали 1 годину при температурі, рівній +37 0 С.
Після інкубації в усі пробірки, за винятком контрольної, доливали по 2 мл розчину фтористого натрію. Вміст пробірок перемішували і переносили в холодильник, де витримували протягом 30 хвилин при +4 0 С.
Проби колоріметріровалі на КФК-2 при λ = 530 нм. Результати порівнювали з даними контрольної проби. Значення оптичної щільності множили на коефіцієнт перерахунку 875.
2.2.5. Метод визначення вмісту продуктів перекисного окислення ліпідів (дієнових і тріенових кон'югатів)
Для екстракції ліпідів брали 1 мл 25% гомогенату плацентарної тканини, доливали 3 мл метанолу, перемішували скляною паличкою, струшували протягом 15 хвилин, потім центрифугували при 3000 об / хв протягом 5 хвилин. Додавали 3 мл гексану, знову ретельно перемішували скляною паличкою, струшували протягом 15 хвилин і залишали відстоюватися на 30 хвилин.
Після поділу шарів, верхній (метанол - гексанової шар) відбирали в суху пробірку і використовували для досліджень.
Рівень дієнових кон'югатів визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 233 нм, кетодіенов і зв'язаних тріенов - 278 нм, ненасичених ліпідів - 220 нм. Розраховували содержанімое дієнових кон'югатів, кетодіенов і зв'язаних тріенов по відношенню до рівня ненасичених ліпідів (E 233 / E 220 і Е 278 / Е 220).
2.2.6. Метод визначення вмісту гідроперекисів
Для приготування гомогенату використовували буфер 0,025 н трис-HCl (pH 7,4), що містить 0,175 м KCl. У центрифужні пробірки поміщали по 2 мл 25% гомогенату і брали в облогу білки додаванням 0,2 мл 50% розчину Тху.
Утворений осад відокремлювали центрифугуванням протягом 10 хвилин при 4000 об / хв. Далі 2 мл надосадової рідини доводили 96% етанолом до 27 мл, додавали 0,2 мл концентрованої соляної кислоти і 0,025 мл 5%-го розчину солі Мора в 3%-ної HCl, проби інтенсивно струшували. Через 30 секунд доливали 1 мл 20%-го розчину роданистого калію, після чого розвивається малинова забарвлення. В якості контролю використовували проби, що містять 96%-ний етанол замість надосадової рідини. Вимірювання оптичної щільності проводили протягом 10 хвилин після додавання роданистого калію при λ = 480 нм.
2.2.7. Статистична обробка результатів дослідження
Достовірність відмінностей між середніми визначали з використанням t-критерію Стьюдента. Кореляційний аналіз проводили за допомогою програми Статистика (версія 6.0).
РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ І ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
3.1. Активність катепсину D в плацентарної тканини в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода
Результати дослідження показали достовірне підвищення активності катепсину D плацентарної тканини при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода. Відзначено підвищення активності ферменту при патології в 1,8 разів у порівнянні з нормою (рис.2).
\ S
Рис.2. Активність катепсину D в плаценті в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода (нмоль продукту, що утворився за 1 хв інкубації на 1 мг білка; * - р <0,05; ** - р <0,01; *** - р < 0,001 відносно норми)
Підвищення активності катепсину D плацентарної тканини при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду може бути пов'язане з порушенням структурно-функціональних властивостей клітинних мембран плаценти при досліджуваної патології.
3.2. Кількість пептидів середньої молекулярної маси в плацентарної тканини в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода
Згідно з результатами дослідження при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду зміст пептидів середньої молекулярної маси в плацентарної тканини підвищувався в 1,86 рази по відношенню до норми (рис. 3).
\ S
Рис. 3. Зміст пептидів середньої молекулярної маси в плаценті в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода (мкг / мл; * - р <0,05; ** - р <0,01; *** - р <0,001 відносно норми)
Підвищення змісту пептидів середньої молекулярної маси може бути пов'язано з підвищенням активності катепсину D [14].
3.3. Активність каталази в плацентарної тканини в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода
Результати дослідження показали достовірне зниження активності каталази в плацентарної тканини при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду в 1,46 рази по відношенню до норми (рис. 4).
\ S
Рис. 4. Активність каталази в плаценті в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода (каталазної число; * - р <0,05; ** - р <0,01; *** - р <0,001 відносно норми)
3.4. Активність церулоплазміну в плацентарної тканини в нормі
і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода
Згідно з результатами дослідження при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода активність церулоплазміну в плацентарної тканини знижувалася в 1,49 рази по відношенню до норми (рис. 5).
\ S
Рис. 5. Активність церулоплазміну в плаценті в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода (одиниці; * - р <0,05; ** - р <0,01; *** - р <0,001 відносно норми)
Ймовірно, зниження активності каталази і церулоплазміну в плацентарної тканини при ХВГП пов'язано з пригніченням антиоксидантної системи [31].
3.5. Активність дієнових кон'югатів в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду в плацентарної тканини
Згідно з результатами дослідження при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода активність дієнових кон'югатів в плацентарної тканини знижувалася в 1,6 рази по відношенню до норми (рис. 6).
\ S
Рис. 6. Активність дієнових кон'югатів в плаценті в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода (одиниці; * - р <0,05; ** - р <0,01; *** - р <0,001 відносно норми)
3.6. Активність тріенових кон'югатів в плаценті в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода
Згідно з результатами дослідження при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода активність тріенових кон'югатів в плацентарної тканини знижувалася в 2,1 рази по відношенню до норми (рис. 7).
\ S
Рис. 7. Активність тріенових кон'югатів в плацентарної тканини в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода (одиниці; * - р <0,05; ** - р <0,01; *** - р <0,001 відносно норми)
Пониження вмісту дієнових і тріенових кон'югатів може бути пов'язано з посиленням активності низькомолекулярних антиоксидантів - токоферолу і ретинолу, зміст яких підвищений у плацентарної тканини при досліджуваної патології [6].
3.7. Концентрація гідроперекисів у плацентарної тканини в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода
Згідно з результатами дослідження при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода концентрація гідроперекисів у плацентарної тканини підвищувалася в 1,25 рази по відношенню до норми (рис. 8).
\ S
Рис. 8. Концентрація гідроперекисів у плацентарної тканини в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду в плацентарної тканини (одиниці; * - р <0,05; ** - р <0,01; *** - р <0,001 відносно норми)
Підвищення вмісту гідроперекисів у плацентарної тканини при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду, швидше за все, є результатом посилення перекисного окислення ліпідів на фоні зниженої антиоксидантної активності.
Плацента - основний орган, який здійснює анатомо-фізіологічну зв'язок між матір'ю і плодом і забезпечує гомеостаз у фетоплацентарному комплексі. Різні патологічні стани материнського організму призводять до порушень компенсаторно-пристосувальних механізмів і, відповідно, до різних форм плацентарної недостатності. Порушення транспортної, трофічної, ендокринної та метаболічної функцій плаценти є причиною таких патологій, як гіпоксія, гіпотрофія та внутрішньоутробна затримка розвитку плода [46]. Тривале або повторне вплив пошкоджуючих чинників призводить до надмірної активації діяльності плаценти і напрузі всіх компенсаторних механізмів. Напруга в подальшому змінюється стадією гноблення, яка характеризується дезорганізацією основних функцій і розвитком незворотних деструктивних процесів у плаценті [4], що викликає інтерес до вивчення активності катепсинів в даному органі при фізіологічному і ускладненому перебігу вагітності [16, 38].
Результати дослідження показали достовірне підвищення активності катепсину D в плацентарної тканини при ХВГП.
У патогенезі ХВГП одне з провідних місць займає порушення структурно-функціональних властивостей клітинних мембран плаценти. При патологічному перебігу вагітності посилюється перекисне окислення ліпідів на тлі зниження антиоксидантної активності [4].
Згідно з результатами дослідження при ХВГП в плацентарної тканини відзначено достовірне зменшення активності каталази і церулоплазміну в порівнянні з нормою. Ймовірно, в умовах патологічного перебігу вагітності ферментативне ланка антиоксидантної системи пригнічується і накопліваются токсичні продукти перекисного окислення. Передбачається, що це впливає на активність ферменту, так як виявлена позитивна кореляційна взаємозв'язок (КК = 0,89 **) між активностями церулоплазміну, каталази і катепсину D в плацентарної тканини.
Порушення в системі ПОЛ та АОА є одним з механізмів формування антиоксидантної недостатності внаслідок надмірного посилення ПОЛ. У результаті активації перекисного окислення ліпідів та накопичення вільних радикалів відбувається порушення структурно-функціональної цілісності клітинних мембран, у тому числі і лізосомальних. Ці процеси призводять до виходу кислих гідролаз в цитозоль. У результаті спостерігається посилення процесів аутолізу і дезорганізація практично всіх сторін метаболізму. Неконтрольоване наростання протеолізу викликає інактивацію ферментів і пептидних гормонів, змінює їх функціональну роль [2, 3, 33].
Крім того, виявлено достовірне зниження рівня дієнових і тріенових кон'югатів в плацентарної тканини при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду в порівнянні з нормою.
Це може бути пов'язано з підвищенням активності низькомолекулярних антиоксидантів (ретинолу та токоферрола), зміст яких підвищується в плацентарної тканини [6]. Враховуючи позитивні кореляційні взаємозв'язки (КК = 0,95 **) рівня дієнових і тріенових кон'югатів з активністю катепсину D, збільшення антиоксидантного захисту можна розцінювати як компенсаторно-пристосувальних реакцій в умовах хронічної внутрішньоутробної гіпоксії плоду.
У розвитку ХВГП важливу роль відіграє дисфункція ендотелію судин фетоплацентарного комплексу. Остання характеризується зниженням вироблення ендотелієм вазодилататорів, це викликає спазм судин, порушення мікроциркуляції, в результаті чого розвиваються локальні ішемічні зміни в плаценті. Дані процеси ведуть до активації ПОЛ, утворення токсичних радикалів (гідроперекисів ліпідів, дієнових і тріенових кон'югатів). При цьому знижена ферментативна антиоксидантний захист (зменшення активності каталази і церулоплазміну в плацентарної тканини). Все вище перераховане сприяє порушенню структурно-функціональних властивостей клітинних мембран. Необхідно зазначити, що згідно з літературними даними [2, 3, 6], спостерігається активація ланки антиоксидантної системи - токоферолу і ретинолу, які, можливо, і сприяють зниженню рівнів дієнових і тріенових кон'югатів у плацентарної тканини.
Будь-яка патологія є стресом для фетоплацентарної системи. Відзначено підвищення рівня КТРФ в плацентарної тканини при патологічному перебігу вагітності [8]. Відомо, що КТРФ знижує рівень гонадотропінів [8, 13]. Ймовірно, тому спостерігається зменшення рівня ХГЛ, що веде до пригнічення синтезу прогестерону та естрогенів [20, 32, 48].
Рівні інгібіторів протеолізу a 2 - макроглобуліну і a 1 - антитрипсину регулюються гонадотропними гормонами, естрогенами, прогестероном [8, 20, 32]. Зниження концентрації естрогенів і прогестерону в фетоплацентарному комплексі при ХВГП тягне за собою зменшення активності інгібіторів протеаз, в результаті чого спостерігається неконтрольоване наростання процесів внутрішньоклітинного протеолізу в плаценті за участю катепсинів.
Також було відзначено достовірне підвищення вмісту пептидів середньої молекулярної маси.
Активація внутрішньоклітинного протеолізу призводить до збільшення продуктів протеолізу - молекул малої і середньої маси. До числа останніх відносять пептиди ендогенного походження, молекулярна маса яких становить 300-5000 дальтон. Вони утворюються у процесі протеолізу в ушкоджених клітинах при виході лізосомальних протеолітичних ферментів в цитоплазму. Підвищене утворення пептидів середньої молекулярної маси виявляється як при вагітності, так і при її ускладненнях. Істотна особливість пептидів середньої молекулярної маси полягає в їх чітко вираженої високої біологічної активності. Накопичення середньомолекулярних пептидів призводить до розвитку синдрому ендогенної інтоксикації [17].
Токсичні продукти ендогенної природи надають шкідливу дію на судинну систему, погіршують і без того недостатній кровообіг. Це ускладнює перебіг патологічного процесу, роблячи негативний вплив на життєдіяльність всіх систем і органів.
Кореляційна взаємозв'язок (КК = 0,77 **) між активністю катепсина D і змістом пептидів середньої молекулярної маси в плаценті при ХВГП, ймовірно, свідчить про погано функціонуючої системі антіпротеоліза.
Таким чином, катепсин D грає важливу роль в патогенезі ХВГП. Останні супроводжуються змінами з боку регуляторних механізмів, що контролюють діяльність пептид-гідролаз плаценти. Ймовірно, представлені результати можуть бути основою для подальшого дослідження гомеостазу фетоплацентарної системи і вишукування способів корекції метаболічних змін у плаценті при патологічному перебігу вагітності.
ВИСНОВКИ
1. Виявлено підвищення активності катепсину D в плацентарної тканини при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду в порівнянні з нормою.
2. Встановлено збільшення вмісту пептидів середньої молекулярної маси в плаценті при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду по відношенню до норми.
3. Виявлено зниження активності каталази і церулоплазміну в плаценті при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду в порівнянні з нормою.
4. Встановлено зменшення вмісту дієнових і тріенових кон'югатів у плацентарної тканини при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду по відношенню до норми.
5. Виявлено підвищення концентрації гідроперекисів у плацентарної тканини при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду в порівнянні з нормою.
6. Катепсин D бере участь у патогенезі хронічної внутрішньоутробної гіпоксії плоду.
ЛІТЕРАТУРА
1. Анастасьева В.Г. Морфофункціональні порушення фето-плацентарного комплексу при плацентарної недостатності. - Новосибірськ, 1997.
2. Аржанова О.Н., Кошелева Н.Г., Ковальова Т.Г., Громико Г.Л., Тишкевич О.В. Плацентарна недостатність: діагностика та лікування / / Навчальний посібник. Під редакцією Е.К. Айламазяна. - СПб: издат НОРМЕД, 2000.
3. Афанасьєва Н.В., Стрижаков А.Н. Результати вагітності та пологів при фетоплацентарної недостатності різного ступеня тяжкості / / Питання гінекології, акушерства та перинатології. - 2007. - Т. 3, № 2
4.Бичков В.І., Образцова Є.Є., Шамарін С.В. Діагностика та лікування хронічної фетоплацентарної недостатності / / Акушерство і гінекологія. - 1999. - № 6.
5. Ашмарин І.П., Каразеева Є.П. Нейропептиди / / в кн. «Нейрохімія» під ред. Ашмаріна І.П., Стукалова П.В. - М.: Видавництво інституту біомедичної хімії РАМН, 2006.
6.Д.Б.Юренева. Відділення гінекологічної ендокринології Наукового центру акушерства, гінекології та перинатології РАМН, Москва. «Постоваріектоміческій синдром» / / Гінекологія № 1, 2004.
7. О. Р. Григорян. ГУ Ендокринологічний науковий центр РАМН, Москва. «Сучасні принципи корекції метаболічного синдрому у жінок в період постменопаузи» / / Consilium medicum № 9, 2005.
8. І. В. Кузнєцова. Кафедра акушерства і гінекології РМАПО, Москва. «Замісна гормональна терапія» / / Consilium medicum № 9, 2005.
9.Вовчук К.Л., Чернадчук С.С. Активність тканинних катепсин-В-подібних протеїназ у жінок з онкопатологією тіла матки / / Укр. биохим. журн. - 2004. - Т. 76, № 2.
10. Запорожан В.М., Хаіт О.В., Низова Н.М., Скрипник М.М., Рихлецкій В.М. Зміна показників імунної та протеазной-інгібіторної систем при фізіологічній вагітності / / Акушерство і гінекологія. - 1992. - № 8-1
11. Айламазян Е.К. Антиоксиданти в комплексній терапії пізнього токсикозу і пов'язаної з ним хронічної гіпоксії плода / / Акушерство і гінекологія.-1991. - № 3.
12.Бандік В. П., Чернокульскій С.Т, Яроцький М. Є., Венцковский Б. М. Ультраструктурні особливості мікросудинного русла термінальних ворсин хоріона і плацентарний бар'єр при пізніх токсикозах вагітності / / ПАГ .- 1994 .- № 2.
13. Болдирєв А.А., Введення в біохімію мембран. - М.: Наука, 1998.
14. Бурле В. А. Вільно-радикальне окислення в системі мати-плацента-плід при акушерській патології / / Автореф. дис .... д-ра мед. наук .- М., 1992.
15. Бурмістров С.О., Опаріна Т.І., Прокопенко В.М., Арутюнян А.В. Показники процесу деградації білків і антиокислювальної системи при нормальній вагітності / / Акушерство і гінекологія. - 2001 - № 6
16. Бичков В.І., Образцова Є.Є., Шамарін С.В. Діагностика та лікування хронічної фетоплацентарної недостатності / / Акушерство і гінекологія. - 1999. - № 6.
17. Ветров В.В., Леванович В.В. Роль молекул середньої маси в патогенезі пізнього токсикозу вагітних / / Акушерство і гінекологія. - 1990. - № 6.
18. Владимиров Ю. А., Арчаков А. І. Перекисне окислення ліпідів у біологічних мембранах .- М., 1992.
19. Возовик А.В. Корекція фетоплацентарної недостатності у вагітних з нетоксичним вузловим зобом. / / Матеріали V Російського Форуму «Мати і Дитя». - Москва, 2003.
20.Воскресенскій О. М. Біофізичні і фізико-хімічні дослідження в вітамінології / / Москва, 1981.
21.Гомазков О.А. Пептиди в кардіології. - М: Материк Альфа, 2000.
22. Грищенко В. І., Щербина Н. А. Удосконалення діагностики і терапії перинатальної патології / / Акушерство і гінекологія. -1990 - № 10
23. Грищенко В. І. Сучасні методи діагностики та лікування пізнього токсикозу вагітних. / / М., Медицина, 1977.
24. Громико Г.Л., Шпаков А.О. Сучасні уявлення про механізми регуляції кровообігу в плаценті при фізіологічній і ускладненій вагітності / / Вісник Російської асоціації акушерів-гінекологів. - 1995. - № 4.
25. Губський Ю. І., Сільченко І. А., Селезньова О. І. Роль антиоксидантних вітамінів в обмеженні токсинів. / / В кн.: Біофізичні і фізико-хімічні дослідження в вітамінології .- М.: Наука, 1981.
26.Демідовіч Є.О., Ігнатко І.В. Особливості плодового ниркового кровотоку при фетоплацентарної недостатності. / / Матеріали V Російського Форуму «Мати і Дитя», Москва. - 2003.
27.Дмітріев Л. Ф., Давлетіна Л. М., Іванов І. І. Взаємозв окисного фосфорилювання і перекисного окислення ліпідів / / Біологічні мембрани - 1985 .- Т.2, № 8.
28.Омакін М.С., Арцимович Н.Г. Біологічно активні речовини, асоційовані з плацентою / / Акушерство і гінекологія. - 1991. - № 9.
29. Кошелева Н.Г., Аржанова О.Н., Громико Г.Л. та співавт. Нові підходи до лікування загрозливих передчасних пологів / / Вісник Російської асоціації акушерів гінекологів. -1996. - № 1.
30. Крайнєва Т.к, Морозова Ю.В, Єфремова Л.М, Шерер Л.А, Качаліна Дослідження специфічної оксидазної активності сироваткового церулоплазміну у вагітних жінок - випуск Том 51, випуск 6-нижегородський медичний журнал.
31.Орджонікідзе Н. В., Клименко П. А., Джівігелова Г. Д. та інших Нове в лікуванні вагітних з синдромом затримки розвитку плода / / Акушерство і гінекологія. -1996. - № 3.
32.Павловіч Л.Л. Патогенетичне обгрунтування пpименения w-3-поліненасичених жирного кислот пpи ускладненому перебігу беpеменності / / Акушерство і гінекологія. - 1998. - № 1.
33. Паращук Ю. С., Грищенко О. В., Лахно І. В., Шевченко О. І. Фетоплацентарна недостатність. Навчальний посібник. Харків: ХДМУ, 1999.
34. Радзинський В.Є., Смалько П.Я. Біохімія плацентарної недостатності. - М: Видавництво Російського університету дружби народів, 2001.
35. Савельєва Г.М., Федорова М.В., Клименко П.А., Січінава Л.Г. Плацентарна недостатність. - М.: Медицина, 1991. - 272 с.
36. Сидельникова В.М. Актуальні проблеми невиношування вагітності. М., 1999.
37. Тютюнник В. Л., вирує В. А., Зайдіева З. С. Морфофункціональний стан системи мати-плацента-плід при плацентарної недостатності та інфекції / / Акушерство і гінекологія. - 2003. - № 6.
38. Федорова М.В. Плацентарна недостатність. / / Акушерство і гінекологія, 1997.
39. Федорова М.В., Калашнікова Є.П. Плацента та її роль при вагітності. - М.: Медицина, 1986.
40. Шмагель К. В., Чеpешнев В. А. Плацентаpний лактоген: функції, клінічне значення / / Акушерство і гінекологія. - 2003. - № 3.
41. Арчаков А.И., Іпатова О.М., Прозорівська М.М. Харчування і здоров'я: біологічно активні добавки до їжі. М.: Медіа, 1996.
42. Алі-заде С.М., Кенгерелі Г.С. Ліпідний обмін, перекисне окислення ліпідів і антиоксидантна система при гестозі. Деп. рукопис. 1999.
43. Кулаков В.І., Мурашко Л.Є., вирує В.А. Клініко-біохімічні аспекти патогенезу гестозів. Акушерство і гінекологія 1995.
44. Аккер Л.В., Варшавський Б.Я. та ін Показники оксидантного та антиоксидантного статусу у вагітних з гестозом. Акушерство і гінекологія 2006.
45. Савельєва Г.М. Патогенетичне обгрунтування терапії та профілактики гестозів. Вісник акушерства і гінекології 1998.
46. Кущ І.Б. Структурні порушення еритроцитарних мембран і спосіб їх корекції у вагітних з гестозом. Автореф. дисс. ... Канд. мед. наук. М., 1988.
47. Коломійцева А.Г., Черненко Т.С. Ліпіди сироватки і мембрани еритроцитів у вагітних з пізнім гестозом. Акушерство і гінекологія 1986.
48. Омаров Н.С.-М. Лактаційна функція у породіль з гестозом і залізодефіцитною анемією. Автореф. дисс. ... Докт. мед. наук. Махачкала, 2000.
49. Далгатова С.В. Фактичне харчування жінок Дагестану, вплив на перебіг гестації, стан плода та новонародженого 1 року життя. М., 1999. 50. Тутельян В.А., Суханов Б.П. Біологічно активні добавки в харчуванні людини (оцінка безпеки, характеристика, застосування в профілактичній і клінічній медицині). Томськ: НТЛ, 1999.
2.2.4. Метод визначення активності церулоплазміну
Активність церулоплазміну визначали модифікованим методом Ревіна, який базується на окисленні p-фенілендіамін за участі цього ферменту. Ферментативну реакцію зупиняють додаванням фтористого натрію. За оптичної щільності виникають продуктів судять про концентрацію церулоплазміну.
У пробірки вносили по 0,1 мл гомогенату. У контрольну пробу додавали 2 мл розчину NaF (з метою інактивації ферментативної активності церулоплазміну). Потім в контроль і досвід додавали по 8 мл ацетатного буфера та по 1 мл р-фенілендіамін (використовуваного в якості субстрату). Пробірки струшували і инкубировали 1 годину при температурі, рівній +37 0 С.
Після інкубації в усі пробірки, за винятком контрольної, доливали по 2 мл розчину фтористого натрію. Вміст пробірок перемішували і переносили в холодильник, де витримували протягом 30 хвилин при +4 0 С.
Проби колоріметріровалі на КФК-2 при λ = 530 нм. Результати порівнювали з даними контрольної проби. Значення оптичної щільності множили на коефіцієнт перерахунку 875.
2.2.5. Метод визначення вмісту продуктів перекисного окислення ліпідів (дієнових і тріенових кон'югатів)
Для екстракції ліпідів брали 1 мл 25% гомогенату плацентарної тканини, доливали 3 мл метанолу, перемішували скляною паличкою, струшували протягом 15 хвилин, потім центрифугували при 3000 об / хв протягом 5 хвилин. Додавали 3 мл гексану, знову ретельно перемішували скляною паличкою, струшували протягом 15 хвилин і залишали відстоюватися на 30 хвилин.
Після поділу шарів, верхній (метанол - гексанової шар) відбирали в суху пробірку і використовували для досліджень.
Рівень дієнових кон'югатів визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 233 нм, кетодіенов і зв'язаних тріенов - 278 нм, ненасичених ліпідів - 220 нм. Розраховували содержанімое дієнових кон'югатів, кетодіенов і зв'язаних тріенов по відношенню до рівня ненасичених ліпідів (E 233 / E 220 і Е 278 / Е 220).
2.2.6. Метод визначення вмісту гідроперекисів
Для приготування гомогенату використовували буфер 0,025 н трис-HCl (pH 7,4), що містить 0,175 м KCl. У центрифужні пробірки поміщали по 2 мл 25% гомогенату і брали в облогу білки додаванням 0,2 мл 50% розчину Тху.
Утворений осад відокремлювали центрифугуванням протягом 10 хвилин при 4000 об / хв. Далі 2 мл надосадової рідини доводили 96% етанолом до 27 мл, додавали 0,2 мл концентрованої соляної кислоти і 0,025 мл 5%-го розчину солі Мора в 3%-ної HCl, проби інтенсивно струшували. Через 30 секунд доливали 1 мл 20%-го розчину роданистого калію, після чого розвивається малинова забарвлення. В якості контролю використовували проби, що містять 96%-ний етанол замість надосадової рідини. Вимірювання оптичної щільності проводили протягом 10 хвилин після додавання роданистого калію при λ = 480 нм.
2.2.7. Статистична обробка результатів дослідження
Достовірність відмінностей між середніми визначали з використанням t-критерію Стьюдента. Кореляційний аналіз проводили за допомогою програми Статистика (версія 6.0).
РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ І ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
3.1. Активність катепсину D в плацентарної тканини в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода
Результати дослідження показали достовірне підвищення активності катепсину D плацентарної тканини при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода. Відзначено підвищення активності ферменту при патології в 1,8 разів у порівнянні з нормою (рис.2).
Рис.2. Активність катепсину D в плаценті в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода (нмоль продукту, що утворився за 1 хв інкубації на 1 мг білка; * - р <0,05; ** - р <0,01; *** - р < 0,001 відносно норми)
Підвищення активності катепсину D плацентарної тканини при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду може бути пов'язане з порушенням структурно-функціональних властивостей клітинних мембран плаценти при досліджуваної патології.
3.2. Кількість пептидів середньої молекулярної маси в плацентарної тканини в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода
Згідно з результатами дослідження при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду зміст пептидів середньої молекулярної маси в плацентарної тканини підвищувався в 1,86 рази по відношенню до норми (рис. 3).
Рис. 3. Зміст пептидів середньої молекулярної маси в плаценті в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода (мкг / мл; * - р <0,05; ** - р <0,01; *** - р <0,001 відносно норми)
Підвищення змісту пептидів середньої молекулярної маси може бути пов'язано з підвищенням активності катепсину D [14].
3.3. Активність каталази в плацентарної тканини в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода
Результати дослідження показали достовірне зниження активності каталази в плацентарної тканини при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду в 1,46 рази по відношенню до норми (рис. 4).
Рис. 4. Активність каталази в плаценті в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода (каталазної число; * - р <0,05; ** - р <0,01; *** - р <0,001 відносно норми)
3.4. Активність церулоплазміну в плацентарної тканини в нормі
і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода
Згідно з результатами дослідження при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода активність церулоплазміну в плацентарної тканини знижувалася в 1,49 рази по відношенню до норми (рис. 5).
Рис. 5. Активність церулоплазміну в плаценті в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода (одиниці; * - р <0,05; ** - р <0,01; *** - р <0,001 відносно норми)
Ймовірно, зниження активності каталази і церулоплазміну в плацентарної тканини при ХВГП пов'язано з пригніченням антиоксидантної системи [31].
3.5. Активність дієнових кон'югатів в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду в плацентарної тканини
Згідно з результатами дослідження при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода активність дієнових кон'югатів в плацентарної тканини знижувалася в 1,6 рази по відношенню до норми (рис. 6).
Рис. 6. Активність дієнових кон'югатів в плаценті в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода (одиниці; * - р <0,05; ** - р <0,01; *** - р <0,001 відносно норми)
3.6. Активність тріенових кон'югатів в плаценті в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода
Згідно з результатами дослідження при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода активність тріенових кон'югатів в плацентарної тканини знижувалася в 2,1 рази по відношенню до норми (рис. 7).
Рис. 7. Активність тріенових кон'югатів в плацентарної тканини в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода (одиниці; * - р <0,05; ** - р <0,01; *** - р <0,001 відносно норми)
Пониження вмісту дієнових і тріенових кон'югатів може бути пов'язано з посиленням активності низькомолекулярних антиоксидантів - токоферолу і ретинолу, зміст яких підвищений у плацентарної тканини при досліджуваної патології [6].
3.7. Концентрація гідроперекисів у плацентарної тканини в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода
Згідно з результатами дослідження при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плода концентрація гідроперекисів у плацентарної тканини підвищувалася в 1,25 рази по відношенню до норми (рис. 8).
Рис. 8. Концентрація гідроперекисів у плацентарної тканини в нормі і при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду в плацентарної тканини (одиниці; * - р <0,05; ** - р <0,01; *** - р <0,001 відносно норми)
Підвищення вмісту гідроперекисів у плацентарної тканини при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду, швидше за все, є результатом посилення перекисного окислення ліпідів на фоні зниженої антиоксидантної активності.
Плацента - основний орган, який здійснює анатомо-фізіологічну зв'язок між матір'ю і плодом і забезпечує гомеостаз у фетоплацентарному комплексі. Різні патологічні стани материнського організму призводять до порушень компенсаторно-пристосувальних механізмів і, відповідно, до різних форм плацентарної недостатності. Порушення транспортної, трофічної, ендокринної та метаболічної функцій плаценти є причиною таких патологій, як гіпоксія, гіпотрофія та внутрішньоутробна затримка розвитку плода [46]. Тривале або повторне вплив пошкоджуючих чинників призводить до надмірної активації діяльності плаценти і напрузі всіх компенсаторних механізмів. Напруга в подальшому змінюється стадією гноблення, яка характеризується дезорганізацією основних функцій і розвитком незворотних деструктивних процесів у плаценті [4], що викликає інтерес до вивчення активності катепсинів в даному органі при фізіологічному і ускладненому перебігу вагітності [16, 38].
Результати дослідження показали достовірне підвищення активності катепсину D в плацентарної тканини при ХВГП.
У патогенезі ХВГП одне з провідних місць займає порушення структурно-функціональних властивостей клітинних мембран плаценти. При патологічному перебігу вагітності посилюється перекисне окислення ліпідів на тлі зниження антиоксидантної активності [4].
Згідно з результатами дослідження при ХВГП в плацентарної тканини відзначено достовірне зменшення активності каталази і церулоплазміну в порівнянні з нормою. Ймовірно, в умовах патологічного перебігу вагітності ферментативне ланка антиоксидантної системи пригнічується і накопліваются токсичні продукти перекисного окислення. Передбачається, що це впливає на активність ферменту, так як виявлена позитивна кореляційна взаємозв'язок (КК = 0,89 **) між активностями церулоплазміну, каталази і катепсину D в плацентарної тканини.
Порушення в системі ПОЛ та АОА є одним з механізмів формування антиоксидантної недостатності внаслідок надмірного посилення ПОЛ. У результаті активації перекисного окислення ліпідів та накопичення вільних радикалів відбувається порушення структурно-функціональної цілісності клітинних мембран, у тому числі і лізосомальних. Ці процеси призводять до виходу кислих гідролаз в цитозоль. У результаті спостерігається посилення процесів аутолізу і дезорганізація практично всіх сторін метаболізму. Неконтрольоване наростання протеолізу викликає інактивацію ферментів і пептидних гормонів, змінює їх функціональну роль [2, 3, 33].
Крім того, виявлено достовірне зниження рівня дієнових і тріенових кон'югатів в плацентарної тканини при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду в порівнянні з нормою.
Це може бути пов'язано з підвищенням активності низькомолекулярних антиоксидантів (ретинолу та токоферрола), зміст яких підвищується в плацентарної тканини [6]. Враховуючи позитивні кореляційні взаємозв'язки (КК = 0,95 **) рівня дієнових і тріенових кон'югатів з активністю катепсину D, збільшення антиоксидантного захисту можна розцінювати як компенсаторно-пристосувальних реакцій в умовах хронічної внутрішньоутробної гіпоксії плоду.
У розвитку ХВГП важливу роль відіграє дисфункція ендотелію судин фетоплацентарного комплексу. Остання характеризується зниженням вироблення ендотелієм вазодилататорів, це викликає спазм судин, порушення мікроциркуляції, в результаті чого розвиваються локальні ішемічні зміни в плаценті. Дані процеси ведуть до активації ПОЛ, утворення токсичних радикалів (гідроперекисів ліпідів, дієнових і тріенових кон'югатів). При цьому знижена ферментативна антиоксидантний захист (зменшення активності каталази і церулоплазміну в плацентарної тканини). Все вище перераховане сприяє порушенню структурно-функціональних властивостей клітинних мембран. Необхідно зазначити, що згідно з літературними даними [2, 3, 6], спостерігається активація ланки антиоксидантної системи - токоферолу і ретинолу, які, можливо, і сприяють зниженню рівнів дієнових і тріенових кон'югатів у плацентарної тканини.
Будь-яка патологія є стресом для фетоплацентарної системи. Відзначено підвищення рівня КТРФ в плацентарної тканини при патологічному перебігу вагітності [8]. Відомо, що КТРФ знижує рівень гонадотропінів [8, 13]. Ймовірно, тому спостерігається зменшення рівня ХГЛ, що веде до пригнічення синтезу прогестерону та естрогенів [20, 32, 48].
Рівні інгібіторів протеолізу a 2 - макроглобуліну і a 1 - антитрипсину регулюються гонадотропними гормонами, естрогенами, прогестероном [8, 20, 32]. Зниження концентрації естрогенів і прогестерону в фетоплацентарному комплексі при ХВГП тягне за собою зменшення активності інгібіторів протеаз, в результаті чого спостерігається неконтрольоване наростання процесів внутрішньоклітинного протеолізу в плаценті за участю катепсинів.
Також було відзначено достовірне підвищення вмісту пептидів середньої молекулярної маси.
Активація внутрішньоклітинного протеолізу призводить до збільшення продуктів протеолізу - молекул малої і середньої маси. До числа останніх відносять пептиди ендогенного походження, молекулярна маса яких становить 300-5000 дальтон. Вони утворюються у процесі протеолізу в ушкоджених клітинах при виході лізосомальних протеолітичних ферментів в цитоплазму. Підвищене утворення пептидів середньої молекулярної маси виявляється як при вагітності, так і при її ускладненнях. Істотна особливість пептидів середньої молекулярної маси полягає в їх чітко вираженої високої біологічної активності. Накопичення середньомолекулярних пептидів призводить до розвитку синдрому ендогенної інтоксикації [17].
Токсичні продукти ендогенної природи надають шкідливу дію на судинну систему, погіршують і без того недостатній кровообіг. Це ускладнює перебіг патологічного процесу, роблячи негативний вплив на життєдіяльність всіх систем і органів.
Кореляційна взаємозв'язок (КК = 0,77 **) між активністю катепсина D і змістом пептидів середньої молекулярної маси в плаценті при ХВГП, ймовірно, свідчить про погано функціонуючої системі антіпротеоліза.
Таким чином, катепсин D грає важливу роль в патогенезі ХВГП. Останні супроводжуються змінами з боку регуляторних механізмів, що контролюють діяльність пептид-гідролаз плаценти. Ймовірно, представлені результати можуть бути основою для подальшого дослідження гомеостазу фетоплацентарної системи і вишукування способів корекції метаболічних змін у плаценті при патологічному перебігу вагітності.
ВИСНОВКИ
1. Виявлено підвищення активності катепсину D в плацентарної тканини при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду в порівнянні з нормою.
2. Встановлено збільшення вмісту пептидів середньої молекулярної маси в плаценті при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду по відношенню до норми.
3. Виявлено зниження активності каталази і церулоплазміну в плаценті при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду в порівнянні з нормою.
4. Встановлено зменшення вмісту дієнових і тріенових кон'югатів у плацентарної тканини при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду по відношенню до норми.
5. Виявлено підвищення концентрації гідроперекисів у плацентарної тканини при хронічній внутрішньоутробній гіпоксії плоду в порівнянні з нормою.
6. Катепсин D бере участь у патогенезі хронічної внутрішньоутробної гіпоксії плоду.
ЛІТЕРАТУРА
1. Анастасьева В.Г. Морфофункціональні порушення фето-плацентарного комплексу при плацентарної недостатності. - Новосибірськ, 1997.
2. Аржанова О.Н., Кошелева Н.Г., Ковальова Т.Г., Громико Г.Л., Тишкевич О.В. Плацентарна недостатність: діагностика та лікування / / Навчальний посібник. Під редакцією Е.К. Айламазяна. - СПб: издат НОРМЕД, 2000.
3. Афанасьєва Н.В., Стрижаков А.Н. Результати вагітності та пологів при фетоплацентарної недостатності різного ступеня тяжкості / / Питання гінекології, акушерства та перинатології. - 2007. - Т. 3, № 2
4.Бичков В.І., Образцова Є.Є., Шамарін С.В. Діагностика та лікування хронічної фетоплацентарної недостатності / / Акушерство і гінекологія. - 1999. - № 6.
5. Ашмарин І.П., Каразеева Є.П. Нейропептиди / / в кн. «Нейрохімія» під ред. Ашмаріна І.П., Стукалова П.В. - М.: Видавництво інституту біомедичної хімії РАМН, 2006.
6.Д.Б.Юренева. Відділення гінекологічної ендокринології Наукового центру акушерства, гінекології та перинатології РАМН, Москва. «Постоваріектоміческій синдром» / / Гінекологія № 1, 2004.
7. О. Р. Григорян. ГУ Ендокринологічний науковий центр РАМН, Москва. «Сучасні принципи корекції метаболічного синдрому у жінок в період постменопаузи» / / Consilium medicum № 9, 2005.
8. І. В. Кузнєцова. Кафедра акушерства і гінекології РМАПО, Москва. «Замісна гормональна терапія» / / Consilium medicum № 9, 2005.
9.Вовчук К.Л., Чернадчук С.С. Активність тканинних катепсин-В-подібних протеїназ у жінок з онкопатологією тіла матки / / Укр. биохим. журн. - 2004. - Т. 76, № 2.
10. Запорожан В.М., Хаіт О.В., Низова Н.М., Скрипник М.М., Рихлецкій В.М. Зміна показників імунної та протеазной-інгібіторної систем при фізіологічній вагітності / / Акушерство і гінекологія. - 1992. - № 8-1
11. Айламазян Е.К. Антиоксиданти в комплексній терапії пізнього токсикозу і пов'язаної з ним хронічної гіпоксії плода / / Акушерство і гінекологія.-1991. - № 3.
12.Бандік В. П., Чернокульскій С.Т, Яроцький М. Є., Венцковский Б. М. Ультраструктурні особливості мікросудинного русла термінальних ворсин хоріона і плацентарний бар'єр при пізніх токсикозах вагітності / / ПАГ .- 1994 .- № 2.
13. Болдирєв А.А., Введення в біохімію мембран. - М.: Наука, 1998.
14. Бурле В. А. Вільно-радикальне окислення в системі мати-плацента-плід при акушерській патології / / Автореф. дис .... д-ра мед. наук .- М., 1992.
15. Бурмістров С.О., Опаріна Т.І., Прокопенко В.М., Арутюнян А.В. Показники процесу деградації білків і антиокислювальної системи при нормальній вагітності / / Акушерство і гінекологія. - 2001 - № 6
16. Бичков В.І., Образцова Є.Є., Шамарін С.В. Діагностика та лікування хронічної фетоплацентарної недостатності / / Акушерство і гінекологія. - 1999. - № 6.
17. Ветров В.В., Леванович В.В. Роль молекул середньої маси в патогенезі пізнього токсикозу вагітних / / Акушерство і гінекологія. - 1990. - № 6.
18. Владимиров Ю. А., Арчаков А. І. Перекисне окислення ліпідів у біологічних мембранах .- М., 1992.
19. Возовик А.В. Корекція фетоплацентарної недостатності у вагітних з нетоксичним вузловим зобом. / / Матеріали V Російського Форуму «Мати і Дитя». - Москва, 2003.
20.Воскресенскій О. М. Біофізичні і фізико-хімічні дослідження в вітамінології / / Москва, 1981.
21.Гомазков О.А. Пептиди в кардіології. - М: Материк Альфа, 2000.
22. Грищенко В. І., Щербина Н. А. Удосконалення діагностики і терапії перинатальної патології / / Акушерство і гінекологія. -1990 - № 10
23. Грищенко В. І. Сучасні методи діагностики та лікування пізнього токсикозу вагітних. / / М., Медицина, 1977.
24. Громико Г.Л., Шпаков А.О. Сучасні уявлення про механізми регуляції кровообігу в плаценті при фізіологічній і ускладненій вагітності / / Вісник Російської асоціації акушерів-гінекологів. - 1995. - № 4.
25. Губський Ю. І., Сільченко І. А., Селезньова О. І. Роль антиоксидантних вітамінів в обмеженні токсинів. / / В кн.: Біофізичні і фізико-хімічні дослідження в вітамінології .- М.: Наука, 1981.
26.Демідовіч Є.О., Ігнатко І.В. Особливості плодового ниркового кровотоку при фетоплацентарної недостатності. / / Матеріали V Російського Форуму «Мати і Дитя», Москва. - 2003.
27.Дмітріев Л. Ф., Давлетіна Л. М., Іванов І. І. Взаємозв окисного фосфорилювання і перекисного окислення ліпідів / / Біологічні мембрани - 1985 .- Т.2, № 8.
28.Омакін М.С., Арцимович Н.Г. Біологічно активні речовини, асоційовані з плацентою / / Акушерство і гінекологія. - 1991. - № 9.
29. Кошелева Н.Г., Аржанова О.Н., Громико Г.Л. та співавт. Нові підходи до лікування загрозливих передчасних пологів / / Вісник Російської асоціації акушерів гінекологів. -1996. - № 1.
30. Крайнєва Т.к, Морозова Ю.В, Єфремова Л.М, Шерер Л.А, Качаліна Дослідження специфічної оксидазної активності сироваткового церулоплазміну у вагітних жінок - випуск Том 51, випуск 6-нижегородський медичний журнал.
31.Орджонікідзе Н. В., Клименко П. А., Джівігелова Г. Д. та інших Нове в лікуванні вагітних з синдромом затримки розвитку плода / / Акушерство і гінекологія. -1996. - № 3.
32.Павловіч Л.Л. Патогенетичне обгрунтування пpименения w-3-поліненасичених жирного кислот пpи ускладненому перебігу беpеменності / / Акушерство і гінекологія. - 1998. - № 1.
33. Паращук Ю. С., Грищенко О. В., Лахно І. В., Шевченко О. І. Фетоплацентарна недостатність. Навчальний посібник. Харків: ХДМУ, 1999.
34. Радзинський В.Є., Смалько П.Я. Біохімія плацентарної недостатності. - М: Видавництво Російського університету дружби народів, 2001.
35. Савельєва Г.М., Федорова М.В., Клименко П.А., Січінава Л.Г. Плацентарна недостатність. - М.: Медицина, 1991. - 272 с.
36. Сидельникова В.М. Актуальні проблеми невиношування вагітності. М., 1999.
37. Тютюнник В. Л., вирує В. А., Зайдіева З. С. Морфофункціональний стан системи мати-плацента-плід при плацентарної недостатності та інфекції / / Акушерство і гінекологія. - 2003. - № 6.
38. Федорова М.В. Плацентарна недостатність. / / Акушерство і гінекологія, 1997.
39. Федорова М.В., Калашнікова Є.П. Плацента та її роль при вагітності. - М.: Медицина, 1986.
40. Шмагель К. В., Чеpешнев В. А. Плацентаpний лактоген: функції, клінічне значення / / Акушерство і гінекологія. - 2003. - № 3.
41. Арчаков А.И., Іпатова О.М., Прозорівська М.М. Харчування і здоров'я: біологічно активні добавки до їжі. М.: Медіа, 1996.
42. Алі-заде С.М., Кенгерелі Г.С. Ліпідний обмін, перекисне окислення ліпідів і антиоксидантна система при гестозі. Деп. рукопис. 1999.
43. Кулаков В.І., Мурашко Л.Є., вирує В.А. Клініко-біохімічні аспекти патогенезу гестозів. Акушерство і гінекологія 1995.
44. Аккер Л.В., Варшавський Б.Я. та ін Показники оксидантного та антиоксидантного статусу у вагітних з гестозом. Акушерство і гінекологія 2006.
45. Савельєва Г.М. Патогенетичне обгрунтування терапії та профілактики гестозів. Вісник акушерства і гінекології 1998.
46. Кущ І.Б. Структурні порушення еритроцитарних мембран і спосіб їх корекції у вагітних з гестозом. Автореф. дисс. ... Канд. мед. наук. М., 1988.
47. Коломійцева А.Г., Черненко Т.С. Ліпіди сироватки і мембрани еритроцитів у вагітних з пізнім гестозом. Акушерство і гінекологія 1986.
48. Омаров Н.С.-М. Лактаційна функція у породіль з гестозом і залізодефіцитною анемією. Автореф. дисс. ... Докт. мед. наук. Махачкала, 2000.
49. Далгатова С.В. Фактичне харчування жінок Дагестану, вплив на перебіг гестації, стан плода та новонародженого 1 року життя. М., 1999. 50. Тутельян В.А., Суханов Б.П. Біологічно активні добавки в харчуванні людини (оцінка безпеки, характеристика, застосування в профілактичній і клінічній медицині). Томськ: НТЛ, 1999.