МІНІСТЕРСТВО АГЕНСТВО ДО ОСВІТИ
Сибірський федеральний університет
Інститут фундаментальної біології та біотехнології
Кафедра біохімії та фізіології людини і тварин
О.А. Голубєв
Студент 3 курсу
Антиоксидантна система плазми крові в нормі і при патології
(Курсова робота)
Наукові керівники:
канд. біол. наук
Тітова Н.М. ____________
док. мед. наук
Черданцев Д.В.____________
Красноярськ 2008

Зміст
Глава 1. Огляд літератури .. 5
1.1. Активні форми кисню і оксидативна модифікація макромолекул: користь, шкоду і захист. 5
1.2. Характеристика антиоксидантної системи організму. 7
1.2.1. Неферментативне антиоксидантна система ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 8
1.2.2. Ферментативна антиоксидантна система ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
1.3. Антиоксиданти плазми крові. 17
Глава 2. Матеріали та методи .. 21
2.1. Об'єкт дослідження. 21
2.2. Методика визначення церулоплазміну ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .21
2.3 Статистична обробка результатів. 22
Глава 3. Результати досліджень та їх обговорення ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 23
ВИСНОВКИ .. 25
ЛІТЕРАТУРА .. 26
Додаток. 28

Введення
Людина в спокої вдихає близько 280 мл О2 / хв, або не менше 400 л / добу, що відповідає 18 молям О2. Основна кількість О2 (95-98%) витрачається на вироблення енергії та окислювальний катаболізм субстратів. Відносно невелика частина (2-5%) переходить в активні форми кисню (АФК) [1, 2] і потім частково використовується для оксидативний модифікації (ОМ) макромолекул. Це означає, що в АФК переходить ~ 0,4-0,9 благаючи О2. При відсутності метаболізму середня концентрація АФК в організмі досягла б 6 - 14 мМ . Однак реальний рівень в тканинах дорівнює 10 - 8 М , Тобто в 106 разів менше [2].
Виникають питання: 1) яке значення мають АФК і ОМ макромолекул - це просто витік з головного шляху використання О2 або важливі процеси, але тоді вони корисні чи шкідливі; 2) як здійснюється потужний метаболізм АФК і активних окислених молекул і чому це потрібно?
Метою даної роботи було вивчення зміни активності церулоплазміну плазми крові у хворих ендемічним зобом для з'ясування можливого взаємозв'язку антиоксидантного функції даного ензиму з хворобою.
До завдань роботи входило:
1) аналіз літератури по досліджуваному питанню;
2) відпрацювання методики визначення вмісту церулоплазміну;
3) вивчення вмісту церулоплазміну в плазмі крові людей, хворих ендемічним зобом.
Дана робота виконувалася на базі кафедри біохімії та фізіології людини і тварин Інституту фундаментальної біології та біотехнології Сибірського федерального університету та кафедри хірургічних хвороб № 2 з курсом серцево-судинної хірургії ім. А.М. Дихне Красноярської державної медичної академії і є частиною комплексних досліджень стану АОС в нормі і при різних патологічних станах.

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

1.1. Активні форми кисню і оксидативна модифікація макромолекул: користь, шкоду і захист

Крім повного четирехелектронного відновлення молекули О2 до води в дихальному ланцюзі мітохондрій в аеробних клітинах завжди відбувається і неповне - одно-трехелектронное відновлення з послідовним утворенням різних АФК, до яких відносяться вільний радикал-аніон супероксид, перекис водню Н2О2 і найбільш активний радикал - гідроксил НОJ ( реакції (1)): Донорами електрона можуть бути Fe2 +, Сu + або семіхінони, а для другої і третьої реакцій - також і:

H2O2 + Fe2 + HO-+ HOJ + Fe3 +
Термін «АФК» ширше, ніж «вільні радикали кисню» (НОJ), так як крім останніх включає також молекули Н2О2, синглетний кисень О2, озон О3 і гіпохлорит HOCl.
АФК генеруються у всіх частинах клітини. Найбільший внесок вносить дихальна ланцюг мітохондрій, особливо при низькій концентрації АДФ. Важлива роль і системи цитохрому Р-450, локалізованої в ендоплазматичної мережі. Беруть участь ядерна мембрана та інші частини клітини, при цьому АФК часто виникають не лише спонтанно, але і ферментативно (НАДФН-оксидаза дихального вибуху в плазматичної мембрани і ксантиноксидаза в гіалоплазми). Концентрації АФК в тканинах невисокі: Н2О2 - 10 - 8 М , - 10 - 11 М , НОJ <10 - 11 М . АФК викликають утворення органічних гідропероксидів ROOH - ДНК, білків, ліпідів, а також малих молекул [1, 3]. ROOH утворюються і в реакції з звичайним молекулярним О2 за участю ферментів диоксигеназа (реакція (4)) або циклооксигеназ:
RH + O2 ROOH
ROOH за своєю структурою подібні Н2О2 (RO-OH і Н-О-О-Н) і хімічно теж активні, при подальшому метаболізмі вони переходять в спирти, альдегіди, епоксиди та інші окислені сполуки. Освіта ROOH називають перекисного окислення (пероксидацію), а сукупність описаних реакцій (рис. 1) тепер іменують ОМ молекул.
АФК викликають у ліпідах (L), в основному в залишках поліненасичених жирних кислот, ланцюгові реакції з накопиченням ліпідних радикалів LJ, пероксілов LOOJ, гідропероксидів LOOH і алкоксілов LOJ:
Перші три реакції - це ініціація і продовження ланцюга, а реакція LOOH c Fe2 + створює її розгалуження. Далі утворюються дієнові кон'югати, а потім мінорні метаболіти: малоновий діальдегід, етан, пентан та ін [1, 3]. Протягом багатьох років перекисне окислення ліпідів (ПОЛ) вважали переважно спонтанним (неферментативних) і неспецифічним самоускоряющімся процесом і йому надавали провідне значення в ОМ та її наслідки. Проте потім стало ясно, що: 1) величезне значення мають і ферментативні реакції типу (4), каталізуються ліпоксигенази [4] і циклооксигенази - першими ферментами шляхів, що призводять до утворення специфічних регуляторів - ейкозаноїдів [5-7], 2) в організмі головними продуктами ПОЛ є 4-гідроксіалкеналі типу С5Н9-СНОН-СН = СН-СНТ, тобто знову специфічні речовини; 3) велике значення має ОМ та інших макромолекул - ДНК і білків, посилено вивчається в 90-ті роки [8, 9].
АФК викликають ОМ нуклеотидів і нуклеїнових кислот, особливо ДНК. Це призводить до гідропероксиду ROOH (так, з _емма_ утворюється 5-СН2ООН-урацил), а потім до гідроксипохідних ROH або R (OH) 2, основними з яких є 8-ОН-2'-дезоксигуанозина і тімінгліколь (їх визначення в тканинах і сечі використовують як індекси ОМ ДНК) [8]. ОМ білків також викликає утворення в організмі ROOH, а потім ROH (o-і m-тирозину), R (OH) 2 (ДОФА), карбонилов та інших окислених похідних; утворюються і димери (дитирозина); відбувається також аутооксідатівное глікозилювання білків [9 ].

1.2. ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИОКСИДАНТНОГО СИСТЕМИ ОРГАНІЗМУ

Антиоксидантна система (АОС) включає:
1. Ензиматичні перехоплювачі, такі як супероксиддисмутазу (СОД), дісмутірующую О2-до Н2О2, каталазу і глутатіонпероксидази (ГПО), які конвертують Н2О2 до води. ГПО і глутатіон-S-трансфераза (ГSТ) беруть участь у детоксикації гідропероксидів жирних кислот;
2. Гідрофільні скевенджери радикалів - відновлений глутатіон (ГSН), аскорбат, урат, тіоли (цистеїн, ерготіонеін);
3. Ліпофільні перехоплювачі радикалів - токофероли, флавоноїди, каротиноїди, убіхінон, білірубін.;
4. Ферменти, що здійснюють відновлення окислених низькомолекулярних біоантіоксідантов (глутатіонредуктаза) або беруть участь у підтримці у функціонально активному стані білкових тіолів (тіоредоксінредуктаза);
5. Ферменти, які беруть участь у підтриманні внутрішньоклітинного стаціонарного рівня відновлювальних еквівалентів (глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа, що каталізує утворення НАДФН у пентозофосфатному шляху окислення глюкози);
6. Антиоксидантні білки (церулоплазмін, альбумін, феритин, трансферин, лактоферин та ін), які беруть участь у зберіганні, транспорті або знешкодженні іонів металів змінної валентності.
Клітинна АОС представлена ​​сімейством супероксиддисмутази, глутатіонпероксидази та глутатіон-S-трансфераз, а також глутатіонредуктази, знайдених в цитоплазмі, мітохондріях і ядрі. Каталаза локалізована в пероксисомах і цитоплазмі, а в такій високодиференційований та спеціалізованої клітці, як еритроцит, існує в розчинній (в цитоплазмі) і мембранозв'язаних формах.
Склад нізомолекулярних антиоксидантів досить великий: відновлений глутатіон і аскорбінова кислота перебувають у водній фазі клітини, захищаючи компоненти цитозолю і матриксу мітохондрій, токофероли і каротиноїди - плазматичну і внутрішньоклітинні мембрани.
АФК постійно генеруються у водній фазі плазми крові та інших біологічних рідин. О2-і Н2О2 можуть утворюватися ферментами активованих фагоцитуючих клітин, в продукцію О2-залучений і судинний енодотелій. Активовані нейтрофіли, крім того, за участю мієлопероксидази генерують позаклітинний гіпохлорит [].
1.2.1. Неферментативне антиоксидантна система
В якості компонентів неферментативної АОС можуть виступати низькомолекулярні речовини, що мають високу константу швидкості взаємодії з АФК.
Неферментативне АОС включає різні за хімічною будовою і властивостями з'єднання: водорозчинні - глутатіон, аскорбат, цистеїн, ерготіонеін, і гідрофобні - a-токоферол, вітамін А, каротиноїди, убіхінон, вітаміни групи К, які знижують швидкість утворення вільних радикалів і зменшують концентрацію продуктів реакцій , що протікають за участю радикалів [Гуськов, Кенія, Лукаш, 1993].
Основна спрямованість дії низькомолекулярних АТ пов'язана із захистом білків, нуклеїнових кислот, полісахаридів, а також біомембран від окислювального руйнування при вільнорадикальної процесах. Важливе значення низькомолекулярні АТ набувають в умовах окислювального стресу, коли ферментативна АОС виявляється менш ефективною у порівнянні з їх протекторний дією. Причини цього - швидка інактивація конститутивного пулу ферментів вільними радикалами і значний час, необхідне для індукції їх синтезу [Зенков, Меньщикова, Шергін, 1993].
Гідрофобні (ліпідні) антиоксиданти
У ліпідах містяться природні антиоксиданти (АТ), які суттєво впливають на швидкість реакції обриву ланцюгів окиснення. До гідрофобним АТ фенольного типу відносяться три групи речовин: токофероли, убіхінон і вітаміни групи К. Кожне з цих речовин утворює групу структурно-споріднених зв'язків, що включають хінони, хінол, хроманоли і хроменоли [Смирнов, 1974; Рочінскій, 1988]. У ліпідному бішарі мембран ці форми можуть переходити одна в іншу. Кожна група природних АТ присутня в ліпідах переважно в одній, найбільш стабільною для даних сполук формі: вітаміни групи К перебувають у вигляді хінонів, токофероли знаходяться в ліпідах, в основному, в циклічній формі 6-оксіхроманов як у вигляді вільного токоферолу, так і у вигляді його ефірів, для убіхінон найбільш стійкою є хінону форма. Гідрохінону форма убіхінон задоволена нестабільна і окислюється киснем повітря, проте в клітинах до 70% убихинона може знаходиться у відновленій формі. Більш стабільними є циклічні форми - убіхроменоли, що не беруть участь в процесі переносу електрона по дихальному ланцюгу. Припускають, що ця форма виконує в ліпідах роль АТ.
Характерною особливістю вищеназваних сполук є наявність в їх структурі бічних аліфатичних заступників, які складаються з декількох изопреноидной ланок, що розрізняються ступенем ненасиченості [Бурлакова, Крашаков, Храпова, 1998].
До складу природних АТ, що містяться в ліпідах, входять відновлені фенольні форми, активно реагують з пероксирадикалами ліпідів (ROO ·) і окислені хінони форми, які взаємодіють з алкільними радикалами (R ·) [Бурлакова, Храпова, 1985]. Значним спорідненістю до пероксирадикалів мають вітаміни групи К і токоферол, константи швидкостей реакцій становлять 5,8 * 106 і 4,7 * 106 М-1с-1 відповідно. Убіхіноли і убіхроменоли в 10 разів менш активні, ніж токофероли [Бурлакова, Храпова, 1985]. Висока спорідненість природних АТ до пероксирадикалів обумовлено наявністю в їх молекулах лабільних гідроксильних груп, а довжина і ступінь ненасиченості бічних ланцюгів не робить істотного впливу.
Хінони легко реагують з алкільними радикалами ліпідів (R ·), частка яких у загальній кількості вільних радикалів при ПОЛ велика, по механізму:
R · + Q ® RQ ·; RQ · + R · ® RQR
і можуть ефективно гальмувати окислення.
Хінони та їх похідні здатні реагувати з АФК, зокрема, хінони здатні зв'язувати радикали супероксид-аніону, що беруть участь в ініціюванні ланцюгів вільнорадикального окислення ліпідів, з освіту семіхінонов. Разом з тим припускають, що убісеміхінони і убіхінон можуть, подібно менасеміхінону і менадіолу, реагувати з молекулярним киснем з утворенням супероксидних аніон-радикалів.
Один і той же АТ в залежності від концентрації може гальмувати або прискорювати окислення. Такі подвійні властивості по відношенню до окислення ліпідів були встановлені для токоферолів різної будови, вітаміну А і каротиноїдів, з'єднань групи убихинона, іонів заліза та аскорбінової кислоти [Бурлакова, Храпова; 1985; Бурлакова, Крашаков, Храпова; 1998, Капітанів, Піменов, 1993] .
У ліпідах біомембран завжди присутні кілька АТ, що змінюють швидкість окислення ліпідів. Між АТ може спостерігатися ефект синергізму. Аскорбінова кислота є синергістом по відношенню до токоферолу. Відновлюючи радикали токоферолу до активної фенольної форми, аскорбінова кислота збільшує ефективність дії токоферолу. Аналогічної здатністю регенерувати токофероксільние радикали володіють і убіхіноли. Окремі компоненти неферментативної АОС можуть доповнювати або підміняти один одного, здійснюючи інгібування на різній глибині окислення ліпідів [Бурлакова, Крашакова, Храпова, 1998].
Серед ліпідних мембранних АТ фенольного типу провідна роль належить токоферолу, оскільки саме вони перебувають у ліпідах в стійкій фенольної формі [Бурлакова, Храпова, 1985].
Реакція з пероксирадикалами ліпідів на стадії обриву ланцюга не є єдино можливим шляхом впливу токоферолу на швидкість ПОЛ. Токофероли ефективно взаємодіють з іншими АФК (О2 ·, · АЛЕ, НО2 ·, ROО ·), що виконують роль ініціаторів окислення. Виводячи зі сфери реакції АФК, токофероли тим самим знижують загальну швидкість окиснення за рахунок зменшення сумарної швидкості ініціювання. Токофероли є гасників синглетного кисню [Шинкарьов, 1986].
Вітамін Е представлений декількома гомологами (a-, b-, g-, d-токоферолами) з яких найбільшою антиоксидантну активність має a-токоферол [Айдарханов та ін, 1989]. Ефективність дії a-токоферолу, як природного аніоксіданта, обумовлена ​​його винятково високою антирадикальної активністю (константа швидкості його взаємодії з перекисних радикалами становить 3,1 ± 0,3 '106 л / моль с, що на 1 - 2 порядки вище відповідних констант швидкостей для багатьох відомих синтетичних і біоантіоксідантов) і стабілізацією ліпідного бішару мембран шляхом утворення міцних комплексів з поліеновие жирними ацил ліпідів [Бурлакова, Храпова, 1985; Козлов та ін, 1983]. a-Токоферолу взаємодіє з перекисних радикалами в якості донора водню: ROO · + a-Т-ОН ® ROOH + a-Т-О ·. Радикал токоферолу регенерується аскорбату.
Час напіврозпаду a-токоферолу, визначене за допомогою ізотопної мітки варіює від 5 днів в печінці та еритроцитах до 30 днів в клітинах головного мозку [Євстигнєєв, Волков, Чудінова, 1998].
До гідрофобним антиоксидантам також належать вітаміни групи А: А1 (ретинол), А2 і цис-форма вітаміну А1, що відрізняються додатковими подвійними зв'язками в кільці b-ионона. Всі з'єднання представляють собою циклічний неграничні одноатомний спирт, що складається з 6-членного кільця (b-ионон), двох залишків ізопрену та первинної спиртової групи. Всмоктування відбувається в кишечнику в присутність ліпідів. В організмі легко окислюються з утворенням цис-(сітківка ока) і транс-альдегідів (інші тканини); відкладаються про запас у печінки у формі більш стійких складних ефірів: ретінілпальмітат, ретінілацетат і ретінілфосфат. Відомі також попередники (провітаміни) вітаміну А - каротини. Розрізняють a-, b-і g-каротини. Найбільшою біологічною активністю володіє b-каротин, оскільки він містить два b-иононового кільця і ​​при розщепленні в кишечнику, і можливо в печінці, при участь b-каротин-діоксигенази, в присутність молекулярного О2, з нього утворюються дві молекули вітаміну А. Підвищений вміст b-каротину в харчовому раціоні і плазмі крові надає профілактичну дію щодо цілого ряду захворювань [Алімова, Аствацатурьян, 1975; Горобина, Калмикова, 1997; Хохлова, Кудріна, 1996; Хазанов, 1997]. Існує припущення, що завдяки наявності подвійних зв'язків в молекулі, вітамін А може брати участь в окислювально-відновних реакціях, оскільки він здатний утворювати перекиси, які в свою чергу збільшують активність АТ ферментів у клітині. Також передбачається участь вітаміну А у поділі та диференціювання клітин, обумовленого його дією на ініціацію реплікації; на зростання кісткової тканини - участь в синтезі хондроітінсульфата [Зенков, Меньщикова, 1993]. Невід'ємним є участь вітаміну А в фотохімічному акті зору.