Дослідження рівня цитокінів у хворих з гнійно-запальними захворюваннями

Різноманітні біологічні функції цитокінів поділяються на групи [Перцева Т.А., Конопкін Л.І. Інтерферони та їх індуктори / / Український хіміотерапевтічній журнал. - 2001. № 2. ]: - С. 62-67.]:

• вони управляють розвитком і гомеостазом імунної систем;

• здійснюють контроль за ростом і диференціюванням клітин крові (Системою гемопоезу);

• беруть участь у неспецифічних захисних реакціях організму, роблячи вплив на запальні процеси, згортання крові, кров'яний тиск;

• цитокіни беруть участь у регуляції росту, диференціювання і тривалості життя клітин, а також в управлінні апоптозом.

За структурою виділяють кілька різновидів молекул цитокінів, кожен з яких кодується власними генами. Складаються цитокіни з однієї - двох, рідше більше, поліпептидних (гомо-і гетерологічних) ланцюгів (мономери, димери, тримери), з молекулярною масою від 8 до 90 кДа, в основному 15-35 кДа. Переважна більшість з них у якості характерного структурного елементу містить 4 α-спіралі і лише для небагатьох (ІЛ-1, ФНП β, трансформуючий фактор росту) характерно переважання β-шаруватої структури.

1. Клітини-продуценти цитокінів

Можна виділити 3 відносно автономні групи клітин - продуцентів цитокінів (табл. 1). Це

• стромальні сполучнотканинні клітини, які виробляють цитокіни та відповідальні переважно за гемопоез;

• моноцити / макрофаги, які є продуцентами цитокінів - медіаторів запалення;

• лімфоцити, що виробляють лімфокіни, які забезпечують розвиток антигенспецифической складової імунної відповіді.

Таблиця 1.

Основні типи клітин - продуцентів цитокінів

Всі клітини-продуценти цитокінів характеризуються своїм власним типом відповіді на активуючі впливу і природою активаторів, а також власним, хоч і значно перекриваються набором продукованих ними цитокінів (табл. 1) і тими процесами, реалізацію яких вони забезпечують. [Paul WE, Seder RA Lymphocyte responses and cytokines Cell, 76, 241 - 251, 1994 Review]

У нормі рівень продукції цитокінів стромальних клітинах невисокий. Стимулами для вироблення цих цитокінів у відсутність ушкоджують або патогенних факторів служать, по-видимому, контакти з кровотворними клітинами. Бактеріальні продукти суттєво підсилюють вироблення зазначених цитокінів, причому це відбувається не тільки в кровотворних органах, але й в осередках агресії, що призводить до формування екстрамедулярних вогнищ кровотворення. В умовах активації аналогічну активність проявляють епітеліальні клітини шкіри і слизових оболонок.

Вироблення цитокінів (монокинов) клітину мієлоїдного-моноцитарного походження індукується головним чином під впливом бактеріальних продуктів. Викликати її можуть також багато метаболіти, самі цитокіни, пептидні фактори, поліелектроліти, а також контакти з оточуючими клітинами, процеси адгезії і фагоцитозу. Активація цитокінових генів відбувається в моноцитах і макрофагах в межах 1ч, і в найближчі години цитокін вже можна виявити в середовищі. Серед виділяються цими клітинами цитокінів переважають фактори, які беруть участь у розвитку запалення. Їх називають монокіні.

Третю групу клітин - продуцентів цитокінів (лімфокінів) складають лімфоцити. Практично всі різновиди лімфоцитів здатні виділяти цитокіни, проте «професійними» продуцентами їх є СD4 ^{+-клітини-хелпери.} Спочиваючі лімфоцити не продукують гуморальних факторів. Активація клітин здійснюється в результаті зв'язування антігенраспознающіх рецепторів і корецептора. Самий ранній з лімфокінів - ІЛ-2 - з'являється в цитоплазмі Т-клітин через 2 години після стимуляції; інші лімфокіни виробляються значно пізніше і в певній послідовності: ІЛ-4 через 4 години, ІЛ-10 через 6 години, ІЛ-9 через 24 години. Пік вироблення різних лімфокінів варіює: 12 год для ІЛ-2, 48 г для ІЛ-4 та 5, 72 год для ІЛ-9 та ІФН γ. Ця послідовність відображає процеси диференціювання Т-хелперів.

Цитокіни починають синтезуватися клітинами тільки при наявності чужорідного агента в організмі. Це сприяє розвитку імунної реакції, що охороняє сталість внутрішнього середовища організму від усього генетично чужорідного (рис. 1).

Рис. 1. Цитокіни, загальна схема дії

Після виділення клітинами-продуцентами цитокіни мають короткий період напіввиведення з крові. До 50% циркулюючих цитокінів інтерналізуется протягом 30 хвилин. Виведення катаболізірованних цитокінів з організму здійснюється печінкою та нирками. Секреція цитокінів - короткостроковий процес. Кодирующая цитокіни мРНК нестабільна, що в поєднанні з короткостроковою транскрипції генів цитокінів призводить до короткостроковості їх біосинтезу. [Кольман Я., Рем К. - Г., Наочна біохімія, видавництво «Світ», стр.378-379].

Говорячи про особливості цитокінів, потрібно враховувати наступне:

1. Один цитокін може продукуватися більш ніж одним типом клітин;

2. Одна клітина може продукувати більш ніж один цитокін;

3. Один цитокін може діяти на більш ніж один тип клітин;

4. Більш ніж один цитокін може індукувати однакову функцію у конкретно взятого типу клітин. [Дранник Г. Н. Клінічна імунологія та алергологія, МІА, Москва 2003р. С. 98-99.].

Володіючи широким спектром біологічної активності, вони визначають не тільки адекватний рівень імунної відповіді, але і регулюють взаємодії головних біологічних інтегративних систем організму - нервової, імунної та ендокринної.

Цитокіни взаємопов'язані і утворюють цілісну систему взаємодіючих елементів - цитокінового мережу.

1.1.2. Рецептори цитокінів та механізм дії цитокінів на клітину

Цитокіни діють

• аутокринно (тобто на клітину, яка їх продукує);

• паракринно (на клітини, розташовані поблизу, наприклад у вогнищі запалення або в лімфоїдному органі);

• ендокринно-дистанційно - на клітини будь-яких органів і тканин після попадання цитокіну в циркуляцію крові [Сімбірцев А.С. / / Цитокіни та запалення. 2002. № 1. С. 9-16.].

Освіта і вивільнення цих високоактивних молекул відбувається короткочасно і жорстко регулюється.

Одна частина цитокінів має плюрипотентні дією, тобто діє на різні клітини-мішені, інша - робить специфічний вплив на певні клітинні лінії. Вплив цитокінів на проліферацію та диференціювання клітин-мішеней підпорядковується певній послідовності; важливим також є концентрація та комбінація діючих цитокінів.

Цитокіни - гідрофільні сигнальні речовини, дія яких опосередковано специфічними високоафінними рецепторами на зовнішній стороні плазматичної мембрани, чутливих до цитокинам клітин.

Рецептори до цитокинам виділяють у 2 великих сімейства:

• сімейство-SWISS характеризується наявністю в складі молекул позаклітинних ділянок з гомологічною послідовністю довжиною приблизно в 200 амінокислотних залишків.

SWISSPROT: CRF4_HUMAN

SWISSPROT: CYRB_HUMAN

SWISSPROT: CYRG_HUMAN

SWISSPROT: FLT3_HUMAN

До цього суперсімейство відносяться рецептори до ІЛ-2, ІЛ-3, ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-6, ІЛ-7, ІЛ-9, ІЛ-12, гранулоцитарного колонієстимулюючого фактору (Г-КСФ) і гранулоцитарно-макрофагальної колонієстимулюючого фактору (ГМ-КСФ). У нього ж входять рецептори для гуморальних факторів (гормону росту і пролактину), що діють переважно поза імунної системи.

• сімейство-SITE об'єднує рецептори до всіх інтерферонів, а також рецептори до ІЛ-1 α, ІЛ-1β і макрофагальний колонієстимулюючий фактор (М-КСФ):

PROSITE: RECEPTOR_CYTOKINES_1

PROSITE: RECEPTOR_CYTOKINES_1

PROSITE: PROTEIN_KINASE_ATP

PROSITE: PROTEIN_KINASE_TYR

PROSITE: RECEPTOR_TYR_KIN_III

Існують загальні групові рецептори, що сприяють усуненню надлишку цитокінів в осередку ураження. [Becker S., Groner B. & Muller CW Three-dimentional structure of the Stat3b homodimer bound to DNA Nature, 394, 145 - 151, 1998]

Усі рецептори цитокінів представляють собою трансмембранні глікопротеїни, у яких позаклітинна частина відповідає за зв'язування цитокіна. Як правило, ці рецептори складаються більш ніж з однієї субодиниці, причому високоафінні зв'язування є наслідком взаємодії з різними субодиницями, кожна з яких сама здатна зв'язувати відповідний цитокін, але з більш низькою афінності. Нерідко на клітинах-мішенях цитокінів виявляються декілька типів центрів зв'язування, що розрізняються афінності до цитокіну. У складі клітинних мембран одні ланцюга реагують тільки з певним цитокіном, в той час як інші здатні формувати спільні рецептори для різних цитокінів. Наявність спільних структур в рецепторах може обумовлювати функціональне схожість ряду цитокінів. [Кольман Я., Рем К. - Г., Наочна біохімія, видавництво «Світ»]

Синтез рецепторів протікає більш інтенсивно і тривало, ніж синтез відповідних цитокінів, що обумовлює їх більш повну та швидку елімінацію з судинного русла і реалізацію біологічного ефекту в осередку ураження. Розчинна рецептор, що зв'язується з цитокіном, - це відщепленим ферментом позаклітинний домен мембранного рецептора. Розчинні рецептори зберігають високу афінність щодо своїх лігандів і завдяки цьому здатні нейтралізувати цитокіни, перешкоджаючи їхньому доступу до інтактним мембранним рецепторам; їх можна виявити в сироватці та сечі. Розчинні рецептори можуть виконувати функції конкуруючих антагоністів, а також брати участь в транспорті, доставці цитокінів у вогнище ураження і виведенні їх з організму.

Зв'язування цитокіну з відповідним рецептором забезпечує трансмембранне проведення сигналу в клітину, що, у свою чергу, забезпечує активацію цитоплазматичних ферментів і, зокрема, фосфорилювання тирозинкіназ.

Самі цитокінових рецептори не володіють тірозінкіназной активністю (за небагатьма винятками). Після зв'язування з цитокіном (1) (див. рис. 3) молекули рецептора асоціюють, утворюючи гомодимера. Крім того, вони можуть утворювати гетеродімери за рахунок асоціації з білками-переносниками сигналу [БПС (STP)] або стимулювати димеризації самих БПС (2). Цитокінової рецепторів класу I можуть агрегувати з трьома типами БПС: білками GP130, β _з або γ _с. Ці допоміжні білки самі не здатні зв'язувати цитокіни, але вони здійснюють передачу сигналу на тирозинкінази (3). Однакові спектри біологічної активності багатьох цитокінів пояснюються тим, що різні цитокіни-рецепторні комплекси можуть активувати одні і ті ж БПС. [Brisce J. et al. JAKs and STATs branch out Trends in Cell Biology, 6, 336 - 340, 1996]

Активація (фосфорилювання) тирозин / серинових кіназ призводить до запуску каскаду ферментативних процесів, в результаті яких у клітинах накопичуються фосфорильовані білки (рис. 2). Ці білки з цитоплазми надходять в ядро клітини і взаємодіють з певними генами в молекулі ДНК, активуючи процес транскрипції цих генів і синтез відповідних і-РНК або реплікацію ДНК. Накопичення і-РНК призводить, у свою чергу, до синтезу і накопичення в клітині набору нових білкових молекул, що виявляється у зміні фенотипічних властивостей і поведінки клітин. [Кашкін К.П. Цитокіни імунної системи: основні властивості та імунобіологічна активність (лекція) / / 1998 . Клінічна лабораторна діагностика. - 1998. № 11. ] - С. 21 - 32.]

Рис. 2. Спрощена схема передачі сигналу від рецептора гамма-інтерферону з використанням Jak-STAT шляху

Як приклад передачі сигналу від цитокінів на рис. 3 показано, як рецептор ІЛ-6 (IL-6) після зв'язування з лігандом (1) стимулює димеризації GP130 (2). Димер мембранного білка GP130 зв'язує і активує цитоплазматичну тирозинкіназ ЯК-сімейства (Янус-кінази, що мають два активних центру) (3). Янус-кінази фосфорилируют цитокінової рецепторів, БПС і різні цитоплазматичні білки, які здійснюють подальшу передачу сигналу; вони також фосфорилируют фактори транскрипції - переносники сигналу і активатори транскрипції [ПСАТ (STAT, від англ. S ignal t ransducers and a ctivators of t ranscription)] . Ці білки відносяться до сімейства БПС, що мають у структурі SH2-домен, що довідався залишки фосфотірозіна. Тому вони мають властивість асоціювати з фосфорілірованним цитокінової рецепторів. Якщо потім відбувається фосфорилювання молекули ПСАТ (4), фактор переходить в активну форму і утворює димер (5). Після транслокації в ядро димер в якості чинника транскрипції зв'язується з промотором ініційованого гена і індукує його транскрипцію (6). [Brisce J. et al. Кольман JAKs and STATs branch out Trends in Cell Biology, 6, 336 - 340, 1996] [Кольман Рём Я., Рем Г ., Наглядная До. - Г., Наочна издательство « Мир » ] біохімія, видавництво «Світ»]

Рис. 3. Механізм дії цитокінів на прикладі ІЛ-6

Деякі цитокінових рецептори можуть за рахунок протеолізу втрачати екстрацелюлярний лігандсвязивающій домен (на рис. 3 не наведено). Домен надходить у кров, де конкурує за зв'язування з цитокіном, що знижує концентрацію цитокіну в крові. [Кольман Я., Рем К. - Г., Наочна біохімія, видавництво «Світ»].

1.1.3. Класифікація цитокінів за механізмом дії

До системи цитокінів в даний час відносять близько 200 індивідуальних поліпептидних речовин, які за структурними особливостями і біологічній дії діляться на кілька самостійних груп. Угруповання цитокінів по механізму дії дозволяє розділити їх на такі групи:

1 група. Прозапальні, що забезпечують мобілізацію запальної відповіді;

2 група. Протизапальні, що обмежують розвиток запалення;

3 група. Регулятори клітинного та гуморального імунітету - природного або специфічного, що володіють власними ефекторними функціями (противірусними, цитотоксичними).

Згідно з однією з прийнятих класифікацій до цитокинам відносять:

• -α, IF -β, IF -γ, IF -ω, IF -τ); інтерферони, що представляють собою велику групу противірусних пептидів (IF-α, IF-β, IF-γ, IF-ω, IF-τ);

• - CSF , M - CSF , GM - CSF ); колонієстимулюючі фактори, що активують розмноження і диференціювання клітин-попередників різних паростків гемопоезу на різних етапах їхнього дозрівання (G - CSF, M - CSF, GM - CSF);

• -4, MIP -2, MCP -1); хемокіни, або хемотаксичні цитокіни, що забезпечують активацію міграції різних типів лейкоцитів і деяких інших _лееток (PF -4, MIP -2, MCP -1);

• - GF , TGF - β ); трансформують ростові фактори (PD - GF, TGF - β);

• - α , TNF - β ); група факторів некрозу пухлин - ФНП (TNF - α, TNF - β);

• 1-29). інтерлейкіни ІЛ 1-29 (IL 1-29). ІЛ з номерами 1-29 не можна об'єднати в одну підгрупу цитокінів, пов'язаних спільністю функцій, і вони можуть бути розділені на прозапальні цитокіни, ростові і диференційовані фактори лімфоцитів і окремі регуляторні цитокіни. [Зав'ялов В.П. Структурно-функціональна класифікація та еволюція цитокінів / / 1993 . Вісник РАМН. - 1993. 2 . № 2. 8 – 10. ]. - С. 8 - 10.].

.1.4. 1. 1 .1.4. Інтерлейкін-4

Імунна система являє собою комплекс клітин, які взаємодіють на основі принципів і механізмів саморегуляції, які реалізуються в значній мірі через медіатори - цитокіни.

Інтерлейкіни - білки, які продукують макрофагами і Т-лімфоцитами і забезпечують зростання лімфоїдних і, ймовірно, інших клітин. Ці білки різняться за фізико-хімічними властивостями, будовою і функціональної активності. [Agui T. Stimulation of interleukin-6 production by endothelin in rat bone marrow-derived stromal cells. / / Blood 1994, Vol. 84, P. 2531]

ІЛ-4 (В-клітинний стимулюючий фактор). Продукується активованими Т-хелперами 2-го типу.

Інтерлейкін-4 вперше описаний в 1982 р. Паулем, які виявили, що супернатант стимульованих мітогеном лаконосу EL-4 клітин здатний підтримувати зростання B-клітин після впливу імуноглобуліну, примушуючи їх вступати в S-фазу [Paul W. / / Blood. 1991. V. 77. P. 1859.].

Виявлений цитокін, як і ІЛ-2 та ІЛ-3, відноситься до групи гемопоетінов. ), т.е. Раніше його називали BCGF-I (від англ. B-cell growth factor), тобто -клеток. фактор росту B-клітин. Він являє собою мономер, що включає 129 амінокислотних залишків. У силу різного ступеня глікозилювання цього цитокіну молекулярна маса коливається від 18 кДа до 22 кДа.

Особливість ІЛ-4, що відрізняє його від інших цитокінів, полягає в наявності видовий специфічності. ІЛ-4 людини надає біологічну дію на клітини людини і мавп, але не мишей. У свою чергу ІЛ-4 миші діє тільки на клітини мишей. Джерелом ІЛ-4 є T-хелпери, стимульовані мітогеном, гладкі клітини, неідентифіковані клітини строми кісткового мозку (див. мал. 4). ІЛ-4 - продукт субпопуляції активованих T-клітин - діє через специфічний рецептор.

Рис. 4. Клітини-продуценти і клітини-мішені інтерлейкіну-4.

Основною клітиною-продуцентом інтерлейкіну-4 (ІЛ-4) є хелперних Т-клітина. Клітинами-мішенями є широкий набір як зрілих клітин, так і клітин, що знаходяться на найбільш ранніх стадіях гемопоезу.

Рецептори ІЛ-4, з молекулярною масою 139 кДа, виявлений на покояться T-клітинах, B-клітинах, макрофагах, тучних клітинах, на стромальних клітинах кісткового мозку, клітинах печінки, м'язах, фібробластах. [Http://humbio.ru/humbio / apop_cyt/00001e1d.htm Keegan A., Nelms K., Wang L., Pierce J., Paul W. Today. / / Immunol. Today. 1994. V. 15. P. 423].

Відомо що ІЛ-4 посилює експресію антигенів гістосумісності II класу (MHC II) в покояться В-клітинах, а також синтез імуноглобулінів IgG та IgЕ після стимуляції ліпополісахаридом (ЛПС), підтримує життєздатність і зростання інтактних Т-клітин, підвищує активність цитотоксичних Т-лімфоцитів , підсилює проліферацію попередників гемопоезу при відповіді на ростові фактори. Терапевтичний потенціал цитокіну пов'язаний з його можливістю відновлювати клітинний і гуморальний імунітет [Anliytsky W., Schuler M,, Peschel C. / / Drugs. 1994. V. 48. 5. P. 667.].

По відношенню до В-клітин ІЛ-4 виступає в якості костімулятора проліферації. Так, він не робить якого-небудь впливу на покояться B-клітини, проте досить подіяти на них одним зі специфічних для даних клітин індуктором активації, щоб проявилося біологічну дію ІЛ-4: різке підвищення проліферації даного типу клітин.

Відома також здатність ІЛ-4 підвищувати рівень продукції IgE. Приблизно це відбувається за рахунок посилення проліферації клону клітин, що продукують даний клас імуноглобулінів. При цьому, щоб такий клон відповів посиленням продукції імуноглобулінів, у всіх випадках необхідна попередня специфічна (антигеном) або неспецифічна (мітогеном) стимуляція відповідають клітин.

З'ясувалося, що ІЛ-4 здатний підсилювати проліферацію і Т-клітин, що відносяться до різних субпопуляцій. Його дія на Т-клітини, як і на В-клітини виявляється тільки після попередньої їх активації антигеном або мітогеном.

За своєю природою ІЛ-4 виступає в якості плейотропних регулятора, тому що взаємодіє з найрізноманітнішими типами клітин. Anliytsky W., Schuler M,, Peschel C. Так, його дія на макрофаги проявляється в посиленні експресії молекул II класу МНС і Fc-рецептора для IgG, придбанні протипухлинної активності по відношенню до фібросаркоми, посилення антігенпредставляющіе функції. [Anliytsky W., Schuler M,, Peschel C. / / Drugs. 1994. V. 48. * 5. P. 667.]

Бере участь ІЛ-4 і в розвитку кістковомозкових клітин-попередників. Один ІЛ-4 не змінює інтенсивність проліферації цих клітин, але посилює митотические процеси в поєднанні з іншими ростовими факторами. Тандем ІЛ-4 з гранулоцитарний колонієстимулюючим чинником (Г-КСФ) забезпечує більш активне розмноження клітин гранулоцитарного і моноцитарного паростків диференціювання, тандем з еритропоетином - еритроїдних попередників, з ІЛ-1 - розмноження клітин-попередників мегакаріоцітарного шляху розвитку.

1 на синтез IgG 4 и IgE . Таким чином основна функція ІЛ-4 полягає в переключенні синтезу IgG 1 на синтез IgG 4 і IgE. Спільно з іншими цитокінами сприяє проліферації тканинних базофілів. -фрагменту IgE на базофилах обоих типов, усиливает экспрессию молекул ГКГ класса II на В-клетках и макрофагах. Підсилює проліферацію В-клітин, підвищує експресію рецептора до Fc-фрагменту IgE на базофілах обох типів, посилює експресію молекул ГКГ класу II на В-клітинах і макрофагах. Є антагоністом гамма-інтерферону. Пригнічує продукцію ІЛ-1, ФНП, ІЛ-6, ІЛ-8, інгібує цитотоксичну активність Т-лімфоцитів, макрофагів. Відноситься до антизапальною цитокинам. [Дранник Г. Н. Клінічна імунологія та алергологія, МІА, Москва 2003р. С. 100].

1.1.1.5. Гамма-інтерферон

Інтерферони представляють собою сімейство глікопептидів, які діляться на два типи. [Дранник Г. Н. Клінічна імунологія та алергологія, МІА, Москва 2003р. С. 107-109].

Тип 1 в свою чергу підрозділяється на альфа - і бета-інтерферони, які продукують лейкоцитами і фібробластами відповідно.

Тип 2 інтерферонів отримав назву гамма-інтерферону. продукується активованими Т-лімфоцитами хелперами 1-го типу та ЄК-клітинами.

Розрізняють такі біологічні ефекти ітерферонов:

а) противірусний;

б) антіпроліфератівний (протипухлинний);

в) імуномодулюючий;

г) антибактеріальний.

Противірусний ефект інтерферонів представлений на схемі 1. Як видно зі схеми, зв'язування інтерферону з рецептором індукує в клітці три одночасно протікають процесу, які закінчуються:

1. Активацією латентної ендорібунуклеази, що призводить до руйнування вірусної РНК;

2. Придушенням синтезу вірусної матричної РНК;

3. Придушенням синтезу білків вірусної оболонки.

Ці механізми інтегрально реалізують противірусний ефект, приводячи до пригнічення реплікації вірусу.

Схема 1. Противірусний ефект інтерферону.

Антіпроліфератівний (протипухлинний) ефект інтерферонів пояснюється наступними механізмами:

1. Активацією цитотоксичних клітин;

2. Посиленням експресії опухольассоціірованних антигенів;

3. Модуляцією продукції антитіл;

4. Ингибицией дії пухлинних ростових факторів;

5. Ингибицией синтезу РНК і білків пухлинної клітини;

6. Уповільненням клітинного циклу з переходом у фазу "спокою";

7. Стимуляцією пухлинних клітин до дозрівання;

8. Відновленням стримуючого контролю за проліферацією;

9. Гальмуванням утворення нових судин у пухлині;

10. Ингибицией метастазування;

11. Біомодуляціей активності цитостатиків: а) зміною метаболізму, б) зниженням кліренсу.

12. Подолання лікарської резистентності за рахунок інгібіції генів множинної лікарської резистентності.

В даний час за допомогою генної інженерії отримано велику кількість інтерферонів, які широко використовуються для лікування при вірусних і онкологічних захворюваннях.

Одним з найважливіших біологічних ефектів інтерферонів є імуномодулюючий ефект. Встановлено, що він опосередковується наступними механізмами:

1. и II ; Посиленням експресії антигенів гістосумісності класів I і II;

2. Регулюванням чутливості до цитокинам;

3. Активацією цитотоксичних ефекторних клітин.

В останні роки показано, що інтерферони володіють також антибактеріальним ефектом, в основі якого лежить здатність інтерферонів індукувати активність деяких ферментів в ураженій клітині:

1. -триптофана, что, в свою очередь, является причиной гибели бактериальной клетки в связи с нарушением метаболизма; Індукція індоламін-2 ,3-дезоксігенази призводить до зниження внутрішньоклітинного вмісту L-триптофану, що, у свою чергу, є причиною загибелі бактеріальної клітини у зв'язку з порушенням метаболізму;

2. -синтетазы приводит к продукции N0 – мощного бактерицидного фактора, способствующего разрушению бактериальной клетки. [ Дранник Г. Н. Клиническая иммунология и аллергология, МИА, Москва 2003г. Індукція NO-синтетази призводить до продукції N0 - потужного бактерицидного фактора, що сприяє руйнуванню бактеріальної клітини. [Дранник Г. Н. Клінічна імунологія та алергологія, МІА, Москва 2003р. С. 107-109].

IFN типу II (імунний IFN, ІНФ-гамма), являє собою глікопротеїн з молекулярною масою 20-25 кДа і відомий як імунний інтерферон, кіслотолабільний, продукується Т-клітинами і натуральними кілерами у відповідь на чужорідні антигени або мітогени, причому, його продукція пов'язана з бласттрансформації цих клітин. Добрими індукторами ІФН-гамма є антигени таких мікроорганізмів, як мікобактерії туберкульозу, стафілококи, віруси грипу і віруси герпесу та ін, так як всі вони викликають бласттрансформації Т-лімфоцитів. [Young HA / / Seminars in Virology. 1995. V. 6. P. 175-180.]

Хоча гамма-інтерферон був відкритий за здатністю надавати противірусний ефект, надалі з'ясувалося, що він представляє собою плейотропний лімфокін, що володіє множинним дією на ріст і диференціювання клітин різних типів. Наприклад, гамма-інтерферон індукує диференціювання мієлоїдних клітин з кісткового мозку і клітин хронічного мієлолейкозу, в результаті чого вони набувають Fc-гамма - рецептори, ферменти, а також функціональні властивості більш зрілих моноцитів. Важливе і специфічне для інтерферону властивість - здатність індукувати експресію антигенів MHC класу II на ендотеліальних і різноманітних епітеліальних клітинах, а також клітинах пухлинних ліній. Гамма-інтерферон стимулює і експресію антигенів MHC класу I. Подібні ефекти призводять до посилення взаємодії між імунними T-лімфоцитами і нелімфоіднимі клітинами, що необхідно, наприклад, для боротьби з вірусною інфекцією.

V.136.-N.6.-P.2171. ] Гамма-інтерферон є і найважливіший фактор, що активує макрофаги; він сприяє більш ефективному знищенню макрофагами внутрішньоклітинних мікроорганізмів, запускаючи пошкоджені раніше мікробіцидність механізми макрофагів і викликає загибель внутрішньоклітинних мікроорганізмів (рис. 5). [Holter W., Grunow R., Stockinger H. , et al. / / J.Immunol.-1986 .- V.136.-N.6.-P.2171.]

Рис. 5. Активація макрофагів Т - хелперами (гуртки - поверхневий мікробний антиген; червоні квадрати - молекули MHC класу II, хвилясті лінії - внутрішньоклітинні паразити.).

Крім того, гамма-інтерферон діє синергічно з клітинною отрутою, лимфотоксинов, індукуючи експресію рецепторів лимфотоксинов на клітинах мішенях.

Інтерферон-гамма здатний подавити проліферацію клітин еритроїдного паростка, вироблення еритропоетину нирками і вивільнення заліза з макрофагів.

Противірусна активність ИНФ проявляется при его взаимодействии с соответствующими рецепторами на поверхности зараженных клеток, вследствие чего в этих клетках включаются гены, ответственные за синтез белков и ферментов, препятствующих самовоспроизведению вируса. г амма-ІНФ проявляється при його взаємодії з відповідними рецепторами на поверхні заражених клітин, внаслідок чого в цих клітинах включаються гени, відповідальні за синтез білків і ферментів, що перешкоджають самовідтворення вірусу. Тим самим інтерферон блокує біосинтез вірусних часток в зараженій клітині. На цій властивості інтерферону грунтується використання його препаратів в якості лікарських при вірусних інфекціях.

1.2. Гнійно-запальних захворюваннях

1.2.1. Фурункульоз

Фурункул (лат. furunculus) - гостре гнійно-некротичні запалення волосяного фолікула і навколишнього його сполучної тканини. Викликає розвиток Ф золотистий, рідше білий стафілокок. Важливу роль у виникненні Ф грають екзогенні та ендогенні фактори, що привертають. Екзогенними факторами є пошкодження шкіри (расчеси, садна, дерматит та ін), забруднення її частинками пилу, вугілля і т.д., піодермія. Ендогенними - ендокринні порушення (цукровий діабет, ожиріння), порушення обміну (гіповітаміноз, анемія), алкоголізм, переохолодження та ін Про фурункульозі кажуть при множині і рецидивуючому появі та розвитку Ф. Часто фурункульоз виникає на тлі супутнього цукрового діабету. [Сетдікова Н. Х., Латишева Т.В. Комплексні механізми розвитку хронічного рецидивуючого фурункульозу та шляхи їх корекції / / Імунологія. - 2000 .- № 3. - С.48-50.]

Фурункул може розвинутися на будь-якій ділянці шкіри, де є волосяні фолікули. Найбільш часта локалізації - особа, шкіра шиї, тилу кистей, попереку. Спочатку з'являється щільний яскраво-червоного кольору запальний інфільтрат, який піднімається над рівнем шкіри невеликим конусом. Хворі відзначають легкий свербіж, помірні болі. У міру розвитку Ф. інфільтрат збільшується, наростає гіперемія, приєднується периферичний набряк. На 3-4-й день у центрі інфільтрату з'являються некроз і розм'якшення тканин, які набувають зеленуватий колір, формується некротичний стержень фурункула. У цей період болю різко посилюються, особливо при локалізації у фізіологічно активної області (наприклад, в області суглоба), можливі підвищення температури тіла, головний біль, нездужання. При сприятливому перебігу через 2-3 дні гнійно-некротичний стержень самостійно відторгається з утворенням глибокої помірно рани, що кровоточить. Ще через 2-3 дні рана заживає. При стерте протягом процесу утворюється болючий інфільтрат без нагноєння і некрозу. При абсцедуючої Ф. гнійно-некротичний процес розповсюджується за межі волосяного фолікула з розвитком гнійної порожнини або флегмони. Поодинокі Ф. зазвичай не викликають загальної реакції і не дають ускладнень, однак у хворих на цукровий діабет можливо важкий перебіг процесу. Ф. може ускладнитися лімфангіітом, регіонарним лімфаденітом, тромбофлебітом. [Шкірні хвороби / / Под ред. Кубанова А.А. - М.: ГЕОТАР Медицина. - 1999р. - 175-184с.]

Ведучими змінами імунної системи при ХРФ є дефекти фагоцитарного та гуморального ланок імунітету. [А.С. Манько, Н.Х. Сетдікова, Т.В. Латишева, Ю.А. Горностаєва, О.М. Котова, Н.М. Голубєва «Клініко-імунологічна ефективність сераміда у хворих на хронічний рецидивний фурункульозом» / / Російський Алергологічний Журнал, № 5, 2005р]

1.2.2. Остеомієліт

Остеомієліт - запалення кісткового мозку, зазвичай поширюється на компактне і губчасту речовину кістки і окістя. [Борисов Л.Б. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія. М.: Медицина 1994. С. 485-487]

За етіологічним ознакою розрізняють неспецифічний О., викликається гнійними мікроорганізмами, і специфічний, що викликається специфічною мікрофлорою. У залежності від шляхів проникнення збудників інфекції в кістку виділяють гематогенний (ендогенний) і негематогенний (екзогенний) остеомієліт. Гематогенний О. виникає в результаті занесення по кровоносному руслу збудників гнійної інфекції з віддаленого вогнища (гострий гематогенний і первинно-хронічний О.). Екзогенний О. викликається інфекцією, що проникає в кістку при пораненнях, операціях або за рахунок безпосереднього переходу гнійного запалення на кістку з навколишніх органів і тканин. Залежно від механізму виникнення розрізняють вогнепальний, посттравматичний, післяопераційний та контактний остеомієліт. Вогнепальний О. є наслідком вогнепальних поранень з пошкодженням кістки. Посттравматичний О. розвивається при відкритих переломах. Післяопераційний О. може виникнути при оперативному лікуванні закритих переломів, інших операціях на кістках і частіше пов'язаний з порушенням правил асептики.

За клінічним перебігом О. може бути гострим і хронічним (вторинним), що розвиваються, після будь-якого гострого неспецифічного О. Крім того, розрізняють первинно-хронічний О., до якого відносять атипові форми О. (склерозуючий остеомієліт Гарре, альбумінозний остеомієліт Олльє, абсцес Броді) , а також О. при деяких інфекційних хворобах (туберкульоз, сифіліс тощо).

Ряд авторів виділяє антибіотичний О., що виникає у ослаблених хворих в процесі тривалого лікування масивними дозами антибіотиків, і пострадіаційних О., пов'язаний з тривалим впливом іонізуючого випромінювання.

Збудником неспецифічного О. можуть бути будь-які мікроорганізми, але найчастіше - аеробні гноєтворні мікроорганізми стафілококової і стрептококової групи. Більш ніж в 90% випадків при гострому гематогенному О. з гною виділяють золотистий стафілокок. Відзначається збільшення числа остеомієлітів, обумовлених неклостридиальной анаеробної і грамнегативної флорою. У рідкісних випадках гематогенний О. має грибкову етіологію. [Белохвостикова Т.С., Кірдей Л.Є., Гаврилова Є.Ю., ПРОМТ М.В., Леонова С.М., Кірдей Є.Г. Корекція вторинних порушень імунної системи при хронічному посттравматичному остеомієліті. / / Медична імунологія, 2002, т.4, № 2, с.228-229.].

При гострому гематогенному О. мікрофлора з явного або прихованого первинного вогнища заноситься током крові (бактеріємія) в довгі трубчасті кістки, де в широкій мережі судин, особливо в області метафіза, сповільнюється швидкість кровотоку і мікроорганізми фіксуються в синусах губчастої речовини. За певних умов ці вогнища можуть дати спалах гнійного О. Хронічний гематогенний О. є наслідком гострого процесу.

Запальний процес у кістки може обмежитися крайової зоною - утворюються грануляції запобігають подальше інфікування кісткового мозку. При порушенні регенераторних процесів гострий О. переходить у хронічний. У інфікованої рани осколки кісток піддаються некрозу, стають джерелами нагноєння, навколо них утворюються гнійні порожнини, формуються свищі, що перешкоджає розвитку кісткової мозолі.

Первинно-хронічні (атипові) форми О. розвиваються в основному в результаті впливу слабовірулентних стафілококової мікрофлори.

У початковій стадії гострого гематогенного О. розвиваються дифузний набряк кісткового мозку і серозне запалення, яке в подальшому змінюється його гнійної інфільтрацією. Процес, що має характер флегмони, поширюється вздовж кістки і у напрямку до окістю. Підвищення внутрішньокісткового тиску посилює порушення кровообігу кістки, в результаті чого відбуваються некроз і Аутоліз кісткових перекладин, кортикального шару кістки, стінок каналів остеонів. Резорбція кістки супроводжується появою в ній дрібних дефектів, заповнених гноєм, які зливаються в більші фокуси, що містять секвестри. Тромбофлебіт і тромбартерііт дрібних судин кістки повністю позбавляють харчування вражений її ділянку, в результаті чого зона некрозу кістки збільшується. Окістя спочатку потовщується, а потім відшаровується гноєм, який проникає з кістковомозкового каналу по кістковим каналах.

Якщо поднадкостнічного флегмона кістки своєчасно не розкрита, то гній проривається в міжм'язової простір (міжм'язової флегмона), переходить на підшкірну клітковину і мимоволі розкривається назовні з утворенням нориці. Омертвілі ділянки кістки, що знаходяться в порожнині гнійника, піддаються відторгнення (секвестрації). При обмеженому процесі поблизу компактного речовини кістки утворюються кортикальні секвестри. Вони можуть перебувати поднадкостнічного, проникати в м'які тканини або виходити через свищевой хід назовні. Секвестри, отторгающиеся з боку ендоста, називають центральними, або внутрішньопорожнинне. Відторгнення їх відбувається в просвіт кістковомозкового каналу. При некрозі всієї товщі кістки, але на обмеженій ділянці, утворюються так звані проникаючі (перфорують) секвестри - один кінець такого секвестру знаходиться в костномозговое каналі, а інший - в м'яких тканинах. У рідкісних випадках при ураженні кістки по колу може сформуватися тотальний секвестр. Секвестри перешкоджають загоєнню вогнища О. і підтримують запалення, тому що зберігається в них інфекція, незважаючи на застосування антибіотиків широкого спектру, пригнічує активність тканинних ферментів. Можливість «імплантації» або розсмоктування секвестру, на думку більшості дослідників, мало ймовірна.

Одночасно з запально-некротичними змінами в кістковій тканині відбуваються репаративні процеси. Ділянки некрозу заміщуються молодий кістковою тканиною. При обмежених некрозах кістки, своєчасному і комплексному лікуванні, переважно у хворих молодого віку захворювання може закінчитися одужанням з відновленням кісткової структури. Але приблизно в ¹ / ₃ хворих гострий остеомієлітичних процес переходить у хронічний.

Атипові форми О. характеризуються уповільненим запальним ураженням кісток з переважанням склеротичних процесів, що призводить до звуження або повного закриття кістковомозкового каналу, веретеноподібного потовщення діафіза кістки, меншій вираженості некрозу кістки і рідкісному утворення секвестрів. Однією з таких форм є склерозуючий остеомієліт Гарре, при якому відзначають виражене потовщення кістки, відсутність свищів і секвестрів. Переважають гіперостоз і остеосклероз з концентричним звуженням кістковомозкового каналу. При альбумінозном остеомієліті Олльє морфологічну основу складає невеликий деструктивний вогнище в кортикальному шарі кістки, що містить серозний або слизисто-білковий ексудат. Іноді є невеликі секвестри.

Остеомієліт як ускладнення деяких інфекційних хвороб - сепсису, черевного тифу, бруцельозу, туберкульозу, сифілісу - має специфічні для кожного з цих захворювань морфологічними ознаками. [Керк О.В., Гусєва В.М., Потапенко О.І., Якунова О. А. та ін Роль імунологічних показників при туберкульозі і остеомієліті хребта / / Медична імунологія. - 2005. - № 2-3. С.243-244]

У доступній нам літературі не виявлено даних про дослідження рівня цитокінів ІЛ-4, γ ІФН при хронічному остеомієліті та хронічному рецидивуючому фурункульозі.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

2.1. Матеріали дослідження

Обстежено 49 хворих у віці від 20 до 55 років з ГВЗ різної локалізації: з них 34 - з хронічним рецидивуючим фурункульозом і 15 - з хронічним остеомієлітом у стадії загострення. Клінічне обстеження хворих включало ретельний збір аллергоанамнеза.

Контрольну групу склали 10 донорів без гнійно-запальних захворювань, порівнянні за статтю і віком.

Об'єктом дослідження слугувала сироватка крові. Забір крові проводився з 8.00 до 10.00 годин.

Кров центрифугували при 1500 об / хв протягом 15 хв. З експерименту виключалася гемолізованих і хілозної (що містить жирові включення) сироватка.

Отриману сироватку використовували як джерела ІЛ-4 та γ-інтерферону.

2.2. Методи дослідження

Дослідження проводилося на базі лабораторії імунології та алергології ГОУ ДПО Пензенський інститут удосконалення лікарів Росздрава.

2.2.1. Метод визначення рівня інтерлейкіну-4 в сироватці крові

-4 " фирмы ВЕКТОР-БЕСТ. Набор "ИФА- IL -4" предназначен для определения концентрации ИЛ-4 в сыворотке крови в клинических, диагностических и научно-исследовательских лабораториях. Для визначення рівня ІЛ-4 використовувався метод твердофазного імуноферментного аналізу, з використанням набору реактивів "ІФА-IL-4" фірми ВЕКТОР-БЕСТ. Набір "ІФА-IL-4" призначений для визначення концентрації ІЛ-4 в сироватці крові в клінічних, діагностичних і науково-дослідних лабораторіях.

Склад набору:

■ комплект з дванадцяти восьмілуночних стрипів з рамкою з іммобілізованими на внутрішній поверхні лунок моноклональними антитілами до інтерлейкіну-4, маркований "Стрипи з моноклональними антитілами";

■ 7 калібрувальних проб, які містять відомі кількості інтерлейкіну-4 - 0; 12,5; 25; 50; 100; 200 і 400пг \ мл, ліофілізовані препарати;

■ аналітичний буферний розчин, маркований "Буфер А", 1 флакон;

■ -4-биотин, маркирован "Антитела", 1 флакон; концентрований розчин антитіл анти-IL-4-біотин, маркований "Антитіла", 1 флакон;

■ концентрований розчин кон'югату авидин-пероксидаза, маркований "Кон'югат Е", 1 флакон;

■ концентрований буферний розчин для промивок лунок, маркований "Буфер Р", 1 флакон;

■ субстратний буфер, маркований "Буфер С", 1 флакон;

■ 10% кислота, маркована "Стоп-реагент", 1 флакон;

■ розчин тетраметилбензидину, маркований "ТМБ";

Додаткові матеріали та обладнання:

■ автоматичні одноканальні піпетки із змінним обсягом відбору рідин: від 0,005 до 0,01 мл; від 0,05 до 0,25 мл; від 0,2 до 1 мл; від 1 до 5 мл;

■ одноканальна напівавтоматична піпетка, що дозволяє відбирати об'єми рідини до 0,3 мл.

■ прилад для струшування рамки Із Стріп (шейкер), що дозволяє проводити струшування з амплітудою коливання 3-4мм і частотою 4-6 Гц при кімнатній температурі (+16-25 ° С), або статіруемий шейкер, що дозволяє проводити струшування в тому ж режимі при температурі +37 ° С;

■ спектрофотометр, що дозволяє виміряти оптичну щільність розчину у стрипах при довжині хвилі 450Нм;

■ циліндри, що дозволяють відміряти 10 і 100 мл;

■ два скляних склянки ємністю 20 мл і один - 150 мл;

■ дистильована вода.

Принцип роботи набору.

-4" использован "сэндвич" вариант твердофазного иммуноферментного анализа. У наборі "ІФА-IL-4" використаний "сендвіч" варіант твердофазного імуноферментного аналізу. Для реалізації цього варіанту використані два моноклональних антитіла з різною специфічністю епітопной до інтерлейкіну-4. Одне з них іммобілізовано на твердій фазі (внутрішня поверхня лунок), друге кон'югованому з біотином. -4, содержащийся в калибровочных и исследуемых пробах связывается с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. На першій стадії аналізу IL -4, що міститься в калібрувальних та досліджуваних пробах зв'язується з антитілами, іммобілізованими на внутрішній поверхні лунок. -4 взаимодействует с конъюгатом вторых антител – биотин. На другій стадії аналізу іммобілізований IL -4 взаємодіє з кон'югатом другий антитіл - біотин. -4 в исследуемом образце. Кількість зв'язаного кон'югату прямо пропорційно кількості IL -4 в досліджуваному зразку. На останній стадії аналізу в лунки вносять авидин-пероксидазу.

Під час інкубації з субстратної сумішшю відбувається фарбування розчину в лунках. Ступінь забарвлення прямо пропорційна кількості зв'язалися мічених антитіл. -4 в определяемых образцах. Після вимірювання оптичної щільності розчину в лунках на підставі калібрувальної кривої розраховується концентрація IL -4 в визначених зразках.

Підготовка реагентів до аналізу

• Калібрувальні проби. У флакони з калібрувальними пробами додати по 1,0 мл дистильованої води, витримати протягом 20хв. І потім ретельно перемішати до повного розчинення, уникаючи піноутворення. Зберігати при температурі +4 ... +6 ° С протягом трьох діб, при можливості більш тривалого зберігання розлити по 220 мкл (щоб уникнути повторного осідання) і зберігати при температурі -20 ° С не більше місяця.

• Стрипи. Розкрити і встановити на рамку необхідну кількість стрипів. Решта стрипи зберігати в герметично закритому пакеті з фольгированного поліетилену при температурі

• Сироватковий буфер. У склянку з 480 мл дистильованої води додати вміст флакона з маркуванням "Буфер Р". ранить промывочный буфер при температуре +2…8°С. Ретельно перемішати, уникаючи піноутворення. X поранити промивний буфер при температурі +2 ... 8 ° С.

• Буфер А. Готовий до використання. Зберігати закритим при температурі +2 ... 6 ° С.

• -4-биотин. Набір антитіл анти-IL-4-біотин. Залежно від кількості використовуваних стрипів підготувати необхідний обсяг одноразового розчину антитіл шляхом змішування 40 мкл концентрованого антитіл з 1 мл розчину для промивання буфера з розрахунку на один стріп. Однократний розчин антитіл повинен бути використаний протягом години, тривалого хрипіння не підлягає.

• Кон'югат Є. авидин-пероксидаза. Залежно від кількості використовуваних стрипів підготувати необхідний обсяг одноразового розчину кон'югату шляхом змішування 40 мкл концентрованого кон'югату Е з 1 мл розчину для промивання буфера з розрахунку на один стріп. Одноразовий розчин кон'югату Е повинен бути використаний протягом години, тривалому зберіганню не підлягає.

• Субстратна суміш готується безпосередньо перед вживанням.

• "Стоп-реагент" готовий до використання.

Проведення аналізу:

Таблиця 2. Витрата реагентів для проведення аналізу

Приклад калібрувальних кривих для кожного конкретного набору приводитися в Паспорті контролю якості (Мал. 6).

Рис. 6. Калібрувальна крива (ЗРАЗОК) для визначення ІЛ-4

2.2.2. Метод визначення рівня гама-інтерферону в сироватці крові

- gamma " фирмы ВЕКТОР-БЕСТ. Набор "ИФА- IFN - gamma " предназначен для определения концентрации γ ИФН в сыворотке крови в клинических, диагностических и научно-исследовательских лабораториях. Для визначення рівня гама-інтерферону використовувався метод твердофазного імуноферментного аналізу, з використанням набору реактивів "ІФА-IFN - gamma" фірми ВЕКТОР-БЕСТ. Набір "ІФА-IFN - gamma" призначений для визначення концентрації γ ІФН у сироватці крові в клінічних, діагностичних та науково-дослідних лабораторіях.

Склад набору:

■ комплект з дванадцяти восьмілуночних стрипів з рамкою з іммобілізованими на внутрішній поверхні лунок моноклональними антитілами до інтерлейкіну-4, маркований "Стрипи з моноклональними антитілами";

■ 7 калібрувальних проб, які містять відомі кількості гамма-інтерферону - 0, 50, 100, 300, 500, 1000 і 2000пг \ мл, ліофілізовані препарати;

■ аналітичний буферний розчин, маркований "Буфер А", 1 флакон;

■ - gamma -биотин, маркирован "Антитела", 1 флакон; концентрований розчин антитіл IFN - gamma-біотин, маркований "Антитіла", 1 флакон;

■ концентрований розчин кон'югату авидин-пероксидаза, маркований "Кон'югат Е", 1 флакон;

■ концентрований буферний розчин для промивок лунок, маркований "Буфер Р", 1 флакон;

■ субстратний буфер, маркований "Буфер С", 1 флакон;

■ 10% кислота, маркована "Стоп-реагент", 1 флакон;

■ розчин тетраметилбензидину, маркований "ТМБ";

Додаткові матеріали та обладнання:

■ автоматичні одноканальні піпетки із змінним обсягом відбору рідин: від 0,005 до 0,01 мл; від 0,05 до 0,25 мл; від 0,2 до 1 мл; від 1 до 5 мл;

■ одноканальна напівавтоматична піпетка, що дозволяє відбирати об'єми рідини до 0,3 мл.

■ прилад для струшування рамки Із Стріп (шейкер), що дозволяє проводити струшування з амплітудою коливання 3-4мм і частотою 4-6 Гц при кімнатній температурі (+16-25 ° С), або статіруемий шейкер, що дозволяє проводити струшування в тому ж режимі при температурі +37 ° С;

■ спектрофотометр, що дозволяє виміряти оптичну щільність розчину у стрипах при довжині хвилі 450Нм;

■ циліндри, що дозволяють відміряти 10 і 100 мл;

■ два скляних склянки ємністю 20 мл і один - 150 мл;

■ дистильована вода.

Принцип роботи набору.

- gamma " использован "сэндвич" вариант твердофазного иммуноферментного анализа. У наборі "ІФА-IFN - gamma" використаний "сендвіч" варіант твердофазного імуноферментного аналізу. Для реалізації цього варіанту використані два моноклональних антитіла з різною специфічністю епітопной до гамма-інтерферону. Одне з них іммобілізовано на твердій фазі (внутрішня поверхня лунок), друге кон'югованому з біотином. На першій стадії аналізу γ ІФН, що міститься в калібрувальних та досліджуваних пробах зв'язується з антитілами, іммобілізованими на внутрішній поверхні лунок. На другій стадії аналізу іммобілізований γ ІФН взаємодіє з кон'югатом друге антитіл - біотин. Кількість зв'язаного кон'югату прямо пропорційно кількості γ ІФН у досліджуваному зразку. На останній стадії аналізу в лунки вносять авидин-пероксидазу.

Під час інкубації з субстратної сумішшю відбувається фарбування розчину в лунках. Ступінь забарвлення прямо пропорційна кількості зв'язалися мічених антитіл. Після вимірювання оптичної щільності розчину в лунках на підставі калібрувальної кривої розраховується концентрація γ ІФН у визначених зразках.

Підготовка реагентів до аналізу

• Калібрувальні проби. У флакони з калібрувальними пробами додати по 1,0 мл дистильованої води, витримати протягом 20хв. І потім ретельно перемішати до повного розчинення, уникаючи піноутворення. Зберігати при температурі +4 ... +6 ° С протягом трьох діб, при можливості більш тривалого зберігання розлити по 220 мкл (щоб уникнути повторного осідання) і зберігати при температурі -20 ° С не більше місяця.

• Стрипи. Розкрити і встановити на рамку необхідну кількість стрипів. Решта стрипи зберігати в герметично закритому пакеті з фольгированного поліетилену при температурі

• Сироватковий буфер. У склянку з 480 мл дистильованої води додати вміст флакона з маркуванням "Буфер Р". ранить промывочный буфер при температуре +2…8°С. Ретельно перемішати, уникаючи піноутворення. X поранити промивний буфер при температурі +2 ... 8 ° С.

• Буфер А. Готовий до використання. Зберігати закритим при температурі +2 ... 6 ° С.

• Набір антитіл анти-γ ІФН-біотин. Залежно від кількості використовуваних стрипів підготувати необхідний обсяг одноразового розчину антитіл шляхом змішування 40 мкл концентрованого антитіл з 1 мл розчину для промивання буфера з розрахунку на один стріп. Однократний розчин антитіл повинен бути використаний протягом години, тривалого хрипіння не підлягає.

• Кон'югат Є. авидин-пероксидаза. Залежно від кількості використовуваних стрипів підготувати необхідний обсяг одноразового розчину кон'югату шляхом змішування 40 мкл концентрованого кон'югату Е з 1 мл розчину для промивання буфера з розрахунку на один стріп. Одноразовий розчин кон'югату Е повинен бути використаний протягом години, тривалому зберіганню не підлягає.

• Субстратна суміш готується безпосередньо перед вживанням.

• "Стоп-реагент" готовий до використання.

Проведення аналізу:

Таблиця 3. Витрата реагентів для проведення аналізу

Приклад калібрувальних кривих для кожного конкретного набору приводитися в Паспорті контролю якості (Мал. Б).

Рис. 7. Калібрувальна крива (ЗРАЗОК) для визначення γ ІФН

2.2.3. Статистична обробка результатів дослідження

Результати піддавали статистичній обробці з використанням t-критерію Стьюдента, розходження вважали достовірними при p <0,05 [Лакин Г.Ф. Біометрія. М.: Вища школа, 1990.352с.].

РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ

До недавнього часу в Росії вивченням цитокінів займалися нечисленні групи дослідників, так як біологічні методи дослідження дуже трудомісткі, а імпортні імунохімічні набори досить дорогі. З появою доступних вітчизняних імуноферментних наборів все більший інтерес до вивчення цитокінового профілю проявляють практикуючі лікарі.

На даний момент діагностична значимість оцінки рівня цитокінів полягає в констатації самого факту підвищення або зниження їх концентрації у даного хворого з конкретним захворюванням. Причому для оцінки тяжкості та прогнозування перебігу захворювання доцільно визначати концентрацію як противо-, так і прозапальних цитокінів.

Відомо, що цитокинам належить важлива роль у генезі розвитку запальної реакції при ГВЗ. 1 на синтез IgG 4 и IgE . Зокрема, ІЛ-4 - антизапальний цитокін - інгібує цитотоксичну активність Т-лімфоцитів, макрофагів, бере участь у перемиканні синтезу IgG 1 на синтез IgG 4 і IgE. Спільно з іншими цитокінами ІЛ-4 сприяє проліферації тканинних базофілів. Антагоністом ІЛ-4 є гамма-інтерферон - найважливіший фактор, що активує макрофаги; він сприяє більш ефективному знищенню макрофагами внутрішньоклітинних мікроорганізмів, запускаючи пошкоджені раніше мікробіцидність механізми макрофагів і викликає загибель внутрішньоклітинних мікроорганізмів.

// Объединённый иммунологический форум: Тезисы. Маркером течії ГВЗ вважається зміна рівня імуноглобуліну Е [Перетня М. М., Сенькове Л. В., Добродєєв К. Г. Капутін С. Л. та ін До питання про роль IgE / / Об'єднаний імунологічний форум: Тези. - Єкатеринбург .- 2004.-с. при ГВЗ . 119]. Зокрема клінічно несприятливим показником є підвищення рівня IgE при ГВЗ. У зв'язку з цим, цікавим видається дослідження кореляційних взаємозв'язків рівнів інтерлейкіну 4 і гамма-інтерферону з показниками загального імуноглобуліну Е в сироватці крові хворих з ГВЗ.

3.1. Результати дослідження рівня інтерлейкіну-4 і гамма-інтерферону в сироватці крові хворих з різним рівнем імуноглобуліну Е при хронічному рецидивуючому фурункульозі

Áàêòåðèàëüíûå èíôåêöèè êîæè ÿâëÿþòñÿ âàæíîé êëèíè ÷ åñêîé ïðîáëåìîé ââèäó èõ ðàñïðîñòðàíåííîñòè âî âñåì ìèðå è íåäîñòàòî ÷ íîé ýôôåêòèâíîñòè òåðàïèè ýòèõ çàáîëåâàíèé. Íàèáîëåå ÷ àñòî âñòðå ÷ àþùèåñÿ èíôåêöèîííûå çàáîëåâàíèÿ êîæè âêëþ ÷ àþò ôîëëèêóëèòû, ôóðóíêóëû è êàðáóíêóëû. Ôàêòîðàìè ïðåäðàñïîëîæåííîñòè ê âîçíèêíîâåíèþ ðåöèäèâèðóþùåãî ôóðóíêóëåçà (ÐÔ) ÿâëÿþòñÿ èíôèöèðîâàííûå ðàíû, íàðóøåíèå ïðàâèë ãèãèåíû, äèàáåò, àëêîãîëèçì, îêêëþçèâíàÿ êîñìåòèêà, òåñíàÿ îäåæäà, îáùåå îñëàáëåíèå îðãàíèçìà, ïîòåðòîñòè, ïåðåãðåâ, êîíòàêò ñ õèìè ÷ åñêèìè àãåíòàìè, íåàäåêâàòíîå ëå ÷ åíèå êîæíûõ ïîâðåæäåíèé, èñïîëüçîâàíèå ñòåðîèäíûõ ãîðìîíîâ. Ïðè ÷ èíû ðàçâèòèÿ Х ÐÔ íå âñåãäà ïîíÿòíû. Як правило при èçó ÷ еніі îñîáåííîñò їй ðåöèäèâèðóþùåãî ôóðóíêóëåçà, îòìå ÷ àåò ся íàëè ÷ èå àëëåðãè ÷ åñêîãî êîìïîíåíòà â âîñïàëåíèè ïðè ôóðóíêóëåçå ó ëèö ñòàðøåãî âîçðàñòà, ÷ òî ñîïðîâîæäàåòñÿ ïîâûøåíèåì îáùåãî IgE. Крім того, п ðè Х ÐÔ, êàê ïðè âñÿêîé ðåöèäèâèðóþùåé èíôåêöèè, ìîæíî ïðåäïîëîæèòü íàëè ÷ èå íàðóøåíèé èììóíîëîãè ÷ åñêîé ðåàêòèâíîñòè.

У нашій роботі обстежено 34 пацієнта з ХРФ. : первую группу составили 14 больных с повышенным уровнем IgE , вторую – 20 пациентов с нормальными значениями указанного иммуноглобулина. За дискриминационный уровень принимались показатели иммуноглобулина Е – 130-150 МЕ/мл. Ці пацієнти були сформовані в 2 групи, в залежності від рівня IgE: першу групу склали 14 хворих з підвищеним рівнем IgE, другу - 20 пацієнтів з нормальними значеннями зазначеного імуноглобуліну. За дискримінаційний рівень приймалися показники імуноглобуліну Е - 130-150 МО / мл. Контрольну групу склали 10 осіб - донори без ГВЗ.

3.1.1. Результати дослідження рівня інтерлейкіну-4 в сироватці крові у хворих з хронічним рецидивуючим фурункульозом

Результати дослідження рівня інтерлейкіну-4 в сироватці крові у хворих з хронічним рецидивуючим фурункульозом наведено на рис. 8 і табл. 1 (додаток 1).

Згідно з отриманими результатами достовірне підвищення рівня ІЛ-4, в порівнянні з контрольною групою, відзначалось як у хворих з підвищеними, так і нормальними значеннями загального імуноглобуліну Е.

Концентрація ІЛ-4 у хворих з високими значеннями загального імуноглобуліну Е (вище 150 МО / мл) перевищувала показники контрольної групи в 10 разів (р <0,05). Концентрація ІЛ-4 у хворих з нормальними значеннями сироваткового імуноглобуліну Е (130 МО / мл) перевищувала показники контрольної групи в 7 разів (р <0,01). Отримані результати свідчать про залучення ІЛ-4 у формування імунної відповіді при розвитку ХРФ. Однак, ці зміни не залежали від показників загального імуноглобуліну Е в обстежуваній групі хворих з ХРФ.

3.1.2. Результати дослідження рівня гама-інтерферону в сироватці крові у хворих з хронічним рецидивуючим фурункульозом

Результати дослідження рівня гама-інтерферону в сироватці крові у хворих з хронічним рецидивуючим фурункульозом наведено на рис. 9 і табл. 1 (додаток 1).

Отримані результати показали, що зміни рівня ІФН γ як у хворих з підвищеними, так і нормальними значеннями загального імуноглобуліну Е, достовірно не відрізнялися від показників концентрації гама-інтерферону контрольної групи.

Ймовірно, отримані результати свідчать, що гамма-інтерферон не бере участь у формуванні відповідної реакції організму при розвитку ХРФ. Крім того, показники концентрації гама-інтерферону в обстежуваній групі хворих з ХРФ не залежали від рівня сироваткового імуноглобуліну Е.

3.2. Результати дослідження рівня інтерлейкіну-4 і гамма-інтерферону в сироватці крові хворих з різним рівнем імуноглобуліну Е при хронічному остеомієліті

Характер і специфіка імунологічної реактивності при хронічних остеомиелитах, визначається морфологічної деструкцією кістки і оточуючих м'яких тканин у зоні запалення, які купують на певному етапі запалення властивості аутоантитіл. Розвиваючі у цих умовах імунодефіцит і дисбаланс компонентів імунної відповіді знижують можливості специфічного і неспецифічного захисту, що сприяє персистенції мікробних агентів і розвитку порочного кола, що обумовлює підтримання патологічного процесу. Відомо, що деякі бактерії здатні вимикати процеси антитілоутворення як прямим, так і опосередкованим (через індукцію чинників, що перешкоджають активації Т-клітин) шляхом, і тим самим знижувати загальний рівень імунної відповіді. Важливу роль при цьому відіграють цитокіни, які, будучи медіаторами імунітету, здатні змінювати характер перебігу гнійно-запального процесу. Природно, що при такому складному механізмі імунорегуляції протягом гнійного процесу залежить не тільки від імуногенності потенціалу інфікуючих мікроорганізмів, але і від вихідного імунного статусу організму хазяїна [Белохвостикова Т.С., Кірдей Л.Є., Гаврилова Є.Ю., ПРОМТ М. В., Леонова С.М., Кірдей Є.Г. Корекція вторинних порушень імунної системи при хронічному посттравматичному остеоміеліте. / Медична імунологія, 2002, т.4, № 2, с.228-229.].

У нашій роботі обстежено 15 пацієнтів з хронічним остеомієлітом. : первую группу составили 10 больных с повышенным уровнем IgE (выше 150МЕ/мл), вторую – 5 пациентов с нормальными значениями указанного иммуноглобулина (130 МЕ/мл). За дискриминационный уровень принимались показатели иммуноглобулина Е – 130-150 МЕ/мл. Ці пацієнти були сформовані в 2 групи, в залежності від рівня IgE: першу групу склали 10 хворих з підвищеним рівнем IgE (вище 150МЕ/мл), другу - 5 пацієнтів з нормальними значеннями зазначеного імуноглобуліну (130 МО / мл). За дискримінаційний рівень приймалися показники імуноглобуліну Е - 130-150 МО / мл. Контрольну групу склали 10 осіб - донори без ГВЗ.

3.2.1. Результати дослідження рівня інтерлейкіну-4 в сироватці крові у хворих з хронічним остеомієлітом

Результати дослідження рівня інтерлейкіну-4 в сироватці крові у хворих з хронічним остеомієлітом наведено на рис. 10 і табл. 2 (Додаток 2).

Згідно з отриманими результатами достовірне підвищення рівня ІЛ-4, в порівнянні з контрольною групою, відзначалось як у хворих з підвищеними, так і нормальними значеннями загального імуноглобуліну Е.

Концентрація ІЛ-4 у хворих з високими значеннями загального імуноглобуліну Е (вище 150 МО / мл) перевищувала показники контрольної групи у 8 разів (р <0,01). Концентрація ІЛ-4 у хворих з нормальними значеннями сироваткового імуноглобуліну Е (до 130 МО / мл) перевищувала показники контрольної групи в 8,7 разів (р <0,05). Отримані результати свідчать про залучення ІЛ-4 у формування імунної відповіді при розвитку хронічного остеомієліту. Однак, ці зміни не залежали від показників загального імуноглобуліну Е в обстежуваній групі хворих з хронічним остеомієлітом.

3.2.2. Результати дослідження рівня гама-інтерферону в сироватці крові у хворих з хронічним остеомієлітом

Результати дослідження рівня гама-інтерферону в сироватці крові у хворих з хронічним остеомієлітом наведено на рис. 11 і табл. 2 (Додаток 2).

Згідно з отриманими результатами достовірне підвищення рівня ІФН γ, в порівнянні з контрольною групою, відзначалось як у хворих з підвищеними, так і нормальними значеннями загального імуноглобуліну Е.

Концентрація гамма-інтерферону у хворих з високими значеннями загального імуноглобуліну Е (вище 150 МО / мл) перевищувала показники контрольної групи в 3,5 рази (р <0,05). Концентрація гамма-інтерферону у хворих з нормальними значеннями сироваткового імуноглобуліну Е (до 130 МО / мл) перевищувала показники контрольної групи в 3 рази (р <0,05). Отримані результати свідчать про залучення гамма-інтерферону у формування імунної відповіді при розвитку хронічного остеомієліту. Однак, ці зміни не залежали від показників загального імуноглобуліну Е в обстежуваній групі хворих з хронічним остеомієлітом.

ГЛАВА 4. ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ

Гнійно-запальні захворювання залишаються актуальною проблемою сучасної медицини. При численних клініко-лабораторних спостереженнях виявлено, що при ГВЗ відбуваються зміни в імунологічній системі організму. [Панченко М. К., Вертігора І.П., Грицай Н. П. Комплексне лікування хворих з хронічним остеомієлітом із застосуванням кісткової пластики / / Вісн. хір. - 1988. - № 10. -С.42-46 Пінєгін Б. Ф., Юдіна Т. І., Карсанова М. І. Загальні питання імунітету, иммунодиагностики та імунотерапії на моделі хірургічних інфекцій / / Сучасні проблеми алергології, клінічної імунології та імунофармакологів. -М., 1998. -С 10-178 Хаитов Р. М., Пінєгін Б. В. Вторинні імунодефіцити: клініка, діагностика, лікування / / Іммунологія.-1999. - № 2. -С.14-17]

В останні роки, завдяки розвитку методів кількісного визначення рівнів продукції цитокінів, був досягнутий значний прогрес в розумінні ролі деяких цитокінів в нормі і при патології. Найбільш оптимальними для оцінки рівнів цитокінів є імуноферментні методи, які високоспецифічний, прості і швидкі у виконанні. Застосування діагностичних імуноферментних тест-систем для оцінки цитокінового статусу, як на місцевому, так і на системному рівнях при різних патологіях є істотним доповненням до розуміння патогенезу захворювань. Вивчення рівнів цитокінів дозволяє отримати інформацію про функціональну активність різних типів імунокомпетентних клітин; про тяжкість запального процесу, його перехід на системний рівень і прогнозі, про співвідношення процесів активації Т-хелперів 1 і 2-типів, про стадії розвитку ряду алергічних і аутоімунних захворювань. Оцінка рівнів цитокінів, зокрема, з використанням імуноферментних діагностичних тест-систем дозволяє по-новому підійти до вивчення стану імунної системи організму в клінічній практиці. Зараз практично неможливо назвати патологію, яка не була б предметом вивчення цитокінів. [Дем'янов А.В., Котов А.Ю., Сімбірцев А.С. Діагностична цінність дослідження рівнів цитокінів в клінічній практиці / / Цитокіни та запалення, 2003, Т. 2, № 3, с. 20-35)]

Цитокинам належить важлива роль в розвитку і перебігу захворювань різних органів і систем.

В даний час ідентифіковано більше 100 цитокінів (Додаток 3), і їх кількість продовжує збільшуватися.

Цитокіни забезпечують передачу сигналу, обмін інформацією між клітинами всередині одного органу, зв'язок між органами та системами, як у фізіологічних умовах, так і дії різних патогенних факторів - інфекційних мікроорганізмів, механічних, термічних, хімічних травм. У здорових людей вміст цитокінів мінімально, вони виявляються лише в слідових кількостях.

При патологічних станах загальне число і зміст окремих цитокінів різко зростає.

Індукторами підвищеного синтезу цитокінів є інфекційні мікроорганізми (віруси, бактерії), продукти їх життєдіяльності, токсини, метаболіти, а також змінені, модифіковані клітини власного організму, деякі білки рослинного походження, харчові, лікарські алергени і ін

[Сімбірцев А.С. Цитокіни - нова система регуляції захисних реакцій організму / / Цитокіни та запалення, 2002, № 1]

Цитокіни можуть бути виділені в нову самостійну систему регуляції основних функцій організму, існуючу поряд з нервовою та ендокринною системами регулювання та пов'язану в першу чергу з підтриманням гомеостазу при впровадженні патогенів і порушенні цілісності тканин.

4.1. Інтерлейкін-4 і гамма-інтерферон при хронічному

рецидивуючому фурункульозі

Бактеріальні інфекції шкіри є важливою клінічною проблемою з огляду на їх поширеності в усьому світі і недостатньої ефективності терапії цих захворювань.

ХРФ - множинне і рецидивуючий поява фурункулів, гостре гнійно-некротичні запалення волосяного фолікула, що є бактеріальною інфекцією.

При імунологічному обстеженні хворих ХРФ виявляються зміни в імунній системі:

- Порушення фагоцитарної ланки (зниження фагоцитарного індексу, зниження бактерицидності нейтрофілів);

- Порушення гуморальної ланки (гіпогамаглобулінемія, зниження афінності анти-ОАД-антитіл, порушення цитокінового балансу);

3+, CD 4+, CD 21+-лимфоцитов). - Порушення клітинної ланки (лейкопенія, зниження CD 3 +, CD 4 +, CD 21 +-лімфоцитів).

Саме цитокінового дисбалансу, на нашу думку, відводиться одна з ключових ролей у генезі формування хронізації патології шкірних інфекцій.

Вміст цитокінів у периферичній крові визначали у групі 29 пацієнтів з ХРФ. сформированы 2 группы: первую группу составили 12 больных с повышенным уровнем IgE , вторую – 17 пациентов с нормальными значениями указанного иммуноглобулина. Залежно від рівня IgE сформовані 2 групи: першу групу склали 12 хворих з підвищеним рівнем IgE, другу - 17 пацієнтів з нормальними значеннями зазначеного імуноглобуліну. Контрольну групу склали 10 донорів, без ГВЗ порівнянних за статтю і віком. Клінічне обстеження хворих включало ретельний збір аллергоанамнеза.

у больных с ХРФ получены следующие результаты: концентрация IgE была выше верхней границы нормы (130МЕ/мл) в 41% случаев. При вивченні рівня сироваткового IgE у хворих з ХРФ отримані наступні результати: концентрація IgE була вище верхньої межі норми (130МЕ/мл) в 41% випадків. составил от 150 МЕ/мл до значений, превышающих 1000МЕ/мл. Розкид показників підвищеного рівня IgE склав від 150 МО / мл до значень, що перевищують 1000МЕ/мл.

является маркером аллергических реакций или причиной его повышения являются внешние воздействия – паразитарные инфекции. Відомо, що підвищений рівень загального IgE є маркером алергічних реакцій або причиною його підвищення є зовнішні впливи - паразитарні інфекції. сопутствующая аллергопатология была выявлена в 44% случаев. При клінічному обстеженні пацієнтів з ХРФ і підвищеним рівнем IgE супутня аллергопатология була виявлена ​​в 44% випадків. При цьому в 7,5% був виявлений поліноз, в 13% - алергодерматози, в 5,5% - респіраторні алергози, у 3,7% - кропив'янка, в 11% - лікарська сенсибілізація. Необтяжених аллергоанамнез відзначений в 58% випадків.

обнаружены антитела к следующим гельминтам: описторхисам, трихинеллам, токсокарам и эхинококку. Також у сироватці крові хворих ХРФ з підвищеним рівнем IgE виявлені антитіла до наступних гельмінтам: опісторхіса, трихинелла, токсокарами і ехінокок.

. Таким чином, можна вважати, що були встановлені етіологічні фактори підвищення сироваткового IgE.

На даний момент діагностична значимість оцінки рівня цитокінів полягає в констатації самого факту підвищення або зниження їх концентрації у даного хворого з конкретним захворюванням. Причому для оцінки тяжкості та прогнозування перебігу захворювання доцільно визначати концентрацію як противо-, так і прозапальних цитокінів у динаміці розвитку патології. Наприклад, вміст цитокінів у периферичній крові визначається термінами загострення, відображає динаміку патологічного процесу, зокрема при ГВЗ.

У нашій роботі ми визначали концентрацію двох цитокінів - інтерлейкіну-4 і гамма-інтерферону - за допомогою твердофазного імуноферментного. Обидва досліджуваних цитокіну беруть участь в активації і розвитку імунної реагування при інфекційно-запальних захворюваннях бактеріальної природи. Ці цитокіни є антагоністами за механізмом дії. За сучасними даними, ІЛ-4 в комплексі з гамма - інтерфероном є ключовим чинником, що визначає тип імунітету [Кетлинская С.А. / / Роль Т-хелперів типів 1 та 2 у регуляції клітинного та гуморального імунітету / Імунологія, 2002. - Тому. 23. - № 2. - С.77 - 79. ]

Інтерлейкін-4 - цитокін, що відповідає за активність гуморальної ланки. Він бере участь не тільки в розвитку прозапальних реакцій, але і відіграє значну роль у процесах хронізації. [Пекарєва Н. А., Чупрова А. В., Шваюк А. П., Горбенко О. М., Обухова О. О., Трунов А. Н. Порівняльний аналіз балансу цитокінів в сироватці крові та сечі у дітей з хронічним пієлонефритом в стадії клінічної ремісії / / Алергологія та імунологія, том 8, № 1, 2007, С. 132-133]

У наших дослідженнях при аналізі рівня сироваткового ІЛ-4 було виявлено підвищення концентрації при ХРФ в групах хворих як з підвищеним рівнем імуноглобуліну Е (вище 150 МО / мл), так і з нормальним рівнем (130 МО / мл) зазначеного імуноглобуліну. Результати дослідження рівня інтерлейкіну-4 в сироватці крові у хворих з хронічним рецидивуючим фурункульозом наведено на рис. 8 і табл. 1 (додаток 1).

Нами був зроблений висновок, що підвищення рівня інтерлейкіну-4 під час ХРФ відображає участь цього цитокіну в процесі запалення.

Відомо, що провідними змінами імунної системи при ХРФ є дефекти фагоцитарного та гуморального ланок імунітету. [А.С. Манько, Н.Х. Сетдікова, Т.В. Латишева, Ю.А. Горностаєва, О.М. Котова, Н.М. Голубєва «Клініко-імунологічна ефективність сераміда у хворих на хронічний рецидивний фурункульозом» / / Російський Алергологічний Журнал, № 5, 2005р]. Ймовірно, що виявлене підвищення концентрації ІЛ-4 є свідченням зменшення антігенпрезентірующіх і цитокін активність макрофагів при ХРФ.

4 с уровнем общего IgE . Разом з тим в обох групах хворих не виявлено кореляції рівня сироваткового IL 4 із рівнем загального IgE. 4 и различной кинетикой синтеза указанных субстанций. Ймовірно, відсутність кореляції обумовлено міжклітинним характером дії IL 4 і різної кінетикою синтезу зазначених субстанцій.

Не виключено, що знайдене в нашому дослідженні підвищення рівня сироваткового ІЛ-4 при ХРФ може сприяти придушенню звільнення цитокінів запалення (ІЛ-1, ІЛ-8), а також продукції цитокінів ТН-1-лімфоцитами (ІЛ-2, гамма-ІНФ і ін).

ТН-1-лімфоцити - це, клектом-продуценти гамма-ІНФ. ІФН γ-найважливіший ендогенний імуномодулятор, здатний активувати Т-клітинну ланку імунної системи і клітинну цитотоксичність. Підвищення рівня ІФН γ може сприяти підвищенню можливостей специфічного і неспецифічного захисту організму, і, обмеження розвитку запалення при ХРФ.

У ході дослідження було виявлено, що зміни рівня ІФН γ як у хворих з підвищеними, так і нормальними значеннями загального імуноглобуліну Е за ХРФ, достовірно не відрізнялися від показників концентрації гама-інтерферону контрольної групи (рис. 9 та табл. 1 (Додаток 1) . Оскільки відомо, що продукція ІФН γ пригнічується ІЛ-4, то, ймовірно, що виявлений в обстежуваній групі пацієнтів з ХРФ низький рівень сироваткового ІФН γ, є наслідком підвищеного рівня ІЛ-4.

в сыворотке крови, не имеет диагностического значения для выявления механизмов повышения IgE при ХРФ. Показники концентрації гама-інтерферону в обстежуваній групі хворих з ХРФ не залежали від рівня сироваткового імуноглобуліну Е. Таким чином, визначення рівня ІФН γ, відповідального за інгібування синтезу IgE в сироватці крові, не має діагностичного значення для виявлення механізмів підвищення IgE при ХРФ.

Крім того, аналіз отриманих дозволив зробити висновок про необхідність формування груп хворих, в першу чергу, в залежності від гостроти процесу при ХРФ (ремісія, підгострий період, загострення). Нам видається, що оцінка рівня ІЛ-4 та ІФН γ в період загострення дозволить отримати більшу інформацію про характер імунної відповіді при ХРФ.

4.2. Інтерлейкін-4 і гамма-інтерферон при хронічному остеомієліті

Остеомієліт - гнійне запалення кісткового мозку, що поширюється на прилеглі тканини. Виникає в результаті зараження організму бактеріями гноєродной природи на фоні зниженої імунної реактивності.

Результати численних клініко-лабораторних спостережень показують, що при О. відбуваються зміни в імунній системі організму. [Панченко М. К., Вертігора І.П., Грицай Н. П. Комплексне лікування хворих з хронічним остеомієлітом із застосуванням кісткової пластики / / Вісн . хір. - 1988. - № 10. -С.42-46 Пінєгін Б. Ф., Юдіна Т. І., Карсанова М. І. Загальні питання імунітету, иммунодиагностики та імунотерапії на моделі хірургічних інфекцій / / Сучасні проблеми алергології, клінічної імунології та імунофармакологів. -М., 1998. -С 10-178 Хаитов Р. М., Пінєгін Б. В. Вторинні імунодефіцити: клініка, діагностика, лікування / / Іммунологія.-1999. - № 2. -С.14-17] Залежно від типу мікроорганізму та стану макроорганізму (виразності системної запальної відповіді, тривалості захворювання, ендотоксемії і т.д.) при О. виникають різні порушення клітинного та гуморального імунітету, які характеризуються зниженням фагоцитарної активності, зміною синтезу компонентів комплементу, відсутністю або зниженням цитотоксичності лімфоцитів і макрофагів, зміною цитокінового статусу організму [Вишневський А. А., Тіходеев С. А., Андріанова Т. Р. Білки гострої фази, молекули низької і середньої маси в оцінці ендотоксемії при остеомієліті хребта / / Праці міської багатопрофільної бльніци № 2. - СПб.: Ольга, 2001.-С.4-11 Тіходеев С. А., Вишневський А. А. Неспецифічний остеомієліт хребта. -СПб.: Ізд.дом СПбМАПО, 2004. -250С]

Перебіг запальних захворювань залежить від стану імунної системи і від ступеня вираженості запального відповіді. У зв'язку з цим рання імунодіагностика і оцінка стадії захворювання є невід'ємним комплексом у лікуванні пацієнтів, дозволяє не тільки прогнозувати перебіг захворювання, але і дає можливість підібрати патогенетичну терапію. [Вишневський А. А., Орлов А. Б., Тіходеев С. А. Вибір імуномодулюючої терапії при неспецифічному остеомієліті хребта / / Вісн. хір. Т.165 .- № 2.-2006.-С.32-36]

Дослідження рівня цитокінів у здорових людей і хворих О. допоможе зрозуміти роль цих молекул в перебігу захворювання, що можна буде використовувати для ранньої діагностики і лікування препаратами цитокінів.

Результати дослідження вмісту інтерлейкіну-4 показують достовірне підвищення рівня ІЛ-4, в порівнянні з контрольною групою, як у хворих з підвищеними, так і нормальними значеннями загального імуноглобуліну Е. Результати дослідження рівня інтерлейкіну-4 в сироватці крові у хворих з хронічним остеомієлітом наведені на рис. 10 і табл. 2 (Додаток 2).

Підвищення рівня ІЛ-4 в сироватці крові хворих свідчать про залучення цього цитокіну в процес запалення при хронічному остеомієліті. Відомо, що деякі бактерії здатні вимикати процеси антитілоутворення через індукцію чинників, що перешкоджають активації Т-клітин [Белохвостикова Т.С., Кірдей Л.Є ., Гаврилова Є.Ю., ПРОМТ М.В., Леонова С.М., Кірдей Є.Г. Корекція вторинних порушень імунної системи при хронічному посттравматичному остеоміеліте. / Медична імунологія, 2002, т.4, № 2, с.228-229.]. Не виключено, що підвищення рівня ІЛ-4 є однією з ланок у ланцюжку імунної відповіді, що призводить до відсутності або зниження цитотоксичності Т-лімфоцитів і макрофагів при хронічному остеомієліті. Наші дані узгоджуються з даними ряду авторів про інгібуванні цитотоксичної активності Т-лімфоцитів і макрофагів при остеомієліті [Вишневський А. А., Тіходеев С. А., Андріанова Т. Р. Білки гострої фази, молекули низької і середньої маси в оцінці ендотоксемії при остеомієліті хребта / / Праці міської багатопрофільної бльніци № 2. - СПб.: Ольга, 2001.-С.4-11 Тіходеев С. А., Вишневський А. А. Неспецифічний остеомієліт хребта. -СПб.: Ізд.дом СПбМАПО, 2004. -250С]. Ймовірно, ІЛ-4 стимулює проліферацію тимоцитів і Т-клітин і викликає зростання тучних клітин при розвитку і перебігу запалення при хронічному остеомієліті, і таким чином, відіграє центральну роль в модуляції імунної відповіді.

Е) не выявлено корреляции уровня сывороточного ИЛ-4 с уровнем общего IgE . Як видно з результатів нашого дослідження, в обох групах пацієнтів (з підвищеним рівнем і нормальними значеннями Ig Е) не виявлено кореляції рівня сироваткового ІЛ-4 з рівнем загального IgE. Ймовірно, що відсутність статистично значущих відмінностей у цих групах обумовлено міжклітинним характером дії ІЛ-4 і різної кінетикою синтезу зазначених субстанцій. в сыворотке крови‚ не имеет диагностического значения для выявления механизмов повышения IgE при хроническом остеомиелите. Таким чином, визначення рівня ІЛ-4, як цитокіну, відповідального за вироблення IgE в сироватці крові, не має діагностичного значення для виявлення механізмів підвищення IgE при хронічному остеомієліті.

У ході вивчення рівня гама-інтерферону встановлено достовірне підвищення рівня ІФН γ, в порівнянні з контрольною групою, як у хворих з підвищеними, так і нормальними значеннями загального імуноглобуліну Е. Результати дослідження рівня гама-інтерферону в сироватці крові у хворих з хронічним остеомієлітом наведені на рис. 11 і табл. 2 (Додаток 2).

Відомо, що гамма-інтерферон сприяє більш ефективному знищенню макрофагами внутрішньоклітинних мікроорганізмів [Holter ., Grunow W., Grunow ., Stockinger R., Stockinger ., et H., Et .// J . Immunol .-1986.- V .136.- N .6.- P .2171.]‚ т.е. al. / / J. Immunol .- 1986 .- V .136 .- N .6 .- P .2171.], тобто ІФН γ є потужним активатором макрофагів. Проте, порушення в клітинного та гуморального імунітету при остеомієліті призводять до зниження фагоцитарної активності. Ймовірно, що підвищення рівня ІФН γ в обстеженій групі хворих з хронічним остеомієлітом, є специфічною реакцією організму, що призводить до активації макрофагів. Не виключено, що підвищення концентрації ІФН γ є одним з етапів у каскаді реакцій, що ведуть до підвищення можливостей специфічного і неспецифічного захисту організму, і, що обмежують розвиток запалення при хронічному остеомієліті.

Е) не выявлено коррелятивных связей сывороточного ИФН γ с уровнем общего IgE . Як видно з результатів нашого дослідження, в обох групах пацієнтів (з підвищеним рівнем і нормальними значеннями Ig Е) не виявлено корелятивних зв'язків сироваткового ІФН γ з рівнем загального IgE. в сыворотке крови‚ не имеет диагностического значения для выявления механизмов повышения IgE при хроническом остеомиелите. Таким чином, визначення рівня ІФН γ, як цитокіну, відповідального за інгібування синтезу IgE в сироватці крові, не має діагностичного значення для виявлення механізмів підвищення IgE при хронічному остеомієліті.

Так само як і при аналізі даних про рівень цитокінів при ХРФ був зроблений висновок, що при хронічному остеомієліті необхідно формувати групи хворих, в залежності від гостроти процесу (ремісія, підгострий період, загострення).

Таким чином, в даний час не викликає сумніву, що цитокіни є найважливішими чинниками імунопатогенезі. А вивчення рівня цитокінів - медіаторів імунітету - дозволяє отримати інформацію про функціональну активність різних типів імунокомпетентних клітин і робити висновок про характер перебігу гнійно-запального процесу.

Безумовно, рівень цитокінів доцільніше вимірювати у відповідних тканинах після екстракції тканинних протеїнів з біоптатів відповідних органів або в природних рідинах, оскільки цитокіни є локальними медіаторами. Подібні дослідження будуть предметом нашого подальшого вивчення імунних механізмів у патогенезі хворих з ГВЗ.

ВИСНОВКИ

1. Виявлено достовірне підвищення (в порівнянні з контрольною групою) концентрації інтерлейкіну-4 у сироватці крові хворих з хронічним рецидивуючим фурункульозом, і на тлі підвищеного і на фоні нормального рівня загального імуноглобуліну Е.

2. Показники концентрації гама-інтерферону в сироватці крові хворих з підвищеним та нормальним рівнем загального імуноглобуліну Е при хронічному рецидивуючому фурункульозі достовірно не відрізнялися від показників концентрації гама-інтерферону контрольної групи.

3. Виявлено достовірне підвищення (в порівнянні з контрольною групою) концентрації інтерлейкіну 4 в сироватці крові хворих з хронічним остеомієлітом, і на тлі підвищеного і на фоні нормального рівня загального імуноглобуліну Е.

4. Виявлено достовірне підвищення (в порівнянні з контрольною групою) концентрації гамма-інтерферону в сироватці крові хворих з хронічним остеомієлітом, і на тлі підвищеного і на фоні нормального рівня загального імуноглобуліну Е.

5. Показники концентрації інтерлейкіну 4 в групах пацієнтів з підвищеним та нормальним показником загального імуноглобуліну Е при хронічному рецидивуючому фурункульозі і хронічному остеомієліті, достовірно не відрізнялися один від одного.

6. Показники концентрації гама-інтерферону не залежали від показників загального імуноглобуліну Е в обстежуваних групах хворих з хронічним рецидивуючим фурункульозом і хронічний остеомієліт.

ЛІТЕРАТУРА

1. Ашмарин Ю. Я., Креінін В. М. Фурункульоз. М., 1974. 12-23 с.

2. Белохвостикова Т. С., Кірдей Л. Є., Гаврилова Є. Ю., ПРОМТ М. В., Леонова С. М., Кірдей Є. Г. Корекція вторинних порушень імунної системи при хронічному посттравматичному остеомієліті / / Медична імунологія. 2002. т.4. № 2. С. 228-229.

3. Борисов Л.Б. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія. М.: Медицина, 1994. 485-487 с.

4. Вишневський А. А., Орлов А. М. До питання про оцінку імунологічного статусу у хворих з неспецифічним остеомієлітом хребта / / Вісн. хір. 2004. № 5. С. 73-78.

5. Вишневський А. А., Орлов А. Б., Тіходеев С. А. Вибір імуномодулюючої терапії при неспецифічному остеомієліті хребта / / Вісн. хір. 2006. Т.165. № 2. С. 32-36.

6. Вишневський А. А., Тіходеев С. А., Андріанова Т. Р. Білки гострої фази, молекули низької і середньої маси в оцінці ендотоксемії при остеомієліті хребта / / Праці міської багатопрофільної бльніци № 2. СПб.: Ольга, 2001. С.4-11.

7. Вишневський А. А., Тіходеев С. А. До питання про особливості перебігу остеомієліту та його діагностика / / Сучасні напрямки в діагностиці, лікуванні та профілактиці захворювань: Праці міської багатопрофільної лікарні № 2. СПб: Ольга, 2002. С.91-98.

8. Дем'янов А. В., Котов О. Ю., Сімбірцев А. С. Діагностична цінність дослідження рівнів цитокінів в клінічній практиці / / Цитокіни та запалення. 2003. Т. 2. № 3. С. 20-35.

9. Драннік Г. М. Клінічна імунологія та алергологія. МІА. М. 2003р. 98-109 с.

10. Зав'ялов В. П. Структурно-функціональна класифікація та еволюція цитокінів / / Вісник РАМН. 1993. 2 . № 2. 8 – 10. С. 8 - 10.

11. Кашкін К. П. Цитокіни імунної системи: основні властивості та імунобіологічна активність / / Клінічна лабораторна діагностика. 1998. № 11. С. 21 - 32.

12. Керк О. В., Гусєва В. М., Потапенко Е. І., Якунова О. А. та ін Роль імунологічних показників при туберкульозі і остеомієліті хребта / / Медична імунологія. 2005. № 2-3. С.243-244.

13. Шкірні хвороби / / Под ред. Кубанова А. О. М.: ГЕОТАР Медицина, 1999р. 175-184с.

14. Кольман Я., Рем К. - Г. Наочна біохімія. «Світ», 378-379с.

15. Лакин Г. Ф. Біометрія. М.: Вища школа, 1990. 352с.

16. Манько А. С.,. Сетдікова Н. Х., Латишева Т. В.,. Горностаєва Ю. А., Котова О. М., Голубєва Н. М. «Клініко-імунологічна ефективність сераміда у хворих на хронічний рецидивний фурункульозом» / / Російський Алергологічний Журнал. 2005р. № 5. С. 34-36.

17. Панченко М. К., Вертігора І.П., Грицай Н. П. Комплексне лікування хворих з хронічним остеомієлітом із застосуванням кісткової пластики / / Вісн. хір. 1988. № 10. С. 42-46.

18. Пекарєва Н. А., Чупрова А. В., Шваюк А. П., Горбенко О. М., Обухова О. О., Трунов А. М. Порівняльний аналіз балансу цитокінів в сироватці крові та сечі у дітей з хронічним пієлонефритом в стадії клінічної ремісії / / Алергологія та імунологія. 2007. том 8. № 1. С. 132-133.

19. // Объединённый иммунологический форум: Тезисы. Перетня М. М., Сенькове Л. В., Добродєєв К. Г., Капутін С. Л. та ін До питання про роль IgE / / Об'єднаний імунологічний форум: Тези. Єкатеринбург. 2004. С. 119.

20. Перцева Т. А., Конопкін Л. І. Інтерферони та їх індуктори / / Український хіміотерапевтічній журнал. 2001. № 2. С. 62-67.

21. Пінєгін Б. Ф., Юдіна Т. І., Карсанова М. І. Загальні питання імунітету, иммунодиагностики та імунотерапії на моделі хірургічних інфекцій / / Сучасні проблеми алергології, клінічної імунології та імунофармакологів. М. 1998. З 10-178.

22. Сетдікова Н. Х., Латишева Т. В. Комплексні механізми розвитку хронічного рецидивуючого фурункульозу та шляхи їх корекції / / Імунологія. 2000. № 3. С. 48-50.

23. Сімбірцев А. С. Цитокіни - нова система регуляції захисних реакцій організму / / Цитокіни та запалення. 2002. № 1. С. 9-16.

24. Тіходеев С. А., Вишневський А. А. Неспецифічний остеомієліт хребта. СПб.: СПбМАПО, 2004. 250С.

25. Хаитов Р. М., Ігнатьєва Г. А., Сидорович І. Р. Імунологія: підручник. М.: Медицина, 2000. 186-189с.

26. Хаитов Р. М., Пінєгін Б. В. Вторинні імунодефіцити: клініка, діагностика, лікування / / Імунологія. 1999. № 2. С. 14-17.

27. Agui T. Stimulation of interleukin-6 production by endothelin in rat bone marrow-derived stromal cells. / / Blood. 1994. Vol. 84. P. - 31 . 25 - 31.

28. Anliytsky W., Schuler M,, Peschel C. / / Drugs. 1994. V. 48. P. 667.

29. Becker S., Groner B. Р . & Muller CW Three-dimentional structure of the Stat3b homodimer bound to DNA Nature, 394, 1998 Р. 145-151.

30. Brisce J. et al. JAKs and STATs branch out Trends in Cell Biology. Р . 1996. Р. . 336 - 340.

31. Holter W., Grunow R., Stockinger H., et al. / / J.Immunol.-1986. V.136. - 71 . N.6. P.21 - 71.

32. Keegan A., Nelms K., Wang L., Pierce J., Paul W. / / Immunol. Today. 1994. V. 15. P. . 423.

33. Paul W. / / Blood. 1991. V. 77. P. - 59 . 18 - 59.

1. Paul WE, Seder RA Lymphocyte responses and cytokines Cell. Р . 76. Р. 241-251.

2. Young HA / / Seminars in Virology. 1995. V. 6. P. . 175-180.

ДОДАТОК

Интерлейкин -4 (IL4) и Додаток 1. Інтерлейкін -4 (IL4) і интерферон (IFN γ ) у больных с хроническим рецидивирующим фурункулезом γ - інтерферон (IFN γ) у хворих з хронічним рецидивуючим фурункульозом

4) и γ -интерферона ( IFN γ ) в сыворотке крови больных с хроническим рецидивирующим фурункулезом в зависимости от уровня IgE Таблиця 1. Зміст інтерлейкіну-4 (IL 4) і γ-інтерферону (IFN γ) у сироватці крові хворих з хронічним рецидивуючим фурункульозом в залежності від рівня IgE

Примітка. * - Достовірно в порівнянні з контролем, р <0,05

** - Достовірно в порівнянні з контролем, р <0,01

4) и γ -интерферон ( IFN γ ) у больных с хроническим остеомиелитом Додаток 2. Інтерлейкін-4 (IL 4) і γ-інтерферон (IFN γ) у хворих з хронічним остеомієлітом

4) и γ -интерферона ( IFN γ ) в сыворотке крови больных с хроническим остеомиелитом в зависимости от уровня IgE Таблиця 2. Зміст інтерлейкіну-4 (IL 4) і γ-інтерферону (IFN γ) у сироватці крові хворих з хронічним остеомієлітом в залежності від рівня IgE

Примітка. * - Достовірно в порівнянні з контролем, р <0,05

** - Достовірно в порівнянні з контролем, р <0,01

Додаток 3.

Таблиця 3. Цитокіни людини