Апарат експресії генів і його логіка

б. ДНК-залежні РНК-полімерази
У прокаріотів синтез всіх видів РНК-мРНК, рРНК і тРНК, а також більш спеціалізрованних РНК, що беруть участь в процессингу РНК, - каталізується єдиною ДНК-залежною РНК-полімеразою. Бактеріальні РНК-полімерази - це складні білки, що складаються з декількох різних субодиниць. Найбільш вивчений фермент - холоферменту РНК-полімераза Є. coli - містить п'ять різних поліпептидних субодиниць: дві а-ланцюги, одну в-і одну в'-ланцюга, а-і ю-ланцюга. Альтернативна, співіснують з першої форма ферменту, звана кором, позбавлена ​​а-субодиниці.
Одиницями холоферменту вивчена роль а-субодиниці. Корфермент, позбавлений а-субодиниці, каталізує більшість реакцій, необхідних для транскрипції ДНК з утворенням РНК, а саме комплементарное копіювання матричної ланцюга, освіта фосфодіефірних зв'язків та терминацию ланцюга РНК. Однак він не може ініціювати синтез РНК в потрібному місці, оскільки не здатний дізнаватися промоторні сайти. Точне зв'язування та ініціація в промоторах відбуваються тільки після додавання до корферменту а-субодиниці та освіти холоферменту. Таку поведінку можна пояснити, наприклад, тим, що корфермент дуже міцно, але неспецифічно зв'язується з ДНК, а тому рідко виявляється в тому місці, де знаходиться промотор. І навпаки, холоферменту зв'язується з неспецифічними ділянками ДНК неміцно і, послідовно зв'язуючись з різними областями ДНК, знаходить промотор і міцно зв'язується з ним. Після утворення кількох перших фосфодіефірних зв'язків а-субодиниця відокремлюється від ініціюючого комплексу, і подальша транскрипція здійснюється за допомогою корфермента. Транскрипція безперервно продовжується до тих пір, поки фермент не досягне сайту термінації транскрипції. Отже, а-субодиниця забезпечує ефективне зв'язування холоферменту з промотором, а при її від'єднанні полімераза перемикається на елонгацію. А-Субодиниця може знову стимулювати ініціацію, специфічно зв'язавшись з іншою молекулою РНК-полімерази.
Є дані про те, що здатність РНК-полімерази дізнаватися промотор може змінюватися при зв'язуванні з різними а-субодиницями. Так, після зараження Bacillus subtilis певними бактеріофагами або на ранніх стадіях спо-руляціі експресуються різні а-субодиниці і в результаті змінюється порядок транскрипції клітинних і вірусних генів. Чи використовує РНК-полімераза інших прокаріот різні а-субодиниці для регуляції промоторної специфічності, поки невідомо.
Не всі РНК-полімерази прокаріотів представляють собою мультісуб'едінічние ферменти. РНК-полімерази, які кодуються бактеріофагами Т3 і Т7 Є. coli, - це поодинокі поліпептидні ланцюги середньої довжини. Ці ферменти високоспецифічні відносно промоторних сайтів, що використовуються для транскрипції певного набору вірусних генів. Такі «спрощені» ферменти мають всі активностями мультісуб'едінічних РНК-полімераз. Вони каталізують синтез РНК на ДНК-матрицях і здійснюють правильну терминацию ланцюгів РНК.
в. Транскрипція ініціюється в особливих нуклеотидних послідовностях
Транскрипція ініціюється при утворенні стабільного комплексу між холоферменту і специфічної послідовністю, промотором і розташовується на початку всіх транскрипційних одиниць. Вивчення нуклеотидної послідовності більш ніж 50 різних промоторних сайтів прокаріотів і мутаційний аналіз виявили тільки два консервативних ділянки, мабуть грають ключову роль в розпізнаванні і функціонуванні промотора. Одна з цих послідовностей складається з шести або семи пар основ і розташована на відстані приблизно 10 підстав до того нуклеотиду, з якого починається транскрипція; цей сигнал звичайно позначають як-10-послідовність. Порівняльний аналіз 10-послідовностей приблизно 50 промоторів прокаріотів показав, що всі вони трохи відрізняються від консенсус-послідовності ТАТААТ. Підкреслений Т присутній майже у всіх промоторах, тоді як по інших позиціях в кожному промоторі може спостерігатися від одного до декількох варіантів.
Друга послідовність, довжина якої зазвичай дорівнює дев'яти нуклеотидам, розташована на відстані ~ 35 підстав до сайту ініціації і також зустрічається в більшості промоторів прокаріотів. Нуклеотидна послідовність сегмента між -35 - і-10-ділянками не є критичною, важливо лише відстань між цими ділянками. -35-послідовність бере участь у зв'язуванні РНК-полімерази, що передує переміщенню ферменту в Прібновбокс. Можливо, РНК-полімераза викликає локальне розкручування спіралі, починаючи цей процес з Прібновбокса, і створює умови для ініціації синтезу РНК.
Проте залишається відкритим питання, чи достатньо простого зв'язування РНК-полімерази з промотором для локального розбіжності ланцюгів поблизу сайту ініціації синтезу РНК або РНК-полімераза розплітає спіраль у стартовому сайті. Незалежно від механізму утворення «відкритого» промоторної комплексу дозволяє РНК-полімеразі здійснити спаровування першого і другого рибонуклеозид-трифосфато з матричною ланцюгом і каталізувати освіта першого фосфодіефірних зв'язку.
Відмінності в ефективності транскрипції індивідуальних генів частково залежать від структури їх промоторів. Як міцність взаємодії РНК-полімерази з промоторної послідовністю, так і ефективність освіти «відкритого» промоторної комплексу визначаються конкретними нуклеотидними послідовностями -35 - і-10-ділянок відповідно. Мутації в цих ділянках призводять до значних змін здібності багатьох промоторів забезпечувати ініціацію транскрипції. У деяких випадках ініціацію транскрипції в малоефективних промоторах полегшують допоміжні білки, що зв'язуються з ДНК поблизу-35-послідовностей. Суть подібного феномена до кінця не з'ясована, але відомо, що іноді білки, що зв'язуються з-35-послідовністю, збільшують ймовірність того, що вона буде виявлена ​​РНК-полімеразою та зв'яжеться з нею. Зв'язування білків-активаторів може призвести також до зміни структури ДНК і тим самим сприяти ініціації транскрипції. Зміна топологічної структури ДНК - особливо збільшення числа негативних сверхвітков - також може призводити до підвищення або зниження ефективності деяких промоторів.
р. Термінація транскрипції і відділення ланцюгів РНК
Послідовності ДНК, що є сигналами зупинки транскрипції, називаються транскрипційними термінаторами. Виявлено два типи сигналів термінації - р-залежний і р-незалежний термінатори. Обидва вони мають деякі спільні ознаки. І той і інший містять інвертовані повтори, завдяки чому 3'-кінці РНК-транскриптів складаються з утворенням шпильок різної довжини. Стебла шпильок р-незалежних термінаторів зазвичай містять GC-багаті ділянки; один з них знаходиться поблизу основи стебла, і до нього примикає ділянка, що складається з чотирьох-шести уріділових і одного-двох аденілових залишків. У стеблі р-залежних термінаторів, навпаки, міститься лише кілька GC-пар, а урідіновие 3'-хвости можуть бути відсутні.
Точний механізм р-незалежної і р-залежною термінації транскрипції є поки що предметом дискусій. Найбільш ймовірним є таке пояснення р-незалежної термінації: РНК-полімераза зупиняється після транскрипції інвертованого повтору, тому що шпилькова структура виявляється перешкодою. У результаті відразу після зупинки процесу РНК відділяється від матричної ланцюга поблизу U-багатого ділянки, який відносно слабко спарений з А-багатим ділянкою матриці. Цим, мабуть, пояснюється та обставина, що найбільш часто на кінці ланцюга РНК знаходяться уріділовие або аденілових залишки.
Р - це олігомерних білок, міцно зв'язується з РНК і в цьому стані гідролізу АТР до ADP і неорганічного фосфату. В одній з моделей дію р-білка пояснюється тим, що він зв'язується з синтезується ланцюгом РНК і переміщається уздовж неї в напрямку 5 '-> 3' до місця синтезу РНК; необхідна для його переміщення енергія виділяється при гідролізі АТР. Якщо р-білок наштовхується на утворюється в РНК шпильку, він зупиняє полімеразу, яка могла б продовжувати транскрипцію. Можливо, для від'єднання РНК від матриці достатньо цієї р-індукованої зупинки, але не виключено, що дисоціації і відділенню сприяє сам р-білок.
Термінація транскрипції рідко є абсолютно залежною або абсолютно незалежною від р-білка. Деякі р-незалежні термінатори працюють у присутності р більш ефективно. А в деяких умовах так звані р-залежні термінатори викликають терминацию і під час відсутності р, хоча і не так успішно.
Термінація, як і ініціація синтезу РНК, є регульованим процесом. Існують білки, що функціонують як антітермінатори і запобігають терминацию в р-незалежних термінатора; відомі також інші білки, інгібуючі р і тим самим забезпечують подовження ланцюжка після сигналів термінації. За певних обставин молекули РНК можуть утворювати альтернативні шпилькові структури на особливих послідовностях певних ділянок ДНК. Одні з таких структур можуть призводити до абортивної термінації, а інші - до продовження транскрипції.
3. Процесинг РНК у прокаріот
Первинні транскрипти, які утворюються при транскрипції прокаріотів генів, що кодують білки, функціонують як мРНК без подальшої модифікації або процесингу. Дійсно, трансляція мРНК часто починається навіть до завершення синтезу 3'-кінця транскрипту. Зовсім інша ситуація спостерігається для молекул рРНК і тРНК. У цьому випадку кластери рРНК-або тРНК-генів або навіть перемежовуються ділянки цих генів часто транскрибуються з утворенням єдиного ланцюга РНК. І хоча транскрипція цих генів завжди починається на певних промоторах і закінчується на певних термінатора, для утворення зрілих функціональних форм повинні відбутися специфічне надрізання первинних РНК-транскриптів та модифікація. Подібні молекулярні події називають загальним терміном Посттранскрипційна модифікації або просто процесинг РНК. Механізми процесингу рРНК і тРНК і ферменти, за допомогою яких він здійснюється, найбільш повно вивчені у Є. coli, і для ілюстрації особливостей Посттранскрипційна процесингу РНК ми використовуємо цю систему. Аналогічні модифікації еукаріотичних РНК; в цьому випадку крім процесингу рРНК і тРНК використовуються більш складні системи дозрівання транскриптів з утворенням мРНК.
а. Групи генів, що кодують рРНК і тРНК
У геномі Є. coli ідентифіковані і картіровани сім дискретних транскрипційних одиниць, що кодують рРНК. Кожна транскрипційних одиниця - це молекула РНК, яка складається з ~ 5000 нуклеотидів і містить по одній копії кодують послідовностей для 5S-, 16S-і 23S-pPHK. Транскрипція в цій області здійснюється у напрямку 16S -> 23S -> 5S. Крім цих трьох послідовностей, що кодують рРНК, транскрипти містять вставки різної довжини і одну або більше копій тРНК-генів. Спейсери можуть перебувати перед послідовностями для рРНК, між ними і після них, а тРНК-гени зазвичай лежать у межах вкраплених або 3'-кінцевих спейсерних сегментів. Для утворення функціонально зрілих молекул РНК повинен відбутися процесинг таких транскриптів. До процесингу або під час нього відбувається модифікація специфічних підстав у спейсера, а також у рРНК-і тРНК-генах.
б. Розрізання рРНК-тРНК-котранскріптов
Початкове розщеплення первинних транскриптів на фрагменти, що містять або тРНК, або 16S-, 23S-або 58-рРНК-послідовності, здійснює ендонуклеаза РНКаза III. Її мішенями служать короткі дуплекси РНК, які утворюються при внутрішньомолекулярним спарюванні підстав в послідовностях, що фланкують кожен з рРНК-сегментів. Наприклад, комплементарні ділянки в спейсерних областях, фланкують послідовність 16S-pPHK, утворюють стебло шпильки, в петлі якої знаходиться послідовність 16S-pPHK. Аналогічні шпильки утворюють і послідовності 23S-і 5S-pPHK. РНКаза III вносить розриви в дволанцюжковій стебло, в результаті утворюється ланцюг РНК, що містить послідовність тієї чи іншої рРНК, фланкованому короткими спейсернимі ділянками з 5'-фосфатним і 3'-гідроксильних кінцями. Потім зайві нуклеотиди спейсерних послідовностей видаляються, можливо за допомогою тієї ж самої РНК-екзонуклеазами, яка каталізує і останні етапи процесингу тРНК. У принципі для того, щоб відбулося ферментативне розщеплення, повинні бути транскрибовано тільки ті нуклеотидні послідовності, які утворюють шпильки. Однак процесинг відбувається лише після завершення синтезу всього первинного транскрипту, оскільки, мабуть, для правильного укладання цілого РНК-транскрипту, який і розпізнається ендонуклеаз III, необхідні рибосомні або будь-які інші білки. Процесинг тРНК-сегментів, вищепляются з мультігенних транскриптів, здійснюється так само, як і процесинг тРНК з транскрипційних одиниць одиночних генів.
в. Освіта зрілих тРНК з більших транскриптів
Незважаючи на те, що деякі кодують тРНК гени знаходяться всередині транскрипційних одиниць рРНК та експресуються спільно з генами рРНК, основна частина тРНК-генів представлена ​​поодинокими генами або об'єднана в кластери. Одні кластери містять множинні повтори одних і тих же генів, інші - різні і неспоріднені тРНК-гени. У деяких випадках кожен кластер транскрибується як одна велика молекула РНК, яка піддається процесингу з послідовним відщепленні зрілих тРНК-фрагментів. Для утворення зрілої функціональної тРНК, мабуть, повинні відбутися специфічна модифікація підстав і приєднання одного, двох або всіх трьох нуклеотидів 3'-ССА-кінця.
Незалежно від того, чи містить первинний транскрипт одну або більше тРНК-послідовностей або ці послідовності впроваджені в спейсерние ділянки рРНК, 5'-кінці всіх тРНК утворюються за участю однієї ендонуклеази, званої РНКази Р. Мабуть, РНКаза Р дізнається характерну згорнуту структуру тРНК в полинуклеотид-попередника і відщеплює лідерних або спейсерную послідовності, розташовані перед 5'-кінцем зрілої послідовності тРНК. 3'-кінці тРНК утворюються за допомогою кількох активностей. До цих пір неідентифікована ендонуклеаза розщеплює попередник в тому місці шпильки, де знаходиться 3'-кінець зрілої тРНК, а потім інша ендонуклеаза, РНКаза D, завершує освіту правильного 3'-кінця. У деяких випадках екзонуклеазну розщеплення припиняється точно у 3'-ССА-кінця зрілої тРНК, а в інших випадках під дією екзонуклеазами утворюється кінець, службовець запалом, до якого тРНК-нуклеотіділтрансфераза додає один або більше інваріантних кінцевих нуклеотидів.
Відмінною особливістю РНКази Р є те, що сайт розщеплення для неї формується в результаті правильного укладання молекули тРНК. Зміни у нуклеотидної послідовності, що не приводять до порушення цієї укладання, не позначаються і на процессингу 5'-кінця. Іншим незвичайним властивістю РНКази Р є те, що вона складається з білка і РНК. Ця РНК має специфічну послідовність з 377 нуклеотидів і сама транскрибується РНК-полімеразою з гена трохи більшого розміру і потім піддається процесингу до розміру зрілої молекули. Дивною особливістю цієї РНК виявилося те, що вона одна може каталізувати таку ж ендонуклеазною реакцію, що і цілий рибонуклепротеіну; білок ж не має самостійної ендонуклеазною активністю. Таким чином, ендонуклеазною активність може бути притаманна самій РНК, а білок, мабуть, необхідний для збереження структури РНК в максимально активної конфігурації.
Зрілі тРНК не тільки мають характерну конформацію, але й містять модифіковані нуклеотиди. Багато з таких модифікацій виявляються істотними для виконання деяких фізіологічних функцій тРНК. Сьогодні охарактеризовано лише деякі з цілої армії ферментів, що каталізують величезна кількість реакцій модифікації. Однак ясно, що модифікації відбуваються в основному на стадії РНК-попередника і в повністю процессірованной тРНК. Такі модифікуючі ферменти становлять особливий інтерес завдяки своїй незвичайній специфічності щодо певних послідовностей: наприклад, тільки окремі ураціловие залишки перетворюються на тиоурацил, метіліруют до тиміну або відновлюються до дігідроураціла. Ще більш загадковим видається освіта псевдоуріділата при модифікації звичайного зв'язку між урацилом і рибоза.
4. Генетичний код
Послідовність амінокислот в білках визначається порядком розташування дезоксинуклеотидов в генах, що кодують білки, точніше - послідовністю рибонуклеотидов в мРНК-транскриптах. Інформаційний зв'язок між нуклеотидними і амінокислотними послідовностями здійснюється за допомогою генетичного коду. Для складання генетичного словника було проведено безліч спеціальних генетичних і біохімічних експериментів. Він включає також і розділові знаки - початок і кінець ділянок, що кодують білки. За винятком незначних варіацій у використанні декількох нуклеотидів для кодування особливих амінокислот у мітохондрій і деяких інфузорій, генетичний словник універсальний, тобто конкретна послідовність нуклеотидів задає однакову для всіх живих організмів амінокислотну послідовність.
Наявність такої системи кодування передбачає існування якогось механізму для перекладу інформації з мови нуклеотидів на мову амінокислот. Як і слід було очікувати, цей механізм і реакції, які здійснюють переказ, дуже складні. Незважаючи на відмінності між про-і еукаріотів як у тому, що стосується структури мРНК, так і в фізичному взаємовідносини генів і апарату трансляції, обидва типи організмів використовують дуже подібні механізми для розшифровки генетичних послань.
а. Амінокислотна послідовність білків відповідає нуклеотидної послідовності кодують їх генів
Припущення про колінеарності нуклеотидних та амінокислотних послідовностей було висловлено в числі перших у дискусії про природу генетичного коду. Здогадки такого роду виникли після того, як було показано, що багато мутації проявляються в заміні однієї-єдиної амінокислоти в білках бактерій, рослин або тварин. Але гіпотеза колінеарності залишалася непідтвердженою до тих пір, поки не були проведені ретельні генетичні та біохімічні дослідження добре охарактеризованих генно-білкових систем. Наприклад, було показано, що відносне положення амінокислотних замін в а-субодиниці тріптофансінтетази Є. coli узгоджується з відносною локалізацією на карті відповідних мутацій в trpA-гені цього мікроорганізму. Однак виділити і охарактеризувати мутантних ДНК в той час не вдалося, тому не можна було встановити відповідність між нуклеотидними послідовностями і амінокислотними.
Теоретичний аналіз призвів до припущень, що найбільш підходить за розміром для генетичної кодує одиниці, або кодону, є послідовність з трьох нуклеотидів. В основі цього висновку лежали три міркування. По-перше, чотири нуклеотиду, взяті по одному, можуть кодувати тільки чотири різні амінокислоти. Сполучення з двох нуклеотидів можуть кодувати тільки 4 ^2, або 16 амінокислот, а це менше, ніж ті 20 амінокислот, які, як було відомо, присутні в білках. І тільки сукупності трьох нуклеотидів дають 64 можливих кодону, тобто число, більш ніж достатня для кодування 20 різних амінокислот. Генетичні експерименти, виконані на мутантів з делеція або вставками завдовжки один, два або три нуклеотиду в генах, що кодують білки, дозволили довести, що найбільш підходящий розмір для кодону - три нуклеотиду. Більш того, з цих досліджень був зроблений висновок, що нуклеотидна послідовність зчитується розташованими один за іншим триплетами з фіксованої точки. Всі ці висновки поряд з даними про те, що поліпептидні ланцюги синтезуються послідовно шляхом з'єднання аміногрупи однієї амінокислоти з карбоксильною групою інший, послужили наріжним каменем у розшифровці генетичного коду.
б. Відповідність між амінокислотами та їх кодонами
Одним із загадкових моментів кодування була відсутність структурної комплементарності між нуклеїновими кислотами, з одного боку, і амінокислотними ланцюжками - з іншого. Вихід із цього концептуального глухого кута-відповідь на питання, як амінокислоти спаровуються з відповідними кодонами, - був знайдений, коли з'явилася ідея про існування адаптора. Відповідно до цієї ідеї, амінокислоти спочатку зв'язуються з молекулами РНК, а потім такі гібриди шикуються уздовж мРНК, з'єднуючись з нею шляхом комплементарного спаровування декількох підстав у адапторной молекулі РНК з відповідним кодоном в мРНК. Адапторная гіпотеза отримала суворе експериментальне підтвердження після того, як були виявлені тРНК і ферменти, відповідальні за зв'язування амінокислот і тРНК, і показано, що приєднані до тРНК амінокислоти є прямими попередниками при складанні поліпептиду.
Якщо тРНК - це адаптори, то кожна амінокислота повинна приєднуватися тільки до специфічної тРНК, а кожна тРНК - спаровуватися тільки з одним, відповідним їй кодоном. Правильність першого з цих положень була доведена за відкриттям особливих ферментів - аміноацил-тРНК-синтетаз, кожен з яких пов'язує одну-єдину амінокислоту з однією або декількома спорідненими тРНК. Ці ферменти і каталізуються ними реакції більш детально будуть розглянуті в розд. 3.5.а. Тут досить сказати, що зв'язування амінокислот з молекулами тРНК - це перший крок у процесі розшифровки. Правильність другого положення адапторной гіпотези - про те, що тРНК сама визначає місце своєї амінокислоти в поліпептидному ланцюзі - була підтверджена за допомогою простого експерименту. Одна з амінокислот, будучи пов'язаною з відповідної тРНК, була хімічно перетворена в іншу. Після включення цієї модифікованої амінокислоти в білок in vitro було встановлено її локалізація в білкового ланцюга. Виявилося, що після перетворення цистеїну-тРНК в аланіл-тPHK залишок аланіну, пов'язаний з тРНК, виявляється в тих сайтах білкового ланцюга, які зазвичай займає цистеїн, а не в сайтах, де зазвичай знаходиться аланін. Стало ясно, що саме тРНК з приєднаною до неї амінокислотою, а не сама амінокислота визначає, з яким кодоном має відбутися спарювання.
в. Розшифровка генетичного коду
Передумовами для розшифровки коду послужили два відкриття. По-перше, було встановлено, що мРНК - це інформаційний посередник між генами і білками. По-друге, виявилося, що мРНК, введена в бактеріальні екстракти, транслюється з утворенням відповідних білків. Прорив в цій області стався, коли за допомогою екстрактів з клітин Є. coli була здійснена трансляція синтетичних РНК-поліуріділата, поліаденілат і поліцітіділата - з утворенням поліфенілаланіна, полілізіна і поліпроліна відповідно. Це призвело до висновку, що триплети, що складаються тільки з U, А і С, кодують відповідно фенілаланін, лізин та пролін. Потім були пророблені експерименти із застосуванням змішаних полімерів з варьирующим співвідношенням двох і трьох нуклеотидів; в результаті було визначено склад кодонів. Проте ці дані дозволили встановити лише нуклеотидний складу кодонів, але не порядок проходження нуклеотидів в них. Всі кодони були врешті-решт ідентифіковані за допомогою наступних двох експериментів. В експериментах першого типу порівнювали амінокислотну послідовність поліпептидів, отриманих in vitro з використанням синтетичних мРНК, що містять певні повтори з двох або трьох нуклеотидів. В експериментах іншого типу визначали, яка саме з аміноацил-тРНК зв'язується з рибосомами в присутності кожного з можливих трінуклеотідов. Ці експерименти дозволили скласти сумісний словник, в якому 61 ​​трехнуклеотідний кодон відповідає 20 амінокислотам, а три кодону - закінчення кодує послідовності. У коді закладена якась неоднозначність, яка пов'язана з точкою початку трансляції, а не з відповідністю кодон-амінокислота. Ця неоднозначність обумовлена ​​наявністю альтернативних наборів триплетів, чи рамок зчитування, для будь-якої полинуклеотидной послідовності. Більшість прокаріотів генів транслюється при одній безперервної рамці зчитування; при альтернативних рамках на кожні 20 нуклеотидів доводиться в середньому по одному терминирующего кодону.
В експериментах з розшифрування коду, описаних вище, синтетичні полінуклеотіди транслювалися в умовах, що не вимагають точної ініціації. Однак in vivo та у відповідних умовах in vitro ініціація відбувається тільки з правильною рамкою зчитування. Однозначність прочитання білок-кодує послідовності забезпечується тим, що трансляція мРНК починається тільки із специфічного триплетів - AUG, і далі розшифровується кожний наступний триплет в напрямку від 5'-кінця молекули мРНК до 3'-кінця. Пізніше був розроблений метод швидкого секвенування нуклеїнових кислот і білків, який дозволив перевірити систему кодування безпосередньо, шляхом порівняння послідовностей ДНК, РНК і кодованих ними білків. Порівняльні дослідження підтвердили також і те, що кодують послідовності справді читаються від 5'-до 3'-кінця мРНК.
р. Надмірність генетичного коду
Дивною особливістю коду виявилося те, що всі амінокислоти, окрім двох, кодуються більш ніж одним кодоном. Ці дві складові виняток амінокислоти, метіонін і триптофан, зустрічаються в білках досить рідко. Найбільше число кодонів мають серин і лейцин, якими білки багаті. Такі досить часто зустрічаються амінокислоти, як цистеїн, аланін, гліцин, валін, а також дикарбонові кислоти та їх аміди, кодуються двома-чотирма кодонами кожна. Через таку надмірності різні нуклеотидні послідовності можуть при трансляції давати одну і ту ж амінокислотну послідовність. Отже, якщо ми знаємо нуклеотидну послідовність, то можемо однозначно визначити послідовність білка, зворотне ж саме виконати неможливо.
Сигналом для зупинки синтезу білка служить будь-який з трьох кодонів: UAA, UAG або UGA. Кодон AUG виконує подвійну функцію: він детермінує амінокислоту метіонін і в певних послідовностях позначає початок сегмента, що кодує білок.
Надмірність коду має одну цікаву особливість: найбільше число варіацій в кодонах, детермінують дану амінокислоту, припадає на третю позицію. Наприклад, амінокислоти гліцин, валін, пролін, аланін і треонін кодуються чотирма кодонами кожна, і в кожному випадку ці чотири кодони розрізняються тільки нуклеотидами в третій позиції. Якщо якась амінокислота кодується двома кодонами, то останні різняться тільки пуринами або піримідиновим, що знаходяться в третій позиції. І тільки кодони для лейцину, серину і аргініну розрізняються нуклеотидами, які перебувають у першій, другій або обох позиціях. Тому мутації, що приводять до замін нуклеотидів у третій позиції, часто не супроводжуються зміною амінокислотної послідовності. Крім того, код влаштований так, що при заміні нуклеотидів навіть у першій або другій позиції деяких кодонів в поліпептид включається структурно споріднена амінокислота, зводячи тим самим до мінімуму порушення у вторинній структурі білка. Кодони для гідрофобних амінокислот, наприклад фенілаланіну, лейцину, ізолейцину і валіну, різняться лише одним нуклеотидів. Аналогічна ситуація спостерігається і для кодонів серину і треоніну або аланіну і гліцину.
д. Універсальність генетичного коду
Мабуть, всі прокаріоти, а також більшість еукаріот користуються одним і тим же словником кодонів незалежно від того, представлений чи їх геном ДНК або РНК. У цьому сенсі нерідко говорять, що код універсальний. Тим не менше частота використання кодонів-синонімів варіює як на рівні організмів, так і на рівні мРНК. Якщо дійсно якісь кодони використовуються в більшості кодують білки послідовностей частіше, ніж інші, то це має знайти відображення у відносному вмісті в клітці різних тРНК, розшифровуючих кодони-синоніми. Так, якщо кодон AGA зустрічається в мРНК будь-якого організму порівняно рідко, то і зміст тРНК, що розшифровує AGA, має бути невелика. У деяких випадках вибір кодонів для конкретної кодує послідовності визначається завданнями, не пов'язаними з їх трансляцією. Наприклад, певне взаємне розташування кодонів може сприяти утворенню специфічної вторинної структури мРНК; таким чином, присутність конкретних кодонів може впливати на готовність мРНК до трансляції і тим самим грати регуляторну роль. У деяких випадках експериментальна заміна існуючих кодонів їх синонімами призводить до зміни стабільності мРНК при повному збереженні її здатності до правильної трансляції.
Поодинокі винятки в стандартному словнику кодо-нів виявлені у інфузорій і в мітохондріальних генах. Наприклад, в мітохондріях ссавців кодон UGA читається як триптофан і мітохондріальна ДНК кодує тРНК, чий антикодон UCA злучається з UGA майже так само міцно, як з нормальним триптофанового кодоном UGG. У мітохондріях ссавців кодони AGA і AGG прочитуються як сигнали термінації. AUU, AUC, AUA і AUG служать ініціювали кодонами, a AUA кодує метіонін замість ізолейцин. У мітохондріях дріжджів триплети CUU, CUC, CUA і CUG кодують треонін, а не лейцин.

5. Апарат трансляції
Основними учасниками процесу зчитування інформації, закодованої в послідовності мРНК, є аміноацил-тРНК-синтетази, тРНК, рибосоми, білки, пов'язані з рибосомами, і деякі інші білки. Вони відповідальні за ініціацію, елонгацію і терминацию збірки поліпептиду. У цьому розділі ми опишемо властивості кожного з перелічених компонентів, а в наступному обговоримо, як вони функціонують на різних етапах процесу трансляції.
а. Приєднання амінокислот до «спорідненим» тРНК
Функціонування тРНК при трансляції зводиться до двох унікальним процесам. Перший з них полягає в приєднанні амінокислоти до 3'-кінця спорідненої тРНК за допомогою специфічної аміноацил-тРНК-синтетази, другий - у специфічному зв'язуванні аміноацил-тРНК з відповідним кодоном мРНК, що знаходиться в комплексі з рибосомою. Ключовою особливістю обох реакцій є їх специфічність, оскільки збої в освіті аміноацил-тРНК або зв'язування аміноацил-тРНК з відповідним кодоном приведуть до помилок в експресії генів. Тому дуже важливо зрозуміти природу такою специфічності, механізм її забезпечення та наслідки порушень точності на цих двох етапах трансляції.
Основні особливості структури тРНК. У будь-якій клітині є дуже багато різних тРНК. Молекула тРНК складається звичайно з 75-85 нуклеотидів і містить унікальний трінуклеотід, який визначає, яку амінокислоту ця тРНК приєднує і з яким кодоном вона може злучитися. На підставі даних про нуклеотидної послідовності більш ніж 150 окремих видів тРНК, виділених з клітин про-і еукаріотів, були побудовані комп'ютерні моделі внутрішньомолекулярного комплементарного спаровування основ у молекулі тРНК. Був зроблений висновок, що практично всі тРНК, незалежно від їх нуклеотидної послідовності, мають характерну вторинну структуру, яку називають структурою «конюшини» через наявність у ній трьох шпильок. Реальність передвіщеної структури була підтверджена даними про різної хімічної чутливості підстав, одні з яких спарені, а інші ні.
Більшість молекул тРНК, що мають форму листа конюшини, містять чотири області, кожна з яких володіє інваріантними властивостями незалежно від амінокислотної специфічності тРНК. 1. На 3'-кінці молекули завжди знаходяться чотири неспарених нуклеотиду, причому три з них-це обов'язково ССА. 5'-і 3'-кінці ланцюжка РНК утворюють акцепторний стебло. Ланцюги утримуються разом завдяки комплементарного спаровування семи нуклеотидів 5'-кінця з сімома нуклеотидами, що знаходяться поблизу 3'-кінця. 2. У всіх молекул є шпилька РФС, що позначається так тому, що вона містить два незвичайних залишку: ріботімідін і псевдоуридин). Шпилька складається з дволанцюжкової стебла з п'яти спарених підстав, включаючи пару GC, і петлі довжиною сім нуклеотидів. Трінуклеотід Т завжди розташований в одному й тому ж місці петлі. У антікодоновой шпильці стебло завжди представлена ​​сімома спареними основами. Триплет, комплементарний родинному кодону, - антикодон - знаходиться в петлі, що складається з семи нуклеотидів. З 5'-кінця антикодон фланкують інваріантний залишок урацилу і модифікований цитозин, а до його 3'-кінця примикає модифікований пурин, як правило аденін. 4. Ще одна шпилька складається з стебла завдовжки три-чотири пари нуклеотидів і петлі варьирующего розміру, часто містить урацил у відновленій формі - дігідроураціл.
Найбільш сильно варіюють нуклеотидні послідовності стебел, число нуклеотидів між антікодоновим стеблом і стеблом ТФС, а також розмір петлі і локалізація залишків дігідроураціла в DU-петлі.
Рентгеноструктурний аналіз деяких молекул тРНК дозволив виявити їх характерну четвертинну структуру. Ця структура більш компактна, ніж структура «конюшини». Вона утворюється завдяки внутрішньомолекулярним взаємодіям, зближуючим DU-і Т | С-шпильки. У результаті молекула тРНК виглядає так, як ніби вона складається з двох взаємно перпендикулярних частин - в одній з них знаходиться акцепторний ділянку, в іншій - антикодон. З-за такого загального вигляду молекули структура отримала назву L-конфігурації. L-структура видається більш адекватною, ніж «лист конюшини», особливо якщо врахувати, що тРНК грає роль адаптора при взаємодії кодону і антикодоном на рибосомі.
Зазвичай акцепторами для однієї і тієї ж амінокислоти служать кілька різних тРНК, що мають різні антикодоном, що дозволяє їм паруватися з кодонами-синонімами. Частково цим пояснюється і вирожденність коду, тобто спроможність різних антикодоном детермінувати одну і ту ж амінокислоту.
Етерифікація молекул тРНК. Для виконання функції адаптора в процесі трансляції мРНК тРНК повинна зв'язатися з амінокислотою, відповідної своєму антикодоном. Це відбувається в результаті АТР-залежної реакції, що каталізується специфічними ферментами аміноацил-тРНК-синтетазами. У ході реакції АТР розщеплюється на 5'-аденілових кислоту і неорганічний фосфат, а вивільняється при цьому, використовується для приєднання карбоксильної групи амінокислоти до однієї з гідроксильних груп рибози на 3'-кінці тРНК. Насправді освіта аміноацил-тРНК проходить у два етапи. На першому етапі карбоксильна група амінокислоти приєднується до а-фосфату АТР, що супроводжується вивільненням неорганічного фосфату і утворенням аміноацил-аденилат. Аміноацил-аденилат володіє дуже високою реакційною здатністю і стабілізується завдяки міцному зв'язування з ферментом. Другий етап полягає в перенесенні аміноацільной групи від пов'язаного з ферментом аміноацил-аденилат на 2'-або 3'-ОН-групу кінцевий рибози тРНК. Потенціалу перенесення ацильної групи аміноацил-тРНК більш ніж достатньо для утворення пептидного зв'язку без додаткового надходження енергії.
Ключовою особливістю реакції, що приводить до аміноацетілірованію тРНК, є специфічність беруть участь у ній ферментів. Приєднання до тРНК кожної з 20 амінокислот, що зустрічаються в білках, каталізується певної аміноацил-тРНК-синтетазою. Фермент повинен відрізнити одну амінокислоту від 19 інших і перенести її до однієї або декільком ізоакцепторними тРНК з наявних приблизно 75 інших тРНК. Згадаймо при цьому, що багато амінокислот дуже подібні за структурою: лейцин, валін і ізолейцин; валін і треонін; аспарагінова і глутамінова кислоти. Аміноацил-тРНК-синтетази повинні відрізнити «свої» тРНК від всіх інших, незважаючи на надзвичайну схожість їх вторинної та третинної структур. Тому необхідно, щоб ферменти мали дуже високою специфічністю, що дозволяє їм зробити правильний вибір з настільки споріднених структур й уникнути помилок при синтезі білка.
Коментар з приводу структур аміноацил-тРНК-синтетаз та їх здатності до впізнавання амінокислот і споріднених тРНК. Багато аміноацил-тРНК-синтетази вдалося очистити. Деякі з них складаються з однієї поліпептидного ланцюга, інші - з двох або чотирьох ідентичних ланцюгів, кожна мовляв. масою від 35 до 115 кДа. Деякі димерной і тетрамерние ферменти складаються з субодиниць двох типів. Чіткої кореляції між розміром молекули ферменту або характером його субодиничний структури і специфічністю не існує.
Дослідження взаємодії між аміноацил-тРНК-синтетазами і родинними їм тРНК не дозволили з'ясувати природу їх високої специфічності. Більшість робіт показало, що специфічність ферменту визначається його міцним зв'язуванням з акцепторним кінцем тРНК, DU-ділянкою та вариабельной петлею. Деякі ферменти, мабуть, не розпізнають антікодоновий триплет і каталізують реакцію аміноацетілірованія навіть при зміненому антикодоном. Однак окремі ферменти проявляють знижену активність по відношенню до таких модифікованим тРНК і при заміні антикодоном приєднують не ту амінокислоту. Відтак, у деяких випадках істотним є і взаємодія з антікодоновой петлею. У будь-якому випадку акцепторний кінець тРНК повинен бути орієнтований так, щоб каталітичний центр ферменту зміг перенести пов'язаний аміноаціладенілат до кінцевого нуклеотиду тРНК.
У якійсь мірі здатність ферменту приєднувати потрібну амінокислоту до спорідненої тРНК залежить від специфічного зв'язування амінокислоти. Однак, якщо безпомилкове розпізнавання родинних амінокислот неможливо, синтетази можуть виправляти помилки, що відбуваються при приєднанні. Наприклад, не можна повністю виключити можливість скріплення валіну ізолейцил-тРНК-синтетазою через подібність розміру і структури ізолейцину і валіну. Дефект у специфічності виявляється в першій же реакції: ізолейцил-тРНК-синтетаза утворює ферментсвязанний валив-аденилат, хоча і з меншою ефективністю, ніж ізолейцил-аденилат, проте такий активоване валін не зв'язується ні з TPHK, ні з тРНК. Замість цього ферментсвязанний валив-АМР швидко гідролізується в присутності тРНК, і освіта валив-тРНК запобігає. Подібний механізм дозволяє валив-тРНК-синтетази розрізняти валін і треонін, а метионит-тРНК-синтетази відрізняти треонін від метіоніну. Очевидно, що аміноацил-тРНК-синтетази користуються механізмом корекції з метою запобігання неминучих помилок в аміноацетілірованіі тРНК. І навпаки, механізм, за допомогою якого віддалялася б вже приєднана до тРНК неправильна амінокислота, відсутня. У таких випадках амінокислота займає неправильну позицію в білку. Частота таких помилок дуже низька. У гемоглобіні кролика, наприклад, валін опиняється в місцях, зазвичай займаних ізолейцин, тільки в одному з 25000-50000 можливих випадків. Таким чином, точність першого кроку на складному шляху зчитування генетичної інформації забезпечується чіткою роботою різних аміноацил-тРНК.
б. На рибосомах здійснюються спаровування аміноацил-тРНК з кодонами та збирання білкових ланцюгів
У всіх клітинах є рибосоми, що грають ключову роль у синтезі білка; їх число коливається від 20000 до 50000 в залежності від білоксинтезуючої активності клітин. Рибосоми індиферентні щодо синтезованих ними білків або тих клітинних мішеней, до яких вони направляють синтезовані продукти. Тип синтезованого рибосомою білка в кожному синтетичному циклі диктується мРНК, з якою рибосома виявилася пов'язаною. Внутрішньо-або позаклітинна локалізація білків визначається їх структурними особливостями і - залежно від цих особливостей - характером взаємодії зі спеціалізованими мембранами і органелами.
Рибосоми про-і еукаріотів мають у загальному дуже подібними структурою та функціями. Тим не менше з-за відмінностей в структурі та організації про-та еукаріотичних мРНК і через те, що процеси транскрипції і трансляції в еукаріот є сполученими в часі і в просторі, тонкі відмінності між рибосомами про-і еукаріотів є. Типовими прокариотическими рибосомами є рибосоми Є. coli, і оскільки їх структура та функції вивчені краще інших, ми використовуємо цю модель у подальшому обговоренні. Для порівняння ми зупинимося на деяких структурних особливостях рибосом еукаріотів.
Будова рибосомних частинок. Рибосоми прокаріотів складаються з малих і великих субчастіц. 30S-субодиниці складаються з єдиної молекули рРНК розміром 1542 нуклеотиду і 21 білка з різною мовляв. масою. 50S-субодиниці містять дві рРНК - велику, що складається з 2904 нуклеотидів, і більш дрібні, з 120 нуклеотидів; вони пов'язані з 34 різними білками. Нуклеотидні і амінокислотні послідовності всіх рРНК і білків відомі. Електронно-мікроскопічні дослідження 70S-рибосом і побудови їх тривимірних моделей показали, що мала і велика субчастіци стикаються в декількох точках, але найхарактернішою особливістю є наявність борозенки між ними, необхідної, мабуть, для розміщення в ній мРНК на час трансляції.
І мала, і велика рибосомні субчастіци можуть диссоциировать на складові молекули РНК і білка. Більш того, навіть після відділення один від одного молекули всіх РНК і білків здатні відновлювати вихідну функціонально активну рибосомну субодиницю, якщо їх змішати у відповідних умовах. Це означає, що вся інформація про складання мультімерного комплексу укладена в структурі його компонентів. Експерименти по реконструированию рибосом дозволяють краще зрозуміти характер взаємодії між цими компонентами і визначити можливий порядок, в якому збираються білки і РНК in vivo. Крім того, в подібних експериментах можна перевірити сумісність еквівалентних РНК або білкових субчастіц з різних джерел. Далі, за допомогою цього методу можна оцінити здатність мутантних РНК або білків до взаємодії з відновленням структури рибосом і прояву різних видів активності, властивих реконструйованим рибосомам.
Рибосоми еукаріот, що знаходяться в цитозолі, також складаються з малих і великих субчастіц. Малі субчастіци містять одну молекулу РНК розміром 1900 нуклеотидів і 30-35 білків; великі - три ланцюги РНК довжиною 120, 160 і 4800 нуклеотидів і 45-50 білків. Рибосоми мітохондрій і хлоропластів відрізняються від цитозольних рибосом. Як правило, вони менше і містять меншу кількість білків і різних рРНК. Дані щодо фізичного і хімічного реконструированию більш складних еука-ріотіческіх хромосом значно поступаються аналогічним даним, отриманим для Є. coli.
Необхідно виділити два важливих у функціональному відношенні ділянки, що утворюються при асоціації субчастіц в процесі формування 70S-рибосоми. Це ділянки, в яких відбувається зв'язування двох тРНК - однієї, приєднаної до білкового ланцюжка, і другий, несучої наступну додається до ланцюга амінокислоту.
Особливі тРНК і деякі допоміжні білки, що беруть участь в трансляції. Як у про-, так і у еукаріотів є два види тРНК, які пов'язують метіонін. У прокаріотів вони позначаються як тРНК і тРНК, а у еукаріотів - відповідно тРНК і тРНК. Кожна з обох видів тРНК як у про-, так і у еукаріотів аміноацетіліруется метіоніном за допомогою відповідних аміноацил-тРНК-синтетаз. тРНК прокаріотів і тРНК еукаріот мають незвичайні властивості, що дозволяють їм функціонувати в якості адапторов при ініціації синтезу поліпептидного ланцюга у відповідних ініціаторних AUG-кодонах. тРНК про-і еукаріотів дізнаються AUG-кодони в білок-кодують послідовностях.
У прокаріотів аміногрупа метионит-тРНК, але не метионит-тРНК форміліруется особливим ферментом до Fmet-TPHK з використанням в якості донора формільной групи М ^{10-формілтетрагідрофолата.} Очевидно, трансформілаза відрізняє met-TPHK від met-TPHK. Fmet-TPHK використовується виключно для ініціації білкових ланцюгів, a met-TPHK _M ^Met - тільки для декодування внутрішніх метіоніновим кодонів. Незважаючи на те, що тРНК еукаріотів також використовується тільки для ініціації, її метіонільная група не піддається Формілювання. Очевидно, якісь особливі властивості, притаманні тРНК і необхідні для виконання нею спеціальної ініциаторной функції, пов'язані виключно з її нуклеотидної послідовності і / або тривимірною структурою.
Відомі білки, які тільки тимчасово, на період трансляції, зв'язуються з рибосомами. Вони грають важливу роль при ініціації, елонгації і термінації синтезу білкового ланцюга. Перш ніж докладно обговорювати ці процеси, ми познайомимо читача з такими білками і коротко опишемо їх властивості та роль в трансляції.
Ці білки, звані факторами ініціації і що позначаються IF-1, IF-2 і IF-3, необхідні для ініціації трансляції мРНК з утворенням білків. IF-1 і IF-3 зв'язуються з 3. Важливим етапом термінації або відділення білкового ланцюга від мРНК є гідроліз GTP.
6. Трансляція мРНК у прокаріотів
Знаючи всіх учасників процесу, ми можемо наразі приступити до розгляду хімічних реакцій, що протікають при синтезі поліпептидів, тобто реакцій, які беруть участь у власне трансляції. Незважаючи на те, що цей процес протікає безупинно від старту до фінішу, зазвичай виділяють три його етапи: ініціацію, елонгацію і терминацию. Розглядаючи кожен з етапів направляється мРНК синтезу поліпептидного ланцюга, ми повинні враховувати дві основні властивості цього процесу. По-перше, поліпептидні ланцюги синтезуються однонаправлені-но: з аміно-кінця до карбокси-кінця. При цьому карбоксильна група вже утворився ділянки поліпептидного ланцюга з'єднується з аминогруппой наступної приєднуваної амінокислоти за допомогою пептидного зв'язку. Це може статися, лише якщо карбоксильний кінець зростаючої поліпептидного ланцюга знаходиться в активованому стані. Як ми вже відзначали, необхідна для цього енергія надходить в результаті приєднання карбоксильної групи зростаючої поліпептидного ланцюга і кожної приєднуваної амінокислоти до тРНК. По-друге, зчитування мРНК починається з кодону AUG, який позначає 5'-кінець кодує послідовності і детермінує N-кінцеву амінокислоту синтезованого поліпептиду. При ініціації перша і друга молекули аміноацил-тРНК спаровуються з першими двома кодонами мРНК. Далі трансляція триває в напрямку 5'-> 3 'кодон за кодоном до тих пір, поки не досягне стоп-сигналу, розташованого одразу ж за кодоном, детерминирующим С-кінцеву амінокислоту.
а. Умови ініціації
70S-рибосома здатна здійснювати трансляцію послідовності мРНК, але не може ініціювати цей процес. При зв'язуванні ініціаторних білків IF-1 і IF-2 з 30S-субчастіц відбувається дисоціація 70S-рибосоми. 30S-субодиниця в комплексі з IF-1 і IF-3 пов'язує IF-2, GTP і Fmet-тРНК. Такий повний комплекс зв'язується з 5'-кінцем кодує послідовності мРНК поблизу кодону AUG. Очевидно, IF-2 здатний відрізнити Fmet-тРНК від тРНК, і ця специфічність почасти забезпечується N-формільной групою, відсутньої у тРНК Формування повноцінного функціонального комплексу ініціації завершується асоціацією 50S ^ 6-частинки з преініціаторним комплексом. З утворенням функціональної 70S-субодиниці відокремлюються всі три білки ініціації.
Як пізнається перший кодон? Зв'язування 30S-6-частинки з мРНК знаходиться під суворим контролем нуклеотидної послідовності, розташованої приблизно за 10 нуклеотидів до 5'-кінця ініциаторного кодону. Взаємодії сприяє комплементарное спаровування цієї багатої пуринами послідовності з п'яти-восьми нуклеотидів, званої послідовністю Шайна-Дальгарно, з поліпірімідіновим ділянкою, що перебуває поблизу 3'-кінця 16S-pPHK. Ефективність ініціації істотно залежить від ступеня комплементарності між послідовностями Шайна-Дальгарно і 16S-pPHK і від відстані пурин-багатого ділянки до кодону AUG. Ця особливість поряд з іншими, про які буде сказано пізніше, і пояснює відмінності в ефективності трансляції різних мРНК.
Процес ініціації залежить також від вторинної структури тієї ділянки молекули мРНК, в якому знаходиться ініціаторний кодон AUG. Якщо цей кодон опиниться всередині дволанцюжкової ділянки, то ініціація буде неефективна або зовсім блокується. Саме таким чином може регулюватися доступність ініциаторного AUG-кодону для 30S-рибосоми. AUG стає недоступним, якщо він виявляється спареним при утворенні конденсованої форми зрілої мРНК, і, навпаки, доступним для ініціації під час транскрипції мРНК або під час трансляції інших кодують послідовностей на тій же молекулі мРНК.
б. Елонгація поліпептидного ланцюга
При асоціації двох рибосомних субчастіц перед ініціацією трансляції утворюються два функціональних ділянки, необхідних для складання білка: Р-і А-ділянки. Fmet-TPHKj »займає Р-ділянка, а для освіти першої пептидного зв'язку необхідно, щоб аміноацил-тРНК, відповідна наступного кодону, зайняла А-ділянку. Для цього аміноацил-тРНК повинна спочатку зв'язати EF-Tu і GTP. Утворився потрійний комплекс і доставляє аміноацил-тРНК до А-ділянці. GTP в цей час гідролізується, і комплекс відділяється від рибосоми. Коли обидві ділянки, А і Р, зайняті, пептиділтрансферазний активність 50S-субодиниці каталізує перенесення групи Fmet з її тРНК на аміногрупу аміноацил-тРНК, що знаходиться в А-ділянці. У результаті в А-ділянці виявляється дипептидил-тРНК, а в Р - вільна тРНК.
Для прочитання наступного кодону і подовження поліпептидного ланцюга ще на одну амінокислоту вся серія реакцій повинна повторитися. Однак, перш ніж це відбудеться, тРНК повинна звільнити Р-ділянка, що утворилася дипептидил-тРНК повинна переміститися на нього, а новий кодон повинен бути готовий до того, щоб зайняти звільнився А-ділянку. Всі ці процеси здійснюються за допомогою EF-G при GTP-залежною транслокації рибосоми. Джерелом енергії для переміщення рибосоми до наступного триплети кодує послідовності і видалення вільної тРНК з Р-сайту служить реакція гідролізу GTP до GDP. Тепер новий кодон, що зайняв А-сайт, готовий до спарювання зі спорідненою аміноацил-тРНК.