Експресія генів

МІНІСТЕРСТВО СІЛЬСЬКОГО ГОСПОДАРСТВА РОСІЙСЬКОЇ

ФЕДЕРАЦІЇ

ФГТУ ВПО «Далекосхідного державного АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ»

Інститут лісу

Кафедра біології

Реферат

Тема: Експресія генів

Виконав: студент 2 курсу ІЛ групи 8217 Варламов С.

Перевірив: Красавіна А.А.

Благовєщенськ 2009

План

Введення

Транскрипція.

1.1 ДНК-залежні РНК-полімерази

Регуляція експресії генів на рівні транскрипції у прокаріот
Трансляція у еукаріотів

Висновок

Список використаної літератури.

Введення

Кінцевим результатом експресії генів, що кодують білки або нуклеїнові кислоти, має бути освіта цих повноцінних у функціональному відношенні макромолекул, що супроводжується формуванням певного фенотипу організму. У відповідності з основним постулатом молекулярної біології генетична інформація в процесі її реалізації передається однонаправлено від нуклеїнових кислот до білків. При цьому реалізується наступна узагальнена схема: ДНК ↔ РНК → білок, яка підкреслює, що в ряді спеціальних випадків можлива передача генетичної інформації від РНК до ДНК з використанням механізму зворотного транскрипції. До цих пір не виявлено передача генетичної інформації від білків до нуклеїнових кислот. На першому етапі експресії генів відбувається переписування генетичної інформації, що містяться в генах, на матричні (інформаційні) РНК (мРНК - messenger RNA, mRNA), які є місцем проміжного зберігання цієї інформації при її реалізації. У деяких випадках вже самі РНК є кінцевим результатом експресії генів, і після ряду ферментативних модифікацій вони безпосередньо використовуються в клітинних процесах. Це стосується, перш за все, до рибосомних і транспортним РНК (рРНК і тРНК), які разом складають основну частину сумарної РНК клітини. До таких РНК належать і малі ядерні РНК (малі ядерні РНК), які беруть участь у процессингу попередників мРНК еукаріотів, РНК, що входять до складу ферментів, і природні антисмислової РНК.

Синтез РНК відбувається в результаті складної послідовності біохімічних реакцій, званої транскрипцією. Поява русифікованого терміну "мРНК" пов'язане з тим, що на другому етапі реалізації генетичної інформації, званому трансляцією, послідовність нуклеотидів мРНК згідно генетичним кодом однозначно визначає послідовність амінокислотних залишків синтезованих білків, тобто є матрицею, відповідно до послідовностями нуклеотидів якої відбувається з'єднання амінокислотних залишків один з одним у поліпептидних ланцюгах білків під час їх біосинтезу. Таким чином, експресію генів визначають два глобальних молекулярно-генетичних механізму: транскрипція генів і трансляція синтезованих мРНК рибосомами, яка завершується утворенням поліпептидних ланцюгів, кодованих генами. Однак процес експресії генів не обмежується їх транскрипцією і трансляцією. Суттєвими моментами експресії генів є Посттранскрипційна і посттрансляційних модифікації мРНК і білків, які включають процесинг їх попередників (видалення надлишкових послідовностей та інші ковалентні модифікації послідовностей РНК і білків). Посттранскрипційна модифікації попередників мРНК забезпечують підготовку мРНК до ефективної трансляції рибосомами і визначають тривалість її існування в цитоплазмі. Посттрансляційна модифікації білків також необхідні для їх повноцінного функціонування.

1. Транскрипція

У процесі транскрипції генів відбувається біосинтез молекул РНК, комплементарних одному з ланцюгів матричної ДНК, супроводжуваний полімеризацією чотирьох рібонуклеозідтріфосфатов (ATP, GTP, CTP і UTP) з утворенням 3'-5'-фосфодіефірних зв'язків та звільненням неорганічного пірофосфату. Основними ферментами, що здійснюють транскрипцію, є ДНК-залежні РНК-полімерази, які функціонують за участю численних факторів транскрипції - регуляторних білків, що здійснюють високоспецифічні білок-білкові та білково-нуклеїнові взаємодії. Взаємодії факторів транскрипції з регуляторними нуклеотидними послідовностями генів, один з одним і з молекулами РНК-полімерази необхідні для правильного впізнавання транскрипції комплексом регуляторних послідовностей у складі генів і призводять до підвищення або зниження рівня транскрипції відповідних послідовностей як відповідь клітин на зовнішні чи внутрішні регуляторні сигнали. Завдяки факторам транскрипції та регуляторним послідовностей генів стає можливим специфічний синтез РНК і здійснюється регуляція експресії генів на рівні транскрипції.

1.1 ДНК-залежні РНК-полімерази

Відповідно до субодиничні складом РНК-полімерази поділяються на дві групи. До першої групи належать ферменти, які складаються тільки з однієї субодиниці, серед них - РНК-полімерази мітохондрій і невеликих бактеріофагів, наприклад SP6 і T7. Ці РНК-полімерази транскрибує невелике число генів простих геномів, і для їх функціонування не потрібно складних регуляторних впливів. Другу групу складають складно влаштовані РНК-полімерази бактерій і еукаріот, які представляють собою многосуб'едінічние білкові комплекси, транскрибується сотні і тисячі різних генів. Такі ферменти під час свого функціонування реагують на численні регуляторні сигнали, що надходять від регуляторних послідовностей нуклеотидів і білкових факторів. Не виключено, що загальноприйняте поділ РНК-полімераз за структурно-функціональною ознакою є спрощенням. Є дані, що вказують на те, що і просто влаштовані фагових РНК-полімерази функціонують in vivo в комплексі з іншими білками бактеріальних клітин, які можуть суттєво змінювати їх ферментативні властивості.

РНК-полімераза E. coli. Найбільш вивченою з бактеріальних ферментів є РНК-полімераза E. coli. Вона здійснює транскрипцію всіх бактеріальних генів. Фермент складається з п'яти субодиниць: β '- (молекулярна маса 165 кДа), β - (155 кДа), двох α - (35 кДа кожна) і σ - (частіше всього 70 кДа (σ 70)). Комплекс з чотирьох субодиниць ββ 'αα, часто позначають літерою Е (enzyme), утворює так званий мінімальний (кор-) фермент E. coli, який здатний здійснювати всі основні етапи транскрипції, за винятком правильної ініціації (див. нижче). Для ініціації транскрипції потрібна присутність певної регуляторної σ-субодиниці, необхідної для розпізнавання РНК-полімеразою промоторів бактеріальних генів, що визначає специфічність взаємодії РНК-полімерази з промоторами і, можливо, наступну изомеризацию комплексу РНК-полімераза-промотор, необхідну для початку синтезу РНК.

Повний фермент, що включає σ 70-субодиницю, часто називають холоферменту і позначають Е σ 70. РНК-полімераза Е σ 70 здатна транскрибувати більшість (але не всі) генів E. coli. Зокрема, для транскрипції генів теплового шоку, Оперон gln або nif потрібно включення до складу повного ферменту інший регуляторної субодиниці - σ 54 (молекулярна маса 54 кДа) замість σ 70 з утворенням ферменту E σ 54. В даний час описано до десяти різних σ-факторів, об'єднання яких з мінімальним ферментом дає можливість утворюється холоферменту спостерігати різні промотори. Всі чотири субодиниці кор-ферменту забезпечують контакт РНК-полімерази з промоторами. При цьому β '-субодиниця бере участь у зв'язуванні ферменту із ДНК, β-субодиниця утворює каталітичний активний центр, а α-субодиниці забезпечують правильну взаємодію ферменту з промоторами. Твердження, укладені в двох останніх реченнях, потрібно сприймати з певною часткою скепсису. Дані такого роду зазвичай отримують з використанням ферментів, у яких під дією мутацій змінені конкретні субодиниці, і якщо, наприклад, мутація в гені α-субодиниці порушує зв'язування РНК-полімерази з ДНК, робляться відповідні висновки. Така методологія (втім, одна з найбільш плідних серед існуючих), на жаль, нагадує відомий спосіб локалізації органу слуху у тарганів шляхом обривання ніг - оскільки таргани без ніг не реагують на звуки втікання, робиться висновок, що вони сприймають звукові сигнали ногами. Будь-яка мутантна субодиниця у складі олігомерного ферменту може змінювати його загальну конформацію і надавати ферменту найнесподіваніші властивості. Більш прямим методом визначення місць контакту макромолекул при білок-білкових і білково-нуклеїнових взаємодіях є метод поперечних зшивок з використанням біфункціональних хімічних агентів. Такі хімічні сполуки утворюють ковалентні зв'язки (поперечні зшивки) між близькорозташованих реакційноздатними групами. Проте сам факт наявності контакту між макромолекулами ще не можна однозначно інтерпретувати на користь його функціональної значімості.В відміну від еубактерій, які, як уже згадувалося вище, при транскрипції різних наборів генів використовують різні σ-фактори, еукаріоти для досягнення тих же цілей вдаються до іншої стратегії -спеціалізації молекул РНК-полімераз. У ядрах еукаріот виявлено щонайменше три спеціалізовані форми РНК-полімераз. РНК-полімераза I здійснює транскрипцію генів рибосомних РНК (рРНК), синтезуючи в ядерцях попередники 18S і 28S рРНК; РНК-полімераза II бере участь в утворенні мРНК, а РНК-полімераза III транскрибує гени транспортні (тРНК), 5S та інших низькомолекулярних РНК. Кожен з цих ферментів є многосуб'едінічний білковий комплекс, що складається з двох великих (120-220 кДа) і 5-13 малих (10-100 кДа) субодиниць. Кілька малих субодиниць є загальними для різних форм РНК-полімераз. Великі ж субодиниці гомологічних своїми амінокислотними послідовностями ділянкам β - і β '-субодиниць еубактерій, що, можливо, відображає фундаментальне подібність у структурі та функціонуванні активних центрів цих ферментів. Більш того, амінокислотні послідовності α-субодиниць бактеріальних РНК-полімераз, необхідні для їх взаємодії з великими субодиницями мінімального ферменту, мають гомологи у третій за розміром великий субодиниці РНК-полімерази II, а також у субодиниці, загальною у РНК-полімераз I і III. Кілька невеликих субодиниць еукаріотичних РНК-полімераз, що не мають аналогів у бактеріальних ферментів, є загальними для всіх РНК-полімераз, що може вказувати на їх однакові функції в транскрипції, здійснюваної відповідними ферментами, і на їх можливу участь у координації функціонування різних РНК-полімераз.

РНК-полімераза I еукаріот (Pol I). Як і більшість інших високомолекулярних поліпептидів, великі субодиниці РНК-полімераз містять добре помітні структурні і функціональні домени: дискретні ділянки поліпептидних ланцюгів, що несуть конкретну функціональне навантаження. Клонування генів відповідних субодиниць і визначення їх первинної структури дозволили виявити еволюційно консервативні ділянки поліпептидних ланцюгів і провести мутаційний аналіз функціональної значимості їх окремих доменів. Для цієї мети в

Рис. I.4. Структурні та функціональні домени великих субодиниць еукаріотичної РНК-полімерази I (а) та особливості структури промоторів еубактерій і еукаріот (б)

а - Поліпептидні ланцюга двох великих субодиниць зображені у вигляді горизонтальних прямокутників, в яких чорним кольором і латинськими буквами відмічені ділянки, консервативні у більшості відомих РНК-полімераз. Кисла область і ділянки I α-I δ характерні для РНК-полімераз I. Позначені зони поліпептидних ланцюгів, що формують активний центр ферменту і необхідні для виконання відповідних функцій (наприклад зв'язування Mg2 +). Пунктирні стрілки вказують на ділянки субодиниць, що контактують один з одним. Незаштріхованнимі прямокутниками позначені відомі структурні елементи промоторів, необхідні для ініціації або активації транскрипції. Усередині прямокутників наведено назви факторів транскрипції, що взаємодіють з відповідними елементами промоторів, а також назви сайтів або взаємодіючих з ними білків, що знаходяться над сайтами. Стрілки ↔ позначають фіксовані відстані між елементами промоторів, а → - 5 '-кінцеві частини елонгіруемих транскриптів. Чорними прямокутниками позначені ділянки промоторів, що захищаються від дії ДНКази I або інших агентів E σ 70, а також еукаріотичних транскрипційними комплексами, що забезпечують базальний рівень транскрипції. tss - точка ініціації транскрипції.

Pol I мишей, які є функціональними аналогами β'-і β-субодиниць РНК-полімерази E. coli. РНК-полімераза I еукаріотів є великим ферментом, побудованим щонайменше з 11 субодиниць. Мінімальний фермент Pol I містить два обговорювали вище великих поліпептиду з молекулярною масою 194 та 116 кДа, які асоційовані з декількома малими субодиницями (від трьох до 14 в залежності від методу очищення), молекулярні маси яких лежать в межах 15-60 кДа. Третя за величиною субодиниця Pol I мишей з молекулярної масою 53 кДа, названа PAF53 (polymerase associated factor 53), грає важливу роль в розпізнаванні Pol I своїх промоторів і, мабуть, є структурним і функціональним аналогом білка RPA49 дріжджів. Pol I дріжджів у відсутність субодиниць RPA49 і RPA35.5 (так звана Pol I *) ефективно транскрибує при низьких концентраціях солей__іскусственную матрицю poly [d (AT)], але не нативну двухцепочечную ДНК.

Вважають, що ці субодиниці необхідні для ефективного формуванні комплексу.

Використовуючи антитіла до окремих субодиниць Pol I і подальшу іммунопреціпітація, встановили, що в клітці, принаймні, частина Pol I знаходиться в складі великих комплексів, з якими асоційовані фактори транскрипції. П'ять компонентів такого холоферменту Pol I вивчені в даний час найбільш детально. Мишачий фактор TIF-IB (Pol I-specific transcription initiation factor B), відомий також, як фактор D, забезпечує Pol I селективність у відношенні промоторів генів рРНК (рДНК). Аналогічний білок у людини названий hSL1, у щурів - rSL1 і у X. laevis - Rib 1. Взаємодія фактора TIF-IB/SL1 з промотором рДНК забезпечує зв'язок холоферменту Pol I з промотором і збірку предініціаціонного комплексу. Фактор TIF-IB/SL1 складається з чотирьох субодиниць, одна з яких є основним чинником транскрипції TBP, необхідним для функціонування РНК-полімераз всіх трьох класів. Три інших субодиниці з молекулярними масами 110, 63 і 48 кДа представляють собою різні TBP-асоційовані фактори TAFI, індивідуально і специфічно взаємодіють з TBP, а також один з одним, створюючи міцний комплекс. У складі комплексу TAFI48 забезпечує контакт TIF-IB/SL1 з фактором UBF (див. нижче), а TAFI63 і TAFI110 беруть участь у розпізнаванні промотора. Фактори TAFI не виявляють гомології з відповідними факторами TAFII, специфічними у відношенні Pol II. Більше того, перший з зв'язалися з TBP факторів TAFI запобігає взаємодія з TBP факторів TAFII (і навпаки), що робить неможливим утворення непродуктивних химерних комплексів. Одночасно взаємодія TAFI48 з TBP змінює ДНК-зв'язуючі властивості останнього, після чого той перестає впізнавати TATA-бокс - характерний структурний елемент Pol II-промоторів, і, отже, втрачає здатність забезпечувати ініціацію транскрипції Pol II. Інший білок, що входить до складу холоферменту Pol I, UBF (upstream binding factor) високо консервативний у різних видів тварин. UBF є членом сімейства факторів транскрипції, що містять ДНК-связивающій__HMG-домен (high mobility group domain) - основну послідовність з 80 амінокислот. За допомогою ЯМР-спектроскопії встановлено, що поліпептидний ланцюг HMG-домену організована у три α-спіралі, розташовані у вигляді букви L, які формують три ДНК-зв'язуючих поверхні з зовнішнього боку L. У клітці UBF присутні у двох формах - UBF1 і UBF2 з молекулярними масами 97 і 95 кДа, які утворюються в результаті альтернативного сплайсингу. UBF1 містить п'ять HMG-доменів, фланкованому N-кінцевим дімерізующім мотивом і короткою кислої C-кінцевий послідовністю. Цікаво, що сусідні HMG-домени одного і того ж UBF мають набагато меншою гомологією, ніж відповідні домени UBF різних видів (наприклад шпорцевой жаби і людини). Вважають, що кожен HMG-домен забезпечує особливу, еволюційно консервативну функцію молекули UBF. Такими функціями можуть бути розпізнавання специфічних послідовностей ДНК, створення молекулярних інтерфейсів для білок-білкових взаємодій між Pol I і TIF-IB/SL1, а також різними репрессором і активаторами транскрипції рДНК. З-Кінцева послідовність UBF містить кілька фосфоріліруемих залишків Ser і необхідна для активації транскрипції рДНК. Однією з основних характеристик білків, що містять HMG-бокс, є їх здатність згинати молекулу ДНК і міцно зв'язуватися з її хрестоподібними структурами. Всіма цими властивостями володіє UBF, і вони детально досліджені. Білок CPBF (core promoter binding factor), виділений з асцитної клітин аденокарциноми молочних залоз щурів, специфічно взаємодіє з корови ділянкою промотора рДНК. CPBF, міцно взаємодіє з Pol I, складається з двох субодиниць USF1 і USF2 з молекулярними масами 44 і 39 кДа відповідно. Гомодимера USF1 і USF2 є сильними інгібіторами транскрипції Pol I, тоді як гетеродімери USF1/USF2 стимулюють транскрипцію in vitro.Полагают, що CPBF бере участь у регуляції транскрипції Pol I in vivo. TIF-IA - інший компонент холоферменту Pol I, також бере участь у регуляції синтезу рРНК цим ферментом. У його відсутність ініціаціонний комплекс не може утворювати перший фосфодіефірних зв'язку, а отже, і ініціювати синтез РНК. TIF-IA звільняється після ініціації транскрипції і може знову входити до складу збираються предініціаціонних комплексів. За цим і ряду інших критеріїв TIF-IA розглядають в якості функціонального аналога бактеріального фактора σ70. TIF-IA є мономірним глобулярним білком з молекулярною масою 70-80 кДа. Активність цього фактора або його внутрішньоклітинний вміст зменшується при пригніченні синтезу білка, виснаженні сироватки або диференціювання клітин і зростає у відповідь на мітогенний стимули, що корелює з придушенням або стимуляцією синтезу рРНК. Хроматографічних і за допомогою иммунопреципитации було встановлено, що життєво важливий фактор TIF-IC в розчині асоційований з Pol I. Цей фактор необхідний як для збірки ініціаціонних комплексів, так і освіти першої фосфодіефірних зв'язку. Його присутність запобігає неспецифічну ініціацію транскрипції і її передчасну терминацию, що проявляється в утворенні гомогенних транскриптів правильної довжини. За цими критеріями фактор TIF-IC розглядають в якості функціонального аналога TFIIF (RAP30/74) Pol II.

РНК-полімераза II (Pol II). Pol II людини містить більше 10 субодиниць, які важко назвати субодиницями в звичайному сенсі через слабку асоціації один з одним. – general transcription factors ). Деякі з них належать до основних факторів транскрипції (GTFs - general transcription factors). Взагалі ж поняття холоферменту Pol II еукаріотів не є усталеним. Лише нещодавно в лабораторіях Р. Янга і Р. Корнберга було встановлено, що деякі основні фактори транскрипції вже знаходяться в комплексі з РНК-полімеразою до включення її в предініціаціонний комплекс. На думку Янга, яке стає все більш обгрунтованим, до складу холоферменту Pol II дріжджів входять щонайменше 14 білків і білкових комплексів, перерахованих в табл. I.3. Серед факторів, які відрізняються від основних факторів транскрипції, але відіграють особливу роль в транскрипції у дріжджів, слід відзначити так звані SRB-білки (suppressor of RNA polymerase B). Останні є невід'ємною частиною холоферменту Pol II і відносяться до коактіваторам транскрипції. SRB-Білки ідентифіковані за допомогою генетичних методів при відборі мутацій у дріжджів, які супрессіровалі умовно-летальні мутації в CTD-домені Pol II (С-кінцевому домені великої субодиниці РНК-полімерази II). Такий генетичний скринінг привів до відкриття дев'яти генів SRB. За допомогою тих же мутантів встановлено, що SRB-білки необхідні для здійснення ініціації транскрипції РНК-полімеразою in vivo. Незабаром було підтверджено фізичне і функціональна взаємодія між SRB-білками і CTD-доменом Pol II, які, як виявилося, утворюють з РНК-полімеразою міцний комплекс. Транскрипція з участю холоферменту Pol II стимулюється активатором GAL4-VP16, що не відбувається в присутності тільки одних очищених основних факторів транскрипції і Pol II. На цій підставі був зроблений висновок, що істинний холоферменту Pol II містить додаткові компоненти, які дозволяють йому реагувати на дію білків-активаторів транскрипції. Більш того, показано, що антитіла до CTD-домену викликають дисоціацію многосуб'едінічного комплексу, що містить Pol II, SRB-білки, TFIIF, GAL11/SPT13, SUG1 і ще 10 білків, частина з яких відноситься до класу білків-коактіваторов транскрипції. Цей комплекс білків отримав назву медиаторного комплексу. Він виявився необхідним для здійснення функціонального зв'язку між Pol II і білками-активаторами транскрипції. Суб'едінічние будова РНК-полімераз різного походження, ймовірно, відображає їх функціональну роль в акті транскрипції. Дійсно, всі РНК-полімерази простої будови транскрибує узкоограніченний коло генів або невеликі частини геному, що має місце, наприклад при синтезі РНК-запалів для фрагментів Окадзакі в процесі реплікації ДНК у бактерій. Промотори, впізнавані РНК-полімеразами простої будови, не відрізняються різноманітністю і мають просту структурою. Показово, що при складному будову геному парних T-фагів, в процесі розвитку яких відбувається багаторазове переключення транскрипції з одних груп генів на інші, використовується складна РНК-полімераза бактерії-господаря, а не індукується простий фермент, як це має місце у бактеріофага T7. РНК-полімерази бактерій і еукаріот мають, по-перше, дізнаватися різні промотори, по-друге, реагувати на різні білки-регулятори і, по-третє, змінювати специфічність впізнавання послідовностей нуклеотидів матричних ДНК під дією різноманітних білкових ефекторів. Звідси випливає, що у живих організмів, починаючи з бактерій, виникає потреба в РНК-полімераза складної структури, здатних здійснювати велику програму реалізації генетичної інформації. Ймовірно, тому спостерігається ієрархія в ступені складності будови зазначених ферментів, яка досягає верхньої межі в разі РНК-полімераз еукаріот.

Тим не менш, елементарні акти основних етапів транскрипції забезпечуються молекулами РНК-полімераз простої будови, такими як у фагів T7, мітохондрій та інших об'єктів. Ці ферменти, на думку Р.Б. Хесин, можна розглядати в якості еволюційних попередників складних олігомерних РНК-полімераз, здатних самостійно здійснювати всі основні функції в процесі транскрипції. Дійсно, у олігомерних РНК-полімераз, як і у більшості сложноустроенних ферментів, мабуть, тільки одна субодиниця (β - у

РНК полімераз еубактерій) є власне каталітичної, а інші, можливо, виконують функції регуляторних.

2. Регуляція експресії генів на рівні транскрипції у прокаріот

Регуляція транскрипції у клітинах здійснюється на рівні індивідуальних генів, їх блоків і навіть цілих хромосом. Можливість керування багатьма генами, як правило, забезпечується наявністю у них спільних регуляторних послідовностей нуклеотидів, з якими взаємодіють однотипні фактори транскрипції. У відповідь на дію специфічних ефекторів такі фактори набувають здатність з високою точністю зв'язуватися з регуляторними послідовностями генів. Наслідком цього є ослаблення або посилення транскрипції (репресія або активація) відповідних генів. Три основні етапи транскрипції - ініціація, елонгація і термінація, розглянуті нами вище, використовуються бактеріальними клітинами для регуляції синтезу РНК. Те ж, мабуть, характерно і для інших живих організмів. Нижче наведені приклади регуляторних впливів на транскрипцію.

Регулювання на рівні ініціації транскрипції

Активність багатьох генів прокаріотів регулюється за допомогою білкових факторів, взаємодіючих з регуляторними ділянками промоторів генів. При цьому відбуваються як активація транскрипції генів, так і придушення зчитування генетичної інформації РНК-полімеразами. У першому випадку регуляторні білкові фактори називають активаторами, здійснюють позитивну регуляцію транскрипції, а в другому - репрессором. Регуляцію, пов'язану з придушенням транскрипції, називають негативною. Механізми, за допомогою яких активатори стимулюють ініціацію транскрипції, можуть бути розглянуті з двох точок зору - кінетичної і структурної. Оскільки активація промоторів шляхом утворення відкритих комплексів є лімітуючою стадією на шляху активації транскрипції в цілому, дію різних активаторів може бути охарактеризоване щодо зміни (збільшення) значень кінетичних параметрів реакцій, що відбуваються на різних етапах активації. Так, при дії активуючого комплексу Crp-cAMP на lac-промотор відбувається десятикратне збільшення рівноважної константи асоціації KB РНК-полімерази з промотором з утворенням закритого комплексу. Активація промотора PRM фага λ, опосередкована cI-білком (див. нижче), характеризується п'яти-десятикратним збільшенням константи швидкості kf переходу закритих комплексів у відкриті. Активуюча дію білка λ-cII на промотор рre супроводжується зміною обох вищезазначених кінетичних параметрів. Активація транскрипції може бути також опосередкована збільшенням швидкості звільнення промотора РНК-полімеразою після ініціації синтезу РНК. Багато активатори транскрипції, в тому числі і Crp-cAMP, згинають молекулу ДНК після взаємодії з нею, причому центр такого вигину знаходиться в сайті зв'язування активатора. Проте з використанням мутантних білків було встановлено, що згинання ДНК і зв'язування активаторів з ДНК як таке ще не забезпечують активацію транскрипції. У більшості випадків абсолютно необхідною умовою активації є наявність контакту між специфічними областями поверхонь молекул активатора і РНК-полімерази, часто з її α-субодиницями. Важливим наслідком освіти контактів між активаторами і холоферменту РНК-полімерази є часто спостережуваний синергізм у зв'язуванні обох білків з відповідними промоторами. При цьому мутації в сайтах зв'язування активаторів або промоторі як такому можуть запобігати активацію транскрипції шляхом зміни конформації молекули пов'язаного активатора або контактного ділянки на РНК-полімеразі. Послідовності нуклеотидів промоторних ділянок генів, з якими взаємодіють молекули репрессора, отримали назву операторів. У багатьох випадках репрессор зв'язується з оператором тільки в присутності низькомолекулярного ліганду, специфічно взаємодіє з репрессором. Такі низькомолекулярні ефектори отримали назву корепрессоров. Вони часто потрібні й для функціонування білків-активаторів транскрипції. Найпростіший механізм репресії полягає встеріческом блокуванні зв'язування РНК-полімерази з промотором. Це відбувається в тому випадку, якщо послідовності нуклеотидів місць посадки РНК-полімерази на промотор і репрессора на оператор перекриваються. Деякі бактеріальні білки-репрессора можуть робити свій негативний вплив на етапи ініціації, які відбуваються після зв'язування РНК-полімерази з промотором. Наприклад, молекули репрессора gal-оперону E. coli, зв'язатися з оператором OE і OI, центри послідовностей яких розташовані відповідно на відстанях -60,5 і +53,5 по відношенню до точки ініціації транскрипції, викликають утворення петлі ділянки ДНК, укладеного між ними, але не перешкоджають взаємодії РНК-полімерази з промотором. Вони надають свою дію на наступні етапи ініціації, що передують утворенню першого фосфодіефірних зв'язку. У тому випадку, якщо лише одна молекула репрессора зв'язується із зовнішнім оператором OE, він частково інгібує транскрипцію шляхом взаємодії з α-субодиницею РНК-полімерази. Це супроводжується зниженням рівня, але не повним припиненням синтезу РНК gal-оперону, тобто тоншим зміною рівня експресії відповідних генів. Поширеним механізмом активації транскрипції за допомогою білків-активаторів є полегшення її ініціації РНК-полімеразою після утворення контакту між ферментом і білком-активатором, пов'язаними з регуляторною областю промотора, що супроводжується конформаційними змінами РНК-полімерази. У бактерій є білки-регулятори, що мають активність як репрессора, так і активатора транскрипції. Такими "амфотерними" властивостями володіє, зокрема, репрессор cI фага λ. Білок-активатор катаболітних Оперон (Crp-білок) активує транскрипцію бактеріальних генів, продукти яких беруть участь у розщепленні (катаболізмі) різних органічних сполук (переважно цукрів), використовуваних зростаючої бактеріальною клітиною в якості джерела вуглецю. Свої властивості активатора Crp-білок набуває лише в комплексі з циклічним AMP (Сamp). Внутрішньоклітинна концентрація Сamp зростає у бактерій, що ростуть на бідних поживних середовищах, і знижується в умовах надлишку легко засвоюваних джерел вуглецю, наприклад глюкози. Тому система Crp-Сamp забезпечує включення експресії катаболітних Оперон лише на бідних поживних середовищах. Crp-білок може виступати і в ролі репрессора транскрипції генів галактозним оперона E. coli. Якщо всі гени катаболітних Оперон активуються Crp-білком у присутності Сamp, то негативна регуляція їх транскрипції відбувається індивідуально. Добре відомими прикладами такого роду є регуляції транскрипції lac-оперону E. coli під дією Lac-репрессора, а також галактозним і арабінозного Оперон специфічними білками-репрессором цих Оперон. Низькомолекулярні ефектори можуть змінювати активність РНК-полімерази не тільки опосередковано через білки-регулятори, але і безпосередньо при взаємодії з ферментом. За допомогою гуанозінтетрафосфата (ppGpp) у клітинах E. coli здійснюється координація експресії генів рибосомних РНК (рРНК) і білків. Цей незвичайний нуклеотид (відомий також під назвою "магічного плями") синтезується бактеріальними клітинами в умовах внутрішньоклітинного нестачі амінокислот, що призводить до значного зниження інтенсивності транскрипції генів рРНК і білків та одночасної стимуляції синтезу РНК Оперон, контролюючих біосинтез амінокислот. У присутності ppGpp очищена РНК-полімераза припиняє синтез рРНК з одного з двох промоторів цих Оперон, що призводить до послаблення, але не повного припинення їх транскрипції. Відомі мутації, локалізовані в гені β-субодиниці РНК-полімерази E. coli, що призводять до припинення впливу ppGpp на синтез РНК, що підтверджує наявність безпосереднього контакту між нуклеотидом і ферментом в процесі транскрипції. Деякі регуляторні елементи бактерій, що беруть участь в активації транскрипції, так само як і енхансери еукаріот, можуть розташовуватися на великій відстані (декількох сотень нуклеотидів) від промоторів, на які вони надають свою дію. У цьому випадку контакт активатора з РНК-полімеразою забезпечується завдяки випетліванію ділянки ДНК, розташованого між даними регуляторними елементами, що приводить до просторового зближення двох білків. Прямий доказ утворення таких петель на ДНК E. coli було, зокрема отримано за допомогою електронної мікроскопії для білків NtrC і NifA, що діють відповідно на промотори генів glnA і nifH. Іншим шляхом досягнення білком-активатором молекули РНК-полімерази на віддаленому промоторі (наприклад промоторі пізніх генів бактеріофага Т4) є його переміщення вздовж відрізка ДНК, що розділяє ці два регуляторних елемента. Процес такого переміщення може бути ініційований послідовностями нуклеотидів, розташованими вище або нижче промотора на відстані кількох сотень пар основ. Одним з давно обговорюються питань є необхідність зміни структури ДНК в околицях промоторів під дією білків-активаторів для активації транскрипції. У ряді випадків такі докази були отримані. Так, в mer-локусі E. coli, що забезпечує стійкість бактеріальних клітин до іонів ртуті, зв'язування Mer-білка з регуляторним ділянкою промотора (merT) в присутності ртуті супроводжується розкручуванням спіралі ДНК в районі промотору на 50о. Це призводить до утворення правильного відстані між сайтами зв'язування активатора та промотором, так як перший розташований незвично - між нуклеотидами в положеннях -35 і -10 промотора. Без такої зміни структури ДНК зв'язавшись з ним активатор не може утворити правильного контакту з РНК-полімеразою.

3. Трансляція у еукаріотів

Бактерії мають єдиною універсальною системою трансляції, основні механізми функціонування якої були коротко розглянуті вище. На відміну від цього, клітини тварин, крім основної системи трансляції, локалізованої в цитоплазмі, мають додаткову систему трансляції мітохондрій, яка по ряду властивостей наближається до бактеріальної. Клітини рослин мають ще однієї додаткової системою біосинтезу білка, що функціонує в хлоропластах. Більшість даних про механізми біосинтезу білка у еукаріот було отримано з використанням безклітинних белоксинтезирующий систем. Останнім часом важливі результати про механізми трансляції у еукаріот були отримані з використанням стабільно трансформованих клітин тварин і рослин, вирощуваних в культурі. У ході цих досліджень встановлено, що в рослин і тварин в основному функціонують одні й ті ж механізми трансляції. Ініціація біосинтезу білка еукаріотичних рибосомами Як буде видно з подальшого викладу, ініціація трансляції еукаріотичних мРНК може здійснюватися, принаймні, трьома способами. Відповідно до першого найбільш поширеним механізмом (модель сканування) рибосоми після взаємодії з 5'-кінцевий послідовністю мРНК здійснюють пошук ініціюючого AUG-кодону, переміщуючись вздовж 5'UTR. При реалізації другого механізму рибосоми ініціюють біосинтез білка на внутрішніх AUG-кодонах, віддалених від 5'-кінцевий кеп-групи. І, нарешті, після звільнення поліпептиду з транслює комплексу рибосоми, не відділяючись від мРНК, здатні реініцііровать біосинтез білка на наступному ініціюванні кодоні.

Фактори ініціації трансляції. Більшість молекулярних механізмів, які здійснюють регуляцію експресії генів на рівні трансляції, реалізується на стадії ініціації біосинтезу білка. Мабуть, цей факт знаходить своє відображення у великій складності апарату ініціації трансляції. Крім субодиниць еукаріотичних рибосом і білків, зазвичай асоційованих з 5'-і 3'-кінцевими послідовностями мРНК, в ініціації беруть участь щонайменше 11 білкових факторів, побудованих більш ніж з 25 поліпептидів Елонгація поліпептидних ланцюгів в ході еукаріотичної трансляції традиційно користувалася меншою увагою дослідників в порівнянні з ініціацією, оскільки вважалося, що її механізми в основних рисах ідентичні таким бактерій. Подальші дослідження показали, що дана точка зору в основному відповідає дійсності, хоча еукаріотична система трансляції володіє більш складним набором факторів елонгації.

Фактори і механізми елонгації. Еукаріотичні клітини містять у великій кількості фактор елонгації eEF1A, який є функціональним гомологом бактеріального фактора EF1A (EF-Tu). Так само як і у бактерій, цей фактор утворює потрійний комплекс з GTP та аміноацил-тРНК, забезпечуючи входження останньої в А-ділянка елонгірующей рибосоми. Два інших еукаріотичних фактора eEF1B і eEF2 різко відрізняються від бактеріальних функціональних аналогів EF1B (EF-Ts) і EF2 (EF-G) за амінокислотним послідовностей. Гетеротрімерний фактор eEF1B, як і його бактеріальний аналог, каталізує обмін GDP на GTP в комплексі eEF1A-GDP. Фактор eEF2, за аналогією з бактеріальними системами, забезпечує транслокацію пептидил-тРНК в P-ділянка рибосом і перенесення деацілірованной тРНК в E-ділянка. У вищих організмів цей фактор служить мішенню регуляторних впливів через фосфорилювання. Чудовим властивістю факторів eEF1A і eEF2 є здатність зв'язуватися з компонентами цитоскелету еукаріотичних клітин. Вважають, що це їх властивість може забезпечувати один з механізмів внутрішньоклітинного транспорту мРНК, що направляють її в полісоми. Зростаючий поліпептид виводиться в цитоплазму через канал, початок якої розташовано на поверхні рибосоми, де він взаємодіє з білками, що розпізнають сигнальну послідовність, або з іншими цитоплазматичними факторами, які забезпечують його спрямований транспорт всередині еукаріотичної клітини. У бактерій зростаюча поліпептидний ланцюг може викликати зменшення швидкості елонгації, а природа передостанній амінокислоти робить сильний вплив на терминацию трансляції. Припускають, що такого роду ефекти є наслідком взаємодії між будуються пептидом і факторами трансляції, рРНК або безпосередньо каналом, через який він переноситься до поверхні рибосоми. Подібні механізми, мабуть, функціонують і у еукаріотів. У дріжджів, як і у E. coli, швидкість елонгації трансляції знижується в присутності рідко зустрічаються кодонів в мРНК. Наявність певного числа таких кодонів поблизу сайту ініціації трансляції значно знижує швидкість зчитування відповідних ОРС. На швидкість декодування мРНК рибосомами впливають і характер фолдінга споруджуваних поліпептидних ланцюгів, а також сигнальні послідовності амінокислот, що визначають напрямок їх посттрансляційної транспорту всередині еукаріотичних клітин.

Термінація трансляції

В еукаріотичних білоксинтезуючої системи термінація трансляції, як і у бактерій, контролюється специфічними рилізинг-факторами. Однак у еукаріотів ці фактори менш різноманітні. Зокрема, у них відсутній функціональний аналог бактеріального фактора RRF/RF4.

Фактори термінації. За сучасними уявленнями, елонгірующая еукаріотична рибосома розпізнає стоп-кодони, що знаходяться в одній рамці з основними ОРС, після взаємодії з гетеродімерним комплексом рилізинг-факторів (RF), до складу якого входять фактори eRF1 і eRF3. Фактор eRF1 необхідний для розпізнавання решти трьох терминируются кодонів (UAA, UAG і UGA) і звільнення синтезованого поліпептиду. Фактор eRF3 є GTPазой, що володіє гомологією з eEF1A, яка, гидролизуя GTP, стимулює терминацию незалежно від послідовності нуклеотидів у терминируются кодонах.

Висновок

Визначення функцій продуктів нових генів на основі їх первинної структури ускладнюється тим, що багато білків і нуклеїнові кислоти виявляють свою активність і функціонують тільки в складі великих надмолекулярних комплексів, розміри яких часто наближаються до розмірів рибосом. При цьому багато білки самі по собі не мають ферментативною активністю, а виконують допоміжні функції, наприклад, молекул-адаптерів, що забезпечують складання комплексів і створюють молекулярні інтерфейси для їх взаємодії з регуляторними та каталітичними субодиницями. Наявність таких комплексів, як це було встановлено в останнє десятиліття, особливо характерно для клітин еукаріотичних організмів. Так, дослідження молекулярних механізмів транскрипції в еукаріот призвело до розвитку уявлення про транскріптосоме, гігантському білкового комплексу, до якого, крім холоферменту РНК-полімерази з її численними субодиницями входять фактори транскрипції, білки-адаптери, білкові компоненти системи репарації і т.п. При цьому розмір транскріптосоми наближається до такого цілих рибосом. У гігантські надмолекулярні комплекси організовані і молекулярні машини системи синтезу ДНК (бактерій реплісомою), процесингу та редагування РНК (сплайсоми і едітосоми), молекулярні компоненти системи протеолітичної деградації білків (протеасоми). Створюється враження, що організація генетичних систем, що функціонують на основних етапах реалізації генетичної інформації, в гігантські просторово впорядковані комплекси, є общебиологическим принципом.

Список використаної літератури

Патрушев Л.І. Експресія генів. - М.: Наука, 2000. - 800 с., Іл.
Айала Ф., Кайдегер Дж.. Сучасна генетика: т.2. М.: Мир, 1988.
Біологія: у 2 кн. Кн. 1: Життя. Гени. Клітка. Онтогенез. Людина. / Під ред. В. Н. Яригіна.
Біологія: Великий енциклопедичний словник / гол. ред. М. С. Гіляров.
Віллі К., Детье В.. Біологія (біологічні процеси і закони). М.: Світ, 1975.