Участь мітохондріального АТФ інгібіруемого калієвого каналу в пекла

Відмінності в дії Mg ^{2 +,} можливо, пояснюються тим, що Mg ^{2 +} - зв'язуючий ділянку локалізований на регуляторної субодиниці каналу. Зв'язування регуляторної субодиниці з магнієм збільшує, ймовірно, спорідненість до АТФ каналообразующей субодиниці.
Інгібування нуклеотидом, найімовірніше, здійснюється за рахунок його зв'язування в специфічному ділянці, а не в результаті фосфорилювання білка, хоча таке може мати місце. Цікаво, що присутність магнію не є необхідною умовою для інгібуючого ефекту АТФ при реконструкції мітоKir (білка з М _r 55 кДа) в штучні мембрани, отже, Mg ^{2 +} проявляє свій ефект тільки в інтактних мітохондріях, тобто за наявності двох субодиниць.
Так як інгібуючий ефект АТФ виявляється і при реконструкції тільки каналоформірующей субодиниці (мітоKir) у БЛМ і ліпосоми, логічно припустити, що нуклеотідсвязивающій ділянка розташована на каналообразующей субодиниці, проте регуляторна субодиниця (мітоSUR) підвищує спорідненість каналів до нуклеотиду.
У дослідженні з регулювання транспорту калію аденінових нуклеотидами з використанням моделі виходу іонів K ⁺ з мітохондрій у присутності роз'єднувача окисного фосфорилювання було виявлено, що інгібітор адениннуклеотидтранслоказы - атрактілозід в концентрації 1 мкМ повністю запобігав інгібуючу дію АТФ. Отже, можна припустити, що для інгібування каналу АТФ повинен транспортуватися всередину мітохондрій, де і відбувається його зв'язування з каналом. Виходячи з цього, видається, що нуклеотідсвязивающій ділянку мітохондріального АТФ-чутливого калієвого каналу розташовується на зверненій у бік матриксу частини білка-каналу.

1.4. Структура мітохондріального АТФ-залежного
калієвого каналу
Структура цитокі _АТФ і ген кодує її до теперішнього часу відомі. Встановлено, що цей канал складається з двох субодиниць: канальної і регуляторної. Канальна субодиниця має М _r 43-46 кДа і формує АТФ-залежний калієвий канал, який не регулюється специфічними модуляторами каналу. Регуляторна субодиниця має М _r від 60 до 174 кДа, залежно від тканини, і додає каналу чутливість до модулятора [7].
Незважаючи на те, що властивості, регуляція і фізіологічне значення мітоК _АТФ в даний час широко вивчаються, солюбілізація його з мітохондріальних мембран та вивчення структури проводяться лише в окремих лабораторіях. Так як мітоК _АТФ має ряд загальних властивостей з цитокі _АТФ і регулюється загальними регуляторами, було припущено, що за структурою він близький до цитоплазматичної каналу [43] і складається з канальною субодиниці [42] і регуляторної [10]. МітоК _АТФ, також як і клітинний, є, по всій вірогідності, гетеромультімером, що складається з калієвого каналу, білка з молекулярною масою 55 кДа, який має розпрямлюючі властивості і який, за аналогією з цитоплазматическим каналом, назвали мітоKIR [42] і рецептора, чутливого до сульфонілсечовини і тому названого мітоSUR (Мал. 2) [10, 43].
Рис 2. Робоча модель структури мітохондріального АТФ-залежного калієвого каналу (за Mironova et al., 2004)
Білок, виділений з внутрішньої мембрани мітохондрій печінки щура, який формує у БЛМ АТФ-залежні канали і має М _r 55 кДа (мітоKIR), не інгібується глібенкламідом і специфічним інгібітором мітоК _АТФ 5-HD, і не активується кромакалімом і діазоксидом. У той же час ці препарати впливали на АТФ-залежний калієвий транспорт в ізольованих мітохондріях [42].
Константа інгібування АТФ на реконструйованому в БЛМ мітоKIR була значно вище, ніж у інтактних мітохондріях і Mg ^{2 +} для цього інгібування не був потрібен. У той же час, для інгібування фосфонуклеотідом каналу, локалізованого в інтактних мітохондріях, присутність іонів магнію було необхідно [42]. Ті ж відмінності були виявлені при порівняльному вивченні впливу АТФ і сульфонілсечовини на цітоKIR і цілий цитокі _АТФ [62]. Цілий цитокі _АТФ ингибировал значно меншими концентраціями АТФ, ніж канальна субодиниця і був чутливий до сульфонілсечовини і активаторам, в той час як канальна субодиниця такої чутливості не проявляла. З цих даних був зроблений висновок, що основна ділянка зв'язування АТФ в цитокі _АТФ локалізований на канальної субодиниці, а регуляторна субодиниця підвищує спорідненість канальної субодиниці до АТФ і забезпечує чутливість цілого каналу до активаторам і інгібіторів [62].
Наведені вище результати досліджень мітоК _АТФ підтверджують припущення про те, що білок з М _r 55 кДа є канальної субодиницею цілого мітоК _АТФ. Однак, для більш прямого підтвердження цього припущення нами були отримані антитіла (АТ) на цей білок і показано, що вони інгібують АТФ-залежний калієвий транспорт у інтактних мітохондріях, не впливаючи при цьому на інші функції мітохондрій, такі як окисне фосфорилювання і транспорт кальцію [ 6]. Функцію регуляторної субодиниці виконує, ймовірно, білок з М _r 63 кДа, що зв'язується з міченим глібенкламідом [10].

1.5. Порушення гомеостазу, викликані гіпоксією і механізми його відновлення
Відомо, що при гіпоксії недолік кисню приводить до відновлення переносників дихального ланцюга [1]. Відновлення переносників I і III комплексів ланцюга, приводить до збільшення утворення АФК, які активують вільнорадикальні процеси в клітині [19, 32].
Можна виділити дві основні фізіологічні ролі вільнорадикального окислення в організмі. По-перше, цей процес має місце при катаболізмі багатьох ліпідів і білків, що полегшує подальше дію фосфоліпаз і протеаз, спорідненість яких набагато вище саме до окислення субстрату [63], а також при синтезі фізіологічно активних речовин ліпідної природи (лейкотрієни, тромбоксани, простагландини ). По-друге, АФК беруть участь у початкових етапах клітинної сигналізації (редокс-сигналізація) в умовах стресу, гіпоксії, запалення, впливу високих і низьких температур, фізичного навантаження, та інших патологічних станах. Характер клітинної відповіді буде залежати від тривалості та інтенсивності впливу перерахованих вище факторів. При помірному впливі формується неспецифічна відповідь, що підвищує адаптацію організму до нових умов. При впливі високої інтенсивності, наприклад, при глибокій гіпоксії настає некроз тканин, в тому числі і за рахунок ушкоджуючої дії АФК, що активують перекисне окислення ліпідів та інших біологічних молекул [5].
Механізм протекторної дії укладено, мабуть, в окисно-відновних модифікаціях сульфгідрильних груп сенсорних білків, що призводить до активації тірозінкіназной шляху клітинної відповіді [5].
Одним з найважливіших наслідків ініціації редокс-сигналізації і АФК-опосередкованої передачі сигналу є активація ядерних факторів транскрипції, які перебувають у неактивному стані до тих пір, поки в їх молекулі не станеться відщеплення інгібіторного домену. Після цього, ядерні фактори транскрипції виявляються здатними індукувати численні гени. Важливу роль в даний час надають таким факторам транскрипції, як NF-kB [21], AP-1 [41].
Серед відомих до теперішнього часу білків, які синтезуються у відповідь на редокс-сигнал від адаптує чинника, найбільше значення має, перш за все, ряд неспецифічних молекул, таких як ферменти антиоксидантного захисту, білки сімейства HSP і інші білки термінового відповіді, які можуть синтезуватися у відповідь на гіпоксію, стрес, ішемію, реперфузії і т.д. [41]. Крім того, синтезуються специфічні молекули з шапероновой активністю по відношенню до конкретних білків клітини, як показано, наприклад для специфічного шаперон Са-насоса саркоплазматичного ретикулума [13], або білки, специфічно синтезуються у відповідь на дію конкретного фактора, наприклад, у відповідь на гіпоксію [28].
Слід зазначити, що на сьогоднішній день одним з найбільш ефективних способів запобігання ушкоджень тканин, викликаних гипоксическим станом, є інтервальна гіпоксичне тренування. До теперішнього часу вважалося, що основний механізм адаптаційного ефекту всіх видів гіпоксичного тренування обумовлений активацією антиоксидантних ферментів, що підсилюють захист організму від впливу активних форм кисню [28,41]. Нещодавно в лабораторії Скулачова було показано, що незначне зниження мембранного потенціалу (~ на 13%) веде до істотного (до 80%) зменшенню продукції супероксид-аніонів [34]. Слід зазначити, що в мітохондріях утворюється до 95% супероксид-аніонів клітини [11,54,60].
Раніше було висловлено припущення, що активація мітоК _АТФ і збільшення експресії гена, що кодує цей білок, грають роль у формуванні стійкості організму до кисневого голодування [39,55,65], проте прямих доказів цього припущення отримано не було, тому в даній роботі була поставлена мета - з'ясувати роль мітоК _АТФ в адаптації до гіпоксії.

Глава 2. Матеріали і методи

2.1. Виділення білка з молекулярною масою 55 кДа з мітохондрій печінки щурів
У роботі використовували самців щурів лінії Вістар.
Для виділення білка проводили виділення мітопластов, екстракцію білків з мітопластов, відділення водорозчинних білків від нерозчинних у воді. Подальший поділ водорозчинних білків здійснювали методом іонообмінної хроматографії, з повторним проведенням хроматографії фракцій, де був виявлений білок з М _r 55 кДа. Фракції після хроматографії перевіряли за допомогою SDS-електрофорезу і, якщо було необхідно, на приладі для визначення провідності біслойних ліпідних мембран. Далі проводили нативний форез фракцій після повторної хроматографії, в яких за допомогою SDS-форез був виявлений білок з М _r 55 КДА і концентрування білка методом зворотного діалізу за допомогою поліетиленгліколю (ПЕГ).
2.1.1. Виділення мітопластов з мітохондрій печінки щурів
Для одного виділення зазвичай декапітованих 10 щурів, у яких витягували печінку.
Печінка подрібнювали у спеціальному пресі, потім гомогенізували в десятикратному обсязі 300 мМ розчину сахарози в 10 мМ Tris-HCl, рН 7.4 з використанням автоматичної гомогенізатора при 240 об / хв.
Далі гомогенат центрифугували на центрифузі К-70: 4 хв при 1200 об / хв (400g), потім 6 хв при 1500 об / хв (600g). У цих умовах осідають ядра і мембранні структури.
Супернатант центрифугували на РС-6 20 хв при 4800 об / хв (3500g). У цих умовах осідає мітохондріальна фракція. Осад збирали і промивали в 300 мМ розчину сахарози в 10 мМ Tris-HCl рН 7.4, потім ресуспендували.
Повторне центрифугування проводили на РС-6 20 хв. при 4800 об / хв (3500g). Осад збирали, міряли його обсяг.
Доводили отримані мітохондрії Tris-HCl (10 мМ, pH 7.4) до 500 мл.
Залишали при перемішуванні і температурі 4 ° С на 30 хв. У результаті виходили мітопласти.
Мітопласти центрифугували при 5500 об / хв на РС-6 (4000g) протягом 20 хв.
Осад об'єднували. Вимірювали його обсяг і концентрацію білка. Концентрацію білка вимірювали спектрофотометрично (довжина хвилі 750 нм) за методом Лоурі (Лоурі, 1965). Виходячи з отриманих даних, мітопласти розводили бидистиллированной водою до концентрації 44 мг / мл.
2.1.2. Екстрагування білків з мітопластов
До отриманої суспензії мітопластов додавали 9 обсягів 66%-го етилового спирту. Екстракцію білків вели при перемішуванні суспензії протягом 30 хв при 4 ° С. Після екстракції суспензію центрифугували при 5500 об / хв (4000g) протягом 15 хв.
2.1.3. Відділення водорозчинних білків від нерозчинних
Отриманий супернатант діалізовалі проти 5 мМ Tris-HCl pH 7.4 (c 2-меркаптоетанолом - 0,0005%). Обсяг буфера становив 2 л . Потім центрифугували при 100000g 30 хв.
2.1.4. Іонообмінна хроматографія на DEAE-целюлозі
Буфер «А» (Tris 50 mM, EDTA 0.5 mM pH 7.4; 125 мкл 2-меркаптоетанол на 250 мл буфера після доведення рН)
Буфер «Б» (1М КСl в буфері «А»). З нього готували ступінчастий градієнт: 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500 мМ КСl.
Взвешівалілі DEAE-целюлозу з розрахунку 1 г целюлози на 1 мл колонки. Целюлозу промивали три рази деіонізованою водою, потім буфером «А». Наносили на колонку. Промивали буфером «А» після нанесення.
Супернатант наносили на колонку c DEAE-целюлозою (висота 2 см, об'єм 2 мл), попередньо врівноважену буфером «А». Після нанесення білків колонку промивали подвійним об'ємом буфера «А» (Tris 50 мM, EDTA 0.5 мM pH 7.4).
Білки елюіровалі градієнтом KCl: 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500 мМ. Збирали по дві фракції кожної концентрації солі. Кожна фракція по 2 мл. Отримані фракції перевіряли на електрофорезі в ПААГ.
2.1.5. SDS-електрофорез у ПААГ
Білки поділяються за їх молекулярним масам. Додецилсульфат натрію (SDS), зв'язуючись із зарядженими молекулами, компенсує різницю між зарядами білків.
Приготування проб: у 30 мкл кожної фракції з DEAE-cell колонки додавали по 15 мкл SLB.
Приготування SLB:
1) SLB без меркаптоетанол: 1.4 г SDS + 6 г гліцерину + буфер, pH 6.8, без SDS - 7.5 мл, доводили деіонізованою водою до 20 мл.
2) SLB для проб: 1 мл SLB без МЕ (1), 45 мкл МЕ, 45 мкл бромфеноловий синій.
Приготування маркера:
10 мкл маркера (0.1 мг / мл) + 120 мкл SLB (1)
Приготування Кумассі: 600 мг Кумассі блакитного, 200 мл 96% етанолу; 40 мл крижаної оцтової кислоти розчинити в 200 мл води.
Концентрований буфер для форезной камери: 7.6 г Tris-HCl + 36 г гліцину доводили дистильованою водою до 800 мл та рН 8.3-8.8. Після цього в буфер додавали 2.5 г додецилсульфату натрію.
Робочий буфер для форезной камери: Розводили концентрований буфер у 5 разів.
Буфер для розділяє гелю: Tris-HCl 1.5 M (9.1 г на 50 мл води доводили до рН 8.8), потім додавали 200 мг SDS на 50 мл.
Буфер для концентруючого гелю: Tris-HCl 0.5 М ( 3 г на 50 мл). Після доведення рН до 6.8 додавали 200 мг SDS на 50 мл.
40% - біс-акриламід (60 мл): акриламід 23.34г.; Біс-акриламід 0.64г.
Приготування гелів: відомості представлені в таблиці 2.
Таблиця 2. Приготування гелів для SDS-електрофорезу в ПААГ.

Речовина	Розділяючий 10% (20 мл)	Концентрує 5% (5 мл)
40% біс-акриламід	5 мл	0,72 мл
Буфер для гелю	5 мл	1,6 мл
Вода	9,3 мл	3,95 мл
Персульфат амонію (1%)	0,7 мл	0,6 мл
TEMED *	10 мкл	15 мкл

П р и м і т а н н: TEMED вноситься безпосередньо перед заливанням гелю.
Після полімеризації гелів проби (в т.ч. мітчик) кип'ятили на водяній бані протягом 5 хвилин і гарячими наносили в кишеньки гелю. Маркер (робочий) наносили в обсязі 1 / 6 від обсягу проб.
Електрофорез проводили при силі струму 20 мА на одну платівку. Коли проби входили до розділяє гель, силу струму збільшували в 2 рази і залишали до тих пір, поки фарба не доходила до кінця гелю (1.5-2 години).
Фарбували Кумассі приблизно 15 хв. Потім відмивали 7.5% оцтовою кислотою протягом ночі на шейкері. Якщо було необхідно, фарбували срібленням (таблиця 3).
Таблиця 3. Фарбування срібленням (Silver staining, Shevchenko at al., 1996)

Реагент	Експозиція
50% метанол + 10% оцтова кислота	2 * 20 хв
20% етанол	10 хв
Вода	10 хв
Тіосульфат натрію (0.2 г / л)	1 хв
Вода	2 * 20 сек
Нітрат срібла (2 г / л)	30 хв
Вода	20 сек
Проявник: карбонат натрію (30 г / л); 37% формалін 1.4 мг / л; тіосульфат натрію 10 мг / л	Ще не проявиться (близько 20 хв)
1% оцтова кислота	Мінімум 20 хв

Фракції, у яких при електрофорезі виявлений білок з M _r 55 кДа, діалізовалі проти 5 мМ Tris-HCl, pH 7.4.
Діалізат наносили на другу колонку з DEAE-целюлозою (висота 1 см, об'єм 1 мл).
Змивали білки таким же градієнтом по два обсягу колонки.
Фракції після першої і другої колонки перевіряли на приладі для визначення провідності біслойних ліпідних мембран (БЛМ).

2.1.6. Визначення провідності біслойних ліпідних мембран (БЛМ)
Електрична частина приладу для вимірювання провідності біслойних ліпідних мембран є амперметр, який вимірює силу струму при певній різниці потенціалів між електродами. Сила струму залежить від проникності (опору) мембрани, що розділяє розчин електроліту в кюветі. Виходячи з цього, можна визначити провідність мембрани (провідність = 1 / опір).
Провідність билипидного шару дуже близька до нуля (10 ^-12 ПСМ) при помірному напруженні. Абсолютне значення напруги більше 150 мВ «рве» билипидного шар.
Провідність відмінна від нуля визначається білками, вбудованими в билипидного шар.
Провідність нелінійно залежить від напруги (у випадку БЛМ), тому визначається провідність при різних напругах.
Підготовка кювет: до і після роботи кювети відмивали детергентами, потім 10-15 хвилин споліскують в струмені води (у склянці). Промивали дистилятом, протирали спиртом, промивали дистилятом від спирту. Ставили сушитися. Коли кювети висихали, змащували отвір у меншій кюветі ліпідами зовні і всередині і давали висохнути. Вставляли меншу кювету у велику. Наливали в кожну кювету по 1 мл середовища.
Середовище для БЛМ: 3 M KCl, 20 мМ Tris, pH 7.4.
Приготування ліпідів: 20 мкл загальних ліпідів мозку і 26 мкл кардіоліпіну (Blight et al., 1959). Суміш близька за складом до мітохондріальних липидам.
Потім цю суміш сушили аргоном, щоб випарувався хлороформ і метанол.
У пробірку з висушеними ліпідами додавали 80 мкл н-декана, щоб розчинити ліпіди перемішували.
Робота на приладі: наливали в кожну кювету по 800 мкл буфера; вставляли два електроди у кювети; включали прилади; завдавали ліпіди на отвір у меншій кюветі, використовуючи мікроскоп. Чекали, поки кольорова (поліслойная) мембрана стане чорною (біслойную).
В одну з кювет (зазвичай транс-) додавали необхідну кількість білка, а в іншу (цис-) така ж кількість середовища для БЛМ, причому з розрахунком, щоб зміст KCl в обох кюветах було ізоосмотичними.
У разі появи провідності, її реєстрували дві-три хвилини, потім міняли напруга, і ингибировал провідність АТФ.
2.1.7. Нативний електрофорез
При нативному електрофорезі не використовуються детергенти, білки поділяються як по заряду, так і за молекулярною масою. При виявленні (можливе) не однієї, а декількох смуг (забруднення) проводиться елюція з гелю всіх смуг, потім білки ідентифікуються на SDS-форез.
Концентрований буфер для елюції (рН = 8.8): 3г Tris на 500 мл води; 14.4 г гліцину на 500 мл води.
Буфер для елюції: концентрований буфер розвести в 10 разів.
Приготування гелів: відомості представлені в таблиці 4.
Таблиця 4. Приготування гелів для нативного електрофорезу.

10% гель:	2.5% гель:
30% акриламід - 3.3 мл	30% акриламід - 0.5 мл
1% біс-акриламід - 1.3 мл	1% біс-акриламід - 0.5 мл
1.5 М трис (рН = 8.7) - 2.5 мл	0.5 М трис (рН = 6.8) - 1.25 мл
вода - 2.73 мл	вода - 2.67 мл
персульфат амонію - 0.035 мл	персульфат амонію - 0.025 мл
ТЕМЕД - 0.003 мл	ТЕМЕД - 0.0025 мл

Платівки заливали робочим буфером для форез. Проводили префорез: 30 мА 30 хв.
Бромфеноловий синій в кислому середовищі бурий, при рН 8.3 синіє. Фарбу наносили на гель рівним шаром і встановлювали силу струму 30 мА на 1 хв, щоб фарба увійшла в гель.
Додавали сахарозу і гліцерин для збільшення щільності розчину. У фарбу теж додавали сахарозу.
Коли фарба входила в гель, наносили пробу рівним шаром. Встановлювали силу струму 30 мА (приблизно на 3 години).
Після цього, вирізали бічні частини гелю, пофарбували їх 30 хвилин бромфенолового синім, відмивали в 7.5% оцтової кислоти. Вирізали смугу гелю, відповідну смузі білка (повинна бути трохи ширше, ніж смуга білка), подрібнювали, поміщали в трубку для елюції.
Пробірки заповнювали буфером, потім заливали буфер у верхню камеру, щоб покрило пробки. У зовнішній камері буфер повинен покривати мембрану.
Камеру ставили в холодильник, проводили елюція при 8 мА (для двох трубок) 12 годин. Доелюцію (якщо було необхідно) проводили при 10 мА 1 годину.
Після цього, зливали буфер з внутрішньої камери в зовнішню. З трубок піпеткою витягали буфер. Акуратно знімали пробку - в ній препарат. Обережно, щоб не пошкодити мембрану, витягали піпеткою елюат.
2.1.8. Концентрування білка методом зворотного діалізу за допомогою поліетиленгліколю
Фракцію поміщали в діалізний мішечок (його можна ставити вертикально, тоді ПЕГ повинен покривати мішечок на 1 / 3). Мішечок клали в бюкс або чашку Петрі і засипали ПЕГ.

2.2. Виділення мітохондрій із печінки щурів
Середа виділення (200 мл, рН 7.4): манітол 210 мМ: сахароза 70 мМ; HEPES (N-2-гідроксіетілперазін-N'-етансульфоновая кислота) 10 мМ. Середу поділяли на три частини. В одну 37 мг ЕДТА на 100 мл середовища, в іншу 45 мкл 0,1 М ЕГТА на 100 мл середовища. Третю (три мілілітра) залишали без змін.
Всі процедури проводили при 4 ° С. Зважений фізрозчин попередньо охолоджували. Потім зважували разом з печінкою. Подрібнювали печінка в пресі, потім гомогенізували, розбавивши середовищем з ЕДТА в дев'ять разів.
Центрифугували 4 хв при 250 g, потім 6 хв при 600 g. У результаті цього осаджувалися ядра і обривки мембран.
Супернатант центрифугували 20 хв при 4500 g.
Осад ресуспендували в середовищі з ЕГТА і центрифугували 20 хв при 4500 g.
Осад ресуспендували в середовищі без ЕГТА і без ЕДТА у співвідношенні 100 мкл середовища на кожен грам тканини і ставили на лід.

2.4. Виділення мітохондрій із серця щурів
Середа виділення (150 мл, рН 7.4): сахароза 70 мМ; манітол 210 мМ; хепес 10 мМ; ЕГТА 2 мМ. Середу поділяли на три частини. В одну (10 мл) додавали 1 мг протеази (безпосередньо перед виділенням). В іншу (70 мл) - додавали 140 мг БСА. У третю (70 мл) нічого не додавали.
Всі процедури проводили при 4 ° С.
Серце поміщали в заздалегідь охолоджений фізрозчин і зважували. Потім клали серце в середу з протеазой на 10 хвилин, подрібнюючи серце ножицями. Через 10 хвилин частина рідини зверху зливали, щоб видалити частинки жиру і зв'язки. Далі розводили середовищем з альбуміном у 9 разів і гомогенізували.
Гомогенат центрифугували п'ять хвилин при 650g (осідають ядра і обривки мембрани).
Супернатант центрифугували 10 хв при 8000g.
Осад ресуспендували в середовищі без альбуміну, центрифугували 10 хвилин при 8000g.
Осад знову ресуспендували в середовищі без альбуміну з розрахунку 0.1 мл середовища на 1 г тканини серця і ставили на лід.

2.5. Визначення параметрів транспорту До ⁺ за допомогою
К ^{+-селективного} електрода
Іон-селективні електроди дозволяють визначати концентрацію іонів у розчині, яка залежить від різниці потенціалів, що виникає між електродом та електродом порівняння.
Середовище для К ⁺ - електрода (рН 7.2-7.4): Сахароза 150 мМ; Тріс (гідроксиметил) метиламін 10 мМ; NaH ₂ PO ₄ 5 мМ. Використовували прилад «Record 4».
Калібрували шкалу.
У комірку додавали: 1 мл середовища; модулятори каналів, інгібітори ланцюга і т. п.; мітохондрії; ДНФ (5 мкл); triton x-100 (5 мкл, 10%).
Після вимірювань кювету промивали.
Визначали швидкість виходу іонів калію і його кількість в мітохондріях.
Перераховували швидкість виходу калію і його кількість на міліграма білка мітохондрій.

2.6. Визначення параметрів дихання за допомогою кисневого електроду Кларка
Середовище для електрода (рН 7.4): 150 мМ сахароза, 50 мМ хлорид калію; 5 мМ дигідрофосфат натрію; 0.5 мМ хлорид магнію, 10 мМ хепес. Використовували прилад «Record 4».
Калібрування шкали виконували по двох точках. «Нуль» нмоль кисню встановлювали при додаванні дитіонітів натрію (кілька мкг), так як дітіоніт є сильним відновником. 250 нмоль кисню відповідає змісту кисню в середовищі дихання об'ємом 1 мл.
У комірку додавали 1 мл середовища. 1 мМ Rotenon, 5 мМ сукцинат, мітохондрії, 200 мкМ АДФ, ДНФ (5 мкл).
Програма автоматично розраховує швидкість дихання.
Швидкості: до додавання АДФ, після додавання АДФ, після фосфорилювання АДФ, після додавання роз'єднувача вимірювали на самому прямому ділянці.
Перераховували швидкість дихання на міліграм білка мітохондрій.

2.7. Спектрофотометричне визначення швидкості
набухання мітохондрій
Потенціал-залежний вхід іонів К ⁺ в мітохондрії викликає вхід осмотично облігатної води, що веде до набухання і збільшення оптичної щільності.
Середовище для набухання: КCl 50 mM; NaH ₂ PO _{4 травень} mM; MgCl ₂ 0.5 mM; Hepes 5 mM; EGTA 100 мкM.
У кювету додавали: 5 мкМ цитохром С - 4 мкл; 1 мМ Rotenone (якщо в якості субстрату сукцинат) - 10 мкл; 2 мл середовища; модулятори, активні речовини, і. т. п; мітохондрії.
Використовували метод динамічного визначення оптичної щільності при довжині хвилі 520 нм, встановивши час вимірювання рівне трьом хвилинам. Через півтори хвилини додавали субстрат (сукцинат або малат з глутаматом). Після закінчення вимірювання дані зберігали в Excel і розраховували зміна оптичної щільності в хвилину на міліграма білка мітохондрій.

2.8. Визначення стійкості до гіпоксії щурів і адаптація до неї нізкоустойчівих щурів
Групу самців лінії Вістар, помістивши в барокамеру і знизивши тиск до 22 кПа, піддали гострій гіпобаричної гіпоксії, відповідної підйому на висоту 11500 м . Ті тварини, що витримували гіпоксію протягом 10-15 хвилин, вважалися високоустойчиви. Нізкоустойчівие щури витримували цю висоту лише протягом півтора хвилин. Середньостійкі щурів в експеримент не брали. Адаптація нізкоустойчівих щурів проводилась методом інтервальної нормобаричної гіпоксії. Для цього тварини містилися в камеру з контрольованою подачею повітря. Протягом дванадцяти днів тваринам щодня по п'ять разів на день подавалося повітря з вдвічі зниженою концентрацією кисню протягом 10 хвилин з хвилинної перерви, під час яких тваринам подавалося повітря з нормальною концентрацією кисню.

3. Результати та обговорення

3.1. Виділення білка з молекулярною масою 55 кДа

1 2 3 4 5 6

Виділення білка з м. м. 55 кДа з внутрішньої мембрани мітохондрій печінки щурів проводили методом водно-етанольних екстракції [3]. Очищення білка проводилась методом іонообмінної хроматографії з використанням ДЕАЕ-целюлози в якості носія. Присутність білка у фракціях виявляли за допомогою SDS-електрофорезу в 10%-му ПААГ (рис 3).

Малюнок 3. SDS-електрофорез фракцій після повторної хроматографії. На треку 1 - маркер. На треках 2,3 - білок з Мr 55 кДа (фракції з 250 мМ КСl)
Додаткова перевірка фракцій проводилася на приладі для визначення провідності штучних біслойних мембран. При вбудовуванні білка фракції, що містять канальну субодиницю мито-К ⁺ _АТФ виявлялася провідність мембран, інгібіруемая АТФ (рис. 4).
Для додаткового очищення проводили повторну хроматографію активної фракції. Для остаточного очищення білка до електрофоретичної гомогенного стану проводився нативний електрофорез активної фракції з наступною елюції білка з гелю.
Малюнок 4. К ^{+-транспортує} АТФ-інгібіруемая активність білка з молекулярною масою 55 кДа, реконструйованого в штучну мембрану.
Електрофоретичної гомогенний АТФ-інгібіруемий К ^{+-транспортує} білок з M _r 55 кДа заморожували і накопичували для імунізації. При виділенні вищеописаним методом з 100 г печінки щурів отримували 30-70 мкг очищеного білка. Імунізацію кролів проводили при накопиченні 0.2-0.4 мг білка.

3.2. Визначення параметрів дихання у щурів з різною стійкістю до гіпоксії та адаптованих до неї
Визначення проводилося за допомогою кисневого електроду Кларка. Визначалася швидкість дихання (V3) і швидкість фосфорилювання АДФ (V2) в мітохондріях печінки і серця трьох груп щурів. Отримані дані представлені в таблиці 5.
Як видно з таблиці 5, мітохондрії печінки високоустойчиви до гіпоксії щурів швидкості дихання у всіх метаболічних станах, а також у присутності роз'єднувача нижче в порівнянні з цими швидкостями у нізкоустойчівих тварин. Цей ефект не залежав від наявності К ⁺ в середовищі

Середа	Групи щурів	V2, нмоль О 2 / хв * мг білка	V3, нмоль О 2 / хв * мг білка	V4, нмоль О 2 / хв * мг білка	V ДНФ, нмоль О 2 / хв * мг білка	ДК
З іонами К +	ВУ	8.38 ± 1.14	87.9 ± 3.54	23.24 ± 2.88	179.5 ± 4.88	3.78 ± 0.12
	НУ	14.54 ± 1.68	110.76 ± 4.95	32.9 ± 3.25	181.0 ± 4.27	3.36 ± 0.33
	А	11.46 ± 1.32	68.03 ± 4.76	24.7 ± 2.65	94.4 ± 4.12	2.75 ± 0.21
Без іонів К +	ВУ	8.46 ± 0.93	35.01 ± 3.87	11.61 ± 2.54	112 ± 5.21	3.1 ± 0.26
	НУ	14.6 ± 2.05	64.01 ± 3.24	26.58 ± 3.44	166.78 ± 5.8	2.4 ± 0.19
	А	8.76 ± 1.39	45.95 ± 4.77	19.92 ± 1.76	79.55 ± 4.22	2.3 ± 0.14

Таблиця 5. Швидкість дихання в мітохондріях печінки щурів з різною стійкістю і адаптованих до гіпоксії з використанням двох середовищ і сукцинату в якості дихального субстрату.
інкубації мітохондрій. Адаптація до гіпоксії нізкоустойчівих тварин веде також до зниження всіх швидкостей, однак, у присутності іонів калію,
ці швидкості дихання знижуються не так значно. Останнє може вказувати на активацію транспорту іонів К ⁺ в мітохондріях при адаптації тварин до гіпоксії. Слід зазначити, що ці ефекти більше проявляються по відношенню до швидкості дихання у присутності субстрату (V2, V4) в порівнянні зі швидкістю АДФ-стимульованого дихання (V3). Це може бути пов'язано зі збільшенням концентрації АТФ в мітохондріях після фосфорилювання доданого АДФ. Як відомо, АТФ інгібує вхід катіонів К ⁺ в мітохондрії.
Виявлено також, що у адаптованих до гіпоксії тварин дихальний контроль у середовищі з іонами К ⁺ знижений порівняно з цим показником у нізкоустойчівих до гіпоксії тварин. Це зниження спостерігається тільки в середовищі, що містить катіони К ^+, що може вказувати на активацію енергозалежних процесів у мітохондріях.
Сукупність отриманих даних вказує на те, що 1) адаптація до гіпоксії веде до інгібування роботи фосфорилирует дихального ланцюга, незалежно від присутності або відсутності іонів К ⁺ в середовищі, ймовірно, за рахунок активації гліколізу і 2) адаптація веде також до активації знергозавісімого входу К ⁺ в мітохондрії.
Для підтвердження отриманих даних у цих же тварин були визначені параметри АТФ-залежного транспорту іонів К ⁺ в мітохондріях, а також кількість катіонів К ⁺ в них.

3.3. Вивчення параметрів АТФ-залежного транспорту
іонів калію в мітохондріях
Дослідження параметрів проводилося на двох моделях:
А) Модель енергозалежної набухання мітохондрій.
Збільшення концентрації іонів К ⁺ матриксі провокує осмотично облигатное надходження води і, отже, набухання мітохондрій. Зміна об'єму мітохондрій впливає на їх оптичну щільність. Отже, активність каналу можна визначити методом динамічної спектрофотометрії.
Швидкість енергозалежної входу іонів К ⁺ визначалася у щурів з різною стійкістю, а також адаптованих до гіпоксії щурів. Дані представлені в таблиці 6.
З отриманих даних випливає, що швидкість енергозалежної транспорту До ⁺ значно вище у високоустойчиви і адаптованих до гіпоксії щурів у порівнянні з нізкоустойчівимі тваринами.

Субстрат	Показник	НУ	А	ВУ
Сукцинат	Швидкість, DD / хв * мг білка МХ	0.452 +0.074	0.566 +0.146	0.626 +0.122
Малат + глутамат	Швидкість, DD / хв * мг білка МХ	0.339 +0.032	0.548 +0.038	0.537 +0.156

Таблиця 6. Енергозалежний вхід калію в мітохондрії печінки тварин з різною стійкістю до гіпоксії, а також адаптованих до гіпоксії тварин.
Б) Модель енергозалежної набухання мітохондрій.
При сильному роз'єднанні мітоК ⁺ _АТФ здатний опосередковувати вихід іонів К ⁺ з матриксу, тобто звертати свою роботу, що спостерігалася у фізіологічних умовах. Показано, що ця активність інгібується АТФ, що доводить специфічність виходу іонів К ⁺ в даній моделі саме через цей канал.
Швидкість виходу катіонів К ⁺ визначалася у всіх груп щурів.
Дані отримані на моделі ДНФ-індукованого виходу іонів К узгоджуються з даними, отриманими на моделі енергозалежної набухання мітохондрій. Тобто, вказують на споконвічно більшу активність каналу у високоустойчиви щурів і підвищення активності каналу при адаптації. Дані представлені в таблиці 7.