Реферат
Принципи біохімічного дослідження
Введення
Основне завдання біохімії - пояснити, як функціонують живі системи з точки зору процесів, що протікають у клітинах. Всі клітини в організмі знаходяться в стані динамічної активності і піддаються дії внутрішніх і зовнішніх факторів, які в свою чергу також постійно змінюються. У процесі життєдіяльності будь-яка окремо взята клітина взаємодіє з іншими клітинами, які перебувають як в безпосередній близькості від неї (міжклітинні взаємодії), так і на деякій відстані (гормональні ефекти). Функціонування органели всередині клітини також в значній мірі залежить від активності інших органел і навколишнього цитоплазми. Ясно тому, що не можна досить повно вивчити живу клітину, якщо робити це у відриві від цілого організму.
Інтенсивні дослідження, розширюють і поглиблюють наші знання про численні процеси, що протікають в живому організмі, ведуться в галузі фармакології, мікробіології, патології та інших наук. Біохімія вивчає ці процеси головним чином на рівні клітини і клітинних структур, проте отримані результати повинні розглядатися також на рівні органів, тканин, всього організму і навіть у взаємозв'язку організму з навколишнім середовищем.
Вивчення будь-якій послідовності взаємопов'язаних процесів, що протікають в будь-якій біологічній системі, починають, як правило, з вивчення її компонентів. Для цього компоненти зазвичай виділяють, всебічно їх досліджують і намагаються зрозуміти, як вони функціонують у складі організму.
Процеси, характерні для цілої клітини, протікають в окремих клітинних частинках і органелах, які для аналізу виділяють з клітини за допомогою фракціонування. Цей процес звичайно складається з двох етапів (розд. 1.10 .3): спочатку клітини руйнують, а потім з утвореної суспензії методом центрифугування (гл. 2) виділяють потрібні частинки і органели. Подальший поділ індивідуальних компонентів клітинних частинок і органел та вивчення їх властивостей проводять за допомогою центрифугування (гл. 2), хроматографії (гл. 3) або електрофорезу (гл. 4). Для визначення складу, механізму дії та функцій клітинних компонентів користуються складними кількісними та якісними аналітичними методами. На атомному та молекулярному рівнях застосовують цілий ряд спектральних методів (гл. 5); механізм дії клітинних частинок і внутрішньоклітинні взаємодії вивчають, використовуючи одночасно кілька аналітичних методів, таких, як спектроскопія (гл. 5) і радіоізотопні методи (гл. 6), потенціометрія , полярографія (гл. 7) і манометр (гл. 8).
При фракціонуванні нормальна активність клітини може в значній мірі порушуватися. Щоб звести наслідки фракціонування до мінімуму і наблизити умови до природних, застосовують особливі прийоми (розд. 1.10.1). Однак все по бочние явища, що виникають в ході фракціонування, усунути неможливо, тому отримані результати слід трактувати дуже обережно, особливо якщо мова йде про цілій клітині, органі чи організмі.
1. РН середовища та буферні розчини
1. 1 Вплив рН на біологічні процеси
Організми і клітини, як правило, досить стійкі навіть до значних змін рН навколишнього середовища. Внутрішньоклітинні процеси, навпаки, мають високу чутливість до рН і протікають у середовищі, рН якої суворо регулюється (правда, деякі коливання рН можуть спостерігатися і всередині клітини, наприклад у поверхні мембрани). Більшість внутрішньоклітинних процесів протікає при нейтральних значеннях рН, коли їх швидкість максимальна. Гідролази лізосом, однак, мають максимальну активність при рН 5, 0. Шлунковий сік ссавців має вельми незвичайну величину рН - близько 1; саме при цьому рН активність ферменту пепсину, початківця переварювання білків їжі в шлунку, максимальна.
У біологічних системах постійна величина рН підтримується за допомогою ефективних буферних систем, які за своєю хімічною природою такі, що вони перешкоджають змін рН, що виникають в ході метаболічного утворення кислот (наприклад, молочної кислоти) і основ (наприклад, аміаку). Більшість буферних систем, що містяться в клітинних рідинах, включають фосфати, бікарбонат, амінокислоти і білки.
Чутливість біологічних процесів до рН обумовлена цілим рядом причин. Іони водню можуть виступати в якості каталізатора ряду процесів, бути реагентом або продуктом реакції. Крім того, при зміні рН може змінитися проникність клітинної мембрани, а отже, і розподіл речовин або іонів по обидві її сторони. Подібно до інших біологічних структурам, мембрани містять здатні до іонізації групи, і залежно від ступеня їх іонізації змінюється конформація, а значить і біологічна активність молекул, в які ці групи входять. Це насамперед стосується білків, а отже, ферментів. У деяких білках невелика зміна рН навколишнього середовища викликає прояв біологічної активності. На прикладі гемоглобіну, основною функцією якого є перенесення кисню від легень до тканин, можна бачити, що при активному тканинному диханні незначне зниження рН в тканинах у результаті утворення вуглекислоти та іонів водню полегшує вивільнення кисню. Процес вивільнення кисню супроводжується зв'язуванням протонів гемоглобіном, що збільшує буферну ємність системи.
При вивченні метаболічних процесів in возникает необходимость в применении «нефизиологических» буферных растворов: направленное изменение рН может значительно облегчить изучение таких типов молекул, как аминокислоты, белки и нуклеиновые кислоты с помощью электрофореза и ионообменной хроматографии. vitro виникає необхідність у застосуванні «нефізіологічні» буферних розчинів: спрямована зміна рН може значно полегшити вивчення таких типів молекул, як амінокислоти, білки і нуклеїнові кислоти за допомогою електрофорезу та іонообмінної хроматографії.
1.2 Буферні розчини для біологічних досліджень
Буферним називається такий розчин, який перешкоджає зміни концентрації іонів водню при додаванні до нього кислоти або лугу. Така дія розчину називається буферним. Величину буферного дії характеризують буферною ємністю р, рівною кількістю сильної основи, яке необхідно додати для зміни рН розчину на одну одиницю.
( pH ) — изменение рН раствора при добавлении основания.
де d (pH) - зміна рН розчину при додаванні підстави.Зазвичай користуються буферними розчинами, що складаються з суміші слабкої кислоти або основи і солі цієї кислоти, наприклад суміші оцтової кислоти і ацетату натрію (по номенклатурі Бренстеда та Лоурі буферний розчин представляє собою суміш слабкої кислоти і сполученого з нею підстави).
При додаванні до розчину слабкої кислоти (НА) і її солі (А ~) іонів водню останні нейтралізуються аніонами солі, які діють в даному випадку як слабка основа; гідроксильні іони, навпаки, нейтралізуються кислотою. Звідси випливає, що буферна ємність розчину, складеного з цієї кислоти і сполученого з нею підстави, максимальна в тому випадку, коли їх концентрації рівні, тобто рН = рК а кислоти. Буферна ємність залежить також від загальної концентрації розчину і відносини сіль-кислота: чим вище концентрація розчину, тим більше його буферна ємність. Концентрація кислоти і солі в буферних розчинах зазвичай буває близько 0,05-0,20 М, а достатньої буферною ємністю розчини мають в області значень
рН = рК а ± 1
Буфери, застосовувані для біологічних досліджень, повинні задовольняти ряду вимог:
1. Володіти достатньою буферною ємністю в необхідному діапазоні значень рН.
2. Володіти високим ступенем чистоти.
3. Добре розчинятися у воді і не проникати через біологічні мембрани.
4. Володіти стійкістю до дії ферментів і гідролізу.
5. рН буферних розчинів повинен якомога менше залежати від їх концентрації, температури та іонного або сольового складу середовища.
6. Не чинити токсичного чи інгібуючої дії.
7. Комплекси буфера з катіонами повинні бути розчинними.
8. Не поглинати світло у видимій або ультрафіолетовій областях спектру.
На жаль, цим вимогам задовольняють далеко не всі буферні розчини. Так, фосфати мають здатність осаджувати полівалентні катіони і в багатьох системах виступають в якості метаболітів або інгібіторів; трис-буфер іноді надає токсична або інгібуючу дію. До недавнього часу налічувалося всього кілька буферів, рН яких лежить у важливій для біохімії області 6,0-8,0 і які задовольняють перерахованим вище вимогам. В останні роки, однак, з'явився цілий ряд так званих цвіттеріонних буферів типу ГЕПЕС і ПІГТЕС. Деякі найбільш поширені буфери наведено в табл. 1.1. Для отримання буферних розчинів, які застосовуються у широкому діапазоні значень рН, використовуються суміші різних буферів. Наприклад, буфери Мак-Ільвейна мають рН з областю значень від 2,2 до 8,0 і готуються з лимонної кислоти і двузамещенного фосфорнокислого натрію.
Найбільш важливою групою фізіологічних буферів є білки. Завдяки великій кількості містяться в бічних ланцюгах амінокислот лужних і слабокислих груп білки мають дуже високу буферну ємність. Буферна ємність крові в ос новних визначається гемоглобіном.
1.3 Залежність іонізації амінокислот і білків від рН
Амінокислоти і білки - це найбільш важливі в біологічному відношенні з'єднання, тому необхідно знати, в якій мірі зміна рН впливає на їх фізичні властивості. ( NH 2 ) COOH . рН аминогруппы лежит в области 9 ,0—10 ,5, а карбоксильной группы — между 1,7 и 2 ,4.
За винятком проліну, хімічні формули всіх амінокислот, з яких синтезуються білки, можна записати в загальному 'вигляді як RCH (NH 2) COOH. РН аміногрупи лежить в області 9 ,0-10, 5, а карбоксильної групи - між 1,7 і 2, 4.Ступінь іонізації амінокислот у водних розчинах залежить від рН і визначається рівнянням Гендерсона-Хассельбальха.
Таким чином, при низьких значеннях рН амінокислота знаходиться в катіонній формі, а при високих - в аніонних. При деякому проміжному значенні рН амінокислота виявляється незарядженої і називається цвіттеріоном. Було встановлено, що в кристалічному стані або після розчинення в чистій воді такі амінокислоти існують головним чином у вигляді цвіттеріонов, що надає їм властивості іонних сполук, а саме високу точку плавлення і кипіння, хорошу розчинність у воді і погану розчинність в таких органічних розчинниках, як ефір і хлороформ. Величина рН, при якій у водному розчині переважає цвіттеріон, називається ізоіонной точкою: число негативних зарядів, які виникають на молекулі в результаті відщеплення протонів, дорівнює кількості позитивних зарядів, які виникають завдяки приєднанню протонів. ) — молекула не несет суммарного заряда и таким образом оказывается электрофоретически неподвижной.
Для амінокислот ця величина приблизно відповідає ізоелектричної точці (pi) - молекула не несе сумарного заряду і таким чином виявляється електрофоретичної нерухомою. Чисельне значення рН для цього випадку залежить від того, наскільки сильною є кислота, і визначається наступним рівнянням:Для гліцину величини рКа, Н рКа р дорівнюють 2, 3 і 9,6 відповідно; отже, ізоіонная точка дорівнює 6, 0. При більш низьких значеннях рН у розчині містяться і цвіттеріон, і катіон, а співвідношення між ними визначається рівнянням Гендерсона - Хассельбальха; при більш високих рН поряд з цвіттеріоном в розчині перебуває аніон.
Для так званих «кислих» амінокислот, наприклад, аспарагінової кислоти; іонізація має дещо інший характер. Це обумовлено наявністю у них другий карбоксильної групи.
У цьому випадку рН, при якому у водному розчині переважає цвіттеріон, визначається величинами РС а, і рК аз
Для лізину, який є «основний» амінокислотою, ізоіонная точка визначається величинами рКа 2 і рКа 3 - Іонізація відбувається наступним чином:
Замість другої аміно-або карбоксильної групи бічний ланцюг амінокислоти іноді містить іншу хімічну групу, яка при певному значенні рН також ионизуется. До таких груп відносяться фенольна (тирозин), гуаніновий (аргінін), імідазольна (гістидин) і сульфгідрильних груп (цистеїн). Ясно, що ступінь іонізації різних основних груп амінокислот при одному і тому ж рН буде різною. Більш того, невеликі відмінності можуть спостерігатися навіть у однієї і тієї ж групи. Ці відмінності використовують при електрофоретичному і іонообмінному поділі сумішей амінокислот, наявних, наприклад, у білковому гідролізаті.
Іонізація молекул білка якісно нагадує іонізацію амінокислот, але в кількісному відношенні відрізняється від неї завдяки наявності великої кількості здатних до іонізації груп. Білки утворюються шляхом конденсації а-аміногрупи однієї амінокислоти з о-карбоксильною групою сусідній амінокислоти, тому, за винятком двох кінцевих амінокислот, все про аміно-та карбоксильна групи беруть участь в утворенні пептидних зв'язків і в білки не іонізуются. Однак у бічних ланцюгах присутні сотні аміно-і карбоксильних груп, які можуть легко ионизованного. Електростатичне тяжіння, що виникає між деякими з цих груп, сприяє стабілізації третинної структури білкової молекули, при цьому молекули білків часто бувають згорнуті таким чином, що більшість здатних до іонізації груп виявляються розташованими на поверхні молекули, де вони можуть вступати у взаємодію з навколишнім середовищем. Природно, що відносне число позитивно і негативно заряджених груп у молекулі білка визначає ті чи інші її фізичні властивості. У гістонів переважають катіонні групи, в той час як в інших білках кількість аніонних та катіонних груп або однаково, або, навпаки, переважають аніонні групи.
На відміну від амінокислот у білків ізоіонная точка зазвичай не збігається з ізоелектричної. За визначенням ізоіонная точка - це така величина рН, при якій молекула білка містить рівну кількість позитивно і негативно заряджених груп, що утворилися в результаті зв'язування основних груп з протонами і відповідної дисоціації кислотних груп. Ізоелектрична точка - це рН, при якому білок електрофоретичної нерухомий. При її визначенні білок розчиняють в буферному розчині. У цьому розчині завжди містяться низькомолекулярні аніони і катіони, здатні зв'язуватися з численними зарядженими групами білка. У таких умовах спостережуване в ізоелектричній точці рівновагу зарядів частково обумовлено їх компенсацією пов'язані з молекулами білка аніонами і катіонами.
Молекули білка завжди вивчають у буферних розчинах; при цьому важливо встановити ізоелектрична крапку, оскільки, на приклад, саме при цьому значенні рН створюються найбільш сприятливі умови для взаємодії між протилежно зарядженими групами сусідніх молекул, що веде до їх подальшої агрегації і швидкому осадженню.
Агрегацію, а отже, і осадження білкових молекул можна викликати додаванням до розчину білка солей, наприклад сульфату амонію. Молекули білка і неорганічні іони при гідратації конкурують за молекули води, і після досягнення певної концентрації солі взаємодії білок - білок починають переважати над взаємодіями білок - вода, що призводить до агрегації, а потім і осадженню білка. Цей метод широко застосовується на початкових стадіях очищення білків. Відмінності в ізоелектричній точці різних білкових молекул використовуються при поділі білків за допомогою електрофорезу.
2. Підходи до біохімічного дослідження
Як ми вже говорили, активність клітини залежить від взаємодії її як з безпосереднім оточенням, так і з клітинами, значно віддаленими від неї; крім того, грає роль також і те, які методи застосовуються для її вивчення. Тому щоб одержати найбільш повне уявлення про стан клітин усередині органів і тканин, досліди найкраще проводити на інтактних ізольованих органах і тканинах. Перевага такого вивчення полягає в тому, що при цьому вдається уникнути небажаних ефектів, обумовлених зміною безпосереднього тканинного оточення, як це має місце, наприклад, при фракціонуванні клітин. Дослідження на рівні цілих організмів не тільки не порушує цілісності тканин, але дозволяє вивчати окремі органи і тканини, залишаючи без зміни постачання їх поживними речовинами, нервову і гормональну регуляцію і т. д. Таким чином, щоб отримати повну картину клітинного обміну, необхідно провести дослідження на цілому організмі, ізольованому органі, на рівні клітини, клітинної органели, на молекулярному та атомному рівнях.
На рис. 1.1 показано шляхи біохімічних підходів до вивчення можливих перетворень будь-якого екзогенного з'єднання (ксенобіотика) в організмі тварини або його дії на цей організм. Існують два підходи, які взаємно доповнюють один одного.
Перший з них полягає в тому, що тварині вводять з'єднання, а потім виділяють і ідентифікують всі продукти, що виводяться з організму. В інших випадках через деякий час після введення з'єднання тварина умертвляють, виділяють і фракционируют потрібний орган або тканину, а потім вивчають долю введеного з'єднання або досліджують його дію на цікаву субклітинних систему.
Другий підхід полягає у введенні з'єднання на одному з вказаних на рис. 1.1 рівнях (тобто до відповідного ізольований орган, гомогенат, органелу або субклітинних систему) і вивченні дії цього з'єднання або шляхів його перетворення на даному або більш низьких рівнях.
Дія будь-якого сполуки можна досліджувати на декількох клітинних частинках або органелах, кожну з яких необхідно для цього виділити із системи і піддати аналізу.
Найчастіше досліджуване з'єднання являє собою природний метаболіт або входить до складу самого організму, а інколи є ізотопом складового компонента організму. З іншого боку, не завжди дію будь-якого екзогенного з'єднання на функціонування організму представляє інтерес для біохіміка. У будь-якому випадку вивчення можна проводити на будь-якому з вищевказаних рівнів організації, а отримувані на кожному рівні результати допомагають скласти більш повне уявлення про процеси, що протікають в організмі.
3. Дослідження на рівні цілого організму
Біохімічні експерименти на тваринах можуть бути зроблені з різними цілями. Застосовуючи протягом тривалого часу спеціальну дієту, позбавлену певних вітамінів або мікроелементів, і одночасно реєструючи виникають при цьому фізіологічні та клінічні зміни, можна дослідити метаболічну роль даного вітаміну або мікроелемента. Разом з тим, вводячи тварині будь-яке екзогенне з'єднання, можна вивчати як вплив цього з'єднання на організм тварини (фармакологічна або патологічна відповідна реакція), так і вплив організму на введене з'єднання, тобто його перетворення та виведення. Останнім часом, головним чином завдяки створенню комітету Данлопа (нині Комітет з безпеки застосування лікарських засобів) після відомої трагедії з талідомід, все більшу увагу стали приділяти питанням про те, яким чином різні лікарські речовини, харчові добавки і барвники, а також такі сполуки, як ДДТ, накопичуються в їжі і метаболізуються, де вони локалізуються, яке руйнує дію надають на органи і тканини і які тератогенні і канцерогенні побічні ефекти можуть викликати.
Єдиним способом дослідити шляхи перетворення введених сполук у людини є визначення змісту цих сполук та їх метаболітів у крові, сечі, фекаліях, жовчі, видихуваному повітрі, поті і слині. Про поразку органу судять по зміні змісту в сироватці крові таких ферментів, як аспартат-амінотрансфераза і лактатдегідрогеназа. Після введення сполук лабораторних тварин умертвляють, а потім досліджують ізольовані органи.
Результати, одержані при аналізі змісту будь-яких з'єднань і їх метаболітів у біологічних рідинах і екскрементах живих організмів, у тому числі і організму людини, залежать від багатьох взаємопов'язаних факторів. До цих факторів належать:
Спосіб введення з'єднання (перорально або шляхом внутрішньовенної, внутрішньом'язової, підшкірної або внутрішньочеревно ін'єкції).
Швидкість всмоктування з'єднання у кров; якщо з'єднання вводять не внутрішньовенно, то воно повинно проникнути (зазвичай шляхом пасивної дифузії), принаймні, через одну мембрану (якщо з'єднання являє собою слабкий електроліт, то воно повинно пройти через мембрану в неіонізованной формі).
Ступінь зв'язування з'єднання з сироватковим альбуміном.
Кровопостачання тканин.
Здатність даного з'єднання проходити через мембрани і розподілятися в міжклітинних і внутріклітинних рідинах.
Накопичення з'єднання в жировій тканині і характер його зв'язування з нуклеїновими кислотами і меланіном.
Швидкість метаболізму з'єднання (головним чином ферментної системою мікросом печінки).
Швидкість виведення (з сечею і жовчю).
Сукупність перерахованих вище факторів створює характер.
Для даного з'єднання «фармако-кінетичну» картину. Крім усього перерахованого, мають значення також вік, стать, режим харчування, фізичні навантаження, генетичну будову тварини, а також час дня, коли тварині було введено з'єднання (через наявність у тварин циркадного ритму). Виявилося навіть, що перетворення введеного з'єднання у тварин, що утримуються в клітках з м'якими тирсою, відбувається швидше, ніж у тварин, були поміщені в клітки з жорсткими тирсою. Саме завдяки величезному різноманіттю змінних експерименти завжди слід проводити не на одній тварині, а на цілих групах. Дослідження потрібно проводити на тварин чистих ліній, а одержувані експериментальні дані піддавати ретельній статистичній обробці. Результати аналізу фармакологічної дії введених експериментальним тваринам з'єднань необхідно зіставляти з даними, які отримуються в групі контрольних тварин, яким було введено плацебо, тобто абсолютно нейтральну речовину, наприклад лактоза.
Вивчення метаболізму ксенобіотиків проводять на самих різних> лабораторних тварин - мишах, щурах, морських свинках (з-за їх малої вартості і простоти догляду за ними), поряд з ними для дослідів використовують також кроликів, кішок, собак і мавп. Однією з основних проблем, що стоять перед біохіміками і фармакологами, є екстраполяція результатів, отриманих на лабораторних тварин, до людини. Численні порівняльні дослідження показали, що метаболічні процеси у людини і всіх досліджених видів тварин істотно розрізняються. Саме з цієї причини нові лікарські препарати, призначені для введення людині, попередньо проходять випробування не на одній тварині, а на цілому ряді різних лабораторних тварин. Тільки після ретельного порівняльного аналізу отриманих результатів клінічні випробування можна проводити на людині.
При вивченні метаболізму ксенобіотиків найзручніше вводити їх у вигляді ізотопних міток; як правило, вводять препарати, мічені по 14 0 С. Екскрецію у дрібних лабораторних тварин доцільно вивчати за допомогою спеціальної метаболічної скляної камери, в яку тварина поміщають на весь час досвіду (рис. 1.2). Завдяки особливій конструкції камери сеча і фекалії збираються окремо, а видихається вуглекислий газ надходить у спеціальну пастку. При вивченні мічених по вуглецю сполук у клітину подається повітря, не містить вуглекислого газу, а видихається вуглекислий газ поглинається розчином гідроокису натрію; аналіз видихуваного вуглекислого газу, міченого по вуглецю (14 С0 2), дозволяє встановити ступінь розпаду досліджуваного з'єднання. Кошти, виділені з сечею і фекаліями речовини та їхні метаболіти пов'язані, як правило, з такими сполуками, як Р-глюкуронова кислота, гліцин, глутатіон і сульфат, що підвищує розчинність метаболітів у воді, а отже, і ступінь їх екскреції. Тому перед екстракцією метаболітів органічними розчинниками (ефіром або хлороформом) проби екскрементів потрібно гідролізувати, попередньо дослідивши їх відповідними аналітичними методами.
Одним із способів вивчення шляхів перетворення введеного з'єднання in является перфузия органов (например, почек или печени), при которой соединение вводят с помощью тонкой полой иглы в артерию, несущую кровь к данному органу, а затем анализируют пробы крови, взятые из соответствующей вены животного. vivo є перфузія органів (наприклад, нирок або печінки), при якій з'єднання вводять за допомогою тонкої порожнистої голки в артерію, яка несе кров до даного органу, а потім аналізують проби крові, взяті з відповідної вени тварини.
В Англії існують інструкції, що обмежують застосування живих хребетних тварин для дослідницьких цілей; контроль за виконанням цих інструкцій здійснюється спеціальними комісіями Внутрішнього департаменту (Міністерства внутрішніх справ Великобританії). Експерименти на живих хребетних не можна проводити без особливого дозволу міністерства, яка має бути підписана професором фізіології (або фахівцем суміжного профілю) і президентом Королівського товариства або його заступником.
Для вивчення розподілу введеного з'єднання тварина через деякий час після ін'єкції умертвляють за допомогою анестезій, декапітації або цервікальної дислокації. Потім проводять дослідження або трупа тварини, або окремих органів, які для цієї мети ізолюють, виявляють морфологічні зміни, що відбулися в них, вивчають їх складові частини.
Для отримання наочного уявлення про розподіл введених дрібним лабораторним тваринам радіоактивних сполук успішно застосовується метод авторадіографії препаратів цілого організму (розд. 6.2.4). Цей метод дозволяє отримати дані про розподіл і відносному змісті введеного сполуки у тканинах тварини, швидкості його виведення і здатності проникати крізь біологічні мембрани. Через певний проміжок часу після введення з'єднання тварина умертвляють за допомогою анестезії і швидко заморожують сумішшю ацетону з твердим С0 2 при температурі -78 ° С або за допомогою рідкого азоту. Заморожене тварина поміщають при низькій температурі у водний розчин смоли (аравійська камедь), а після застигання смоли розсікають на відповідному рівні різцем, прикріпленим до електродрилі, або роблять секційні зрізи за допомогою мікротому зі спеціальним лезом з карбіду вольфраму. Отриманий зріз прикладають до рентгенівської плівці і залишають на 1-2 тижнів при низькій температурі, після чого плівку проявляють. Зіставляючи отриману авторадіограмму з кольоровим знімком зрізу, вивчають розподіл і локалізацію введеного тварині ізотопу в різних його органах і тканинах. Типова авторадіограмма зображена на рис. 1.3.
4. Ізотонічні сольові розчини
При проведенні експериментів на органах тварин, зрізах рослинних і тваринних тканин, гомогенатах і клітинних органелах необхідно, щоб середовище для суспендированием мала не тільки певний рН, а й заданий іонний склад. Середовище повинне бути ізотонічної, т. е. осмотичний тиск в ній повинно збігатися з осмотичним тиском усередині клітини або клітинної органели, щоб їх метаболічна цілісність не порушувалася. Крім того, якщо, наприклад, вивчають ріст клітин, середовище для суспендированием повинна містити всі необхідні основні поживні речовини. Ця вимога потрібно особливо ретельно виконувати при вивченні культур клітин і тканин, особливо культур клітин тварин.
Існує цілий ряд фізіологічних сольових розчинів, багато з яких є різновидами одного з перших - розчину Рінгера. До них відносяться розчини Тайрода, Янга, Лока, Менгу і Так Жалона. Найбільш часто застосовуються фосфатний і бікарбонатний розчини Кребса-Рінгера. За своїм іонному складу бікарбонатний сольовий розчин близький до сироватці крові ссавців. Фосфатний розчин Кребса-Рінгера не є фізіологічним, але може з успіхом застосовуватися для вивчення зрізів і гомогенатів тканин в тих випадках, коли поглинання кисню вимірюють манометричним методами (розд. 8.6.2). , КС1, MgS 0 4 , СаС1 2 , NaHCO s и КН 2 Р0 4 ; некоторые растворы насыщены смесью газов — кислорода и углекислого газа.
Більшість цих сольових розчинів містять в різних кількостях NaCl, КС1, MgS 0 4, СаС1 2, NaHCO s і КН 2 Р0 4; деякі розчини насичені сумішшю газів - кисню і вуглекислого газу. Крім того, до їх складу можуть входити такі сполуки, як глюкоза, піруват, фумарат і оксалоацетата. Для дослідження культур тварин тканин використовуються розчини Хенкса і Гей-Ерля. Вибір того чи іншого розчину спочатку є довільним і не грунтується на об'єктивних даних, тому перед його застосуванням необхідно переконатися, що склад його оптимальний. І, нарешті, при проведенні фізіологічних експериментів потрібно стежити за тим, щоб ефекти, які спостерігаються при зміні рН середовища, були викликані змінами в концентрації іонів водню, а не будь-якими іншими змінами буферного розчину.5. Перфузія ізольованих органів
Сутність цього методу полягає в тому, що досліджуваний орган (печінка, нирку чи серце) ізолюють з організму тварини і поміщають в спеціальний термостатіруемий прилад. Потім до перфузійної рідини, яка зазвичай вводиться в орган через артерію, додають досліджуване з'єднання і аналізують рідина, що витікає з органу через вену, що дозволяє простежити за перетвореннями введеного з'єднання. Перфузійну рідину можна пропускати через орган одноразово або кілька разів, самопливом або за допомогою невеликого насоса. Насос застосовують тоді, коли перфузійну рідина пропускають через орган багаторазово.
В окремих випадках рідина проганяють не при постійному тиску, а імпульсами, що дозволяє наблизити умови досвіду до ситуації in и имитирует процесс перекачивания крови сердцем. vivo та імітує процес перекачування крові серцем.Для проведення перфузії не обов'язково повністю ізолювати орган; її можна проводити і на органі розкритого анестезированного тварини. При цьому вдається зберегти інтактними нервові волокна і частина судинної системи.
Дія будь-якого сполуки на тканину або орган (наприклад, гістаміну на м'яз) можна вивчати по механічній відповідної реакції ізольованій тканини на дане з'єднання. Досліджуване з'єднання додають до омиває тканину рідини; у відповідь на це тканина, закріплена з одного кінця, а іншим кінцем пов'язана з пером самописця, починає рухатися, і будь-який рух тканини постійно реєструється на самописці. Даний метод дозволяє вивчати відповідну реакцію ізольованих органів на введення дуже невеликих (порядку декількох нанограм) кількостей активних сполук.
Основним недоліком методу перфузії ізольованих органів є відсутність гормонального і нервового контролю; тому при екстраполяції всіх отриманих результатів до ситуації in следует соблюдать осторожность. vivo слід дотримуватися обережності.6. Приготування зрізів органів і тканин
Зрізи тканин бажано робити якомога тонше, щоб забезпечити вільний доступ кисню в самі глубокорасположенние шари зрізів і повне виведення продуктів розпаду за рахунок дифузії. Цим вимогам задовольняють зрізи товщиною від 0,5 до 5 мм; крім того, в цьому випадку співвідношення між зруйнованими та інтактними клітинами залишається досить малим.
Досліджуваний орган витягують з організму відразу ж після смерті тварини, щоб посмертні зміни були мінімальними. Зрізи роблять за допомогою леза бритви або мікротому, потім переносять у посудину з відповідною середовищем суспендированием і вивчають їх метаболізм і дія введених сполук на обмінні процеси. Тканинні зрізи часто досліджують манометричним методами (розд. 8.6.2); при цьому, оскільки зрізи бувають недостатньо тонкими, для створення аеробних умов і забезпечення киснем глубокорасположенних шарів клітин доводиться застосовувати газові суміші, що містять до 95% кисню. Недоліком даного методу є те, що зовнішні шари клітин зрізів знаходяться в середовищі з токсичного концентрацією кисню.
7. Використання рослинного матеріалу
Вибір методів при вивченні метаболізму у рослин визначається в основному рівнем організації рослини. Одноклітинні і багатоклітинні водорості, наприклад, добре ростуть на простих, найчастіше неорганічних живильних середовищах при відповідних зовнішніх умовах. Такі водорості можна розглядати як інтактні організми; вони мають відносно просту будову і є зручним експериментальним матеріалом для вивчення фундаментальних біохімічних процесів, які важко досліджувати на високоорганізованих рослинах.
Як класичний приклад можна привести такі рослинні організми, як Scenedesmus , которые используются для изучения фиксации углекислого газа. і Chlorella, які використовуються для вивчення фіксації вуглекислого газу. Ці системи завдяки зручності контролю за їхнім ростом і простоті постачання екзогенних сполук клітинам особливо зручні для вивчення дії на обмін речовин таких факторів, як освітлення, температура, харчування й т.д.На більш високих рівнях організації - у вищих рослин-доставка екзогенних сполук у відповідну ділянку всередині рослини значною мірою утруднена. Якщо рослина росте в грунті, досліджуване з'єднання у вигляді розчину вносять в цей грунт, звідки воно потім всмоктується корінням. Інший спосіб полягає в тому, що рослина витягають з грунту і коріння поміщають в розчин досліджуваного з'єднання на певний період часу. Розчином з'єднання можна обприскувати рослину або наносити його безпосередньо на листя. Для вивчення розподілу з'єднання і його метаболітів всередині рослинного організму досліджують окремі його частини - коріння, пагони, листя, бруньки та квіти.
Основні труднощі, що виникає при вивченні метаболізму у рослин, полягає в тому, що на відміну від тканин тварин рослинні тканини не містять досить великих і складних структур.
Окремі частини рослини можна ізолювати, поміщати у відповідне середовище, а потім вивчати їх метаболізм in . vitro. Приготування зрізів, дисків, гомогенатов і виділення клітинних органел з рослинних тканин здійснюють такими ж способами, як і з тканин тварин.8. Культури тканин і клітин
Як ми вже говорили, вивчення метаболізму на рівні організму або органу пов'язано з цілим рядом труднощів. Іноді це обумовлено ще й тим, що деякі рослини містять дуже мало живої тканини, наприклад тканини меристеми, виникають також труднощі доставки з'єднання в певну ділянку рослини та контролю за ним.
Тому вирощування тканин і клітин in имеет ряд преимуществ. vitro має ряд переваг. У відповідних експериментальних умовах можна вивчати ріст, ділення і диференціювання клітин, при цьому в значній мірі полегшується доставка сполук до клітин і тканин та вивчення їх дії. In можно выращивать большие количества той или иной ткани по сравнению с естественным содержанием ее в интактном организме. vitro можна вирощувати великі кількості тієї чи іншої тканини в порівнянні з природним вмістом її в интактном організмі.Широке використання даного методу в еволюційних, фізіологічних, загальномедичних і фармакологічних дослідженнях обумовлено тим, що культивування клітин і тканин дозволяє долати багато фізичні, фізіологічні та біохімічні обмеження, що накладаються складною будовою організму. Метод дозволяє вивчати потенціал розвитку клітини, тобто здатність клітини в межах, обумовлених генотипом, утворювати при відповідних хімічних і фізичних умовах будь-який інший тип клітини. Незважаючи на те що культури клітин рослинних і тваринних тканин мало чим відрізняються один від одного, клітини рослинних тканин можуть розмножуватися в менш складних середовищах, ніж клітини тканин тварин.
Культури окремих частин рослини, наприклад кореня або меристеми, отримують, поміщаючи вирізані частини рослини в стерильних умовах у живильне середовище, що підтримує їх ріст і розвиток. У таких середовищах, які бувають рідкими або напіврідкими, можна вирощувати також ізольовані рослинні і тваринні клітини. Живильні середовища мають досить складний хімічний склад; як правило, вони містять джерело вуглецю (наприклад, цукор), суміш неорганічних солей, мікроелементи, вітаміни і фактори росту.
Часто в культуральні середовища вносять складні живильні добавки: до культур тваринних клітин додають сироватку крові, а до культур рослинних - кокосове молоко. Щоб забезпечити повну відтворюваність даних, краще за все там, де це можливо, користуватися живильним середовищем постійного складу. У підходящої середовищі в процесі зростання і ділення клітин утворюються групи клітин, на яких і проводять дослідження. Якщо культуру необхідно аерувати (наприклад, коли вона є рідкою суспензію), конічну колбу або спеціальний посуд з суспензією струшують або обертають. У тих випадках, коли потрібно отримати дезагрегірованную суспензію, в розчин додають певні ферменти, наприклад трипсин до суспензії тварин клітин або пектиназу до суспензії рослинних.
Оцінку клітинного зростання на основі підрахунку кількості клітин і збільшення клітинного об'єму, що дозволяють судити про розмір клітин, зручніше проводити не в інтактній тканини, а в клітинній суспензії. З'єднання, внесене в культуральне середовище, надходить безпосередньо в клітини, що дозволяє легко простежити за дією цієї сполуки на ріст і обмін речовин в клітині. Застосування цього методу для культивування рослинних клітин з віддаленої зовнішньої стінкою (культури протопластів) і для підтримки зростання вірусів ще більше розширює межі його використання.
Клітинні культури широко використовують у мікробіології для отримання у великій кількості водоростей, грибів і бактерій для дослідницьких цілей. Для вирощування мікроорганізмів застосовують як рідкі, так і тверді середовища; за своїм хімічним складом вони, як правило, менш складні, ніж ті, які застосовуються для вирощування культур клітин тварин і вищих рослин. Швидкість росту мікроорганізмів у багато разів вище, ніж швидкість розмноження інших клітинних культур, тому підтримувати стерильність культур рослинних і тваринних клітин надзвичайно важко - будь зараження культури мікробами призводить до швидкого інфікування вирощуваної культури.
Подібно до інших методів in , применение тканевых и клеточных культур ставит перед исследователями проблему экстраполяции полученных результатов к целому организму, особенно в тех случаях, когда при культивировании растительные и животные клетки дифференцируются. vitro, застосування тканинних і клітинних культур ставить перед дослідниками проблему екстраполяції отриманих результатів до цілого організму, особливо в тих випадках, коли при культивуванні рослинні і тваринні клітини диференціюються.
9. Фракціонування клітин
Фракціонування клітин складається з двох послідовних стадій - гомогенізації і поділу. На стадії гомогенізації структура тканини руйнується і тканина перетворюється на так званий гомогенат. На другій стадії - поділ - відбувається групування окремих компонентів гомогенату за принципом спільності їх фізичних властивостей, таких, як розмір і щільність.
За ідеальних умов виділення внутрішньоклітинні компоненти можна було б отримувати в тому ж вигляді і кількості, в яких вони існують в інтактних клітинах, не порушуючи таким чином їх морфологічної структури і не змінюючи їх активності. Однак більшість існуючих в даний час методів фракціонування всім цим вимогам не задовольняє, і при виборі того чи іншого методу часто доводиться мати на увазі, що в ході фракціонування за рахунок збереження морфологічної структури клітини може порушитися її активність, і навпаки.
Вибір тканини для фракціонування визначається конкретними умовами експерименту і об'єктом дослідження. Тканини і клітини різних органів розрізняються по складу, крихкості і щільності, - що в свою чергу визначає вибір того чи іншого методу виділення. Печінка, наприклад, є ідеальним об'єктом для вивчення функціонування мітохондрій, оскільки саме в клітинах печінки мітохондрії містяться в особливо великих кількостях. Тканина тимуса (зобної залози) частіше за інших тканин використовується для виділення ядер, так як ядра тимоцитів становлять до 50% клітинної маси.
Клітини різних тканин зазвичай гетерогенні за формою і розмірами; подібна гетерогенність точно в такій же мірі характерна і для виділяються з гомогенатів тканин субклітинних фракцій. У зв'язку з цим хімічний аналіз виділених фракцій може дати лише усереднені дані про склад цих фракцій. Різні органи тварин відрізняються один від одного і за вмістом у них крові та сполучної тканини: чим більше сполучної тканини міститься в органі, тим гірша тканина піддається гомогенізації і тим важче тому виділити з неї субклітинні компоненти.
9.1 Приготування гомогенатов тканин і клітин
Гомогенізація призводить до втрати морфологічних і біохімічних властивостей, характерних для даної тканини. Така втрата не суттєва, якщо гомогенізація проводиться як попередня стадія виділення з тканини будь-якої хімічної сполуки.
Однак у тих випадках, коли вивчають метаболічні процеси, морфологічна та біохімічна цілісність тканини повинна бути збережена в максимальному ступені. Метою гомогенізації, яка, на жаль, як і раніше залишається емпіричним методом, є руйнування тканин, клітинних стінок і (або) мембран і вивільнення клітинного вмісту. Для цього застосовуються найрізноманітніші методи і прилади, хоча лежать в їх основі принципи не завжди зрозумілі. Позбавлена міцної теоретичної бази і необхідного арсеналу стандартних методів, гомогенізація є скоріше мистецтво, ніж науку. У силу того, що різні тканини значною мірою відрізняються одна від одної як за крихкості певних клітинних органел, так і по стійкості клітин і тканин до руйнування, при гомогенізації будь-якого біологічного матеріалу щоразу неминуче виникають специфічні проблеми, які можна вирішити тільки шляхом проб і помилок. В основному гомогенізація застосовується як стадія, що передує поділу клітинних компонентів, яка дає можливість встановити внутрішньоклітинну локалізацію метаболічних процесів. Гомогенат успішно використовуються і при вивченні поглинання і метаболізму сполук у тих випадках, коли доставка їх у інтактні клітини утруднена в силу недостатньої проникності мембран.
9 .2 Вибір середовища суспендированием
Об'єктивних критеріїв для вибору тієї чи іншої середовища суспендированием при гомогенізації не існує. Деякі рекомендації можна почерпнути з літератури, проте остаточний вибір завжди залежить від результатів попередніх дослідів із застосуванням різних середовищ.
Зазвичай для створення в середовищі необхідного осмотичного тиску, що оберігає частки від набухання і розриву, застосовують сахарозу. Якщо сахароза ускладнює дослідження властивостей ферментів, її замінюють манітом. Існує цілий ряд індивідуальних прописів щодо збереження цілісності частинок і захисту ферментів від інактивації. Рекомендовані розчини різняться за концентрацією сахарози або присутності таких речовин, як ЕДТА, глутатіон, р-меркаптоетанол і т. д. Іноді замість сольових розчинів використовують неіонні середовища, так як, наприклад, в гомогенатах печінки сольові розчини викликають аглютинацію поліморфно-ядерних лейкоцитів і органел . При роботі з гомогенату селезінки, Навпаки, сахароза (0,25 М) володіє більш вираженим аглютинує дією, ніж КС1 (0,2 М).
Для виділення ядер і хромосом користуються лимонною кислотою, яка має здатність пригнічувати активність «нейтральних» дезоксирибонуклеаза.
Для виділення ядер застосовують розчини гліцерину і етиленгліколей, а для виділення пластид із клітин рослин - карбовакси (полімери етиленгліколю). Хлоропласти зазвичай виділяють в середовищах, що містять не сахарозу, а маніт і сорбіт.
Аналіз ферментів в рослинних екстрактах іноді значно ускладнюється в силу того, що в процесі гомогенізації виділяється велика кількість фенолів, які утворюють водневі зв'язки з карбонільними групами, що беруть участь в утворенні пептидних зв'язків білків, а це, мабуть, викликає інактивацію багатьох ферментів. Щоб уникнути цього до екстрактам додають полівінілпіролідон, утворює з фенолами нерозчинний комплекс, який потім видаляють з екстракту фільтруванням.
Для виділення субклітинних органел можна застосовувати неводні середовища. Суспендують середовище в цьому випадку представляє собою суміш легкого і важкого органічних розчинників, наприклад суміш ефіру з хлороформом або бензолу з чотирьоххлористим вуглецем. Щільність середовища можна змінювати таким чином, щоб при наступному центрифугуванні досліджувані частинки або спливали на поверхню, або осідали. «Невідне» фракціонування застосовують для виділення хлоропластів і лейкоцитів, а також гранул гемосидерину з селезінки. Недоліками цього методу є порушення морфологічної структури деяких видів тканини і інактивація окремих ферментів органічними растворігелямі.
9. 3 Способи руйнування тканин і клітин
Для руйнування клітин найчастіше застосовують фізичні методи. Більшість тварин клітин руйнується порівняно легко, проте при руйнуванні рослинних і бактеріальних клітин часто доводиться стикатися зі значними труднощами, пов'язаними з наявністю клітинних стінок. Фізичні методи руйнування клітин поділяються залежно від того, чи відбувається воно під дією сил тертя між клітинами і твердими речовинами (розтирання клітин з твердими матеріалами) або гідродинамічно (руйнування клітин в рідких середовищах).
Розтирання клітин з твердими матеріалами. У сучасній модифікації цей метод полягає в розтиранні клітин з піском або абразивним порошком у ступці за допомогою маточки. В даний час завдяки появі більш м'яких засобів руйнації цей метод застосовується для руйнування тварин клітин досить рідко, проте їм як і раніше користуються для руйнування рослинних і бактеріальних клітин. Бажано, щоб абразивні частинки були якомога більш гострими і мали такий же розмір, що і руйновані клітини. Недолік методу полягає в тому, що при руйнуванні клітин може порушуватися структура найбільш великих органел, таких, наприклад, як хлоропласти.
Хороші результати дає продавлювання клітин, змішаних з абразивними частинками, через прес Хьюза. Вологі клітини з абразивними частинками поміщають в трубку при температурі близько - 5 ° С, а потім однократним ударом по поршню, що створює стрибкоподібне зміна тиску, проштовхують клітинну масу через вузький отвір діаметром близько 0,25 мм. Модифікацією цього методу є продавлювання клітин при температурі - 25 ° С; роль абразивних частинок виконують у цьому випадку кристали льоду. Щоб добитися максимального руйнування бактеріальних клітин, доводиться іноді підвищувати тиск до 5,5-10 7 Па.
Клітини бактерій можна руйнувати також і шляхом механічного струшування суспензій часток з абразивним порошком з частотою 300-3000 коливань в хвилину за допомогою встряхиватель Міклі, в який додаються дрібні скляні намистинки діаметром від 50 до 500 мкм. Однак виникає при струшуванні сильна вібрація часто викликає руйнування клітинних органел.
Руйнування клітин у рідких середовищах. Руйнування клітин, що знаходяться в суспензії, відбувається або при обертанні лопатей або поршня (блендери), або при поступальному русі вгору і вниз поршня чи куль (гомогенізатори).
Блендери, як правило, мають ріжучі лопаті, що обертаються з великою швидкістю. Кількість і конструкція цих лопатей бувають різними, але всі вони зазвичай загострені під прямим кутом один до одного, а форма їх забезпечує гарне перемішування вмісту судини. Суспензію клітин поміщають в спеціальний стакан, який має по всій висоті розтруби і в поперечному перерізі виглядає як лист конюшини. Для підтримки низької температури в процесі гомогенізації склянку поміщають в лід. Завдяки особливому розташуванню лопатей і конструкції склянки в ході фракціонування виникають гідродинамічні сили. Метод достатньо універсальний і широко застосовується для фракціонування клітин, однак слід мати на увазі, що при швидкому обертанні лопатей гомогенізаторів виникають деякі небажані ефекти.
Більшість гомогенізаторів преставляют собою прилад, що складається з маточки з ручним (гомогенізатори Даунса і Тенбрека) або механічним (гомогенізатор Поттера-Ельвегейма) приводом, який обертається або рухається вгору і вниз у скляному циліндричній посудині. Необхідно стежити за тим, щоб зазор між товкачем і стінками судини залишався постійним, так як швидкість руйнування клітин залежить не тільки від швидкості обертання маточки, але і від співвідношення між радіусами маточки і судини. Посудина закріплюється нерухомо, - тому швидкість обертання суспензії змінюється від мінімальної у його стінок до максимальної у поверхні маточки; отже, чим менше відстань між цими поверхнями, тим вище градієнт швидкості. Виникаючі при високих швидкостях сили достатні для руйнування досить тонких мембран тваринних клітин; рослинні і бактеріальні клітини при цьому не руйнуються.
Ефективність гомогенізації в значній мірі залежить від наявності в подрібнюємо матеріалі судинної і сполучної тканини, для видалення якої тканину перед гомогенізацією пропускають через спеціальну м'ясорубку з отворами діаметром 0,88 мм 8.
Поліморфоядерних лейкоцити руйнуються більш м'якими методами-за допомогою піпетки. Еозинофіли руйнують шляхом швидкого пропускання під тиском через мелкорешетчатое сито.
Руйнування клітин за допомогою високого тиску. Цей метод застосовується в основному для руйнування мікробних клітин.
Для цієї мети користуються спеціальними пресами, наприклад френч-пресом (French ), в котором создается давление до 10,4-10 7 Па. Pressure), в якому створюється тиск до 10,4-10 7 Па.Суспензію клітин завантажують у камеру з нержавіючої сталі (рис. 1.4) при закритому положенні голчастого клапана, за допомогою якого камера сполучається з зовнішнім середовищем. Потім камеру перевертають, відкривають клапан і поршнем витісняють з камери повітря, після чого клапан знову закривають, а камеру повертають у вихідне положення і встановлюють на нерухомому підставі. За допомогою гідравлічного преса створюється необхідний тиск на поршень; по досягненні в камері певного тиску голчастий клапан трохи відкривається, тиск в камері дещо зменшується, і в цей момент клітини лопаються. Витікаючу з вихідного отвору камери клітинну масу збирають при відкритому положенні голчастого клапана, підтримуючи в камері постійний тиск. На жаль, невідомо, які саме сили виникають в камері і як їм протистоять клітини та клітинні компоненти. Руйнування за допомогою ультразвуку. Клітини можна зруйнувати також за допомогою високочастотних ультразвукових коливань. Механізм такого руйнування остаточно не з'ясований, проте встановлено, що при обробці клітинних суспензій ультразвуком в середовищі створюється високочастотне зміну тиску. Основним недоліком даного методу є те, що в процесі обробки ультразвуком виділяється значна кількість тепла. Щоб уникнути розігрівання, посудину з суспензією поміщають у лід; конструкція судини така, що рідина безперервно циркулює і охолоджується у стінок. Деякі судини поміщають в холодильні камери, а проте далеко не завжди вдається усунути місцеве нагрівання.
Інші методи. До них відносяться: руйнування клітин методом осмотичного шоку, переварювання клітинних стінок ферментами, наприклад лізоцимом, і складними ферментними препаратами, виділеними з равликів і містять целюлазу, хітинази та ліпазу. Для руйнування клітин деяких видів успішно застосовують заморожування і відтавання, Автоліз і обробку органічними розчинниками, такими, як етилацетат і толуол.
Як ми вже говорили, в більшості випадків руйнування клітин супроводжується виділенням тепла. З огляду на те що при високих температурах багато ферментів інактивуються, всі процедури по руйнуванню клітин і виділенню клітинних органел слід проводити при знижених температурах. Для цього всі роботи проводять у холодних кімнатах при температурі близько 0 ° С або охолоджують клітинні суспензії за допомогою льоду. Слід зазначити, що деякі ферменти нестійкі до холоду і при охолодженні також втрачають свою активність.
При гомогенізації різного роду біологічних тканин виникає безліч приватних проблем, які вирішуються в основному шляхом проб і помилок. Достатню відтворюваність результатів можна отримати лише при ретельному контролі за такими параметрами, як температура, тривалість і швидкість руйнування клітин, а також застосовується робочий тиск. Ідеальним вважається такий гомогенат, який легко піддається подальшому фракціонування.