Виконав: Новак А.Л., 301 гр., Л / ф, Владивосток, 1998.
Актуальність проблеми
Особливо небезпечні інфекції (ОНІ) - це інфекції, які можуть виникати серед населення у вигляді окремих захворювань, епідемій і навіть пандемій, частіше супроводжуючи НС (стихійні лиха, війни, масовий голод і т.п.), що характеризуються природного очаговостью, швидким розповсюдженням і важким перебігом. Єдиного в усьому світі думки про те, які інфекції слід зараховувати до ГОІ поки немає, вітчизняні епідеміологи дотримуються такого переліку:
Міелоідоз
Жовта лихоманка
Холера
Генералізована форма сибірської виразки
Найбільш імовірна поява ГОІ можливо під час НС. Різке погіршення санітарно-гігієнічних умов загострює епідемічну ситуацію щодо інфекцій, які раніше мали ендемічних характер, а завезені інфекції ззовні прибувають особами призводить до того, що потенційні джерела інфекції виявляються неізольованими і протягом тривалого часу мають численні контакти з оточуючими їх особами. У зв'язку з цим до встановлення остаточного діагнозу захворювання дотримується суворий протиепідемічний режим.
При перших ознаках або підозрі на ГОІ здійснюється:
Виявлення контактних осіб та їх обсервація;
Дача антибіотиків широкого спектру дії (доксіцілін, тетрациклін та ін), тобто екстрена профілактика;
Проведення дезінфекційних заходів;
Відбір матеріалу від хворих та доставка його в лабораторію для мікробіологічного дослідження;
Організація часткової (повної) санобробки конкретних осіб.
У даній роботі розбирається етап діагностики ОНІ на прикладі чуми, холери та туляремії. Якщо діагноз встановлений з достатньою достовірністю, можна визначити характер протиепідемічних заходів, встановити можливе джерело інфекції та механізми його передачі. Саме з цього необхідно і виправдано застосування експрес-методів діагностики ОНІ.
Загальні принципи експрес-діагностики станів інфекції і імунітету
Сучасна імунологія виключно багатолика, а сфери застосування імунологічних знань і методів безмежно різноманітні. Вони використовуються практично у всіх розділах біології, ветеринарії і медицини - від фундаментальних молекулярно-біологічних дослідженні до медико-генетичного консультування і безлічі інших суто практичних процедур, здійснюваних рослинникам, тваринниками і медиками. І, тим не менш, особливо важливим в соціальному відношенні і методично найбільш передовим продовжує бути той найстарший і неухильно розвивається розділ імунології, успіхами якого забезпечується розвиток теорії та здійснення практики протиепідемічної роботи-діагностики, профілактики та лікування інфекційних захворювань. А методи імунологічної експрес-діагностики мають ключове значення для ефективного вирішення названих проблем та здійснення всіх відповідних протиепідемічних заходів. Наступні нижче матеріали і присвячені саме цьому розділу прикладної імунології, його стану та перспективам розвитку.
Найважливішою передумовою ефективності будь-яких протиепідемічних заходів є своєчасне прогнозування і виявлення моментів активізації тих екологічних та соціально-екологічних взаємодій, які складають істота епідемічних процесів. Виключне різноманітність, властиве останнім і потребує диференціації протиепідемічних заходів, обумовлено не тільки самобутністю кожної з існуючого безлічі інфекційних хвороб. Дуже велике значення має в цьому відношенні фундаментальне явище гетерогенності популяцій, що входять до складу відповідних екологічних та соціально-екологічних систем мікроб-жертва. Вариабильность цих дуже складних біосоціальних факторів та умов в дуже великій мірі впливає на специфіку того чи іншого етапу існування кожного епідемічного процесу. І своєчасне розпізнавання цих особливостей, здійснюване, як правило, з використанням імунологічних методів, забезпечує ту диференціацію протиепідемічних заходів.
Експрес-індикація - це своєрідна розвідка великої армії лабораторної діагностики. Вона знаходиться на передньому краї наукового пошуку нових, простих, економічних, швидких методів індикації мікробів, частина з яких надалі йде на озброєння лабораторної практики і завдяки цьому остання весь час вдосконалюється.
Основні об'єктивні вимоги до експресним методів діагностики інфекційних захворювань зводяться до наступного:
1. отримання результатів аналізу в максимально короткі терміни (години, ідеально-хвилини);
2. можливість проведення і завершення аналізу без виділення шуканого мікроорганізму в чистій культурі, при використанні тільки нативного матеріалу, в крайньому випадку-з залученням елективних біосередовищ для швидкого накопичення збудників;
3. безперечно висока специфічність і висока чутливість, як передумови належної достовірності аналізу;
4. висока продуктивність, простота, доступність і відтворюваність аналізів.
Ці вимоги в рівній мірі застосовні і до методів експресному діагностики станів імунітету. Перевагу використання того чи іншого з існуючих методів експрес-діагностики залежить від багатьох конкретних умов. Однак найбільш бажаним є паралельне використання 2-3 методів. Такий підхід значно збільшує надійність одержуваного результату.
На найближчі роки найбільш перспективними такі напрями розвитку експрес-індикації мікроорганізмів.
Ензімоіндікаціонное напрямок, пов'язаний з експрес-індикацією біохімічних властивостей та визначенням ферментативного спектра мікробів. Як і раніше збережуть свою значимість дослідження з розробки політропний (полісубстратних) поживних середовищ. У нашій країні були розроблені оригінальні Політропний середовища і їх комбінації, які з успіхом застосовуються в лабораторній практиці. При створенні складних полікомпонентних поживних систем необхідно виходити з різних біохімічних та енергетичних потреб мікроорганізмів. Для кращого прояву життєдіяльності і біохімічної активності патогенних та інших мікробів у середовищах необхідно створювати оптимальні умови для їх росту і розмноження і одночасно вводити ферментуючих субстрати (вуглеводи, багатоатомні спирти, амінокислоти та ін) з найбільш чутливими індикаторами, які швидко б реєстрували їх ферментацію. У результаті застосування оптимальних полісубстратних середовищ виробляється виділення та накопичення чистої культури мікробів з одночасним визначенням їх біохімічних ознак. Перспективним слід розглядати розвиток ензімоіндікаціонних методів, в яких субстрат з індикатором відділений від живильного середовища і фіксований на спеціальному носії. У нашій країні розроблені вуглеводно-паперові диски із захисною плівкою (паперові реагенти для визначення дезамінази у мікробів) та їх аналоги БІС (паперово-індикаторні системи), вуглеводно-паперові поплавці, вуглеводно-полімерні плівки. Всі ці препарати є дуже перспективними, вони дозволяють за найкоротший час (3-5 год), використовуючи загальноприйняті поживні середовища та лабораторний посуд, визначати ферментативну активність різних видів мікроорганізмів. Автономний препарат - олівець-фермент, який не має аналогів ні у нас, ні за кордоном, дозволяє без застосування поживних середовищ безпосередньо на предметному склі визначати біохімічні властивості мікробів. Полісубстратная тест-система і ензімоіндікаторная стрічка використовуються для одночасної ідентифікації 20 біохімічних ознак у мікробів. Це нові види простих "довгоживучих" препаратів, призначених для швидкого й економічного визначення біохімічних властивостей мікробів. Електрофізичний метод визначення ферментативної активності мікробів включає посів мікробної культури на рідкі поживні середовища, що містять пептонную воду, різні вуглеводи, багатоатомні спирти, амінокислоти з подальшим ферментативним розщепленням досліджуваних речовин і утворенням різних іонізованих продуктів розпад за природою, формою і величиною види дрібнодисперсних носіїв (сорбентів) антигенів і антитіл, що сприяють підвищенню чутливості комплексних імунологічних методів. Реакції пасивної гемаглютинації та їх модифікації пов'язані з використанням еритроцитарних діагностичних препаратів. Еритроцитарну діагностику з успіхом застосовуються для прискореного виявлення та ідентифікації як патогенних, так і умовно-патогенних мікроорганізмів (наприклад, збудників туляремії, бруцельозу, сальмонельозу та ін) в різних патологічних матеріалах, одержуваних від хворих, та в об'єктах зовнішнього середовища. Реакції з еритроцитарними діагностикумами є досить чутливими, і в цьому відношенні часто перевершують інші серологічні реакції. Вони введені в офіційні інструкції по експрес-індикації бактеріальних агентів в елементах зовнішнього середовища і в матеріалах, отриманих від уражених людей і тварин. Одночасно тривають пошуки нових носіїв антигенів і антитіл, які були б безантігеннимі, стабільними, не руйнуються при тривалому зберіганні, а вживані реакції - простими з техніки постановки (наприклад, скляні тести) і дослідження з їх допомогою - економічними. Удосконалюються реакції з застосуванням кольорових целюлозних частинок в якості носіїв антигенів і антитіл.
Позитивними властивостями такого роду препаратів є:
відсутність власної антигенності;
стабільність при тривалому зберіганні;
демонстративність і простота техніки постановки реакції, зазвичай на предметному склі;
висока швидкість проходження реакції;
економічність.
Крім того, корисним і виправданим вважаємо пошук нових носіїв антигенів і антитіл. У цьому відношенні перспективними є іонообмінні смоли, латекси, целюлоза та її похідні і ряд інших речовин, які можуть сприяти підвищенню чутливості серологічних реакцій.
Імунохімічної напрямок, пов'язаний з використанням різноманітних комплексних сполук специфічних антитіл або антигенів з хімічними речовинами. Приєднані хімічні речовини надають їм нові феноменологічні здібності і властивості, тим самим, розширюючи можливості експрес-індикації мікробних агентів зокрема і лабораторного аналізу взагалі. Велику популярність і практичну значимість набули методи швидкого імунофлуоресцентного аналізу (прямий, непрямий, антикомплементарних), які нині офіційно використовуються як методи експресному індикації і швидкого визначення мікроорганізмів. Подальший розвиток дуже перспективного иммунохимического напрями багато в чому залежить від хіміків, які повинні розробити досить яскраві нові барвники, що вступають у з'єднання зі специфічними антитілами і антигенами. У результаті можуть бути отримані препарати з новими феноменологическими властивостями, що дозволяють проводити експрес-індикацію мікробних культур та окремих клітин за допомогою широко поширених мікроскопічних пристроїв (типу МБІ різних марок).
Імуноферментні напрямок, інтенсивно розвивається в останні роки. Розроблено прямий, непрямий, антикомплементарних та інші методи швидкого виявлення мікробів шляхом використання іммуноензімологіческого принципу; запропоновані нові види ферментів, а також різноманітні види хромогенних субстратів. Даний напрямок є дуже перспективним, розвиток його може призвести в найближчі роки до появи нових методів експрес-індикації мікроорганізмів.
Іммуноелектрофоретіческое напрям успішно розвивається з кінця 50-х років. Розроблено численні методи імуноелектрофорез. Однак для цілей експрес-індикації мікробів частіше вдаються до зустрічного імуноелектрофорез. Застосування нових хімічних барвників, ферментної або радіоактивної мітки дозволить різко підвищити чутливість методу іммуноелектропреціпітаціі.
Іммунорадіологіческое напрям пов'язаний з використанням різноманітних кон'югатів специфічних антитіл або антигенів, поєднаних з радіоактивними речовинами, які надають їм нові феноменологічні властивості і здібності, р встановити природу збудника навіть у тих випадках, коли іншими методами, у виді його мінливості або забрудненості матеріалу, він залишається нерозпізнаним .
Біологічне напрямок, пов'язаний з вивченням токсичних і агресивних властивостей патогенних мікроорганізмів. Біологічні методи здійснюються на одноклітинних організмах, на культурах клітин, курячих ембріонах, а також на здорових, а ще краще спеціально підготовлених лабораторних тварин. Ці методи більш трудомісткі і менш точні в порівнянні з іншими.
Фізико-хімічний напрямок. Цей напрямок пов'язаний з використанням порівняно швидких, але в той же час і досить складних за апаратурним оформленням методів. Сюди входять методи вивчення бактеріальних популяцій і їх екстрактів за допомогою хроматографії (газорідинна та ін), спектроскопії (інфрачервоної, ультрафіолетової та ін), резістографіі по відношенню до різних антибіотичних, хімічних та лікарських речовин, а також методи температурної та кислотної агрегації, коагуляції мікробних суспензій і їх токсинів.
Рецепторное і генетичне напрямки швидкої індикації патогенних і санітарно-показових мікроорганізмів. Методи, засновані на цих принципах, тільки починають розвиватися. Так, за допомогою целюлозно-глобулінового або еритроцитарної-глобулінового діагностикумів швидко виявляють патогенний стафілокок, який містить білок А, а шляхом гомології невідомих нуклеїнових кислот з відомими нуклеїновими кислотами встановлюють вид патогена.
Комплексне напрямок прискореної ідентифікації патогенних і санітарно-показових мікроорганізмів, що використовує методи експрес-індикації, засновані на інтеграції різних принципів, пов'язаний з розробкою і створенням індикаторних тест-систем, що дозволяють протягом короткого терміну і з мінімальними витратами на аналіз визначити комплекс основних ознак патогена або санітарно-показового представника, достатніх для його ідентифікації до роду, виду і навіть типу.
Напрями, пов'язані з розробкою нових принципів мікробіологічного аналізу. Цілком ймовірно, і ми маємо право очікувати в найближчі 5-10 років появи нових ідей, підходів і принципів у мікробіологічній науці та суміжних з нею галузях. Відкриття нових видів рецепторній, імунологічної та генетичної специфічності у мікробів дозволить створити нові і можливо більш досконалі методи швидкої ідентифікації мікроорганізмів.
Основні шляхи розвитку експрес-індикації мікроорганізмів на найближчі роки:
створення і конструювання нових препаратів, що сприяють прискоренню і здешевленню досліджень, підвищення ефективності лабораторної діагностики інфекцій та індикації патогенних та інших мікроорганізмів. На цьому шляху належить зробити дуже багато, оскільки загальноприйняті діагностичні препарати значною мірою вичерпали свої потенційні можливості;
розробка нових більш чутливих, простих методів лабораторного аналізу.
розробка комплексних методів і видів досліджень. Триватиме подальша інтеграція методів і видів досліджень, що мають різні принципи дії, що лежать у їх основі;
створення нових схем досліджень. Оскільки лабораторна діагностика інфекційних хвороб, а також експрес-індикація, хоча і в меншій мірі, пов'язані з вивченням комплексу різних властивостей і особливостей мікроорганізмів з використанням зазвичай різноманітних методів і прийомів, заснованих на різних принципах, то створення нових схем досліджень із застосуванням нових методів є об'єктивною реальністю і важливим завданням, що випливає із суті самого процесу розвитку мікробіологічного аналізу;
розробка і створення нових методів реєстрації та обліку результатів експрес-індикаційних та лабораторних досліджень.
розробка нової мікромініатюрних лабораторного посуду, апаратури і приладів для досліджень;
автоматизація та комп'ютеризація досліджень.
У сучасних умовах ці питання повинні вирішуватися комплексно. Таким чином, розглядом від 10 осіб. Флакони вміщують у термостат при 370С. Через 3 - 4 години холерні вібріони починають агглютинировать і поступово (протягом найближчих 2 годин) падають у вигляді пластівців на дно флакона. Досліджуючи під мікроскопом пофарбовані мазки і "висячу краплю", виявляють склеєних і частково вільних вібріонів. Через 6 годин дається відповідь і в разі виявлення холерних вібріонів негайно проводиться посів індивідуально від кожного з 10 осіб. Такий метод дає можливість досліджувати до 16 000 чоловік за 3 - 4 дні. Метод імунодіагностичні мікроплівки. Вивчення антигенних властивостей холерних вібріонів проводять шляхом постановки пробіркових або пластинчастої реакції аглютинації з використанням сухих ліофілізованих діагностичних аглютинуючих холерних 0-сироваток і сироваток Огава і Інаба. Сироватку розводять у фізіологічному розчині чи дистильованої воді і змішують при постановці аглютинації на склі з досліджуваної культурою вібріонів. При підготовці сироватки використовується додаткова посуд, що ускладнює роботу бактеріолога, а решти розведеною сироватці швидко проростає бактеріальна мікрофлора і інактивує її. Для вивчення антигенної структури холерних вібріонів були розроблений імунодіагностичні препарат у вигляді мікроплівок разового застосування, який володів достатньою специфічністю, демонстративністю і економічністю. Імунодіагностичні холерні мікроплівки (ІХМП) у вигляді полімерної плівки з нанесеними висушеними краплями, фіксованими на папері, містять мінімальну кількість сироватки, плівкоутворювальний компонент і консервант. Плівкоутворюючий компонент пов'язує, склеює та фіксує мікрокількостей інгредієнтів до поверхні носія, виключає крошение мікроплівок; консервант оберігає препарат від руйнування при тривалому зберіганні. Концентрація діагностичної сироватки в ІХМП є достатньою, оскільки після емульгування у краплі фізрозчину, антитіла містяться в титрі 1:100, що повністю забезпечує перебіг реакції. Тим самим забезпечується достатня концентрація антитіл, знижується, витрата діагностичної сироватки і виключається можливість її невикористання. При цьому створюються умови для швидкого розчинення ІХМП, контакту її з холерними вібріонами та проведення реакції безпосередньо на полімерній плівці. Готові ІХМП зберігають у темному сухому місці при 4 - 7 ° С в картонних коробках (термін придатності 3 роки - термін спостереження) і в міру потреби ІХМП використовують для визначення холерних вібріонів. Для запобігання випадковому зараження навколишніх предметів ІХМП поміщають в чисту чашку Петрі. На поверхню ІХМП наносять краплю фізіологічного розчину, в якій розчиняють її. Розведену сироватку змішують з досліджуваної культурою вібріонів, знятої бактеріологічною петлею з живильного середовища. При іншому варіанті постановки реакції ІХМП знімають скальпелем з паперової підкладки і переносять на предметне скло, розчиняють у краплі фізіологічного розчину і змішують з досліджуваної культурою вібріонів. При позитивній реакції через 1-3 хв з'являються зерна агглютіната, пофарбовані в зелений колір, а крапля просвітлюється. При негативній реакції крапля залишається гомогенно-каламутною. Використану частину полімерної плівки відрізають, а частину, що залишилася плівки з ІХМП зберігають в тій же чашці Петрі для подальших досліджень. Використання ІХМП в дослідженнях вібріонів та інших мікроорганізмів дозволяє одержати статистично достовірні результати, заощадити дорогі діагностичні сироватки, підвищити якість і ефективність досліджень. Реакція аглютинації мікрометодом.
Останнім часом у бактеріологічній практиці знайшов досить широке застосування мікрооб'емний метод постановки серологічних реакцій з використанням спеціальних планшеток і мікротітровальних голок. Реакції аглютинації мікрометодом ставлять з холерними аглютинує референс-сироватками в полістролових мікротітровальних планшетки з плоским або V-образ-ним дном, призначених для імунологічних агглютинировала в планшетки і пробірках відповідно в 95 і 96% випадків. У холерних вібріонів класичного і ельтор біовару серовара Огава співвідношення в обох методиках були практично ті ж. Цікавий факт, що при постановці реакції аглютинації з RO-сироваткою найбільше число штамів, аглютинуючих RO-сироваткою до титру, було виявлено в мікрометод; в пробірках аглютинація встановлена в одного штаму. Всі штами вібріонів 040-056 сероварів в мікрометод НЕ агглютинировала холерними аглютинує сироватками, а в пробірках штам II 258-1099 (040 серовара) агглютинировала усіма холерними сироватками. Більшість вивчених штамів представників сімейства Enterobacteraceae також не агглютинировала холерними аглютинує сироватками, за винятком Sh. flexneri 2503, у якого в пробірках була виявлена аглютинація з усіма сироватками, і штаму S. typhimurium 21, у якого було відзначено неспецифічна реакція аглютинації з усіма сироватками як в пробірках, так і в планшетки. При користуванні цим методом витрата аглютинуючих сироваток зменшується в 10 разів, значно скорочується час, необхідний для постановки реакції, і прискорюється термін видачі відповіді. Крім того, описаний метод менш трудомісткий.
Таким чином, стандартність, достовірність отриманих результатів, висока економічність методу дозволяють рекомендувати його при ідентифікації холерних вібріонів, вивченні штамів і популяції штамів холерних вібріонів за ознакою агглютінабельності. А також: Іммобілізація вібріонів холерними сироватками і типовими холерними фагами. Краплі випорожнень або матеріалу з поверхні пептонов води обробляють холерної О-сироваткою, типовими сироватками Огава і Інаба або типовими холерними фагами. Готують з них препарати "роздавлена крапля", які досліджують за допомогою темнопольної і фазовоконтрастной мікроскопії. У позитивному випадку через 3-5 хвилин рух вібріонів припиняється. РІФ. Препарати з досліджуваного матеріалу обробляють флюоресцирующей протихолерної сироваткою і досліджують в люмінесцентному мікроскопі.
Позитивним результатом вважається виявлення в препараті навіть одиничних вібріонів з яскравим жовто-зеленим світінням у вигляді блискучого обідка по периферії клітини. Позитивний результат можна отримати через 1-2 години після початку дослідження при концентрації вібріонів не менше 106 клітин в 1 мл., Тому рекомендується заздалегідь подращивание матеріалу на живильних середовищах. Експрес-діагностика туляремії Збудник туляремії (Туляре - район Каліфорнії) - Franciella tularensis відноситься до роду з нез'ясованим становищем в систематиці мікробів. Етіологічна природа туляремії була встановлена в 1912 році Г.Мак-якому і Ш. Чепін, а далі докладно вивчена Е. Франсісом.
Туляремія - важка кров'яна зоонозна інфекція з природного осередкових. Основні джерела інфекції - водяні пацюки, ондатри, зайці, пацюки, миші. Хвора людина неконтагіозен і для збудника є біологічним тупиком. Передається трансмісивним шляхом через кліщів, а нерідко і контактним, аліментарним або аспіраційним шляхом. Збудник містить нуклеопротєїдний О-і оболончатий білково-ліпідний Vi-антиген. У перенесли хворобу виробляється дуже напружений і тривалий імунітет. Матеріал для дослідження: кров, гній, пунктат бубна, слиз із горла. Реакція аглютинації-розсіювання. Запропоновано проста, швидка, високочутлива і специфічна реакція аглютинації-розсіювання, для постановки якої використовується антитільний діагностикум. Це суспензія темно-коричневого кольору, що представляє собою комплексну сполуку кулястих крупнодисперсних НК-частинок (Нікітін і Котіч) і протівотуляремійних імуноглобулінів. Препарат зберігають у холодильнику при +4 ° С протягом 2-3 років. Після закінчення 3 років препарат можна ресенсібілізіровать, так як НК-частинки високостабільних. Для постановки реакції аглютинації-розсіювання на ретельно знежирене предметне скло наносять зліва відносяться також Y. pseudotuberculosis і Y. enterocolitica, викликають септичні гастроентероколіти або ієрсиніози.
Чума - особливо небезпечна, дуже важка кров'яна інфекція, схильна до широкого поширення і дає високий відсоток смертності (від 20 до 100%). Це зоонозна трансмісивна природно-осередкова інфекція. Джерела - щури, ховрахи, піщанки, полівки, бабаки, мишоподібні гризуни. Переносники - кровожерливі комахи. У складі бактерій чуми міститься понад півтора десятка специфічних і групових антигенів. Перехворіли набувають довічний, стійкий імунітет фагоцитарного характеру. Матеріал для дослідження: вміст бубонів, відокремлюване виразок, харкотиння, кров, випорожнення. Метод паперових індикаторних систем. Класичні методи (посів на середовища Гіссен) громіздкі, потребують багато часу і великої кількості поживних середовищ, що мають обмежений термін придатності. В даний час ці методи не задовольняють запитам протичумної системи. В даний час найбільш перспективним методом визначення ферментативної активності штамів збудника чуми з метою ідентифікації виділених культур та вивчення їх властивостей можна вважати метод вуглеводно-паперових дисків, запропонований В. М. Нікітіним і С. В. Плугару. В якості середовища краще використовувати бульйон Хоттингера, тому що він дає найбільш швидку ферментацію - 3 години. Доцільно застосовувати БІС у польових умовах, так як набори компактні і можуть тривалий час зберігатися при кімнатній температурі. Фаготіпірованіе. 1. Внесення бактеріофагу в досліджуваний матеріал у момент його посіву на агар з генціанвіолетом дозволяє виявити під мікроскопом негативні колонії фага або "доріжку" в перші години, коли зростання бактерій ще майже не помітний (через 2,5 - 3 години). Метод простий, доступний і дає хороші результати при високій концентрації чумного мікроба і при відносно великому змісті сторонніх мікроорганізмів. 2. Визначення наростання титру чумного фага, що вноситься в досліджуваний матеріал, де у разі наявності збудника фаг починає розмножуватися вже через 30-40 хвилин. У рідкий досліджуваний матеріал (25-50-100 мл) та в контрольну рідину додають стільки фага, щоб отримати його розведення 1:50 - 1:100; ставлять проби в термостатах при 370C на 45-60 хвилин. Після інкубації беруть 0,5 мл рідини з кожної проби і розводять бульйоном у 10 разів; з цього першого розведення фага готують серію послідовних 10-кратних розведень (до 10-10 - 10-11). По 0,5 мл рідини з кожного розведення досліджуваного і контрольного рядів додають до 2,5 мл напіврідкого агару (0,1%), попередньо розплавленого і потім охолодженого до 48-500С. Тут же до агару додають 0,1 - 0,2 мл суспензії 1 - 2 добової індикаторної культури (вакцинний штам чумного мікроба), що містить 15-20 млрд мікробів в 1 мл. Вміст пробірок ретельно перемішують і виливають на чашки Петрі з 2% агаром Хоттингера. Після того, як напіврідкий агар застигне, чашки перевертають дном догори і ставлять у термостат при 370С. Облік результатів проводять через 3-4 години. На тлі суцільного зростання індикаторної культури видно стерильні плями (негативні колонії фага), кількість яких на чашках з досліджуваним матеріалом може перевершувати в 100-1000 і більше разів число негативних колоній на контрольних чашках. Завдяки хорошій дифузії фагових частинок і бактеріальних клітин через напіврідкий агар двошаровий метод дає стерильні плями більшого розміру, ніж при розмазування досліджуваної маси шпателем по поверхні агару. Підрахунок колоній ведуть в рахунковій камері. А також: РІФ, РПГА і ін
Деякі інші методи
Хемілюмінесцентний ІФА. Новим етапом на шляху розвитку імунологічних методів діагностики ОНІ є хемілюмінесцентний ІФА - ХЛІА. Перевага цього методу визначається його високою чутливістю, відносною простотою і продуктивністю, можливістю повної автоматизації У відкритій літературі є окремі повідомлення, присвячені застосуванню ХЛІА в медичній мікробіології, як для виявлення бактеріальних антигенів, так і Специфічність ХЛІА залежить від якості використаних імуноглобулінів. На 42 близькоспоріднених і гетероло-гічного штамах позитивні реакції отримані з Y. pseu-doTuberculosis 816111 (37 °) з чумними загальними ВПК і В. sereus 1 і 3 з сибіркових ІПК в концентраціях 1 -106 м. т. / мл. ХЛІА слід рекомендувати для лабораторної діагностики ОНІ особливо в тих випадках, коли в досліджуваному матеріалі передбачається незначний вміст збудника.
Імуноблотінг
Імуноблотинг - різновид гетерогенного імунного аналізу. Сутність його полягає в перенесенні молекул досліджуваного речовини з одного твердого носія, використовуваного для фракціонування біополімерів, на інший, де за допомогою імунохімічної реакції відбувається їх специфічне виявлення. У залежності від досліджуваного речовини розрізняють ДНК, - РНК і білок - блот. При постановці иммуноблоттинга дотримується наступна методична послідовність: електрофоретичного розділення аналізованого матеріалу на індивідуальні білки або поліпептиди в гелі; отримання репліки шляхом блотів білків або поліпептидів з гелю на твердофазний матрикс; блокування фону, відмивання від компонентів, що використовуються при блокуванні фону; инкубирование зі специфічною тест- сироваткою; відмивання від надлишку сироватки; инкубирование з Jg до антитіл специфічної тест-сироватки, кон'югованими з міткою; відмивання від надлишку міченого іммунореагента; виявлення тестованих антигенів авторадіографіческі або ферментативно по реакції з відповідним субстратом. Імунохімічної виявлення антигенів можна проводити за допомогою антитіл, кон'югованих з міткою. У якості мітки останнім часом широко застосовують або радіоактивні ізотопи, або ферменти (пероксидазу, лужну фосфатазу, лактамазу та ін.) Час блотів шляхом дифузії становить 36-48 ч. Але найбільш швидкий і ефективний спосіб перенесення білків з гелів - електроблот, час якого, в основному, складає 1-3 год (2), для деяких високомолекулярних білків-понад 12 ч. Конкретний вибір сорбентів для різних модифікацій блоту (нітроцелюлоза або папір, оброблена відповідним чином), вибір умов блокування та імуно-хімічного виявлення антигенів повністю залежить від антигену, його кількості, методу імуноаналізу і цілей дослідження. Метод ІБ за низкою обставин набув найбільшого поширення як метод, придатний для використання в якості тесту підтвердження. Безумовна перевага методу - можливість тестування антитіл до слабо або зовсім нерозчинним антигенів і виключення стадії введення радіоактивної мітки в антигени. Про чутливості в разі ІБ судять за граничним кількості нанесеного на гель антигену, яке при фракціонуванні білків вдається виявити імунохімічних після перенесення з гелю на тверду фазу (нітроцелюлозу). Загальна чутливість аналізу залежить від цілого ряду причин: умов фракціонування та іммобілізації антигену на твердому носії, рівня фону, специфічності та афінності антитіл. Важливе значення має вид використовуваної мітки і спосіб її виявлення.
Таким чином, метод імуноблотингу дозволяє ідентифікувати зони антигену на твердій фазі, не пов'язуючи весь білок з антитілами специфічної сироватки. Імуноблотінг і його модифікації в основному використовуються для типування бактеріальних і вірусних антигенів і антитіл, особливо в разі недостатньої роздільної здатності звичайних систем, а також при аналізі імуноглобулінів, нуклеїнових кислот або як тест підтвердження в поєднанні з іншими методами.
Виявлення збудників, антигенів і антитіл за допомогою суспензійних препаратів.
Принцип: фіксовані на частинках компоненти вступають в реакцію антиген-антитіло, що супроводжується утворенням великих, видимих неозброєним оком агломератів. У суспензійних препаратах для виявлення та кількісного визначення антигенів і антитіл використовується властивість багатьох неорганічних і органічних речовин, таких як активоване вугілля, дерматол, бентоніт, каолін, гідроокис алюмінію, сі технічними можливостями лабораторії, контингентом заражених людей, характером і масштабом поширення передбачуваної інфекції. Діагностику необхідно провести в найкоротші терміни, оскільки від цього залежить ефективність ізоляції та лікування хворих. При роботі з патологічним матеріалом важливо враховувати і попереджати можливість зараження медичного персоналу, тому треба суворо дотримуватися інструкції по збору матеріалу від хворих. Класичні методи експрес-діагностики в більшості своїй вичерпали себе, у зв'язку з цим необхідно розробляти принципово нові, такі як ПЦР і т.д. та автоматизувати існуючі.
Таким чином, експрес-діагностика ГОІ і до цього дня залишається актуальною і однією з найважливіших завдань мікробіології та епідеміології. Список використаної літератури Прискорені методи діагностики інфекційних хвороб (зб. тр.)-Кишинів, "ШТІІНЦА", 1987. Препарати для експрес-діагностики (зб. тр.) - Ленінград, 1981. Імунохімія та лабораторна діагностика особливо небезпечних інфекцій (зб. тр.) - Саратов, 1985. Щербак Ю.Ф. Особливо небезпечні інфекції - М., "Медицина", 1975. Рання та диференціальна діагностика основних інфекційних захворювань (ф.-мет. Посібник) - Ленінград, 1988. Медицина катастроф (діл. посібник) - М., "ІНІ Лтд", 1996. Лебедєва М.М. Керівництво до практичних занять з медичної мікробіології - М., "Медицина", 1973. Борисов Л.Б., Козьмін-Соколов Б.М., Фрейдлін І.С. Керівництво до лабораторних занять з медичної мікробіології, вірусології та імунології - М., "Медицина", 1993. Повловіч С.А. Медична мікробіологія в графах - Мінськ, "Вишейшая школа", 1986.