Виконав: Новак А.Л., 301 гр., Л / ф, Владивосток, 1998.
Передмова
Незважаючи на те, що стафілококи належать до числа найбільш легко виявляються і розпізнаються мікроорганізмів, які не потребують складних діагностичних прийомів для їх виявлення, в практичній роботі мікробіологи досі відчувають певні труднощі при встановленні їх причинного ролі в ряді різних захворювань. З одного боку, присутність патогенних стафілококів, що виявляється в досліджуваному матеріалі, не завжди є переконливим доказом їх етіологічного значення.
З іншого, зважаючи на велику різноманітність проявів біологічної активності цих мікробів, залежне від різних, не завжди піддаються обліку факторів, широку їх мінливість під впливом лікарських речовин і самого макроорганізму, досить складно буває визначити їх потенційну патогенність. Нарешті, третя причина пов'язана з тим, що стафілококи є представниками нормальної мікрофлори з групи умовно патогенних мікроорганізмів і, разом з непатогенними, патогенні представники мешкають в організмі людей, поширюючись при цьому вельми нерівномірно на різні ділянки людського тіла. Якщо виділення патогенного стафілококу, з крові хворих людей і різних порожнин, які прийнято вважати стерильними, в переважній більшості випадків може служити доказом його ролі як збудника хвороби, то присутність стафілококів на слизових зіву, носа і т. д. навіть при явному хворобливому стані їх вимагає великої обережності дослідника у висновках про етіологію даних захворювань.
Тому, природно, не може бути загальних рекомендацій, як при діагностиці різних стафілококових інфекцій, так і при мікробіологічних дослідженнях ділянок тіла людини і різних об'єктів зовнішнього середовища. Широкий обмін думками між мікробіологами наукових установ та практичних лабораторій, здійснюваний на з'їздах і конференціях, присвячених проблемам стафілококових інфекцій, а також при особистих контактах, здавалося б, повинен був привести до певних поглядів на різні методи дослідження, пропоновані для виділення та ідентифікації стафілококів. Однак велика кількість запитів, що надходять з лабораторій СЕС і лікувальних установ, свідчить про явні труднощі, які виникають у дослідників при вирішенні різних питань мікробіологічної діагностики стафілококів, а в ряді мікробіологічних установ побутують ще деякі застарілі методи і прийоми, що приводять до неправильних оцінок і навіть прикрим непорозумінь.
Важливою умовою ефективності лабораторної діагностики є поєднане визначення якісних і кількісних критеріїв змісту патогенних стафілококів у досліджуваному матеріалі. Виходячи з цього, я вважаю за необхідне викласти ряд методів основних мікробіологічних досліджень, найбільш простих і доступних для кожної практичної та наукової лабораторії, якими ми користуємося протягом багатьох років.
ОСНОВНІ ПРИНЦИПИ ВИЯВЛЕННЯ І ІДЕНТИФІКАЦІЇ Патогенні стафілококи
Попередня діагностика стафілококів може грунтуватися на бактеріоскопічному вивченні препаратів - мазків, пофарбованих за Грамом. Патогенні стафілококи, крім гроноподібна розташування, характеризуються правильної сферичної формою клітин. Виявлення стафілококів, що знаходяться усередині кліток, дозволяє дати відповідь про наявність стафілококової інфекції. У більшості ж випадків для точного встановлення патогенності виявлених стафілококів потрібно виділити ці мікроорганізми в чистій культурі шляхом посіву досліджуваного матеріалу на щільні живильні середовища. В даний час асортимент диференціальних, елективних і накопичувальних середовищ, запропонованих для виділення патогенних стафілококів, є дуже значним і продовжує розширюватися.
Багато дослідників на основі знання основних біохімічних характеристик і поживних потреб патогенних стафілококів при конструюванні середовищ прагнуть підвищити їх висівання та забезпечити можливість здійснювати їх кількісний облік, отримати надійний спосіб відрізняти потенційно хвороботворні стафілококи від сапрофітів. Вживання рідких накопичувальних середовищ для пер гемолітичну активність стафілококів. При цьому необхідно пам'ятати, що гемолітична здатність, що визначається на чашках з кров'яним агаром, залежить від багатьох факторів - виду крові, її концентрації, наявності в ній антитоксинів, товщини шару середовища, вмісту вуглекислого газу в атмосфері культивування, густоти посіву, присутності і характеру супутньої флори і т. д.
При відборі колоній з кров'яного агару необхідно отвівать як гемолітичні, так і не дають гемолізу, особливо якщо дослідження проводиться на середовищі з людською або кінської кров'ю, а відсутність гемолізу на таких середовищах не дозволяє укласти про відсутність взагалі гемолітичної активності. Тому використання кров'яного агару для первинного посіву доцільно тільки при обстеженні об'єктів, що не містять сторонньої мікрофлори, і бажано додавати в поживне середовище кров кролика або барана.
Якщо ж проводиться дослідження гною відкритих ран або відокремлюваного виразок або свищів, то слід користуватися елективної-диференціальної середовищем для стафілококів - желточно-сольовим агаром (ЖСА) Г. М. Чистовича. Елективної цього середовища забезпечується високим вмістом хлористого натрію, а доданий яєчний жовток дозволяє виявляти лецитовителлазную активність, яка є одним з показників патогенності стафілококів і в силу цього ЖСА більш чітко диференціює патогенних представників, ніж кров'яний агар. Приготування ЖСА нескладно. Заготовляють про запас і стерилізують в автоклаві при 120 ° С "протягом 20 хв поживний агар (МПА або Хоттингера) рН 7,2-7,4, що містить 10% кухонної солі. Перед вживанням сольовий поживний агар розтоплюють, остуджують до 45-50 ° С і додають до нього 20% за обсягом стерильною желточной суспензії (1 жовток курячого яйця на 200 мл фізіологічного розчину). Для кращого емульсірованія бажано мати колби зі скляними бусами. Після ретельного перемішування середовище розливають по 20-25 мл в чашки, які можуть зберігатися в холодильнику протягом кількох днів. Слід виробляти масивний посів досліджуваного матеріалу на чашки з ЖСА, а інкубацію вести протягом 2 діб при 35-37 ° С. Стороння флора різко пригнічується, стафілококи ж на ЖСА виростають практично в чистій культурі. Безпосередньо при перегляді чашок навколо колоній відзначається утворення райдужних віночків і каламутній зони - лецитовителлазная реакція. Такі колонії, не менше двох з кожного посіву, отвівают на скошений м'ясо-пептонний агар для подальшої перевірки виросли культур в реакції плазмо-коагуляції.
Щоб уникнути помилок у визначенні желточной реакції, необхідно мати на увазі, що іноді спостерігається помутніння середовища без райдужного обідка, в цьому випадку проба на лецітовітеллазу вважається негативною. Якщо ж колонії, що виросли на ЖСА, не дають лецитовителлазной реакції, тобто не оточені райдужним віночком, але є ріст стафілококів, то їх теж вважають підозрілими і також отвівают не менше двох з кожного такого посіву на чашки з простим поживним агаром плямами діаметром 5-10 мм. Після добового інкубування при 37 ° С отримані макроколоніі перевіряють в реакції плазмоагглютінаціі, для чого мікробну масу розмішують петлею на склі в краплях цитратної кролячої або людської плазми, розведеної 1: 4. Освіта пластівців враховують протягом 30с-1 хв. При наявності плазмоагглютінаціі такі штами вважають підозрілими і отвівают на скошений агар для подальшого вивчення в коагулазной реакції.
При такому відборі число пропускаються штамів патогенних стафілококів людського походження невелика, культури ж, виділені від тварин, потрібно перевіряти в реакції плазмокоагуляціі. Коагулазная проба є основною ознакою, що визначає хвороботворність стафілококів, тому її постановка вимагає до себе максимальної уваги. Для виявлення коагулазной активності у стафілококів, виділених від людей, можна користуватися як цілісної кров'ю, так і плазмою кроликів або людини. Можна використовувати також кров або плазму, взя результатів проводиться обов'язково двічі: через 2-3 год і 24 год Враховують згортання плазми і утворення згустків. Зазвичай культури, активно продукують коагулазу, дають позитивну реакцію вже через 2-3 год а якщо вони володіють і вираженої фібринолітичною активністю, то спочатку утворилися згустки можуть піддатися розплавлення до кінця доби. Слабокоагулірующіе штами можуть давати позитивну реакцію в пізні терміни-до кінця доби. Досліди, що дали сумнівний результат, необхідно повторити.
Деякі дослідники, отримавши негативну або сумнівний результат, залишають пробірки на столі. Цього робити не можна, так як згортання плазми в більш пізні терміни може носити не специфічний характер і його не слід приймати до уваги. Стафілококи, що дають позитивну коагулазную пробу, повинні розглядатися як потенційно патогенні, незалежно від наявності або відсутності у них гемолітичних властивостей і характеру пігменту, їх відносять до виду St. aureus і надалі піддають фаготіпізаціі і перевірці на чутливість до антибіотиків. Поглиблене вивчення стафілококів показало, що основна ознака па-тогенності - коагулазная реакція може піддаватися мінливості при впливі різних факторів (Г. Н. Чистович, 1961; Є. М. Падеріна, 1966), тому в ряді випадків, при виділенні коагулазонегатівних стафілококів в монокультурі з патологічних вогнищ, доцільно вивчити у них інші ознаки потенційної хвороботворності і перш за все - здатність ферментувати маніт в анаеробних умовах.
Відомо, що серед коагулазоотріцательних частина культур має здатність розщеплювати маніт в анаеробних умовах (8,4%-за даними А. А. Акатова і М. Л. Хатеневер, 1974). Визначення ферментації маніту в анаеробних умовах технічно дуже просто і здійснюється шляхом посіву уколом досліджуваних культур в пробірки з високим стовпчиком напіврідкого агару Хоттннгера, що містить 1% маніту і 0,004% індикатора бромкрезолпурпура або бромтімолблау (рН == 7,2). Цю середу перед посівом "регенерують", тобто кип'ятять на водяній бані, швидко охолоджують, а після посіву заливають шаром стерильного вазелінового масла. Посіви інкубують при 37 ° С протягом 5 днів. Однак у значній кількості випадків результати можуть бути враховані вже через добу. Поряд з реакцією плазмокоагуляціі, велике значення набула ще одна важлива здатність стафілококів, що характеризує їх потенційну патогенність,-дезоксірібонуклеазная активність.
Багато дослідники повідомляють про високу кореляцію цієї ознаки з коагулазной активністю і токсигенних досліджуваних культур; відзначають, що стафілококи, виділені з патологічного матеріалу, як правило, мають ДНК-Азою. Коагуло-зопозітівние штами, отримані від носіїв, можуть не мати цього ферменту, і звичайно відсутність дезоксірібонуклеазной активності поєднується з низькою біохімічної здатністю і атоксігенностью таких культур стафілококів. За спостереженнями деяких дослідників, серед коагулазонегатівних штамів стафілококів, але володіли іншими ознаками патогенності, виділених у ряді випадків від хворих з різними гнійними інфекціями, дезоксірібонуклеазную активність проявляли від 10 до 29% таких культур (І. І. Панишева і співроб., 1967; Franklin та співавт., 1966; Lierd і Golde, 1970).
В даний час цей тест може служити надійним диференціальною ознакою між патогенними та непатогенними стафілококами і в той же час може допомогти в диференціації ступеня патогенності коагулазопозітівних штамів і, безумовно, приверне увагу до коагулазонегатівних, але що володіє цим ферментом культурам стафілококів і в ряді випадків дозволить віднести останні до хвороботворних формам з більшою впевненістю. Методика визначення дезоксірібонуклеазной активності нескладна, в основу її покладено метод Джеффріса. Готують про запас 2% МПА (рН-8, 6), що містить ДНК (2 мг / мл середовища), розливають по флаконах і стерилізують текучою парою протягом 30 хв. Перед розливом в чашки до середовища додають CaCIa (0,8 мг / мл). На подсе деполімеризації ДНК. Після 18-20-годинної інкубації поверхню агару заливають 5 мл IN розчину НС1 і через 3-5 хв враховують зони просвітління. Реакції оцінюють в хрестах.
При цьому слід врахувати, що інтенсивність зони деполімеризації на щільному середовищі не завжди збігається з кількістю продукції цього ферменту у досліджуваних стафілококів у рідких середовищах. Для виявлення фибринолизина використовують декілька удосконалений метод Крісті з співр. Середа Крісті-Чепмена має наступний склад: м'ясний екстракт-0, 45 г, пептони-0, 75 г, хлористий натрій-1, 2 г, агар-2, 75 г, вода-130 мл, рН середовища == 7,0 . Стерилізується в автоклаві і зберігається запас. Перед досвідом середу розтоплюють, остуджують до 50 ° С і додають 15-20% стерильною цитратної людської плазми. Суміш прогрівається у водяній бані при 65-70 ° С протягом 2 - 5 хв до появи ясною каламуті, а потім розливається в чашки. Піддослідні культури засівають "плямами" по 15-20 на чашку. Посіви інкубують при 37 ° С. Враховується утворення зон просвітлення навколо колонії спочатку через 14 год, потім через 24 і 48 год, так як реакція в різних культур тече неоднаково швидко і в деяких штамів вона розвивається в більш пізні терміни. Фібринолітичний тест ми вважаємо вельми придатним для визначення потенційної хвороботворності стафілококів, але оцінюємо тільки в комплексі з іншими ознаками активності. Гіалуронідазною активність визначається за методом Мак-Клину в модифікації М. Ш. Могильовського і Л. С. Коган (1949). Розчин гіалуронату дає в присутності 2 N оцтової кислоти типовий згусток, розливається по 0,5 мл в стерильні пробірки. Додається 0,5 мл добової культури стафілококу в пептонов воді. Контролями служать: гіалуропат + дистильована вода і гіалуропат + незасіяній середовище. Суміші струшують і витримуються при 37 ° С 15-20 хв. Потім в кожну пробірку додається по дві краплі 2 N розчину оцтової кислоти і струшується. У контролях повинен утворитися слизовий грудочку. У досвіді при наявності гіалуронідази він відсутній, що свідчить про деполімеризації гіалуронової кислоти мікробним ферментом.
Для вивчення токсигенності стафілококів зручно користуватися методом, запропонованим Ілека і Леві (1950), що дозволяє визначити типи гемолізинів. З цією метою готуються чашки з поживним агаром, що містить 5% відмитих фізіологічним розчином еритроцитів барана, кролика і людини. На поверхню живильного середовища по діаметру поміщають стерильну смужку фільтрувального паперу, змочену альфа-антитоксичної сироваткою. Відступивши 1-2 мл від краю смужки, перпендикулярно до неї засівають штрихами досліджувані культури. Посіви інкубують при 37 ° С протягом доби, після чого враховують результати. Альфа-гемоліз проявляється у вигляді повного просвітлення середовища навколо штриха культури і нейтралізується альфа-антитоксичної сироваткою. Він виявляється на середовищах з кролячими і баранячими еритроцитами Бета-гемоліз на агарі з баранячою кров'ю дає часткове просвітлення, зона якого має буро-пурпурний відтінок. Це "тепло-холодовий" токсин і краще виявляється після додаткового добового витримування чашок в холодильнику при температурі +4 ° С по характерному пошаровому гемолізу баранячих еритроцитів і не централізується альфа-антитоксичної сироваткою. На кролячих еритроцитах він не активний. Дельта-гемолізини визначається по вузькій смужці гемолізу баранячих і кролячих еритроцитів, не нейтралізується альфа-антитоксичної сироваткою.
Проте освіту дельта-гемоли-зіна на цих чашках може бути замасковано дією альфа-токсину і тому його слід перевіряти на середовищах з еритроцитами людини або коня. Таким чином, для визначення всіх 3 типів гемолізинів досить використовувати еритроцити барана і людини або коня. Для визначення вірулентності стафілококів існують кілька різних методів зараження білих мишей. Найбільш простим є введення 0,1 мл добової бульонной культури випробуваного стафілокока в хвостову вену. Облік загибелі тварин здійснюється протягом 10 діб, реєструю дельта-токсигенних. Для порівняння вірулентності стафілококових культур можна використовувати їх здатність викликати дермонекротіческую реакцію у кролів. Готують 4-мільярдну суспензію добової агарної культури стафілокока у фізіологічному розчині, а з отриманої густоти роблять розведення, щоб отримати 2 - та 1-мільярдні суспензії. З кожного розведення в об'ємі 0,1 мл, що становить 100, 200, 400 мільйонів мікробних тіл, вводять кролику в вистрижені або депілірованную напередодні шкіру. На одному кролика можна одночасно поставити до 8 внутрішньошкірних проб. Щодня відзначають прояви дермонекротіческой реакції, а остаточно на 4-ту добу. За мінімальну дермонекротіческую дозу приймають те найменшу кількість культури, яке дає некроз на 4-ту добу (Г. В. Вигодчіков, 1963).
Список літератури
А. М. Смирнова, А. А. Трояшкін, Є. М. Падеріна: мікробіологія і профілактика стафілококових інфекцій - "Медицина", 1977.
Стафілококові інфекції: російський СБ наук. тр. - С.-П., 1991.
А. М. Смирнова: питання імунології та мікробіології стафілококових і стрептококових інфекцій - Ленінград, 1975.
Лекція по темі. Методична розробка кафедри.