Продукти рекомбінації характеристика і маніпулювання

ДНК-полімераза I може утилізувати 2 ', 3'-дідезоксінуклео-зідтріфосфатние аналоги нормальних дезоксинуклеозидтрифосфатных субстратів. Як і при звичайній полімеризації, відповідний дідезоксінуклеотід приєднується до 3'-гідроксильної кінця праймерної ланцюга, проте утворюється при цьому продукт не може служити праймером для подальшого росту ланцюга, і реакція зупиняється.
Для проведення чотирьох різних реакцій копіювання комплекс "матриця-праймер" інкубують в присутності всіх чотирьох звичайних дезоксирибонуклеозидтрифосфатов і якогось певного дидезоксинуклеозидтрифосфата. Наприклад, в одній реакції використовують ddATP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP, в іншій - dATP, ddGTP, dGTP, dCTP, dTTP і т.д. Подовження ланцюга з допомогою матричного копіювання відбувається до тих пір, поки замість чергового дезоксинуклеотидил не приєднається дідезоксінуклеотід; в цей момент зростання ланцюга припиняється. Оскільки термінація синтезу відбувається у випадкових сайтах, утворюється набір ланцюгів всіх можливих довжин, починаючи з 5'-кінця праймера до сайтів, що відповідають положенню приєднаного дідезоксінуклеотіда. Новосинтезовані ланцюга є радіоактивно міченими, оскільки в реакції використовується щонайменше один радіоактивно мічений дезоксінуклеозідтріфосфат. Часто їм є ^{а-32-Р-дезоксінуклеозідтріфосфат,} але це може бути також ³⁵ 8 - дезоксінуклеозідтріфосфат. Іноді використовується радіоактивно мічений праймер. Продукти чотирьох реакцій піддають одночасного електрофорез на окремих доріжках, як при хімічному секвенування. Послідовність зчитують з радіоавтографа, який виглядає так само, як і радіоавтограф, отриманий при використанні хімічного методу секвенування.
Отримання одноланцюжковою ДНК для секвенування за допомогою дідезоксітермінаторов. Молекули ДНК зазвичай є дволанцюжкові; виняток становлять лише одноланцюгові ДНК деяких бактеріофагів. Як ми вже говорили, фізичне розділення кіл дуплексу не завжди здійсненно. Для розділення ланцюгів дуплекс денатурують нагріванням або обробкою лугом і проводять гель-електрофорез або хроматографію. Поділ двох комплементарних ланцюгів відбувається, мабуть, завдяки відмінностей їх конформацій, обумовленим відмінностями у вторинній структурі. Якщо розділення не сталося, застосовують інші методи отримання одиночних ланцюгів. Найбільш ефективний з них полягає в клонуванні фрагмента ДНК у векторі, сконструйованому на основі бактеріофага М13. Будь-яка клонованої вставка завжди буде фланковані одними і тими ж послідовностями векторної ДНК, що дозволяє використовувати стандартні праймери. Їх синтезують хімічними методами, і завжди можна вибрати зручний праймер. Крім того, не складає труднощів отримати окремі клони, кожен з яких містить одну з двох комплементарних ланцюгів ДНК, завдяки чому легко здійснити секвенування обох ланцюгів.
Комбінуючи клонування в М13 і секвенування за допомогою дідезоксітермінатора, ми можемо отримати ефективний спосіб визначення послідовностей молекул ДНК, довжина яких сягає кількох тисяч пар нуклеотидів. Для секвенування довгих дуплексних молекул їх розрізають механічно на фрагменти і потім проводять клонування. Кожна утворюється бляшка містить певні фрагменти або ланцюги. Випадково відбираючи клони, визначають послідовність вставок. Оскільки вставки утворюються в результаті розриву вихідної молекули ДНК у випадкових місцях, деякі фрагменти містять перекриваються послідовності. За допомогою комп'ютера порівнюють послідовність кожного фрагмента з послідовностями інших фрагментів, виявляють накладається, і розташовують окремі фрагменти в певному порядку. Таким способом були визначені послідовності мітохондріальної ДНК людини і ДНК Х-фага.
Інше застосування методів секвенування. Секвенування за допомогою дідезоксітермінаторов може застосовуватися для прямого визначення послідовностей РНК або ДНК, причому навіть у тому випадку, якщо в суміші крім секвеніруемой ланцюга присутні неспоріднені молекули. Важливим елементом при цьому є праймер, комплементарний невеликому цікавить нас ділянці і лише з малою ймовірністю асоціюються з іншими молекулами, присутніми в суміші. Подібної специфічністю зазвичай володіє праймер довжиною 20 підстав з унікальною послідовністю. За таких умов з допомогою зворотної транскриптази синтезують кДНК. Цей метод можна застосовувати тільки в тому випадку, якщо ми вже досить багато знаємо про цікавлять нас РНК або ДНК, але коло таких систем весь час розширюється.
Метод хімічного секвенування може застосовуватися для аналізу специфічних послідовностей ДНК, присутніх в суміші поряд з великим числом різних молекул ДНК, в тому числі навіть якщо мова йде про одному гені у сумарній геномної ДНК ссавців. Перш за все ДНК розрізають за допомогою рестріктірующей ендонуклеази, так що нас цікавить сегмент виявляється у фрагменті довжиною в кілька сотень пар основ. Потім проводять хімічні реакції, специфічні до певних підставах, в результаті чого утворюються чотири набори фрагментів. Такі набори включають всі можливі по довжині фрагменти з цікавій для нас областю, що починаються в сайті рестрикції, за яким була розрізана ДНК. Тут же є безліч інших фрагментів з іншої частини геному. Фрагменти поділяють шляхом електрофорезу в секвеніруют гелі, потім переносять на нейлоновий фільтр і отжигают з ³² Р-міченим зондом, який комплементарний послідовності-мішені, що знаходиться поблизу одного з сайтів розрізання. Зонд асоціює з усіма фрагментами, що утворилися починаючи з одного кінця послідовності-мішені, в результаті чого на радіоавтограмме утворюється типова "секвеніруют сходи". Таким методом можна визначити, наприклад, нуклеотидну послідовність мутантних форм раніше клонованого гена. Він може використовуватися також для визначення характеру метилування специфічної, вже клонованої області геному, оскільки гідразин реагує з 5'-метілцітозіновимі залишками менш ефективно, ніж з цитозинових і тимінових. Про наявність 5'-метилцитозину в гелі можна судити по відсутності цитозинових залишку, представленого у відповідному фрагменті ДНК, що виділена після клонування та реплікації в клітинах Е. coli.

Комп'ютерний аналіз нуклеотидних послідовностей ДНК

Простота поділу сегментів ДНК шляхом клонування і їх подальший аналіз дозволили визначити нуклеотидну послідовність багатьох ДНК. Але хоча прагнення біологів до отримання точних в хімічному відношенні даних продовжувало стимулювати ці дослідження, інформація виявлялася марною, якщо не були виявлені якісь особливості цих послідовностей. На перший погляд довгі ряди підстав здаються абсолютно загадковими і не піддаються розшифровці. На щастя, проблему розшифровки можна вирішити за допомогою високоефективних комп'ютерних програм і для рутинного використання є програми на декількох стандартних комп'ютерних мовах. Можливості різних програм в значній мірі перекриваються. Їх можна використовувати при роботі як на великих комп'ютерах, так і на міні - і мікрокомп'ютерах. Взагалі кажучи, ці програми придатні для пошуку як структурних, так і біологічних особливостей послідовностей.
а. Зберігання інформації про первинну структуру
Для введення і зберігання даних про послідовності і подальшого пошуку, проведеного дослідником вручну або за допомогою спеціальної аналітичної програми, використовуються стандартні процедури редагування. Більшість цих процедур передбачають також можливість корекції зберігається. Введення даних часто здійснюють шляхом типування послідовності в комп'ютерному терміналі після прочитання і реєстрації даних секвеніруют гелю. Однак є також програми для прямого введення вихідних даних. У принципі такі програми дозволяють звести до мінімуму помилки, яких припускаються при неправильному зчитуванні гелів або неточної реєстрації даних. Існує два підходи до такої автоматизації. У першому випадку детектор автоматично сканує радіоавтографи і передає дані у комп'ютер. У другому дані автоматично реєструються від сенсора, керованого вручну. При другому підході дослідник є арбітром за будь-яких утрудненнях.
б. Структурний аналіз
Первинна структура. Якщо є дані про нуклеотидної послідовності одного ланцюга, то більшість програм дозволяють побудувати комплементарную ланцюг, обчислити нуклеотидний складу, виявити ділянки, багаті пуринів, піримідинів або певними сполученнями підстав, і визначити частоту зустрічальності різних динуклеотид. Можуть бути виявлені специфічні субпоследовательності в межах певного сегмента, що часто використовується для знаходження сайтів для рестріктірующіх ендонуклеаз. У програму введена інформація про сайти впізнавання для відомих ферментів, і по одній команді видаються відомості про становище цих сайтів для кожного з ферментів, зокрема очікуваних фрагментів, що утворюються при розщепленні ними ДНК, розмірі кожного фрагмента в парах основ і його процентному відношенні до загальної довжини сегмента , а також про нуклеотидних залишках, відповідних кінців кожного фрагмента. Існують також програми, які можуть передбачити, які продукти будуть отримані при спільному дії двох або декількох ендонуклеаз. При цьому передбачення робляться як для лінійних, так і для кільцевих молекул. Отримана інформація може використовуватися для підтвердження даних секвенування шляхом порівняльного аналізу очікуваного і реального результатів дії ендонуклеаз.
Наявні програми здійснюють також пошук характерних особливостей послідовностей, включаючи прямі і зворотні повтори. Виявляються не тільки повністю співпадаючі сегменти, але і сегменти з тим або іншим ступенем розбіжності; для цього допускаються певні відхилення параметрів, закладених в програму, від фіксованого значення. У прикладі перераховані всі повтори довжиною не менше шести пар основ і гомологічні не менше ніж на 75%. Передбачається, що максимальний розмір утворюються петель дорівнює двом підставах.
Можна отримати дані про гомології або часткової гомології різних послідовностей. Ці дані можуть стосуватися структури одного і того ж гена у двох різних організмів або споріднених генів одного організму. Такий порівняльний аналіз широко використовується при вивченні еволюції на молекулярному рівні. Для порівняння двох послідовностей між собою або однієї послідовності з групою інших послідовностей розроблені спеціальні алгоритми. Може використовуватися описаний раніше імовірнісний аналіз. За результатами порівняння інформації про послідовності, отриманої в різних лабораторіях, було створено центральний банк даних, з якого завжди можна зажадати інформацію про тих чи інших послідовностях. До 1989 р. в банках була інформація про послідовності більше 20 мільйонів пар основ, що представляє дані про багатьох генах і організмах.
Крім цього загального застосування, виявлення подібності різних послідовностей є складовою частиною секвенування дуже довгих послідовностей за допомогою дідезоксі-методу, об'єднаного з клонуванням в Фаге М13. Використовуючи комп'ютер для виявлення перекриваються послідовностей, ми не тільки робимо роботу менш стомлюючої, але і можемо швидко вирішити, чи слід нам намагатися отримати додаткові дані.
Вторинна структура. Розроблено програми, що дозволяють передбачити стабільну внутрішньомолекулярних вторинну структуру одноланцюгових РНК або ДНК. Вони дозволяють, наприклад, побудувати модель укладання ланцюга тРНК і рРНК, і багато хто з таких моделей отримали експериментальне підтвердження в дослідах з використанням нуклеаз, специфічних до одноланцюговим ділянкам. Розрахунки засновані на припущеннях про ймовірність утворення певних пар основ, на термодинамічних властивостях різних пар основ і даних про стабільність спіралі.
в. Біологічне значення
За допомогою комп'ютерних програм можна перевести інформацію з мови нуклеотидів на мову амінокислот у відповідності з правилами генетичного коду. При цьому вказуються всі три можливі рамки зчитування і стоп-кодони трансляції. У тих випадках, коли амінокислотна послідовність кодованого поліпептиду відома, ідентифікувати правильну рамку зчитування не складає труднощів. В іншому випадку правильну рамку можна вибрати, виходячи з її довжини. Рамки, в яких часто зустрічаються стоп-кодони, навряд чи можуть вважатися правильними. Показані частина генома SV40, що кодує ділянку поблизу м \ ГІ _2-кінця малого і великого Т-антигенів, і отримані за допомогою комп'ютера амінокислотні послідовності для всіх трьох рамок зчитування. Правильною є третя рамка. Можна також розрахувати частоту, з якою зустрічається кожен кодон, і таким чином виявити кращі кодони для певних амінокислот. Звернення цієї процедури дозволяє відтворити можливі нуклеотидні послідовності, виходячи з відомої амінокислотної послідовності поліпептиду, хоча це завдання не має однозначного рішення внаслідок вирожденність генетичного коду. Центральний банк даних містить інформацію про амінокислотних послідовностях всіх проаналізованих поліпептидів, що дозволяє порівнювати послідовності досліджуваного і відомих білків.
За допомогою комп'ютерів можна вести пошук специфічних нуклеотидних послідовностей, наприклад промоторів або ділянок зв'язування з рибосомами. Вони дозволяють також виявити послідовності зі специфічними властивостями. Наприклад, наявність подібних послідовностей в різних неспоріднених у всіх інших відносинах генах або поблизу них наводить на думку про їхню можливу регуляторної ролі. Точно так само присутність гомологічних послідовностей в кодують областях різних генів може свідчити про спільність еволюційного походження цих генів. Дане питання детально розглянуто в ч. III книги. Однак важливо усвідомлювати, що статистичний аналіз ще не є достатнім для того, щоб робити висновок про біологічну роль тієї чи іншої послідовності. Про це можна говорити тільки після проведення незалежного біологічного дослідження.

Визначення положення клонованих сегментів в геномах

В ідеалі встановлення положення клонованого сегмента ДНК означає визначення фланкують його послідовностей і того хромосомного сайту, за яким цей сегмент був включений в хромосому. Кінцева мета такого картування полягає в повному описі структури хромосоми.
а. Молекулярна локалізація
Характеристика клонованого сегмента. Перш за все необхідно довести, що клонований сегмент дійсно є реплікою певного геномного сегмента. Чи існує в геномі гомологічний сегмент з точно так само розташованими сайтами для рестріктірующіх ендонуклеаз? Це питання має важливе значення, оскільки під час реплікації в системі господар-вектор іноді відбувається клонування випадкових послідовностей, що утворилися в результаті рекомбінацій, делеції або мутацій. Основний підхід полягає у використанні клонованої ДНК як зонд для аналізу продуктів ендонуклеазною розщеплення сумарною геномної ДНК, з якої стався цей клонований сегмент. Такий підхід аналогічний описаному в разд.6.1. б з тією відмінністю, що зондом в даному випадку є клонована вставка, мічених ³² Р. В експерименті Б, клонований зонд представляв собою субклонірованний сегмент овальбумінового гена; матеріал, підданий електрофорез, - це coRI-гідролізат ДНК курки. З зондом гібрідізовался матеріал тільки однієї смуги, що представляє собою фрагменти завдовжки 2,35 т.п. н. Цей експеримент показує, що 1) клонована вставка справді є фрагментом ДНК курки;
2) у геномі гибрідизуючою сегмент розташований між двома EcoRI-сайтами, що знаходяться один від одного на відстані 2,35 т.п. н.;
3) ні один із фрагментів будь-якого іншого розміру не гибрідизуючою із зондом. Таким чином, клонований фрагмент завдовжки 2,35 т.п. н., мабуть, являє собою справжню геномної послідовність і два алелі в Диплоид є ідентичними, оскільки локалізація цих EcoRI-сайтів збігається.
Ще одна послідовність овальбумінового гена виявлена ​​в EcoRI-фрагменті довжиною 1,8 т.п. н. Після того як він був клонований і використаний як зонд для аналізу EcoRI-гідролізату ДНК курки, були виявлені три гибрідизуючою фрагмента довжиною 1,8; 1,3; 0,5 тощо н. відповідно. Ці дані свідчать про неідентичності двох алельних овальбумінових генів. Один з них містить додатковий EcoRI-сайт, що розділяє фрагмент довжиною 1,8 т.п. н. на дві частини. Цікаво, що така проста процедура лежить в основі генетичного аналізу. Спадкування двох або більше алелів легко простежується за допомогою ендонуклеазною розщеплення, електрофорезу, ДНК-блотів і гібридизації між відповідним зондом і ДНК, виділеної з різних джерел. Єдиною вимогою є наявність поліморфних ендонуклеазною сайтів в алелі будь-якого гена або сегменту ДНК. Для проведення таких експериментів достатню кількість ДНК можна отримати з дуже невеликого шматочка тканини або з декількох мілілітрів крові, тому метод може використовуватися для аналізу ДНК більшості видів, у тому числі і людини.
Побудова карти молекули. Маючи порівняно короткі сегменти молекули ДНК, такі, наприклад, як раніше описаний субклонірованний фрагмент завдовжки 2,35 т.п. н., можна побудувати детальну карту молекули аж до встановлення її нуклеотидної послідовності. Довші клоновані послідовності, подібні тим, які присутні в Х-векторах або космідах, часто містять кілька генів, а також інші сегменти ДНК, і можуть використовуватися для розширення карти. Так, субклонірованний фрагмент овальбумінового гена завдовжки 2,35 т.п. н. служив зондом для пошуку гомологічних послідовностей в космідной бібліотеці, сконструйованої з геномної ДНК курки. Було відібрано дві косміди з перекриваються послідовностями тільки в області зонда; разом вони становили ділянку геному довжиною 46 тощо н., з яких 7,7 т.п. н. належали самому гену овальбуміна. Область, яка містить овальбуміновий ген, було ідентифіковано завдяки освіті гетеродуплекса з овальбуміновой кДНК. Несподівано виявилося, що два інших ділянки сегмента довжиною 46 тощо н. також гибрідизуючою з овальбуміновой кДНК, хоча і в меншій мірі. При відпалі РНК з яйцепровода курки з космідамі ці дві ділянки гібрідізовалісь також з двома іншими мРНК, відмінними від овальбуміновой. Було висловлено припущення, що в сегменті довжиною 46 тощо н. локалізовані ще два гени, послідовність яких схожа з послідовністю гена овальбуміна. Дане припущення отримало підтвердження після проведення рестрикційного і гетеродуплексного аналізу, а також після визначення нуклеотидної послідовності. Ці два гени, позначені як X і Y, транскрибуються, як і овальбуміновий ген, у присутності стероїдних гормонів.
Методи, що використовуються при картуванні овальбумінового гена і генів X і Y, лежать в основі широко розповсюдженого підходу до побудови детальних генетичних карт, що отримав назву прогулянки по хромосомі. Унікальний сегмент ДНК, що примикає до одного з кінців клонованого фрагмента, очищають і використовують для зондування бібліотеки геномної ДНК. Одні гибрідизуючою клони повністю перекриваються з вихідним клонованим сегментом, інші ж включають нові сегменти, в результаті чого карта розширюється. При повторенні цієї процедури відбувається "прогулянка" на більшу відстань. Даний метод не дуже зручний для картування тих геномів, які містять велику кількість розсіяних повторів, оскільки в цьому випадку важко очистити унікальні послідовності, використовувані як зондів.
б. Хромосомна локалізація
Класичне генетичне картування грунтується на отриманні певних мутацій і аналізі частот рекомбінацій. У Drosophila генетичні карти вдалося розширити і уточнити шляхом встановлення кореляцій між генетичними даними та хромосомними абераціями типу делецій, інверсій і транслокацій, які візуально проявляються як зміни в характері смугастість політенних хромосом. Однак подібні методи непридатні для аналізу хромосом більшості рослин і тварин. Генетичний аналіз нечисленних популяцій з великим періодом генерації вельми скрутний, оскільки політенні зустрічається рідко, а хромосоми досить численні, мають невеликі розміри і практично не піддаються ідентифікації. Наприклад, у ссавців встановлення кореляції між фенотипическими змінами і ділок, транслокаціями і інверсіями дозволяє локалізувати лише обмежене число генів у специфічних хромосомах або окремих їхніх областях. З розвитком методів отримання клонованих сегментів ДНК були розроблені універсальні процедури картування, які не залежать від фенотипического прояви мутацій. Вдалося локалізувати багато генів, в тому числі і гени людини, в специфічних областях хромосом.
Ми розглянемо два найбільш поширені методи. За допомогою одного з них положення клонованого сегмента ДНК встановлюють за його здатності гібрідізоваться зі специфічним ділянкою в практично інтактних хромосомах. Другий дозволяє ідентифікувати хромосому, яка несе певну послідовність, шляхом гібридизації відповідного міченого зонда з гібридними клітинами, які містять різні набори лише з декількох хромосом даного виду. У третьому методі, описаному у вступі до ч. IV, використовуються клоновані фрагменти ДНК для виявлення поліморфізму рестрикційних сайтів. Такий поліморфний маркер застосовують потім як генетичного маркера для побудови карт зчеплення еукаріотичних хромосом - аналогічно тому, як у класичному генетичному аналізі використовують фенотипічні маркери.
Картування хромосом за допомогою гібридизації. РНК-зонди або денатуровані ДНК-зонди можуть гібрідізоваться з відповідними послідовностями денатурованою ДНК, які входять до складу хромосом з характерними морфологічними ознаками. Положення радіоактивно міченого зонда визначають, завдавши на препарат, підготовлений для мікроскопічного дослідження, чутливу емульсію; в тому місці емульсії, яке контактує з гібридним ділянкою, з'являються темні зерна срібла. Провівши мікроскопічне дослідження всього препарату, можна локалізувати зонд. Досить точні дані вдається отримати в разі великих політенних хромосом Drosophila в основному завдяки тому, що положення темних областей можна співвіднести з характером смугастість хромосом.
Однак визначення положення одиничних генів у невеликих і досить численних хромосомах рослин і хребетних шляхом гібридизації in situ ускладнене з двох причин. По-перше, не завжди легко ідентифікувати окремі хромосоми.
Це залежить від їх розміру, положення центромери і характерного малюнка з темних і світлих смуг, що утворюється після фарбування фіксованих метафазних хромосом певними барвниками. Крім того, самі смуги захоплюють занадто великі відрізки ДНК. Наприклад, 3 "10 ⁹ пар нулеотідов гаплоїдного геному людини містяться менше ніж у 1000 різних смугах, а у рослин це число навіть менше. В результаті за допомогою чутливої ​​емульсії можна встановити лише, в якій області хромосоми знаходиться цікавий для нас сегмент. Більш того, розмір зерен срібла і його розкид зменшують роздільну здатність приблизно до 10 ⁷ пар основ.
Друга проблема-чутливість зондів. Маса однієї копії фрагменту дуплексної ДНК довжиною 1 т.п. н. складає приблизно 10 ^-12 мкг. Радіоактивно мічені зонди, отримані за допомогою нік-трансляції, рідко мають питому радіоактивність, що значно перевищує ¹⁰ серпень роз. / Хв на 1 мкг. Гібридизація такого зонда з одним порівнянним сегментом в хромосомі дає тільки 10 ^-4 роз. / Хв на 1 мкг, або приблизно один розпад на тиждень. Щоб досягти необхідної чутливості, слід одночасно використовувати кілька спеціальних прийомів. Наприклад, щоб отримати зонди з питомою радіоактивністю приблизно ¹⁰ вересня роз. / Хв на 1 мкг, можна провести нік-трансляцію з використанням у якості субстрату ¹²⁵ 1-5-йодСТР. Гібридизацію слід проводити у присутності декстрансульфата, що збільшує швидкість процесу приблизно в 100 разів, в результаті чого посилюється сигнал. Число зерен також може зрости, якщо одноланцюгові послідовності векторної ДНК, які зчеплені з гібрідізуемой еукаріотичної послідовністю в клонованій зонді, будуть у свою чергу гібрідізоваться з надлишком молекул зонда. Для збільшення кількості зерен срібла можна збільшити час експозиції до декількох тижнів. Таким способом вдається визначити положення одиничних копій генів у специфічних, але дуже великих областях хромосом ссавців.
Картування хромосом, засноване на отриманні гібридних соматичних клітин. Для локалізації клонованого сегмента в певній хромосомі використовують міжвидові соматичні гібриди. Зазвичай такі гібридні соматичні клітини містять повний набір хромосом одного виду і тільки одну або невелике число хромосом другого виду. Щоб судити про наявність даного гена в певній донорной хромосомі, аналізують групу різних ліній гібридних клітин і встановлюють кореляцію між присутністю тестованого гена і наявністю специфічної хромосоми.
Гібридні соматичні клітини утворюються при 1) злиття клітин двох різних видів;
2) злиття клітин одного виду з міні-клітинами іншого, містять одну або кілька донорних хромосом;
3) трансфекції реципієнтного клітин препаратом очищених хромосом донора. Щоб елімінувати мчали донорні і реципієнтного клітини, застосовують відповідні селективні умови. Наприклад, донорні клітини можуть проявляти чутливість до певних лікарських речовин, а реципієнтного клітини можуть бути мутантами, зростаючими лише в особливих умовах. У присутності таких препаратів і в середовищі HAT ростуть тільки гібридні клітини, що несуть у донорной хромосомі функціональний ген тимідинкінази.
Якщо відібрані гібридні клітини вирощувати в неселективних умовах, то донорні хромосоми зрештою втратити чинності більш-менш випадкових причин. Але клони гібридних клітин можна отримати в будь-який момент і ідентифікувати резидентні донорні хромосоми за характером смугастість, виявлення раніше картіровани послідовностей ДНК або ферментативних маркерів або з використанням усіх трьох методів. Таким способом можна одержати банки різних ліній гібридних клітин, кожна з яких містить певний набір донорних хромосом.
Альтернативний підхід полягає у збереженні селективних умов. Підтримуючи умови, сприятливі для даного гена, протягом багатьох клітинних генерацій, можна отримати лінії клітин тільки з однією стабільною донорной хромосомою. Інший спосіб отримання гібридних клітин з одного донорной хромосомою полягає в трансфекції препаратом, збагаченим цієї хромосомою.
При конструюванні гібридів виникає питання, який із видів буде служити донором, а який - реципієнтом. Відповідь на нього зазвичай можна знайти лише експериментальним шляхом. Як правило, гібридні клітини "людина-миша" втрачають хромосоми людини.
Після ідентифікації чужорідних хромосом в соматичних клітинах гібридів використовують три підходи, для того щоб встановити, чи присутній тестований ген у певній хромосомі. Перший заснований на виявленні кореляції між наявністю цієї хромосоми і експресією тестованого гена з освітою певного продукту. Для цього вимірюють ферментативну активність або виявляють взаємодія зі специфічними антитілами; при цьому необхідно, щоб використовувані методи дозволяли розрізняти продукти генів донорних і реципієнтного клітин. Наприклад, два білки-продукту генів можуть мати різну електрофоретична рухливість, як, наприклад, у випадку галактокіназ гризунів і приматів. При другому підході використовують гібридизацію між клонованим зондом і набором хромосом гібрида in situ; цей підхід має вже описані обмеження. Третій і найбільш загальний підхід пов'язаний з ідентифікацією шуканого гена шляхом відпалу відповідного ДНК - або РНК-зонда з ДНК, виділеної з гібридних клітин і перенесеної на нітроцелюлозні фільтр. Відпал з ендонуклеазною фрагментами часто дозволяє виявити донорний ген у фрагментах, що мають розміри, типові для донорного геному, навіть у тих випадках, якщо гени донора і реципієнта є перехресно гибрідизуючою. Оскільки важко отримати гібриди з одного донорной хромосомою, зазвичай досліджують цілий набір гібридних клітин, які містять різні донорні хромосоми. Якщо цей набір досить великий, то присутність послідовності зонда зазвичай можна пов'язати з присутністю певної хромосоми.
Використовують також гібридні соматичні клітини, що містять лише частина певної хромосоми донора. Наприклад, деякі лінії донорних клітин містять хромосому з делецій або хромосому, несучу невеликий транслоцірованний ділянку з іншої хромосоми, і за минулі роки були виділені і охарактеризовані багато ліній гібридних клітин, що містять делетірованние або складові донорні хромосоми. Наприклад, за допомогою таких гібридних клітин гени важкого ланцюга імуноглобуліну людини були локалізовані в положенні 32 довгого плеча хромосоми 14. Були проаналізовані дві лінії гібридних клітин миші і людини, кожна з яких містила одну з пари реципрокних транслокацій між хромосомою 14 та Х-хромосомою. Зонд, що представляє собою клонований ген імуноглобуліну, гібрідізовался тільки з ДНК з гібрида, що містить частина хромосоми 14, відповідну q32.
У результаті аналізу клонів з бібліотек, що містять ДНК однієї хромосоми, були отримані детальні карти ділянок індивідуальних хромосом. Найбільш прямий шлях отримання таких бібліотек полягає у використанні окремих очищених хромосом. Інший підхід заснований на використанні ДНК з гібридних соматичних клітин, що містять тільки одну донорно хромосому. З такої бібліотеки можуть бути відібрані рекомбінантів, що містять послідовності донорной ДНК, за їхньою здатністю гібрідізоваться з видоспецифічними зондами.
в. Нестабільність при клонуванні
Як правило, клоновані вставки є точними репліки геномних послідовностей, проте іноді під час клонування в цих послідовностях відбуваються зміни. Невідповідність розмірів клонованої вставки і сегменту геномної ДНК найчастіше буває обумовлено рекомбінації, ділок або вставками, що відбулися під час клонування. Нерідко спостерігаються варіації в розмірах вставки або в її рестрикційної карті при повторному виділенні. Якщо клонований фрагмент містить тандемні повтори, то при розщепленні рекомбінантної ДНК часто виходить складна суміш рестрикційних фрагментів. Наприклад, деякі фрагменти можуть бути представлені в кількості меншій, ніж моль-еквівалент. Це теж свідчить про що відбулися під час реплікації рекомбінантної молекули перебудовах, що призводить до утворення змішаної популяції рекомбінантів. Перебудова полягає в гомологічною рекомбінації, що супроводжується делеції або ампліфікації клонованих тандемної повторюваних одиниць. Подібна нестабільність клонованих повторів в Є. сой-системах господар-вектор зменшується, але не усувається повністю в клітинах, мутантних по функціях рекомбінації.

Визначення числа копій даної послідовності в геномі

Ген овальбуміна присутній у гаплоїдному геномі курки в єдиному екземплярі, проте багато генів і деякі інші сегменти ДНК зустрічаються в геномі безліч разів. Типовими прикладами геномів з багаторазово повторюваними послідовностями ДНК є еукаріотичні геноми. Іноді кілька копій в такому геномі бувають абсолютно ідентичні, і тоді при відпалі суміші рестрикційних фрагментів геномної ДНК з міченим гомологічним зондом на електрофореграмме спостерігається одна смуга, чітко видима навіть у тому випадку, коли кількість розщеплюють ДНК не перевищує 1 мкг. Зазвичай для виявлення сегмента, представленого в геномі ссавців лише одноразово, потрібно не менше 10 мкг ДНК, тому поява смуги при кількості ДНК 1 мкг і менше свідчить про те, що даний сегмент представлений в геномі багаторазово. Якщо різні копії послідовності розрізняються по одній або кільком парам підстав, то у них можуть бути і неоднакові сайти для рестріктірующіх ендонуклеаз. У результаті на радіоавтограмме буде присутній безліч смуг або вона буде являти собою одне розмите темна пляма; це залежить від кількості копій повторюваної послідовності.
а. Оцінка кількості копій з допомогою гібридизації ДНК-ДНК
Число копій можна оцінити, провівши денситометрических аналіз радіоавтограмми. При цьому для підвищення точності в окремі лунки на цій же пластині гелю вносять певну кількість немічених клонованої ДНК як зразок ДНК геному. Щільність радіоавтографа лінійно залежить від кількості ДНК в гелі, оскільки зонд присутній в надлишку. Порівнюючи між собою ці показники для геномної ДНК і ДНК стандарту, ми можемо оцінити число копій.
б. Оцінка кількості копій по кінетиці реассоціаціі ДНК
Більш точну інформацію про кількість копій можна отримати, досліджуючи кінетику реассоціаціі ДНК. Кінетичні методи стали застосовуватися для цієї області принаймні на десять років раніше методів, описаних в разд.7.5. а, і саме з їх допомогою були отримані перші дані про те, що еукаріотичні геноми містять багато повторів. Для того щоб зрозуміти суть кінетичного методу, необхідно вивести кілька рівнянь.
Швидкість реассоціаціі окремих комплементарних ланцюгів в розчині залежить від концентрації ДНК і підпорядковується кінетиці другого порядку. Якщо
З ₀ і С-це сумарні концентрації денатурованою ДНК в момент часу t ₀ і в момент часу t після початку гібридизації відповідно, то швидкість реакції описується рівнянням


Хоча, чим більше розмір геному, тим менше справжня концентрація кожного гибрідизуючою фрагмента. Іншими словами, у більш складному геномі кожен гибрідизуючою фрагмент становить меншу частину сумарної ДНК і тому гибрідизуючою при більш високих значеннях Cot. Таким чином, кінетичні криві дозволяють оцінити розмір генома, якщо у нас є препарат геномної ДНК відомого розміру, який може служити стандартом, і якщо криві відповідають кінетиці другого порядку. Якщо N _a і N _{b-розміри} геномів а і b, то


де С - число молей мононуклеотидів на 1 л, t - час у секундах.
Величина зазвичай позначається словом, яке пишеться і вимовляється як "Cot".
Як і в багатьох експериментах по гібридизації, ДНК перед денатурацією і реассоціаціей була розрізана на фрагменти завдовжки близько 400 пар основ. Зверніть увагу на те, що шкала Cot логарифмічна; це полегшує порівняльний аналіз даних. Відповідність кінетичних кривих простої реакції другого порядку випливає з того, що ренатурацією на 90% укладається в інтервал значень Cot, що охоплює два порядки величини.
Конкретні значення Cot _0.5 залежать від загального розміру генома, оскільки С - це сумарна кон-
Характер кінетичних кривих другого порядку для ДНК SV40, Т4 і E. coli дозволяє зробити висновок про те, що кожен геномний сегмент представлений в геномі тільки один раз. Аналогічні криві для еукаріотичної геномної ДНК мають більш складну форму. Як приклад наведено дані для ДНК Drosophila. Гібридизація протікає в широкому діапазоні значень Cot, оскільки багато сегментів ДНК повторюються, причому одні з них багато разів, інші менш часто, а треті - лише кілька разів. Ті сегменти, які зустрічаються в геномі тільки один раз, мають низьку концентрацію і гибрідизуючою при найвищих значеннях Cot. Більшість високоповторяющіхся послідовностей, концентрація яких найбільш висока, гибрідизуючою дуже швидко і характеризуються найнижчими значеннями Cot. Припустивши, що гібридизація сегментів ДНК, представлених в однині, слід кінетиці другого порядку, можна зі складних Cot-кривих за допомогою методу найменших квадратів виділити окрему криву для однокопійной послідовності і оцінити її Cot.
Для таких послідовностей Drosophila значення Cot ₀₅ одно 28,6 моль "з / л при експериментальних умовах, які використовувалися у випадку. Це значення прийнято за стандартне; порівнюючи з ним значення Cot _0.5 для якогось клонованого фрагмента ДНК Drosophila, можна розрахувати число копій цього фрагмента за формулою.
Друга крива відноситься до гібридизації клонованого фрагмента в присутності сумарною геномної ДНК Drosophila. Клонований фрагмент позначено радіоізотопом, завдяки чому кінетику його гібридизації можна реєструвати окремо. Зауважимо, що концентрація фрагмента досить мала, так що його самогібрідізаціей можна знехтувати. Ефективна концентрація клонованої послідовності забезпечується відповідними послідовностями геномної ДНК. Тому значення C ₀ t по осі абсцис, що використовується для отримання значення Cot для фрагмента, розраховується з концентрації геномної ДНК Drosophila, а С і С ₀ по осі ординат відносяться до фракції клонованої ДНК, яка гібрідізовалась. Ось чому значення C ₀ t дійсно відносяться до геномної ДНК. Значення Cot _0.5 для клонованої послідовності одно 1,06, а число копій складає 28,6 / 1,06 = 27.
Для визначення числа копій від однієї до десяти цей метод малопридатний, оскільки для досягнення високих значень Cot потрібен тривалий час або дуже високі концентрації ДНК. Ця проблема ще більш ускладнюється, якщо геном має великий розмір, оскільки збільшується значення Cot _{0 5} для однокопійних сегментів. Значення Cot _{0 5} для таких послідовностей в геномі Drosophila, що має розмір 1,7 * 10 ⁸ пар нуклеотидів, так само 28,6, а відповідне значення Cot _0.5 для геному ссавців щонайменше в десять разів вище.
Насправді кінетичний аналіз гібридизації кілька більш складний, ніж це тут представлено. Швидкість гібридизації залежить не тільки від концентрації ДНК, але і від температури, іонної сили, в'язкості розчину і розміру гибрідизуючою фрагментів. Усі ці параметри мають бути строго фіксованими.
Відсоток гібрідізовавшейся ДНК вимірюють різними способами. По-перше, можна використовувати той факт, що за певних умов з гідроксилапатиту зв'язується дуплексний, але не одноланцюжкова ДНК. По-друге, можна визначати в різні моменти часу відсоток ДНК, яка стає стійкою до нуклеаз, специфічною щодо одноланцюжковою ДНК. Результати, одержані за допомогою цих двох методів, розрізняються, якщо аналізуються складні еукаріотичні геноми. Нуклеазну метод дозволяє визначати тільки кількість дуплексної ДНК, що утворилася при реассоціаціі, а метод осадження на гідроксилапатиті дає не тільки кількість дуплексної ДНК, але і ДНК з неспареними одноланцюжковий хвостами. Такі дуплекси утворюються, зокрема, в результаті випадкових розривів одиночних ланцюгів ще до реассоціаціі з утворенням фрагментів відповідних розмірів, а також завдяки наявності повторюваних послідовностей. Нуклеази S1 розщеплює всі одиночні нереассоцііровавшіе ланцюга, а також всі одноланцюжкові кінці дуплексів. Гідроксилапатит пов'язує всі дуплексні ланцюга, включаючи і ланцюги з одноланцюжковий хвостами, і тому дає більш високу оцінку частки гібрідізовавшіхся ланцюгів, ніж нуклеазну метод. Іншими словами, в дослідах із застосуванням гідроксилапатиту ми отримуємо велику ступінь реассоціаціі ДНК і велику швидкість реассоціаціі, ніж у дослідах з 81-нуклеаз. Ці відмінності зменшуються, якщо використовуються відносно короткі фрагменти ДНК.
в. Оцінка кількості копій з допомогою гібридизації в умовах насичення
Ще один метод оцінки числа копій полягає у визначенні загальної кількості ДНК клонованого сегмента, реассоціірующегося з відомою кількістю геномної ДНК. Клонований сегмент повинен бути присутнім в надлишку на відміну від ситуації, описаної в разд.7.5. б, де в надлишку присутня геномна ДНК. Гібридизація в умовах насичення особливо корисна в тих випадках, коли досліджуваний сегмент присутній в ДНК в дуже малому числі копій і вивчення реассоціаціі утруднено.
Експеримент полягає в наступному. Зростаюча кількість препарату радіоактивно міченого клонованого сегмента інкубують з фіксованою кількістю денатурованою і фрагментованою геномної ДНК і визначають кількість гібрідізовавшейся клонованої ДНК. Час реакції має бути достатнім для досягнення насичення. Краще, щоб мічений фрагмент був одноланцюговим; це дозволяє уникнути його самогібрідізаціі при відносно високих концентраціях, необхідних для отримання насичення. В умовах насичення всі клоновані геномні сегменти пов'язані із зондом. Висота плато дає сумарне число гомологічних послідовностей в геномі, яке можна розрахувати виходячи з питомої радіоактивності міченого фрагмента. Для підвищення точності методу проводять калібрувальні експерименти, в яких до препаратів геномної ДНК додають відомі кількості немічених клонованого фрагмента. В експерименті кількість гібрідізовавшегося радіоактивного фрагмента при насиченні еквівалентно двом копій гена на гаплоїдний геном. Щоб спростити експеримент, препарати денатурованою геномної ДНК фіксують у вигляді плям на нітроцелюлози фільтрі. У вдосконаленому варіанті спочатку визначають насичуючу концентрацію радіоактивного зонда, а потім інкубують зонд з різною кількістю геномної ДНК, фіксованою на нітроцелюлози фільтрі.

Зміна клонованих сегментів: отримання мутантів

а. Загальні положення
В основі класичного генетичного аналізу лежить отримання випадкових мутацій, що викликають успадковані фенотипічні зміни. Розробка нових молекулярно-генетичних методів призвела до створення так званої зворотної генетики. У охарактеризовані клоновані гени вносять специфічні мутації і потім встановлюють кореляцію між змінами в певних ділянках цих генів і зміною фенотипу чи локалізують регуляторні елементи. Наприклад, якщо в кодує частину гена внести мутації, то на ньому буде синтезуватися модифікований поліпептид. Це дозволяє вивчати вплив амінокислотної послідовності білка на його кон-формацію чи ферментативну активність. Аналогічно нуклеотидна заміна в передбачуваному регуляторному ділянці може привести до пригнічення або стимуляції транскрипції, що підтвердить припущення про функціональну роль даної ділянки.
Існують різні способи внесення мутацій в клоновані фрагменти або невеликі геноми, але ми розглянемо лише деякі з них. У всіх випадках успіх залежить від двох умов. По-перше, повинна бути добре відома структура початкової ДНК. Як мінімум, необхідно знати докладну карту сайтів рестрикції, але ще краще, якщо відома вся послідовність досліджуваного фрагмента. По-друге, оскільки всі методи дають якусь суміш продуктів, потрібний елемент слід очистити з допомогою клонування, ампліфікувати і охарактеризувати. При деяких типах мутагенезу мутації утворюються у випадкових місцях, при інших - в певних сайтах; про останні говорять як про сайт-специфічних мутаціях.
б. Делеційного мутанти
Використання рестріктірующіх ендонуклеаз. Внести делеції в певну ділянку можна в тому випадку, якщо клонований фрагмент ДНК містить два близько розташованих унікальних сайту рестрикції в нас цікавить області. Після ендонуклеазною розщеплення фрагмента утворюються "хвости" отщепляют за допомогою специфічної до одноланцюговим ділянкам нуклеази і тупі кінці знову зшивають. Однак настільки простий підхід можна застосовувати лише в рідкісних випадках. Найчастіше використовують інший метод, при якому делеція створюють в околиці одного унікального сайту рестрикції. Після ендонуклеазною розрізання фрагмента сусідні нуклеотиди видаляють за допомогою ендонуклеази Bal 31 або будь-якої екзонуклеазами, наприклад ехоШ E. coli, спільно з нуклеаз S1. При подальшому лигирование утворюється сімейство молекул з делеції, розташованими навколо вихідний ендонуклеазною сайту. Делеційного мутанти очищають за допомогою молекулярного клонування. В одному з варіантів цього методу перед освітою кільцевої молекули до кінців приєднують рестріктазние Лінкер. При цьому в молекулу вводяться ендонуклеазною сайти, які можуть виявитися корисними для дослідження її властивостей, секвенування і подальшого моделювання.
За допомогою більш складних маніпуляцій може бути отриманий цілий набір делецій різної довжини, що беруть початок від одного вихідного сайту. Для цього рекомбіновану молекулу обробляють двома способами. З однієї її частини видаляють за допомогою двох рестріктірующіх ендонуклеаз великий сегмент, що включає мішень для делецій. Другу частину лінеарізуют за допомогою одного з двох ферментів і потім обробляють ферментом Bal 31. Далі в результаті розрізання другий ферментом отримують набір фрагментів зменшується довжини. Лігированіє цих фрагментів до частини А і подальше клонування дає набір молекул з делеції, що починаються в сайті RE1.
Використання неспецифічних ендонуклеаз. У сверхспіральние кільцеві молекули можуть бути внесені поодинокі розриви з допомогою неспецифічних ендонуклеаз, наприклад ДНКази I. При цьому утворюється цілий набір лінійних молекул з розривами в різних сайтах. Після внесення розриву та розширення делетірованной області здійснюють лігування за допомогою методів, описаних раніше для усунення ендонуклеазною розривів. При такому підході використовують деякі цікаві властивості ДНКази I: у присутності Мп ² + цей фермент розщеплює відразу обидві ланцюга дуплексної ДНК, а в присутності Mg ² + гідролізує за один раз тільки один ланцюг, в результаті чого в ДНК з'являються одноланцюгові прогалини. Крім того, фермент розщеплює сверхспіральную ДНК швидше, ніж лінійну дуплексну, внаслідок локальної невпорядкованості ДНК в сверхспіральном стані. Тому після нетривалої обробки сверхспіральной ДНК ДНКазой I у присутності Mg ² + утворюються в основному повнорозмірні лінійні дуплексні молекули. Обробка їх за допомогою Bal 31 або екзонуклеазами, а потім 81-нуклеази розширює утворився раніше пробіл. Після лігування окремі продукти можна отримати за допомогою молекулярного клонування.
в. Інсерційного мутанти
Принципи конструювання но інсерційні мутантів подібні до описаних вище для делеційного мутантів. Клонований сегмент ДНК розщеплюють по одному з сайтів з допомогою рестріктірующей ендонуклеази або неспецифічної ендонуклеази. При необхідності заповнюють прогалини на кінцях утворилася лінійної молекули або отщепляют одноланцюгові "хвости" за допомогою нуклеази і здійснюють лігування у присутності сегмента, який хочуть вмонтувати в молекулу. У якості вставки може використовуватися синтетичний фрагмент, що містить безліч сайтів для рестрикційних ендонуклеаз, - так званий полілінкер. Якщо перше розщеплення було неспецифічним, то поява нових сайтів рестрикції в наборі клонованих мутантів допоможе побудувати фізичну карту мутацій.
р. Точкові мутації
Хімічний мутагенез. Для отримання точкових мутацій у певній ділянці молекули найчастіше використовують дуплексний кільцеву ДНК, що містить короткий одноланцюговий ділянку. Один із способів створення таких сайт-специфічних прогалин полягає в обробці сверхспіральной ДНК відповідної рестріктірующей ендонуклеаз у присутності бромистого етидію, який вбудовується між площинами пар основ і вносить порушення в структуру дуплексу. При цих умовах багато рестріктірующіе ендонуклеази розрізають тільки один з ланцюжків у відповідних сайтах. Мабуть, при вбудовуванні бромистого етидію у звичайну дуплексну молекулу ДНК розрізання взагалі не відбувається, а в сверхспіральной молекулі розрізається тільки один ланцюг. Не всі рестріктірующіе ендонуклеази ведуть себе подібним чином, але все ж таки кількість їх досить велике. Після розрізання молекули за допомогою екзонуклеазами в дуплексної молекулі створюють невеликий одноланцюговий прогалину в місці розрізу. Альтернативний спосіб отримання дуплексного молекули з пропуском полягає у використанні векторної системи на основі фага М13. Для цього створюють одноланцюговий М13-рекомбінантів, який містить потрібний сегмент, а також іншої, дволанцюжкової, рекомбінантів, що містить такий же сегмент, але з ділок. Цей дволанцюжкової рекомбінантів денатурують і реассоцііруют з одноланцюговим, в результаті чого утворюється гетеродуплекс з пропуском.
Якщо ДНК, що містить одноланцюговий пробіл, обробити бісульфіта натрію, то в одноланцюгових ділянці відбудеться дезамінування залишків цитозину з утворенням урацилу, тобто дезамініруются тільки певні залишки цитозину. Якщо пробіл невеликий, а число дезамінірованних залишків цитозину обмежене завдяки малому часу реакції і низької концентрації бісульфіта, то виникає дуже невелике число специфічних мутацій. Далі пробіл заповнюють за допомогою ДНК-полімерази і здійснюють лігування. Замість вихідних С "С-пар в молекулі ДНК тепер містяться пари і" А, які після реплікації перетворюються в Т "А-пари.
Мутагенний копіювання. Специфічні мутації іншого типу можна отримати, якщо при заповненні пропусків замість нормального дезоксирибонуклеозидтрифосфата використовувати його мутагенний аналог. ДНК-полімераза I здатна використовувати в якості субстратів різні аналоги звичайних дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Деякі з них є мутагенами. Наприклад,] М ^{6-гідро-ксідезоксіцітідін-5} '-трифосфат може включатися в синтезируемую ланцюг в положення, відповідне А або G в матричній ланцюга в залежності від того, чи перебуває він у імін або амінної формі відповідно. Якщо пробіл в дуплексної ДНК заповнюється за допомогою HO-dCTP замість dTTP, то навпроти А буде знаходитися HO-dC. Після трансфекції і реплікації поряд з нормальними формами будуть виявлятися мутантні геноми з транзицію Т • А - "З • G. Провівши відбір, ці мутанти можна клонувати. Аналогічно заміщення dCTP на HO-dCTP призводить до транзицію З • G -> Т • А.
Сайт-специфічний мутагенез із застосуванням синтетичних олігодезоксінуклеотідов. Олігодезоксінуклеотіди можна синтезувати у великих кількостях, що дозволяє розробити досить універсальні методи отримання сайт-специфічних точкових мутацій в клонованих сегментах ДНК. В основі одного з таких методів лежить освіту гетеродуплекса між одноланцюговим синтетичним олігодезоксирибонуклеотиди, що містить мутантних послідовність, та комплементарної одноланцюжковою рекомбінантної векторної ДНК, що несе відповідний сегмент дикого типу. Для цього ген, у якому ми хочемо отримати мутацію, клонують, наприклад, в Фаге М13 і отримують одноланцюжкову кільцеву рекомбіновану вірусну ДНК. Потім з цією кільцевою молекулою отжигают синтетичний олігодезоксирибонуклеотиди довжиною від 8 до 20 нуклеотидів, що містить мутантних послідовність. Цей олігодезоксирибонуклеотиди виконує роль праймера, а залишився одноланцюговим ділянка-роль матриці при синтезі ДНК in vitro за допомогою ДНК-полімерази I. Після копіювання всієї кільцевої молекули початок і кінець нового ланцюга з'єднують лігази. Новоутворена дуплексний молекула містить неспарені заснування в мутантної послідовності. Цікаво, що фагової потомство, що вийшло з однієї інфікованої клітини, сегрегуються як змішана популяція фагів дикого типу і мутантних рекомбінантів, які можна розділити при подальшому клонуванні.
При другому підході, так званому касетному мутагенезі, ділянка клонованої ДНК дикого типу заміщають синтетичним дуплексним олігодезоксирибонуклеотиди, що містить мутантних послідовність. У наведеному прикладі клонована вставка вбудована в дуплексний вектор типу pBR322. У найпростішому випадку для вирізання ділянки, в який ми хочемо внести мутацію, використовують унікальні рестрикційний сайти, що зустрічаються у вставці, але не у векторі. Якщо такі сайти відсутні, доводиться вдаватися до додаткових хитрувань. Дуплексний олігонуклеотиди отримують шляхом відпалу двох синтетичних комплементарних ланцюгів, кожна з яких містить відповідну заміну підстави. Крім того, ці ланцюги синтезують таким чином, щоб дуплекс, який вони утворюють, мав відповідні липкі кінці. На відміну від гетеродуплексного методу, при трансфекції і клонуванні зміненого рекомбінантів геномів дикого типу не утворюється. Однак якщо використовують суміш синтетичних олігодезоксирибонуклеотидів, що містять альтернативні заснування в мутантних ділянках, то суміш мутантів сегрегуються після трансфекції і її можна розділити з допомогою подальшого клонування. Такий підхід виявляється корисним, якщо необхідно отримати різні мутації в одному експерименті. Нагадаємо, що синтез таких змішаних олігодезоксирибонуклеотидів здійснюється простим використанням на потрібній стадії хімічного синтезу не одного мононуклеотид, а їх суміші.

Вивчення функцій клонованих сегментів ДНК

Нерідко клонування певних сегментів геномної ДНК, або кДНК, здійснюють з метою з'ясування функцій їх внутрішньоклітинних двійників.
Виходячи з результатів структурного аналізу клонованих послідовностей, що вказують на присутність у них відкритих рамок зчитування, можна припустити, що вони містять гени. Часто вдається виявити специфічні промоторні послідовності та інші регуляторні елементи. Однак, щоб підтвердити ці дані, необхідно провести прямі функціональні дослідження. При цьому потрібно відповісти на наступні питання:
1. Транскрибується дана послідовність лише в одному або декількох типах клітин?
2. Чи є транскрипту молекули мРНК?
3. Чи впливають на транскрипцію зміни, що відбуваються в клітині?
4. Чи містить клонований сегмент промотори, термінатори або інші регуляторні сигнали, і якщо так, то як вони працюють?
5. Який зв'язок між структурою клонованого сегмента і структурою внутрішньоклітинних транскриптів?
6. Чи можуть транскрипти транслюватиметься в поліпептид? Для відповіді на всі ці питання використовують різні експериментальні підходи в залежності від того, яка саме система аналізується.
а. Характеристика внутрішньоклітинних транскриптів, відповідних клонованим сегментами ДНК
Говорячи про будь-якому клонованій сегменті геному, нам перш за все необхідно відповісти на питання, пов'язані з його транскрипцією in vivo. Дуже важливими є також дані про структурний подібність між клонованої кДНК і внутрішньоклітинними родинними транскрипт. В основі відповідних досліджень лежать три методи: РНК-блот, аналіз з використанням специфічних до одноланцюговим ДНК нуклеаз і копіювання РНК, виділеної з клітин, за допомогою зворотної транскриптази. Всі методи включають попереднє виділення і очищення РНК з цілих клітин або специфічних внутрішньоклітинних органел, таких, як ядро ​​або цитоплазма. Результативність всіх методів залежить від здатності РНК утворювати гетеродуплекси з комплементарною клонованої ДНК.
РНК-блот. Блот РНК аналогічний блотів ДНК. Він полягає в наступному. Виділену РНК поділяють за розмірами з допомогою електрофорезу в агарозному гелі. Зазвичай електрофорез проводять в умовах, що сприяють денатурації РНК, щоб звести до мінімуму вплив вторинної структури молекули на її електрофоретична рухливість. Лужні умови для цієї мети не підходять через лабільності фосфодіефірних зв'язків в молекулі РНК в цих умовах. Тому використовують такі агенти, як гліоксаль, формальдегід або сечовину. Потім РНК переносять на іммобілізованих підкладку, намагаючись зберегти розподіл молекул РНК. Далі використовують мічену ДНК як зонд для виявлення на фільтрі відповідних молекул РНК. Фільтр інкубують з ДНК в умовах, що сприяють гібридизації. Промивши фільтр для видалення надлишкової ДНК, за допомогою радіоавтографіі встановлюють положення зонда, а отже, і становище гомологічною РНК в тому гелі, в якому проводився електрофорез. Таким способом виявляють продукти транскрипції клонованого сегмента ДНК. Якщо на паралельній доріжці цього ж гелю одночасно провести розділення суміші РНК або молекул одноланцюжковою ДНК відомого розміру, то можна оцінити розмір транскриптів. Крім того, РНК-блот дозволяє оцінити кількість РНК, синтезованої в клітинах, з яких вона отримана. Метод оцінки аналогічний використовуваному при визначенні числа копій ДНК на нітроцелюлозних фільтрах. Щільність смуги на рентгенівській плівці пропорційна кількості присутньої гомологічною РНК. Як і раніше, бажано, щоб мічений зонд був одноланцюговим, оскільки він не повинен реассоцііровать з комплементарною ланцюгом ДНК замість РНК.
За допомогою всіх цих досить простих методів можна отримати велику інформацію про функціональні властивості клонованого сегмента ДНК. Сюди відносяться не тільки дані про здатність до транскрибированию, але й оцінка числа траскріптов і її залежність від типу клітин або позаклітинної середовища. Аналізуючи РНК з очищених клітинних компонентів, можна встановити, де локалізуються різні транскрипти - в ядрі, цитоплазмі або полісомах. Часто дуже важливим є питання про Поліаденілювання гомологічною РНК, оскільки Поліаденілювання є характерною ознакою більшості еукаріотичних мРНК. Розділити поліаденільованим і неполіаденілірованную] РНК не складає труднощів, оскільки поліаденіт-рованная РНК злучається при відповідних умовах з poly або poly. Самі полімери зазвичай фіксують на інертної твердій основі, що спрощує відділення незв'язаної poly-PHK. Фракцію poly-PHK елюіруют при денатуруючих умовах. Потім РНК з кожної фракції піддають електрофорез, блотів і
тестування на здатність гібрідізоваться з клонованої ДНК. Якщо РНК, ідентифікована за допомогою клонованої ДНК, виділена з цитоплазми і поліаденільованим, то швидше за все вона представляє собою мРНК. Ідентифікація стає більш надійною, якщо, крім того, РНК пов'язана з полісомах.
Ще однією характеристикою мРНК, гібрідізовавшіхся з клонованою сегментом ДНК, є їх розмір. Іноді РНК має більший розмір, ніж клонований сегмент; це означає, що в клоні представлена ​​лише частина гена. В інших випадках РНК виявляється коротше клонованого сегмента, що свідчить про наявність у клонованої послідовності додаткових послідовностей, не представлених у транскрипт. Це можуть бути геномні послідовності, фланкирующие транскрипційного область, або не-кодують послідовності, переривають кодує область і зазнають сплайсингу під час дозрівання мРНК. Всі ці взаємини між клонованим сегментом ДНК і гомологічною клітинної РНК можна встановити більш точно, використовуючи специфічні до одноланцюговим ДНК нуклеази або здійснюючи зворотну транскрипцію.
Дослідження спорідненості між клонованим сегментом ДНК і внутрішньоклітинної РНК за допомогою ДНК-РНК-гібридизації та специфічних до одноланцюговим ДНК нуклеаз. Експеримент включає три етапи. На першому клонований фрагмент ДНК мітять радіоактивним ізотопом і денатурують. Можна також використовувати одноланцюжкову ДНК. На другому етапі ДНК гибрідизуючою з виділеною клітинної РНК в розчині в умовах, сприятливих для утворення ДНК-РНК-гібридів. Будь-які послідовності ДНК, присутні в клонованій фрагменті, але не представлені в РНК, залишаються одноланцюжковий. Їх видаляють за допомогою нуклеази, специфічною до одноланцюжковою ДНК. І нарешті, гібридні молекули денатурують і піддають гель-електрофорез. Розмір утворюється радіоактивної ДНК визначають за допомогою радіавтографіі, порівнюючи становище досліджуваної ДНК з положенням молекул ДНК відомого розміру.
Цей основний експеримент можна проводити в багатьох різних варіантах, кожен з яких дозволяє виявити свої особливості структури РНК в залежності від того, яка саме Нуклеази використовується, чи є РНК сумарною або очищеної цитоплазматичної ро1у-мРНК. Один з таких варіантів, де в ДНК є один протяжна ділянка, комплементарний РНК, і не спарені тільки кінці молекули. Метод дозволяє також виявити будь-яку область, де відсутня комплементарність між РНК і ДНК. У багатьох експериментах такого роду використовується специфічна до одноланцюжковою ДНК ендонуклеаза S1, тому метод називають картуванням.
81-картування часто використовують для встановлення відповідності між початком молекули РНК і специфічним сайтом у клонованій сегменті ДНК. У багатьох випадках цей сайт представляє собою сайт ініціації транскрипції. Точність експерименту значно підвищується, якщо використовується невеликий ДНК-зонд, що дозволяє виміряти довжину захищеного сегмента ДНК з точністю до одного нуклеотиду. Для отримання такого зонда зазвичай субклоніруют строго певні ділянки довгого фрагмента ДНК. Розмір захищеного фрагмента ДНК визначають за допомогою електрофорезу в таких же гелях, що і при визначенні нуклеотидної послідовності.
Подовження праймера: дослідження спорідненості між внутрішньоклітинної РНК і клонованим фрагментом ДНК за допомогою зворотної транскриптази. Для проведення цього експерименту необхідний відносно короткий ДНК-зонд, який гибрідизуючою з ділянкою РНК, бажано знаходяться на відстані не більше 100 пар основ від передбачуваного 5'-кінця РНК. ДНК-зонд отжигают з РНК, і він грає роль праймера при зворотної транскрипції, а матрицею служить РНК. Оскільки зворотна транскриптаза припиняє копіювання, коли досягає 5'-кінця РНК, розмір продукту дозволяє встановити, де починається РНК. Зазвичай праймер буває радіоактивно міченим, що дозволяє легко визначити положення продукту в гелі. Оскільки ДНК-зонд специфічний лише до конкретної РНК, досліджуваний препарат може являти собою суміш різних РНК.
б. Функціональне тестування клонованої ДНК
Клоновані сегменти ДНК можна транскрибувати і транслювати в еукаріотичних системах або in vitro з використанням клітинних екстрактів або очищених ферментів, або in vivo після введення клонованого сегмента в клітку.
Системи in vitro. Для приготування безклітинних екстрактів, що містять РНК-полімерази I, II і III, зазвичай використовують різноманітні еукаріотичні клітини. В аналізованому сегменті повинні бути присутніми послідовності, відповідальні за регуляцію транскрипції; необхідні також допоміжні білки, що стимулюють транскрипцію. При фракціонуванні таких екстрактів отримують очищені або частково очищені полімерази і фактори, за допомогою яких можна детально вивчити механізми транскрипції. Для здійснення трансляції мРНК з утворенням відповідних поліпептидів використовують інші типи клітинних екстрактів.
Системи in vivo. Для вивчення функцій клонованого сегмента ДНК краще всього використовувати цілі клітини, оскільки це дозволяє стежити як за процесом транскрипції, так і за процесом трансляції. Найбільш вивченою біологічної тест-системою є ооцити жаби. Ооцити - це великі клітини обсягом до 1 мкл, які можна багаторазово отримувати від однієї жаби. ДНК ін'еціруют безпосередньо в ядро, при цьому зазвичай досить 5 нг препарату. ДНК у комплексі з гістонами ооцита упаковується з утворенням хроматину, далі здійснюються її транскрипція і трансляція, і протягом кількох годин можна ідентифікувати продукти експресії генів - мРНК і поліпептиди. Для проведення експерименту часто виявляється досить тієї кількості РНК і поліпептидів, яке синтезується одним ооцитом. У багатьох відносинах експресія ін'єктовані клонованих генів в ооцитах протікає нормально. Вихідні ядерні транскрипти генів РНК-полімераз II і III піддаються процесингу, а зрілі мРНК і тРНК переходять в цитоплазму.
Рекомбінантні ДНК можуть бути введені і в еукаріотичні клітини в культурі. Молекули можна ін'єктувати безпосередньо в окремі клітини, проте простіше вводити клоновані молекули у велику популяцію клітин одночасно. При цьому використовується методика трансфекції у зв'язку з клонуванням в еукаріотичних клітинах. Принаймні частина молекул, введених таким способом, досягає ядер.

Синтез поліпептидів, кодованих клонованими сегментами еукаріотичної ДНК

У попередніх розділах ми вже не раз зупинялися на синтезі in vitro та in vivo поліпептидів, кодованих вставками у рекомбінантних векторах. Скринінг за фенотипом залежить від експресії даного нас гена в клітинах господаря. Відбір потрібних клонів такими методами, як HART і гібридізаційного селекція, здійснюється за допомогою трансляції in vitro, а функціональний аналіз клонованого сегменту після введення його в вихідну клітку грунтується на вивченні як транскрипції, так і трансляції. Мета багатьох експериментів з клонування полягає в синтезі потрібного поліпептиду, а іноді - в отриманні його в кількостях, достатніх для проведення фенотипического аналізу. У ряді випадків мета клонування полягає в отриманні антитіл. У цьому розділі ми опишемо деякі системи господар-вектор, спеціально створені для продукції потрібного білка.
Синтез білків, призначених для проведення тих чи інших досліджень або для застосування в медицині та промисловості, - це одна з найперших завдань, які ставилися при розробці технології рекомбінантних ДНК. В даний час ряд надходять у продаж ферментів, використовуваних для конструювання рекомбінантних молекул ДНК, у свою чергу синтезуються під контролем генів, клонованих в плазмідних векторах E. coli. Методи, що використовуються при цьому препарати мають високий ступінь очищення, відносно недорогі і включають ДНК-полімеразу I, ДНК-лігази E. coli, зворотну транскриптазу. Інші білки і їх мутантні форми, отримані після сайт-специфічного мутагенезу відповідних клонованих генів, використовують для встановлення зв'язку між структурою білка і його функцією. До них відносяться алкогольдегідрогеназа, по-лактамаза, цитохром с - і тирозил-тРНК-синтетази. За допомогою методів клонування були синтезовані важливі в клінічному відношенні білки, які важко було отримати в інший спосіб. Сюди відносяться інтерферони, інсулін і гормон росту людини. Були синтезовані білки, що кодуються деякими вірусами тварин і найпростішими. Вони використовувалися як антигенів у деяких вакцинах.
а. Вибір системи експресії
Для експресії вже клонованого гена вибір господаря має таке ж важливе значення, як і при самому клонуванні. Найбільш відповідними господарями для отримання білка часто виявляються клітини E. coli, оскільки з ними просто маніпулювати і їх легко вирощувати у великих обсягах. Після відкриття інтронів, що переривають кодують ділянки багатьох еукаріотичних генів, для використання в експресують векторах частіше стали застосовувати клоновані кДНК, а не самі гени. Однак при синтезі активних форм певних еукаріотичних білків в клітинах E. coli виникає ряд проблем. Так, первинні продукти трансляції деяких еукаріотичних генів повинні піддатися специфічним посттрансляційним модифікаціям, перш ніж утворюються функціональні молекули. Зазвичай ці модифікації полягають у протеолизе, фосфорилюванні, ацетилювання та глікозилювання. Ферменти, що каталізують ці реакції в клітинах Е. coli, зазвичай відсутні. Почасти для вирішення цієї проблеми були розроблені ефективні еукаріотичні системи експресії. У тварин системах господар-вектор в якості кодують послідовностей не обов'язково використовувати кДНК, оскільки ці клітини здатні видаляти інтрони.

Вектори, призначені для ефективної транскрипції і трансляції клонованого сегмента, містять елементи, що підвищують ефективність реплікації вектора і експресії відповідних генів. Реплікація як така для експресії генів не потрібно, але, забезпечуючи утворення великої кількості матриць для транскрипції, вона підвищує вміст мРНК і поліпептидів в клітці. Таким чином, експресують вектори зазвичай містять точку початку реплікації і кодують деякі інші функції, необхідні для ефективної внутрішньоклітинної реплікації і забезпечуються хазяйськими клітинами. Транскрипція залежить від наявності у векторі промотора, який відповідає присутньої в клітинах РНК-полімеразі, тобто промотора E. coli для експресії в клітинах бактерій і промотора, використовуваного РНК-полімеразою II, для експресії в еукаріотичних клітинах. Цей промотор повинен бути розташований у векторі таким чином, щоб клонована ген міг вбудуватися в правильній орієнтації і за промотором по ходу транскрипції. Еукаріотичні експресують вектори повинні також мати сайт для розщеплення і Поліаденілювання транскрипту-попередника функціональної мРНК. Для точної трансляції на початку кодує області повинен знаходитися кодон ATG, а наприкінці - один зі стоп-кодонів. Останній зазвичай міститься в клонованій сегменті, але стартовий кодон часто відсутня у вставці кДНК, тому його функції повинен виконувати вектор. Для трансляції в Є. coli на 5'-кінці на відстані приблизно 10 нуклеотидів від ініціюючого кодону повинен знаходитися сайт зв'язування з рибосомою, послідовність Шайна-Дальгарно.
У експресують вектори часто бувають включені додаткові елементи. Зазвичай вони призначені для збільшення виходу поліпептидів або для спрощення процедури очищення потрібного білка від інших клітинних білків. Одним з основних факторів, відповідальних за зменшення виходу, є нестабільність багатьох білків в чужорідному клітинної середовищі.
Щоб домогтися експресії гена, зазвичай кожного разу доводиться вирішувати унікальну експериментальну задачу. Тому багато екс-прессірующіе вектори, хоча і володіють деякими загальними властивостями, мають свої особливості. Нижче ми розглянемо системи, в яких використовуються оригінальні експресують вектори, призначені для конкретних цілей.
б. Експресують вектори, використовувані в E. coli
Вектори, сконструйовані для здійснення ефективного білкового синтезу в E. coli, звичайно відбуваються від pBR322 або інший висококопійной плазміди; це необхідно для отримання максимального числа матриць для транскрипції.
Промотори. Більшість векторів, призначених для вивчення експресії генів, містять один із сильних промоторів, описаних в разд.3.11: Лас-промотор з відповідним оператором, trp-промотор і оператор, а також Р _{ь-промотор} бактеріофага X. Зазвичай використовують мутантний промотор, званий UV5, оскільки це дозволяє здійснювати транскрипцію з більшою швидкістю, ніж у випадку промотора дикого типу, а крім того, активність зберігається навіть за відсутності позитивного ефектора САР-сАМР. Інший часто використовуваний промотор, lac, являє собою синтетичну конструкцію: його - 35-послідовність являє собою - 35-послідовність trp-промотора, а блок Прібнова - відповідну послідовність промотора UV5. Таким чином, 1ас-промотор ідентичний оптимальному промотора E. coli, структура якого була визначена виходячи з даних, отриманих при порівнянні послідовностей багатьох природних промоторів. Як і очікувалося, він виявився досить ефективним.
Крім такого гідності, як ефективність, ці чотири промотора володіють ще одним цінним властивістю: вони дозволяють здійснювати часовий контроль ініціації транскрипції, оскільки пов'язані з регуляторними елементами. Це дуже важливо, оскільки накопичення великих кількостей чужорідного для E. coli білка може пригнічувати ріст клітин і тим самим обмежувати кінцевий вихід білка. Втім, якщо клітини вдається виростити до високої щільності, а потім індукувати до оптимальної експресії клонованого гена, то часто можна досягти оптимального виходу білка. Якщо білок, який передбачається синтезувати, нестабільний в клітинах Е. coli, то молекули, синтезовані на початку циклу зростання, ймовірно, деградують до часу досягнення культурою високої щільності. Тому має сенс відстрочити експресію до того моменту, коли щільність культури підвищиться досить сильно. Якщо використовуються вектори, у яких експресія клонованого гена залежить від цих промоторів, то кількість потрібного білка звичайно становить від 1 до 10% рівня сумарного білка в клітинному екстракті.
Експресують вектор з lac-промотором. Плазмідні вектори, що містять промотор lac UV5, часто містять також послідовність Шайна-Дальгарно ас-оперону і кодують послідовності на в-галактозидази. Оскільки експресія, що ініціюється на ділянці з ас-оператором-промотором, знаходиться під контролем ас-оперону, транскрипцію можна ініціювати за допомогою індуктора ізопропіл-в-В-тіогалактозіда. У наведеному прикладі замість восьмого кодону в-галактозидазної гена вбудований полілінкер, що порушує кодує рамку. Клітини E. coli, що несуть такий вектор, не здатні синтезувати активну по-галактозидазу. Дві частини рамки зчитування можна поєднати, якщо в один з рестріктазних сайтів полілінкера вбудувати фрагмент з певною рамкою зчитування. У цьому випадку трансляція мРНК може ініціюватися на початку кодує ділянки в-галактозидазної гена, проходити через вставку і решту частини кодує ділянки цього гена і закінчуватися на звичайному стоп-кодоні. У результаті клітини, що містять плазміду з такою вставкою, будуть продукувати активну по-галактозидазу, оскільки перші вісім амінокислот молекули несуттєві для активності ферменту і чужорідні амінокислоти не будуть впливати на неї. Гібридний поліпептид можна очистити, при цьому показником ступеня очищення буде служити питома активність в-галактозидази. У деяких випадках гібридний білок можна розщепити і видалити протяжну карбоксильну по-галактозидазною частину. Однак і самі гібридні білки знаходять застосування: з їх допомогою отримують антитіла до чужорідного білку.
Експресують вектор з trp-промотором. У векторі, перед полілінкером знаходяться trp-промотор, оператор, послідовність Шайна-Дальгарно, аттенуатор, а також приблизно 300 кодонів гена trp E. Транскрипцію можна контролювати, помістивши містять плазміду клітини Є. coli, вирощені до високої щільності, в середу без триптофану і додавши потім 3-в-індолілакріловую кислоту. Остання конкурує з рештою триптофаном за зв'язування з trp-репрессором, однак утворює неактивний комплекс, в результаті чого відбувається дерепресія промотора. Як і у випадку з вектором, що містить Лас-промотор, при вбудовуванні чужорідного гена в рамку зчитування на одному з сайтів рестрикції в полілінкере синтезується гібридний білок. Трансляція зупиняється, дійшовши до випадкового стоп-кодону вектора.
У випадку вставка кодує обернену транскриптазу ретровірусу. Після трансфекції і дерепрессии в клітинах E. coli синтезується ферментативно активний гібридний білок. Для підвищення стабільності зворотної транскриптази більшу частину надлишкових послідовностей гена trpE делетіруют за допомогою деяких маніпуляцій і переклонірованія. Кілька амінокислот trpE, що залишаються на N-кінці утворився поліпептиду, слабо впливають на активність зворотної транскриптази.
Експресують вектор, який використовує P _{L-npo-мотор} бактеріофага X. Вектор дозволяє синтезувати еукаріотичні білки, не зливаються з чужорідним полипептидом. Транскрипція з цього промотору пригнічується X-репрессором, який утворюється профагом, присутніх в клітині-хазяїні. Застосування клітин, лізогенізірованних фагом, який кодує чутливий до нагрівання репрессор, дозволяє індукувати експресію гена шляхом переносу клітин, вирощених при 30 ° С, в середу з температурою 42 ° С. Крім промотора вектор містить частину послідовності Шайна-Дальгарно гена cII фага X. Між промотором і цією послідовністю перебуває група регуляторних елементів фагової ДНК, які функціонують в цис-положенні, послаблюючи транскрипційних полярність. Ці послідовності з антіполярним ефектом функціонують при наявності продукту гена N фага X, що поставляється лізогенізірованнимі хазяйськими клітинами, які зазвичай використовуються з вектором цього типу. У такому векторі сегмент, що містить зв'язується з рибосомою ділянку Ш-Д-послідовності, включає також кодон ATG cII-гена фага X. Більш того, ATG перекриває BamHI-сайт, успадкований від плазміди pBR322. Еукаріотичні кодують ділянки вбудовують в BamHI-сайт різними способами, які залежать від кодуючої послідовності. Дуже важливим моментом є вбудовування кодує послідовності таким чином, щоб вона перебувала в рамці з ATG. Таким чином, вектор поставляє всі регуляторні елементи, необхідні для транскрипції і трансляції, за винятком стоп-кодону, який зазвичай знаходиться в межах клонованих еукаріотичних кДНК.
в. Експресують вектори, що використовуються в клітинах дріжджів
Найбільш ефективні у відношенні експресії генів дріжджові вектори сконструйовані на основі 2 мкм-кільцевої плазміди дріжджів. Ця плазміда забезпечує утворення в дріжджових клітинах великої кількості копій рекомбінантної ДНК до тих пір, поки сегмент REP3 знаходиться в цис-положенні, а функціональні гени REP1 і REP2 - або в цис-, або в транс-положенні. Застосовуються кілька різних регульованих дріжджових промоторів; у прикладі це промотор гена CYC1, що кодує день-1-цитохром с. Цей промотор і пов'язані з ним регуляторні сигнали становлять область розміром у кілька сотень пар основ, що типово для подібних складних еукаріотичних областей, в яких транскрипція регулюється за допомогою РНК-полімерази II. Сегменти ДНК, трансляцію яких ми хочемо здійснити, вбудовують в рамку зчитування в сайті. У цьому випадку вони безпосередньо прилягають до ініціювання кодону ATG гена CYC1. Сайт Поліаденілювання у векторі відсутній, але зазвичай кДНК містять такий сайт, який розташований за стоп-кодоном трансляції.
р. експресують вектори, що використовуються в клітинах тварин
Для експресії клонованих генів в клітинах тварин були сконструйовані два типи векторів; в основі одного з них лежить геном SV40, а іншого - геном папіломавірусу великої рогатої худоби. Основні властивості цих двох систем вірусних векторів описані в розд. 5.7. Вектори на основі папіломавірусів особливо корисні для синтезу великих кількостей білка, а вектори на основі SV40 використовуються у багатьох експериментах.
Типові вектори містять або весь геном BPV, або його частину, необхідну для стабільної трансформації хазяйських клітин, наприклад мишачих клітин у культурі. Такі вектори часто включають еукаріотичний ген разом з промотором, сигналом Поліаденілювання та іншими регуляторними областями. Між сайтом ініціації транскрипції і стартовим кодоном трансляції знаходиться зручний рестріктазний сайт. Коли в цей сайт вбудовується певна кодує послідовність, вона транскрибується з утворенням відповідної мРНК. Синтез цієї мРНК починається від стартового кодону транскрипції і закінчується на сигналі Поліаденілювання, що знаходиться у вставці або у векторній послідовності. Кодирующая послідовність повинна містити свій власний стартовий і стоп-кодони. Однією з переваг експресують векторів, створених на основі BPV, є те, що трансформовані ними клітини зберігаються в культурі протягом багатьох місяців. У результаті безперервного поділу клітин постійно синтезується потрібний білок. В одному з експериментів в BPV-вектор була вбудована попередньо клонована кодує частину гена поверхневого антигену вірусу гепатиту В. Трансформовані клітини секретуватися близько 10 мг антигену на 1 л культури за 24 год

Ферментативна ампліфікація сегментів ДНК і РНК

На зорі розвитку методів молекулярного клонування застосування альтернативних способів ампліфікації специфічних сегментів ДНК або РНК, присутніх у великих популяціях молекул, здавалося малоймовірним. Проте в даний час такий метод розроблений і широко використовується. Він отримав назву полімеразної ланцюгової реакції. З його допомогою можна отримувати мікрограми ДНК-копії сегментів ДНК або РНК, навіть коли вони присутні в препараті у вигляді єдиної молекули.
Вся полімеразна ланцюгова реакція здійснюється in vitro з використанням ДНК-полімерази і олігонуклеотидних праймерів, комплементарних двом 3'-кінців ділянок, що обмежують ампліфікується дуплексний сегмент. Таким чином, розробка ПЛР-методу стала можливою лише після того, як були створені методи швидкого і недорогого хімічного синтезу олігонуклеотидів. Для здійснення реакції необхідно знати нуклеотидну послідовність тієї ділянки, який ми хочемо ампліфікувати, щоб можна було синтезувати відповідні олігонуклеотидно праймери.
Полімеразна ланцюгова реакція. Для того щоб ампліфікувати якийсь сегмент ДНК, синтезують два олігонуклеотидних праймера, кожен з яких комплементарний одному з двох 3'-решт ділянок, що обмежують ампліфікується дуплексний сегмент. У ході ПЛР-реакції необхідно копіювати послідовність кожної з ланцюгів, що знаходиться між ділянками, з якими спаровуються олігонуклеотидно праймери. Після спарювання праймерів з денатурованою ДНК, що містить ампліфікується сегмент, здійснюють зустрічну подовження праймерів за допомогою ДНК-полімерази в присутності чотирьох дезоксинуклеозидтрифосфатов. Утворені дуплексні ДНК денатурують, знову спаривают з праймерами і проводять ДНК-полімеразну реакцію. Цей цикл може бути повторений приблизно 60 разів з подвоєнням у кожному циклі кількості дуплексного сегмента ДНК. За п циклів утворюється 2 "копій дуплексного сегмента, обмеженого праймерами.
Використовуючи теплостійких ДНК-полімеразу, виділену з термофільних бактерій Thermus aquaticus, можна здійснювати безліч ПЛР-циклів при одноразовому введенні ферменту. Спочатку змішують ДНК, надмірна кількість праймерних молекул, дезоксинуклеозидтрифосфаты і полімеразу. Цикл запускають, нагрів суміш до температури, що забезпечує денатурацію ДНК; потім охолоджують розчин до температури, необхідної для відпалу праймерів. Далі встановлюють температуру, при якій може відбуватися синтез ДНК. Весь процес, який триває кілька годин, можна автоматизувати, використовуючи нагрівачі, робота яких регулюється за допомогою комп'ютера.
Використання ДНК-полімерази Т. aquaticus не тільки дозволяє автоматизувати процес, але дає і інша перевага. Цей фермент найбільш активний у температурному інтервалі 70-75 ° С. За таких умов спаровування олігонуклеотидних праймерів і ДНК відбувається більш специфічно, ніж при 37 ° С - оптимальний температурі для ДНК-полімерази Є. coli. У результаті асоціація праймерів відбувається більш точно, що зводить до мінімуму ампліфікацію небажаних сегментів ДНК, особливо в присутності всієї геномної ДНК. Точність відпалу підвищується також при підборі оптимального температурного режиму, іонної сили, довжини праймера і його нуклеотидного складу. Специфічність може бути досить високою, щоб здійснювалася ампліфікація двох різних сегментів в одному і тому ж препараті ДНК в присутності двох пар праймерів.
РНК можна ампліфікувати з утворенням дуплексної ДНК аналогічним чином з тією лише різницею, що на початку першого циклу необхідно синтезувати кДНК-копію РНК. Якщо РНК представлена ​​молекулами мРНК, то роль одного з праймерів у ПЛР, а також в реакціях за участю зворотної транскриптази можуть виконувати короткі рогу-ланцюжка.
Різні варіанти полімеразної ланцюгової реакції. Як ми вже говорили, для проведення ПЛР необхідно знати нуклеотидні послідовності, фланкирующие ампліфікується сегмент. Це має на увазі, що ПЛР-метод може застосовуватися тільки при наявності попередньо клонованих і секвенувати сегментів ДНК. Однак за допомогою відносно простих модифікацій можна значно розширити можливості методу ПЛР. В одному з варіантів можна виділити певний ген, якщо відома амінокислотна послідовність лише короткого ділянки відповідного очищеного білка. Наприклад, синтезувавши праймери довжиною 20 пар нуклеотидів на підставі даних про послідовності двох кінців пептидного сегмента довжиною в 20 амінокислот, можна ампліфікувати геномний фрагмент довжиною 60 п. н. Внаслідок вирожденність генетичного коду при цьому використовують суміш праймерів з альтернативними підставами у потрібних положеннях. Після проведення ПЛР ампліфікованих сегмент з 60 п. н. очищають за допомогою гель-електрофорезу або клонування і використовують як зонд для ідентифікації цікавить нас послідовності при аналізі бібліотек геномної ДНК або кДНК.
Ще один приклад універсальності методу ПЛР дає використання його для ампліфікації повної кДНК-копії мРНК виходячи з даних послідовності одного невеликої ділянки або відповідного пептиду, або мРНК. Метод полягає в наступному. Сумарну мРНК копіюють з утворенням одноланцюжковою кДНК, використовуючи короткий рогу ^ Т) - праймер. Потім за допомогою термінальної трансферази до 3'-кінця кДНК приєднують "хвіст"; разд.4.8); використовуючи короткий рогу ^ С) - праймер, синтезують другий ланцюжок ДНК. До цього моменту ніякої специфічності відносно певної мРНК не проявляється. На наступному етапі використовують олігонуклеотидно праймер з такою ж послідовністю, як і у короткого ділянки поблизу 3'-кінця потрібної нам мРНК. З допомогою цього праймера і poly проводять ПЛР; специфічність виявляється досить високою для одержання практично чистого продукту, що представляє повнорозмірну мРНК.
В іншому варіанті в 5'-кінці праймерів включають послідовності, відповідні якому-небудь рестріктазному сайту. При відпалі з вихідною матрицею вони залишаються неспареними, але ампліфікується фрагмент набуває кінцеві рестріктазние сайти. Вони можуть виявитися корисними при подальшому клонуванні або включення у вектор для вивчення експресії.
Застосування ПЛР. Можливості методу ПЛР у всій повноті ще не розкриті, але з його допомогою вже вдалося отримати нові дані про структуру різних РНК, генів та геномів, а також про процеси, що протікають на геномном рівні. Одне з його дуже важливих застосувань полягає у визначенні характеру мутацій. Після того як ген клонований, за допомогою двох праймерів амплифицируют відповідний геномний сегмент, отриманий від різних особин даного виду. Секвенування цього сегмента дозволяє встановити природу мутації, що сталася в даному гені, або виявити поліморфізм, будь то заміна однієї пари підстав або делеція, інсерцій або перебудова. Завдяки простоті методу з його допомогою можна діагностувати генетичні захворювання і проводити популяційно-генетичні дослідження. Використовуючи праймери, які специфічно асоціюються з певними мутантними формами гена, можна також класифікувати мутації.
За допомогою зондів, комплементарних геномам таких інфекційних агентів, як віруси та бактерії, можуть бути ідентифіковані геноми цих агентів на тлі значного надлишку ДНК клітини-господаря. Зокрема, цілком реальною представляється діагностика СНІДу за допомогою цього методу. Ще одне його застосування полягає в аналізі структури продуктів реакцій рекомбінації.
Одним з цікавих і потенційно найбільш ефективних застосувань ПЛР є ампліфікація сегментів ДНК всередині окремих клітин. Такі досліди проводилися як на диплоїдних клітинах, так і на сперматозоїдах людини. Використання сперматозоїдів має особливе значення для генетичного аналізу видів, включаючи людину, які не можуть піддаватися експериментальному схрещування. Цей метод дозволяє оцінити частоту мейотичний рекомбінації безпосередньо у великих популяціях сперматозоїдів, якщо використовувати пару праймерів, специфічних у відношенні поліморфних чи мутантних форм зчеплених генів.