Виділення вивчення властивостей мікроорганізмів і їх використання для виконання підготовчих процесів

ДИПЛОМНА РОБОТА

"Виділення, вивчення властивостей мікроорганізмів і їх використання для виконання підготовчих процесів переробки овчинно-хутряної сировини"

Введення

У зв'язку з виробничою активністю збільшується антропогенний вплив на навколишнє середовище. Особливо гостро це питання стоїть в Байкальської регіоні, внаслідок цього потрібно кореляція економічної діяльності підприємств з передбачуваним рівнем техногенного впливу на навколишнє середовище. Зниження обсягів і токсичності стічних вод досягається або створенням сучасних методів очищення та утилізації, або вдосконаленням технології. Найбільш оптимальним є останній спосіб, який дозволяє при збереженні якісних параметрів продукції, що випускається значно знизити рівень токсичного забруднення. Це можна досягти не тільки зменшенням витрати використовуваних інгредієнтів в технологічних процесах, а й заміні високотоксичних речовин на менш токсичні.

Основними забруднювачами на підприємствах хутряної промисловості є синтетичні поверхнево-активні речовини (СПАР). Дані інгредієнти широко застосовуються для видалення жирових речовин з поверхні волосяного покриву. Стічні води, що містять СПАР, важко піддаються біодеструкції і, потрапляючи у водойми шкідливо впливають на біоценоз і можуть викликати загибель високоорганізованих організмів.

Рішення даної проблеми можливе через впровадження екологічно безпечних технологій, заснованих на біотехнологічних методах. Одним із способів, що дозволяють зберегти якість хутряного напівфабрикату при зниженні ступеня забруднення стічних вод, є проведення суміщеного мікробіологічного та емульсійного методів знежирення.

У зв'язку з цим, метою даної роботи було одержання концентрованого ферментного препарату, вивчення його властивостей і проведення на його основі процесу знежирення хутряної овчини.

1. Літературний огляд. Механізм впливу прокаріотичних мікроорганізмів на спав і ліпазу

Представники роду Pseudomonas настільки широко поширені в природі, що їх можна назвати всюдисущими. Таке поширення засновано на здатності засвоювати найрізноманітніші за своєю природою з'єднання і рости в різних екологічних умовах / 1 /.

Повсюдне поширення Pseudomonas в природі забезпечується здатністю цих мікроорганізмів рости в широких діапазонах температур, при високому гідростатичний тиск, витримувати повне зневоднення. Деякі з представників цього роду можуть перебувати в анаеробних умовах, інші здійснюють дихання в присутсвии ціаніду. Двоокис вуглецю в підвищених кількостях пригнічує ріст гетеротрофних псевдомонад, але служить джерелом вуглецю для автотрофних видів цього роду. Для зростання різних видів Pseudomonas можуть служити сами різні середовища, починаючи з дистильованої води до складних середовищ, що включають речовини жівотоного і рослинного походження та похідні нафти. Серед Pseudomonas знайдені види з високою осмофільностью і галофільних. Далеко не всі з відомих видів Pseudomonas докладно досліджені. Фізіолого-біохімічне вивчення багатьох видів Pseudomonas, що залишилися поки поза увагою дослідників, безсумнівно дасть багато нових фактів про пристосовність мікроорганізмів до різноманітних умов проживання / 2 /.

Псевдомонади здатні розщеплювати синтетичні поверхнево-активні речовини (СПАР). Легкість розщеплення СПАР, зокрема алкіл-і арілсульфатов, пояснюється, мабуть, тим, що в природних умовах в грунті широко поширені холін-о-сульфат, який входить до складу клітин бактерій і використовується ними як джерело сірки після розщеплення сульфогідралазой. Також ПАР дуже сильно впливають на мікроорганізми / 3 /.

1 .1 Дія ПАР на мікроорганізми

Специфічні властивості ПАР, в першу чергу їх здатність до солюбілізаціі і утворення міцел, обумовлює їх активність цих сполук по відношенню до різних біологічним об'єктам. Вони можуть діяти спільно з бактерицидів і при міцелярних концентраціях інактивувати речовини шляхом їх солюбілізаціі. Якщо розглядати біологічні мембрани як складні подвійні солі з гідрофобним ядром і гідрофільним оточенням, то логічно припустити, що молекули ПАР будуть взаємодіяти з ними. У цьому відношенні мікроорганізми являють собою унікальну модель, за допомогою якої можна вивчати дію ПАР як на структурні компоненти клітини (клітинну стінку, мембрани), так і на протікання процесів обміну речовин / 4 /.

Дослідження дії ПАР на клітини мікроорганізмів неможливо без достатньої інформації про будову самого об'єкта. Найбільш зручною для розуміння проблеми, що розглядається представляється схема, запропонована в 1984 році австралійським ученим А. Віккеном. Вона складена з урахуванням присутності в клітинних стінках бактерій сполук, що володіють амфіфільних властивостями, тобто найбільш ймовірних «мішеней» для дії ПАР / 5 /.

Гідрофільні компоненти бактеріальних амфіфілів є зазвичай зарядженими великими молекулами, що можна проілюструвати на прикладі ліпополісахаридів грамнегативних (Гр ^-) бактерій і ліпотейхоевих кислот у грампозитивних (Гр ^+). Клітини бактерій диференціюють на грампозитивні і грамнегативні в залежності від їх здатності чи нездатності фарбуватися в темно-фіолетовий колір при використанні методу, запропонованого в 1884 р. Грамом. Ці властивості, у свою чергу, обумовлені особливостями будови клітинних стінок бактерій / 6 /.

Внутрішня частина бішару зовнішньої мембрани грамнегативних бактерій містить фосфоліпіди (ФЛ), протеїни (Пр), ліпополіпротеіни (ОПР), які утворюють ковалентное оточення пептідогліканового шару, що лежить над плазматичною мембраною. У верхній частині зовнішнього мембранного бішару знаходяться ліпополісахарідной молекули - гладкі (ЛПС) і шорсткі (РЛПС), а також гаптеном (ЕОА) та імуногенетичні (ЕОА - РЛПС) форми. Плазматична мембрана грампозитивних бактерій представлена ​​складається із протеїнів (Пр), фосфоліпідів (ФЛ), гліколіпідів (ГЛ), у верхній частині - з ацілірованних ліпотейхоевих кислот (аЛТК), чиї гідрофільні полігліцерофосфатние ланцюга пронизують матрікс клітинної стінки, виходячи на поверхні бактеріальної клітини. Молекули так званих «транзитних» ЛТК можуть перебувати лише у верхньому шарі клітинної стінки і виявляються у складі виділяються комплексів. Полісахариди (ПС) також виділяються в середу, де ідентифікують комплекси трьох типів: М ₁ - що складаються з мембранних ліпідів; М ₂ - з аЛТК, білків ФЛ і ПС; М ₃ - з аЛТК і білків. Якщо ж схематично зображати структуру наведених вище амфіфілів, де чітко виділяються гідрофобні (заштриховані) і гідрофільні (заряджені) частини молекул, то стане очевидним загальне структурний подібність природних амфіфілів з ​​синтетичними ПАР. Більш того, бактеріальні амфіфіли здатні утворювати міцелярні агрегати аналогічно ПАР. Бактерії ж різних груп суттєво різняться своїми амфіфіли як вкачественном, так і в кількісному відносинах. Не дивно, що одне і те ж ПАР надає найчастіше неадекватна дія на різні бактерії. Ефекти такого роду, мабуть, є причиною великого числа передбачуваних механізмів дії ПАР на клітини мікроорганізмів. Основними методами оцінки дії ПАР на бактерії, що визначають, у свою чергу, той чи інший гіпотетичний механізм, є електронна мікроскопія, ідентифікація та кількісний аналіз окремих компонентів (макромолекул) клітинних стінок, мембран або вмісту цитоплазми.

Перші електронно-мікроскопічні дослідження з вивчення впливу детергентів на клітинні стінки бактерій проводилися американськими вченими А. Мітчелом (1947) і М. Солтоном (1951), які показали, що детергенти здатні дезінтегрувати бактеріальну клітинну стінку. В даний час електронна мікроскопія є єдиним засобом, що дає найбільш повне уявлення про події, що відбуваються при взаємодії ПАР з клітинної поверхнею / 7 /.

В якості конкретного прикладу розглянемо діляться клітини характерної форми, легко виявлені у всіх препаратах. Після витримування бактеріальної суспензії в буферному розчині, що містить тритон Х-100, спостерігається відторгнення цитоплазматичної мембрани від клітинної стінки. Це явище спостерігали ряд авторів при обробці клітин інших грампозитивних бактерій холато, цетилтриметиламмонийбромидом, і, ймовірно, воно типово для більшості ПАР. До особливостей, що характеризує їх вплив на бактеріальну клітину, відноситься також зміна лучепропускаемості цитоплазми: вона стає темною, внутрішньоклітинні структури - нерозрізненними. Надалі наступає розрив клітинної стінки і вивільнення цитоплазми в навколишнє середовище. Помітне спотворення поверхні цитоплазматичної мембрани свідчить про взаємодію ПАР з мембраною, яке, очевидно, призводить до дезінтеграції останньою і «розсмоктуванню» цитоплазматичного вмісту. Підтвердженням цьому служить виявлений клітинний каркас з характерними розривами, через які могла відбутися «витік» цитоплазматичного матеріалу. При детальному дослідженні встановлено, що фрагментація клітинної стінки бактерій може відбуватися, по-перше, на ділянці перегородки, що росте в напрямку до центру, і, по-друге, відразу в декількох місцях. Відповідно можна припустити два можливих механізму дії тритона Х-100 на поверхню клітин пропіоновокислих бактерій. У першому випадку чутливим до детергенти виявляється ділянку клітинної стінки, де зазвичай локалізуються специфічні ферменти, які внаслідок первинних змін в структурі клітинної стінки, викликаних ПАР, можуть якимось чином активуватися і сприяти її дезінтеграції. Подібне явище спостерігалося при вивченні впливу цетилтриметиламмонийбромида на клітинну стінку стафілококів. У другому випадку відповідною мішенню для тритона Х-100 міг служити білок невідомої природи, що зустрічається в клітинних стінках пропіоновокислих бактерій. Враховуючи той факт, що деякі білки в клітинних стінках грампозитивних бактерій займають окремі ділянки, такий механізм здається цілком прийнятним / 8 /.

У результаті проведених електронно-мікроскопічних досліджень встановлено, що взаємодія ПАР з поверхнею грампозитивної бактеріальної клітини можна розділити на кілька етапів.

1. Адсорбція ПАР, мабуть, спочатку відбувається на ділянках, де його спорідненість з амфіфільних фрагментом клітинної стінки є найбільшим. Потім слід взаємодія молекул (або міцел) ПАР з білками, утворюють пори, (порінамі), що призводить до суттєвих структурних змін в порах бактеріальної стінки. У результаті порушується її проникність, а внаслідок цього - скорочується цитоплазма.

2. Солюбілізірующая здатність ПАР в подальшому виявляється у вигляді часткової дезінтеграції клітинної стінки, що дозволяє молекулам детергенту проникати глибше в клітку і безпосередньо контактувати з цитоплазматичною мембраною. Виявлені розбіжності у дезинтегрирующей дії тритона Х-100 на що діляться і покояться клітини. У першому випадку дезінтеграція клітинної стінки завжди відбувається на ділянці перегородки, зростаючою до центра клітини, причому процес активується в результаті перебудов в клітинній стінці, що наступають після дії ПАР. У другому випадку клітинна стінка фрагментується по ділянках, які, ймовірно, містять білкові компоненти.

3. На заключній стадії дії ПАР спостерігається «витік» цитоплазматичного вмісту з залишився клітинного каркаса, що дозволяє припустити наявність в клітинних екстрактах сполук, синтезованих даними мікроорганізмами / 9 /.

Вдалося також з'ясувати, що процес взаємодії ПАР з поверхнею бактерій зачіпає такі важливі моменти структурно-функціонального єдності живої клітини, що проникність, взаємозв'язок амфіфільних компонентів у поверхневих шарах і мембранах, а також цілісність третинної і вторинної структур білків / 10 /.

Методом скануючої електронної мікроскопії встановлена ​​картина дезинтегрирующей дії 1%-го додецилсульфату натрію (ДСН) на клітини пропіоновокислих бактерій. Це ПАР протягом 1 год інкубації з бактеріальними клітинами приводить їх до лізису і фрагментації клітинних стінок з утворенням високомолекулярних агломератів.

Надзвичайно різноманітні дані / 4 /, що стосуються впливу ПАР на клітинні стінки бактерій і отримані на підставі біохімічних експериментів без допомоги електронної мікроскопії. Встановлено, що механізм дії ПАР на ізольовані клітинні стінки різних грамнегативних бактерій полягає у взаміодействія детергенту з ліпідами, ліпопротеїнами і ліпополісахарідной фрагментами клітинних стінок, а не у дії на розрив дисульфідних (-SS-) зв'язків, як вважалося раніше.

При обробці клітин E.coli лізоцимом і версеном протягом 30-45 с в крижаній лазні вони стають чутливими до литическому дії неионогенного детергенту бридж-58. Ступінь лізису залежить від концентрації детергенту. Ефективність дії цього НПАВ в тисячу разів менше, ніж ДСН і дох. Руйнування клітин під впливом ПАР залежить від концентрації іонів магнію в середовищі, іонної сили і часу лізису. У присутності Mg ^{2 +,} концентрація якого становить 70 мМ, з клітин виходять тільки низькомолекулярні РНК і розчинні білки, а при концентрації 40 мМ 70 S субодиниці і рибосомні фрагменти виділяються разом з розчинною матеріалом. При більш низьких концентраціях Mg ^{2 +} у екстракційному розчині виявляються полірібосоми, а при падінні її нижче 5 мМ з клітин виходить ДНК. Передбачуваний механізм дії НПАВ на клітинні стінки і мембрани можна уявити таким чином. Поверхня клітини є своєрідним молекулярниі ситом з порами, розмір яких залежить від концентрації Mg ^{2 +} та іонної сили навколишнього середовища. Можна також припустити, що місцем дії НПАВ є шар клітинних стінок бактерій / 11 /.

В умовах, при яких ДСН і тритон Х-100 повністю, а бридж-58 частково розчиняють клітинну стінку E.coli, лаурілсаркозілат викликає виборчу дисоціацію цитоплазматичної мембрани (ЦПМ). Наявність іонів магнію при обробці клітинних стінок перешкоджає розчиненню цитоплазматичної фракції лаурілсаркозілатом. Тритон Х-100 в цих умовах розчиняв тільки ЦПМ і не діяв на зовнішню мембрану.

Вивчено вплив солей KCl, NaCl, NH ₄ Cl, (NH _{4) 2} SO ₄ на антимікробну активність неіонних ПАР, зокрема по відношенню до стафілококів. Механізм дії одновалентних катіонів в це випадку пов'язаний з впливом ПАР на клітинну стінку здатністю конкурувати з антимікробними агентами. Встановлено, що мутант стафілококів, дефектний по ліполісахарідам, має підвищену чутливість до дезоксихолатом і таким КПАВ, як гексадецілпірідінхлорід, бензаммонійхлорід. Присутність великої кількості ліпополісахаридів і білків з фосфоліпідів на зовнішній мембрані є вирішальним чинником, який визначає стійкість грамнегативних мікроорганізмів до детергентів. У відношенні стійкості до ПАР бактерій-деструкторів, наприклад псевдомонад до ДСН, вважають, що велика стійкість штаму-деструктора по сравенію з мутантним штамом (не здатним руйнувати ДСС) зумовлена ​​не стільки наявністю специфічних ферментів, що руйнують ПАР, скільки особливостями біохімічного складу клітинної стінки / 5 /.

Ряд авторів / 12 / відзначають також, що «молоді» бактеріальні клітини, вирощені на повноцінній живильному середовищі, стійкі до дії ДСН, ніж клітини більш пізньої фази зростання. Істотне значення також заряд клітинної поверхні. При лужному значенні рН на поверхні клітини зменшується число позитивно заряджених груп, відповідно до цього знижується і кількість сорбованого на поверхні ПАР за рахунок електростатичного притягання гідрофільної частини молекули ДСН, що несе негативний заряд. Внаслідок цього кількість ПАР на поверхні обумовлене тими гідрофобними ділянками, з якими взаємодіє алкільних частина молекули ДСС. Таким чином, ПАР здатні взаємодіяти з різними компонентами клітинних стінок бактерій, включаючи муреіновий шар, білки, ліпіди, ліпопротеїни, ліполісахаріди. Проникнення ПАР всередину клітин, якщо воно ускладнено просторовими або електростатичними факторами, може відбуватися і через пори. Істотну роль у стійкості мікроорганізмів до дії детергентів грає «електростатичне екранування», обумовлене наявністю заряджених функціональних груп на поверхні їх клітин, а також присутністю іонів металів у середовищі / 5 /.

Розглянемо загальну характеристику мембран. На електронних мікрофотографіях ультратонких зрізів клітин бактеріальна клітинна мембрана виглядає як подвійна лінія шириною близько 8 нм. Вона складається з двох шарів фосфоліпідів, в які включені мембранні білки. Самою перспективною і найбільш переконливо трактує сучасні експериментальні дані вважається метаморфно-рідинно-мозаїчна модель структури мембрани. З її допомогою пояснюється і присутність у мембранах білків двох типів: периферичних та інтегральних. Перші переходять в надосадову рідину при відмиванні мембран буферними розчинами з різними значеннями рН або іонної сили. Другі - внутрішні білки, що зберігають зв'язок з мембранами після проведення перерахованих операцій і звільняються тільки після руйнування фосфоліпідного бішару. Слід зазначити, що зазвичай інтегральні білки мають амфіфільних природу і здатні до самоагрегаціі у водних розчинах. Велика частина мембранних білків бактерій є білками-переносниками та ферментами, відповідальними за біосинтез макромолекул. В даний час відомо близько 20 різних білків бактеріальних зовнішніх мембран, деякі з них синтезуються в великих кількостях. ПАР є унікальним інструментом для для вилучення білків з бактеріальних мембран / 12 /.

Принципова подібність в дії НПАВ і АПАВ свідчить про те, що головним агентом фрагментаціімембрани є не заряджені гідрофільні групи детергенту, а гідрофобна частина молекули. Звідси випливає, що міцел, зіткнувшись з поверхнею мембрани, ймовірно, змінює свою конфігурацію, оголюючи гідрофобні групи. У такій формі ПАР взаємодіє з мембраною, головним чином за рахунок неполярної гідрофобною частини молекул, що, мабуть, супроводжується солюбілізаціі ПАР в гідрофобних ділянках мембрани. При цьому остання дробиться на більш-менш великі ліпопротеїдні фрагменти, солюбілізірованние завдяки присутності в них ПАР / 13 /.

Зв'язування детергенту з мембраною залежить від числа зв'язують місць і від ступеня їх спорідненості до молекул детергенту. Число місць зв'язування при високому рівні спорідненості невелика, що, у свою чергу, слабко впливає на конформацію мембранних білків. Зі збільшенням концентрації детергенту поступово починають насичувати місця зв'язування з високою спорідненістю до детергенти. Цим пояснюється «м'яке» вплив НПАВ на мембрани, тому що значення їх концентрації міцелоутворення (ККМ) нижче, ніж у випадку АПАВ. При вивченні послідовності дій КПАВ на цитоплазматичні мембрани стрептококів встановлено, що в першу чергу змінюється проникність мембран. Цим обумовлено порушення тих функцій мембран, які залежать від їх нативної проникності - транспорту речовин і перетворення енергії. Дія більш високих концентрацій КПАВ супроводжується солюбілізаціі білкових і ліпідних компонентів мембран, зміною вторинної структури білків і інактивацією їх ферментних систем. Порушення проникності мембран стрептококів під впливом катіонних детергентів визначається дією цих сполук на ліпідні компоненти мембран, що призводить до зміни структурної організації їх гідрофобної області / 14 /.

Встановлено, що КПАВ діють на фосфоліпідний компоненти мембран протопластів у стрептококів, лізис яких є результатом вторинних осмотичних явищ. АПАВ, навпаки, впливає на білкові компоненти мембран. У результаті інгібування лізису протопластів після попередньої обробки останніх іонами уранілу підтверджена важлива роль фосфатних груп у механізмі дії ПАР на мембрану. Передбачається, що АПАВ і КПАВ діють на різні ділянки мембрани або на один і той же ділянку, але різними шляхами. У ряді алкілсульфатів натрію ДСН володіє найбільшою літичної активністю по відношенню до ЦПМ протопластів дріжджів. Ряд фахівців вважають, що сорбція іонів ПАР відбувається головним чином на мембранних компонентах ліпідної природи, а взаємодія з участю білкових компонентів мембрани / 15 /.

Радянський учений В.А. Тукмачев запропонував модель дії ПАР на мембрани, згідно з якою ярмо іон (або молекула) сорбується на мембрані, проникаючи в неї своєму ліпофільній частиною, і діє на мембранне оточення за принципом клину. При сорбції на мембрані певної кількості іонів (або молекул) ПАР міцність мембрани різко падає, в результаті чого вона руйнується. Взаємодія гідрофільних груп з мембранним оточенням в цій моделі не враховується. Передбачається, що в литическом процесі це взаємодія відіграє другорядну роль. Є. Фриз (Швеція) запропонував наступний механізм взаємодії ПАР і мембрани / 8 /.

1. Зв'язування детергенту без інтеграції. При низьких концентраціях молекули ПАР зв'язуються з мембраною, ймовірно, в результаті вторгнення у зовнішній шар ліпідного бішару.

2. Лізис. Як тільки концентрація вільного мономера ПАР досягає певного рівня, присутні молекули ПАР дестабілізують мембрану.

3. Дисоціація мембрани в розчин. При високій концентрації розчину вся мембрана виявляється оточеній молекулами ПАР, і подальше їх додавання призводить до зміни фаз: мембрани перебудовуються в змішані міцели, що містять детергент-ліпідні або детергент-білкові комплекси.

4. Звільнення білків від ліпідів. Зі збільшенням концентрації додається ПАР кількість ліпідів зменшується до тих пір, поки всі білки не звільняться від них. Експериментальне підтвердження висунутої гіпотези щодо механізму дії ПАР було отримано при вивченні впливу дезоксихолатом натрію (дох) на вірус лісу Семліки. Так, при концентрації ПАР 1,5 мМ спостерігалося руйнування вірусу і одночасне вивільнення ліпідів та білків; при 2 мМ дох всі мембранні білки звільнялися від ліпідів і утворювали комплекси великих розмірів. Збільшення вмісту детергенту до 5 мМ призводило до зростання розмірів безліпідних білкових комплексів. Аналогічні результати отримані при дії на цей об'єкт тритона Х-100 і ДСН; різними були лише концентрації ПАР, що приводили до однакового ефекту.

Причини, з яких до цього часу немає загальноприйнятої схеми механізму дії ПАР, відомі - це відсутність точних даних про будову та склад бактеріальних мембран, а також перешкоди, які виникають в результаті впливу хімічних реагентів, присутніх у середовищі вирощування. Проте в даний час на основі досить великої наукової інформації можна припустити наступну модель дії ПАР на мембрани мікроорганізмів. Спочатку відбувається адсорбція молекул ПАР на поверхні мембрани, змінюючи її проникність з подальшим порушенням цілого ряди функцій. Потім при досягненні ККМ починається солюбілізація одного з амфіфільних компонентів мембрани білка або ліпіду в залежності від їх локалізації та типу детергенту. У результаті солюбілізаціі порушується структурна організація гідрофобних областей мембрани, відповідальних за її цілісність. У свою чергу, порушення такого роду призводять до дезінтеграції мембрани, розпаду її на фрагменти і утворення змішаних міцел, що складаються з молекул ПАР і мембранних амфіфілів / 14 /.

У зв'язку з тим, що дослідження лізису мембран під дією ПАР є одним з активно розвиваються підходів у вивченні її структурної організації, можна очікувати нових, більш точних та інформативних моделей взаємодії детергентів з біомембранами.

Іншим не менш важливим аспектом дії ПАР на мікроорганізми є їхній вплив на процеси обміну речовин. За порушенням цілісності клітинних структур в результаті взаємодії з детергентами повинні послідувати зміни на таких ключових ділянках мікробного обміну речовин, як транспорт і біосинтез молекул, реакція окислювального фосфолірованіе, фотосинтез / 16 /.

При вивченні впливу Твінов на зміну активності накопичення a-кетоглутарової кислоти бактеріями псевдомонадами встановлено, що твіни 60 і 80 помітно збільшують накопичення a-кетоглутарату. Показано, що твін 80 при 0,6%-й концентрації спільно з добавками ізолейцину, метіоніну, серину, лізину, інозиту, аспарата підсилює біосинтез вітаміну В ₁₂ і не впливає на біогенез пропіонової кислоти при вирощуванні пропіоновокислих бактерій на основний живильному середовищі, що містить молочну сироватку. При додаванні в живильне середовище пліснявого гриба аспергилл Твінов 40, 60 і 80 біомаса останнього збільшувалася в 2,5 рази, що супроводжувалося накопиченням алкалоїдів. Максимальна (100%-е) збільшення накопичення алкалоїдів спостерігалася при додаванні Твін 80 0,5 - ій концентрації. У присутності цього детергенту швидкість поглинання поживних речовин із середовища зростала на 27-50%. Вважають, що твін 80 безпосередньо не бере участь у біосинтезі алкалоїдів, а діє як ПАР, полегшує транспорт поживних речовин у клітину. Швидкість утворення фумарової кислоти та її вихід у культурі гриба різопус у присутності твін 60 збільшується на 43%, а при твін 40 і 60 - на 18%. При суміші двох видів твін ефект залежить від кількісного стану індивідуальних Двомісна / 17 /.

Обробка ізольованих гетероцистах ціанобактерій катіонних детергентом цетілметіламмонійбромідом підвищує їх проникність для позаклітинних нуклеотидів. Ефектом іншого роду, викликаних впливом детергентів, є зміна швидкості споживання кисню різними мікроорганізмами. Після обробки клітин сальмонел лаурилсульфат натрію значно знижується дегідрогеназная активність клітин, гліколіз, а також споживання кисню. Культивування оброблених детергентом бактерій на середовищі в присутності 10% гліцерину призводить до відновлення активності цих процесів. Однак вирощування ентеробактерій, стійких до детергентів, на середовищі з глюкозою і аспарагін у присутності ДСН (10%) призводить до додаткових енерговитрат, в результаті чого врожай клітин знижується на 20%, а утилізація глюкози і поглинання кисню прискорюються відповідно на 30-35 і 60 -75% в порівнянні з вирощуванням на середовищі без ДСН / 18 /.

Зниження врожаю клітин на 20% відбувається також при варіюванні співвідношення кількості джерел вуглецю та азоту, при заміні глюкози іншими цукрами. Отримані результати свідчать про додаткове витраті енергії на здійснення активного транспорту сполук внаслідок зниження величини мембранного потенціалу в присутності ДСН. При додаванні до суспензії голодуючих клітин вібріонів Твін 80 спостерігається зменшення об'єму клітин, посилення споживання кисню і зростання тепловіддачі. Припускають, що ПАР впливають на здатність цих бактерій використовувати пов'язані з поверхнею поживні речовини.

У роботах Р.В. Кучера з співробітниками показано, що ПАР комплексно впливають на процес мікробіологічного окислення н-алканів, що призводить до поліпшення проникності клітинних мембран, збільшення активності дегідрогеназ і концентрації розчинного кисню у дріжджів, а також до солюбілізаціі вуглеводнів. ПАР позитивно впливаю на зміну розчинності гексадекану в присутності дріжджів. Солюбілізація вуглеводнів є початковою стадією процесу їх мікробіологічного окислення / 19 /.

При вивченні взаємозалежних зв'язків між концентрацією розчиненого кисню, питомою швидкістю росту і дегідрогеназной активністю в присутності ПАР встановлено, що детергенти при ферментації не включаються до ферментну систему, а покращують проникність клітинних мембран, збільшують аерацію культуральної рідини й спосбствует транспорту кисню та субстрату до клітин зростаючої культури . Біологічна дія ПАР на ферментативні процеси і взаємозв'язок параметрів ростамікроорганізмов пояснюються, мабуть, фізико-хімічними причинами, пов'язаними з утворенням міцел в культуральній рідині / 20 /.

Біоенергетичні процеси в мікробних клітинах також виявляються порушеними при внесенні детергентів в навколишнє середовище. У результаті досліджень впливу тритона Х-100 і дезоксихолатом натрію на основну дихальний ланцюг і ціанідрезістентний шлях перенесення електролітів у мітохондріях встановлено, що в малих концентраціях тритон Х-100 інгібує перенесення електрона в електронно-транспортних ланцюгах хлоропластів, мітохондрій і бактерій. Припускають, що механізм його дії при низьких концентраціях полягає в модифікації структури деяких ділянок мембрани. Крім того, тритон Х-100, перерозподілити між водної та гідрофобною фазами, викликає такі структурні перебудови в ліпідах, які призводять до відриву від мембран досить великих фрагментів, що містять окислювально-відновні фрагменти. Це і обумовлює інгібування переносу електронів у дихальні ланцюги. Отримані дані свідчать також про неоднорідність розподілу ферментів ланцюга перенесення електронів по мембрані та існування фонду специфічних білків, не пов'язаних з іншими компонентами ланцюга. Цікаво відзначити, що при використанні цілих клітин мікрококів ендогенне дихання в них під дією тритона Х-100 падало не повністю. Це означає, по-видимому, що клітинна стінка перешкоджає розпаду цитоплазматичної мембрани на окремі мембранні пухирці, як це, ймовірно, відбувається протопластах. Доступність внутрішньої поверхні цитоплазматичної мембрани при дії навіть значних концентрацій детергенту все одно лімітується якимись просторовими обмеженнями.

Таким чином, ПАР виступають в якості своєрідних регуляторів мікробного обміну речовин і можуть впливати на ріст і розвиток деяких мікроорганізмів, включаючи дріжджі, що ростуть на відходах нафтовиробництва, а також пропіоновокислих бактерій - синтетиків вітаміну В _12. Ці особливості ПАР вимагають подальшого вивчення, що дозволить в майбутньому використовувати їх в біотехнологічних виробництвах.

ПАР здатні викликати дезінтеграцію клітинних структур мікроорганізмів і активно впливати на реакцію обміну речовин. Це властивість детергентів широко використовується для лізису мікроорганізмів і має велике практичне значення, особливо при патогенних формах. При дослідженні впливу довжини вуглеводневого ланцюга ПАР неароматичних четвертинних амонієвих солей і неіонних оксидів амінів на їх ККМ і антимікробну активність встановлено, що із зростанням цієї довжини мінімальна інгібуюча концентрація збільшується, а значення ККМ зменшується. Так, найбільшою антимікробну активність мають ПАР при ККМ нижче 100 мкг / мл / 19 /.

У результаті вивчення генетики загибелі та ультраструктуру грампозитивних і грамнегативних бактерій після впливу алкилдиметиламмонияхлорида встановлено, що низькі концентрації (0,0001%-е) роблять виражений бактерицидний ефект, який вище по відношенню до грампозитивних бактерій. Визначальним у механізмі дії КПАВ є порушення цілісності цитоплазматичної мембрани. У цитоплазмі загиблих бактерій виявлені мембранні структури різної конфігурації та локалізації, не пов'язані з поділом клітини і явяляющіеся, мабуть, результатом самозбірки розпалися під впливом детергенту ліпідних компонентів мембран. Вирощування культури на середовищі з діталаном призводить до порушення процесу спороутворення. Показано, що клітини, які знаходяться в стані спокою, виявляють велику стійкість до високих доз детергенту. Протимікробна активність КПАВ може збільшуватися при включенні в їх молекули залишків пропіонової і оцтової кислот / 9 /.

Встановлено / 4 /, що аніонні та неіонні детергенти, зміст яких не перевищує 0,001-0,4%, не впливають на ріст дріжджів. Проте при великих концентраціях ці ПАР роблять помітний фунгіцидну та фунгістатичну дію. Різний вплив надають ПАР при їх спільному використанні з антибіотиками та іншими лікарськими препаратами. Так, спостерігався ефект посилення дії тетрациклінів щодо стійкості грамнегативних мікроорганізмів за допомогою катаміна АБ, що пояснюється підвищеним накопиченням антибіотика клітинами при обробці їх ПАР. У той же час встановлено, що зниження в присутності НПАВ антибактеріальної активності полівінілпіроллідоніода, бензолконіумхлоріда і гексахлорфенола щодо стафілококів і псевдомонад. ПАР знайшли застосування і в деяких вірусологічних дослідженнях. При вивченні впливу різних концентрацій лужного розчину твін 20 (0,2%-го) на фізичні та біологічні властивості вірусу Сендай встановлена ​​втрата гемолітичної активності і помітне зменшення його інфекційності. Залежно від концентрації детергенту фрагментаи оболонки вірусу розрізнялися чутливістю до еритроцитів, біологічної актіновностью і фізичними властивостями. НПАВ виявилися активними також по відношенню до вірусу герпесу. Безсумнівно, що якнайшвидше з'ясування механізму дії ПАР дозволить з великим успіхом застосовувати детергенти як антимікробні засоби / 21 /.

При вивченні чутливості мікроорганізмів ПАР встановлена ​​наступна особливість: якщо живильне середовище, що містить 0,05% додецілбензолсульфоната (сульфонол), піддати кип'ятіння, то в ній гинуть всі мікроорганізми. Після посіву в ній можуть рости тільки грамнегативні бактерії. Це властивість сульфонол використано для стерилізації живильних середовищ, призначених для грамнегативних мікроорганізмів. Клітини бактерій, що ростуть при 0,05%-й концентрації детергенту, а також більш високою, були грамнегативними. Порогової концентрацією в живильному середовищі, при якій могли зростати грампозитивні бактерії, була 0,008-я ще більш низька. Розподіл бактерій по чутливості до додецілбензолсульфонату може служити однією з ознак, на підставі яких проводиться класифікація мікроорганізмів / 22 /.

1.2 Лужні протеїнази роду Bacillus

Позаклітинні лужні протеїнази виконують ряд важливих катаболічних функцій поза клітини. Найбільш очевидною функцією лужних протеїназ є розщеплення білків та інших високомолекулярних субстратів, що містяться у живильному середовищі, і перетворення їх у форму, здатну легко проникати всередину мікробної клітини. Лужні протеїнази відіграють певну роль в інших життєво важливих процесах клітини. Передбачається, що серинових протеїназ виконує три внутрішньоклітинні функції: 1) бере участь у синтезі білкової оболонки, ймовірно, постачає амінокислотами, 2) грає роль сміттяра - прибирає непотрібні речовини клітини, 3) бере участь в модифікації ферментів, особливо РНК-полімерази / 23 /.

У 1938 р. Кунітц вперше висловив припущення про існування зв'язку між процесом спороутворення та активністю лужної протеїнази. Позаклітинні лужні протеїнази бактеріального походження, головним чином з Bacillus subtilis, вивчені більш детально. Це - ферменти широкої специфічності, гідролізують до 80 зв'язків у білках, з оптимумом рН в лужний зоні. Вперше фермент був виділений, очищений і охарактеризовано в лабораторії Карлсберга (Копенгаген). Фермент був названий субтілопептідазой А, алкалазой, субтилизина А, а потім за ним закріпилася назва субтилизина Карлсберг. Пізніше, в тій же лабораторії з іншого штаму Bac. subtilis був отриманий інший фермент. Цей фермент отримав назву субтилизина Novo. Незважаючи на велику схожість з субтилизина Карлсберг, він все ж не був ідентичний йому, відрізняючись деякими фізико-хімічними та ензиматичними властивостями. Одночасно з цими дослідженнями в Японії була виділена протеиназа, продукуються культурою Bac.amyloliquefaciens. Вона отримала назву BPN '. Таким чином, в даний час вивчено три лужні протеїнази типу субтилизина. Вони мають багато спільних властивостей, але тим не менш субтилизина Карлсберг відрізняється від субтилизина Novo і BPN ', є ідентичними. Молекулярний вага субтилизина 27 000. При рН 5,0 і нижче фермент швидко і необоротно інактивується. Оптимум рН дії для всіх субтилизина лежить в області рН 9-10. Ферменти проявляють широку специфічність при гідролізі білків. Мають естеразной активністю / 24 /.

Незважаючи на значну подібність: 1) у ферментативному поведінці, 2) гідролізі одних і тих же субстратів, 3) схожої реакції по відношенню до одних і тих же інгібіторів, 4) близькості походження, субтилизина відрізняються між собою. Ізоелектрична точка субтилизина Карлсберг лежить в зоні рН 9,4, субтилизина Novo і BPN '- 7,8. Субтилизина складається з однієї пептидного ланцюга та 275 амінокислотних залишків. Субтилизина - одні з небагатьох білків, для яких определно тривимірна структура та побудовано модель молекули.

За механізмом дії та субстратної специфічності субтилизина близькі до серинових протеїназ тваринного походження - хімотрипсину, трипсину, незважаючи на відсутність якого б то не було подібності в структурі між ними / 25 /.

Характер регуляції біосинтезу лужних протеїназ вивчений недостатньо. Лужним протеиназа належить ряд важливих функцій у процесах клітинного диференціювання, зокрема спороутворення. Відомо, що лужні протеїнази різних типів утворюються в основному спороутворюючими видами бактерій, причому утворення ферменту тісно пов'язане з процесом спорообразования / 26 /.

Спороутворюючі види бактерій є продуцентами багатьох біологічно активних сполук. Освіта ряду антибіотиків, ферментів і токсинів починається після завершення активного росту продуцентів і збігається з початком їх споруляції. Тому з'ясування зв'язку процесу споруляції з утворенням різних біологічно активних сполук і вивчення функцій цих з'єднань являє важливість для розробки як загальних принципів, так і приватних методів селекції високопродуктивних штамів спороутворюючих мікроорганізмів. Слід зазначити, що більшість продуцентів, що характеризуються сверхсинтезу ферменту, в генетичній плані практично не вивчені / 27 /.

Дослідження подібного роду представляють також певний інтерес і у зв'язку з вивченням механізму диференціювання суперечка, оскільки ряд біологічно активних сполук, що накопичуються при споруляції, мабуть, бере участь в регуляції різних етапів цього процесу.

1.2.1 Генетика і фізіологія спорообразования різних видів роду Bacillus

Життєвий цикл спороутворюючих бактерій складається з проростання спори, вегетативної стадії, переходу до споруляції і завершується утворенням зрілої суперечки. Причому зміни структури клітини при переході в споруляціонное стан здійснюються в часі і становлять кілька етапів.

На моделі Bac. subtilus встановлена ​​послідовність із семи етапів споруляції / 28 /, що характеризуються певними морфологічними змінами. З'ясуванню послідовності етапів спорообразования у багато сприяло також виділення мутантів, нездатних утворювати зрілі суперечки - «spo» - мутанти. У залежності від порушення певного етапу спорообразования дані мутанти класифікують як spo0, spoI, spoII і та далі.

Генетичне порушення певного етапу спорообразования характеризується відсутністю ряду морфологічних і біохімічних функцій, тобто певними фенотипическими наслідками. Наприклад, характерною рисою spo0-мутантів, що мають порушення «0» стадії споруляції, є плейотропних, тобто поряд з порушенням здатності клітин споруліровать не здійснюється ряд біохімічних подій, таких, як освіта протеїназ, пептидних антибіотиків, зберігається чутливість до деяких фагам і зникає компетентність при трансформації.

Більш детальний аналіз показав, що як перехід від вегетативної стадії росту до спороутворення, так і переключення з одного етапу спорообразования на інший корелює з рядом біохімічних змін в клітці, зокрема зі зниженням синтезу загальної РНК, модифікацією синтезу ДНК, а також з появою певних біологічно активних сполук. Результати генетичних досліджень різних класів мутантів показали, що процес спорообразования визначається полігенною системою, що локалізується в різних районах хромосоми Bac. subtilus (більше 100 генів). В даний час на хромосомі Bac. subtilus локалізовано 28 Оперон, що відповідають за VII етапів процесу спорообразования / 29 /.

Вважається, що регулювання спороутворення може здійснюватися на кількох рівнях: на рівні транскрипції, трансляції та посттрансляційної регуляції.

Регулювання спорообразования на рівні транскрипції. Результати дослідження переходу клітин Bac. Subtilus від вегетативної стадії до спороутворення показали, що цей процес багато в чому визначається зміною матричної активності РНК-полімерази вегетативних клітин на ранньому етапі споруляції. Показано, що під час вегетативного зростання 85% іРНК транскрибується з важкої нитки ДНК і лише 15% - з легкої нитки. Популяція іРНК спорулірующіх летокпредставлена ​​іРНК, транскрибується як з легкої, так і з важкою нитки ДНК, причому з переважним синтезом іРНК на матриці легкої нитки ДНК. На підставі цих даних було зроблено припущення, що споруляціонние гени мають специфічні промоторні ділянки на легкій нитки ДНК / 30 /.

Показано, що бактеріофаг b 3 може інфікувати і реплицироваться в клітинах Bac. subtilus, що знаходяться в логарифмічній фазі росту, але не в спорулірующіх клітинах. Надалі було виявлено, що тільки РНК-полімерази з клітин у логарифмічній фазі має матричної специфічністю щодо ДНКфага, тоді як РНК-полімераза спорулірующіх клітин нездатна використовувати ДНК даного фага як матрицю, але має підвищену активністю на синтетичній матриці полі-dАТ. Разом з тим подібного зміни матричної активності у мутантів з порушеним спорообразование в стаціонарній фазі росту не відбувалося. У зв'язку з цим вважають, що при переході від вегетативного росту до спороутворення відбувається модифікація специфічності РНК-полімерази, наслідком чого є припинення зчитування вегетативних членів і «включення» експресії генів спорових / 31 /.

Спочатку вважали, що зміна специфічності РНК-полімерази пов'язано з модифікацією b-субодиниці ферменту, причому поява модифікованої субодиниці відбувається за рахунок її протеолитического розщеплення лужної протеїнази. Ці висновки були зроблені на підставі того, що РНК-полімераза, виділена з вегетативних і спорулірующіх клітин, мала b-субодиниці з різною молекулярною вагою. Таким чином, зміна матричної специфічності РНК-полімерази не пов'язано з модифікацією мінімального ферменту, а, на думку деяких авторів, пов'язано з втратою або інактивацією s-фактора / 32 /.

Таким чином, природа змін РНК-полімерази при переході від вегетативних клітин до споруляції і роль цих змін в її матричної активності для включення процесу спорообразования остаточно не встановлені. Разом з тим даний напрямок дослідження багато в чому визначить з'ясування природи переходу клітин до споруляції.

Регулювання спорообразования на рівні трансляції. Відомо, що процес спорообразования починає здійснюватися в стаціонарній стадії розвитку Bacillius, на якій відбуваються численні зміни в апараті трансляції клітини. У зв'язку з цим визначення змін в даному апараті, які пов'язані саме зі споруляціонним процесом, утруднено. Це пояснюється наступними причинами. Для виявлення змін в апараті трансляції необхідно виділення, вивчення і порівняння внутрішньоклітинних компонентів, що беруть участь у трансляції, з вегетативно зростаючих клітин, клітин у стаціонарній фазі і суперечка. Однак у зв'язку з тим, що кількість нуклеаз і протеїнах до моменту початку процесу спорообразования значно зростає, компоненти трансляційного апарату зазнають неспецифічні модифікації в момент свого виділення / 33 /.

До теперішнього часу остаточно не встановлено існування стабільних іРНК, специфічних для спороутворення. Однак є дані, що вказують на наявність стабільних споруляціонних іРНК. Додавання міченого актиноміцину D до культури Bac. subtilus через певні проміжки часу від початку процесу спорообразования дозволило виявити різні класи спороспеціфічних іРНК / 32 /.

Результати вивчення ДНК-РНК-гібридизації також вказали на існування стабільної фракції іРНК у прикріплених до мембрани полірібосомах спорулірующіх клітин, оброблених актиноміцин D. Поруч дослідників показано, що при переході до споруляції рибосоми вегетативних клітин зазнають змін. У результаті використання білок-синтезуючої системи in vitro виявлено, що у Bac. subtilus рибосоми стають нездатними транслювати вегетативні іРНК при переході клітин до споруляції. Таким чином, на підставі даних, що вказують на наявність стабільної фракції іРНК, змін у структурі рибосом, конформаційних змін в клітинній мембрані, можна припускати можливість функціональних змін механізму, який визначає специфічну для процесу спорообразования трансляцію / 31 /.

Посттрансляційна регуляція спороутворення. Регуляція спорообразования на посттрансляційної рівні в даний час вивчена недостатньо, проте вважається, що цей вид регуляції, пов'язаний з модифікацією білків клітини, є необхідним для завершення споруляціонного процесу. Виявлено специфічний склад білків для кожної стадії спороутворення. Вважається, модифікація РНК-полімерази, субодиниць рибосом і мембранних компонентів клітини відбувається в результаті посттрансляційних змін і пов'язана з фосфорилюванням, аденілірованіем вже існуючих білків, а також з утворенням пептидних антибіотиків / 27 /.

Роль лужної протеїнази в процесі спороутворення. У процесі споруляції Bac. subtilus утворюються тир протеолітичних активних ферменту: серинових протеїназ (субтилизина), що працює при лужних значеннях рН, у зв'язку з чим у літературі звичайно наводиться назва лужна протеиназа; металлсодержащих протеиназа (нейтральна), рН оптимум якої знаходиться в нейтральній зоні рН, і естераза - фермент , що володіє невисокою протеолітичної активністю. Різні представники роду Bacillus мають специфічною здатністю до утворення певного типу позаклітинної протеїнази. Так, Bac. megaterium і Bac. cereus синтезують тільки нейтральну протеіназу, в той час як Bac. licheniformis, Bac. natto і Bac. subtilis утворюють як нейтральну, так і лужну протеїнази. Слід зазначити, що Bac. subtilis за здатністю освіти протеїнази різного типу можна підрозділити на чотири групи; до першої належать штами, які синтезують тільки лужну протеіназу, друга група утворює лише нейтральну протеіназу, представники третьої групи виділяють у середовище як лужну, так і нейтральну протеїнази, лужна протеиназа у представників четвертої групи з'являється в середовищі тільки після того, як зникне нейтральна протеиназа / 34 /.

Встановлено, що нейтральна протеиназа не бере участі в процесі спороутворення, тоді як лужна протеиназа необхідна для включення даного процесу. Зокрема, виділено температурочувствітельний по лужної протеїназ мутант Bac. subtilis ts5. В умовах інкубації при 47 ⁰ С, тобто температурі, при якій проявляється дефект температурочувствительного субтилизина, мутант не споруліровал. Відновлення активності лужної протеїнази при 30 ⁰ супроводжувалося споруляції вегетативно зростаючих клітин. Момент порушення процесу спорообразования у даного ts5 мутанта збігається з 0 стадією споруляції / 35 /.

У той же час описана велика група плейотропних негативних мутантів, які мали блок на 0 стадії спороутворення і характеризувалися відсутністю здатності до утворення лужної протеїнази. Таким чином, із представлених даних можна судити про наявність кореляції між освітою лужної протеїнази та спорообразование. У наступних роботах для визначення участі протеїназ в процесі споруляції використовували два підходи. Перший підхід полягав у створенні умов, при яких інгібується спорообразование. Виявлено, що клітини, голодуючі по тимідину, не споруліруют і не утворюють такі екзоферментів, як протеїнази, рибонуклеази, лужну фосфатазу, при цьому не зачіпається тільки освіта a-амілази. На підставі цих даних автори запропонували, що зазначені ферменти прямо або побічно пов'язані з спорообразование / 36 /.

Другим підходом для визначення участі саме лужної протеїнази в споруляціонном процесі послужило використання специфічного інгібітора лужної протеїнази - фенилметилсульфонилфторида (PMSF). Додаючи інгібітор через різні проміжки часу від початку процесу утворення спор, виявили, що у здійсненні даного процесу є чутливий період, що триває 2-3 години. Додавання інгібітора в цей період призводить до порушення спороутворення, при цьому не утворюється лужна фосфатаза, рибонуклеаза і термостійкість суперечки. Рівень синтезу нейтральної протеїнази за відсутності інгібітора постійно зростає до початку спороутворення, потім або незначно знижується, або досягає плато. Додавання PMSF призводить до зростання рівня накопичення нейтральної протеїнази, при цьому спорообразование відсутня. На підставі цих даних автори зробили висновок про те, що нейтральні протеїнази в міру свого накопичення руйнуються лужної протеїназ і не беруть участь в спорообразовании / 26 /.

Підтвердженням того, що нейтральна протеиназа не бере участі в процесі споруляції, послужили нормально спорулірующіе мутанти Bac. subtilis, не обоазующіе металлсодержащего протеїнази. Мутанти ж, дефектні за освітою лужної протеїнази, як правило - аспорогенних. Додавання інгібітора лужної протеїнази після чутливого періоду не порушує ні освіти лужної фосфатази, ні появи светопреломляющих суперечка. Отже, лужна протеиназа необхідна для здійснення перших етапів спороутворення, зокрема 0-1. Незважаючи на те, що фермент продовжує накопичуватися протягом усього періоду спороутворення, для подальшого розвитку суперечки, на думку авторів, лужна протеиназа НЕ явялется необхідної / 27 /.

Разом з тим у ряді робіт була показана важлива роль лужної протеїнази в модифікації ферментів на пізніх етапах спороутворення. Наприклад, показано, що протеиназа може перетворювати фермент вегетативних клітин фруктозо-6-фосфатальдолазу в білок, специфічні для зрілих суперечка Bac. subtilis. Не виключено також можлива участь лужної протеїнази в проростанні спор, при цьому припускають, що лужні протеїнази, гідролізуюя білкову оболонку суперечка, включають їх проростання.

Всі наведені вище роботи стосуються ролі позаклітинної лужної протеїнази в спорообразовании.

Разом з тим встановлено, що до моменту початку процесу спорообразования Bac. subtilis утворюється також і внутрішньоклітинна лужна протеиназа, рівень активності якої становить 10% від відповідного рівня позаклітинного ферменту. Інші види Bacillus, наприклад Bac.megaterium, синтезують, на відміну від Bac. Subtilis, толькл внутрішньоклітинну лужну протеіназу. У деяких хімічних властивостях двох протеїназ існують відмінності. Зокрема, вказується на наявність різної потреби в кофактором і субстратної специфічності. Було також виявлено, що двом лужним протеиназа властива різна електрофоретична рухливість. Внутрішньоклітинна протеиназа має більш вузькою специфічністю щодо ефірів і абсолютної потребою в кальції. До останнього часу незрозумілим залишається питання про роль внутрішньоклітинної протеїнази в спорообразовании Bac. Subtilis, хоча й описані мутанти, у яких поряд з відсутністю активності внутрішньоклітинної протеїнази не здійснюється процес споруляції / 34 /.

Таким чином, процес спорообразования регулюється на різних рівнях і які утворюються на різних етапах диференціювання суперечка біологічно активні сполуки, зокрема мають практичний інтерес, можуть брати участь в регуляції цього процесу. У зв'язку з цим принципи регулювання спорообразования представляють інтерес. Проте в даний час ще мало відомо про характер регуляції процесу спороутворення і регуляції синтезу сполук, специфічних для споруляції.

1.2.2 Отримання лужних протеїназ

1) Ряд авторів під керівництвом А. Мудеррізаде Bacillus sp. виділили алкалофільний штам Bacillus sp. в літній період з грунту на території Університету Дікла (Туреччина) і визначили по Берги. Грунтовий образі суспензійовані в 20 мл дистильованої води, инкубировали при 80 ⁰ С 5 хв. Потім 1 мл ресуспензіровалі в 9 мл дистильованої води і по 0,1 мл вносили в поживний агар. Через 72 год інкубації при 37 ⁰ С окремі колонії висівали для визначення активності лужної протеази.

Виділені культури вирощували на різних середовищах. Основна середу мала наступний склад (г / л): соєве борошно 10, крохмаль 10; КН ₂ РО _4; глюкоза 20; Na ₂ CO ₃ 10; рН 11,5. Культивування проводили в колбах на 250 мл з 100 мл середовища на гойдалці при 37 ⁰ З 58 ч. Після вирощування клітини відокремлювали центрифугуванням, супернатант використовували для очищення ферменту. Всі етапи очищення проводилися при 4 ⁰ С.

Очищення лужної протеази. До фільтрату культуральної рідини, доведеному до рН 11,5, при перемішуванні повільно додавали сульфат амонію до 75% насичення. Осад відокремлювали центрифугуванням, розчиняли в 20 мл трис-HCl-буфера, рН 8,8, з 50 мМ NaCl і діалізовалі проти 1 л того ж буфера протягом ночі. Діалізованний фермент наносили на колонку з ДЕАЕ-целюлозою (3 '20 см), попередньо врівноважену 10 мМ натрій-фосфатним буфером, рН 7,6 містить 50 мМ NaCl. Активні фракції збирали, потім проводили діаліз в 10 мМ фосфатному буфері протягом ночі, потім наносили на колонку з КМ-целюлозою (2 '15 см), попередньо врівноважену тим же буфером. Елюція проводилася лінійним градієнтам NaCl (200 мл, 0-0,5 М) у тому ж буфері. Активні фракції об'єднували для зберігання / 37 /.

2) МотінаЛ.І., Нахапетян Л.А. / 38 /, також розробили спосіб отримання лужної протеїнази. Вони отримували її культивуванням штаму Вacillus subtilis 72 на рідкому поживному середовищі такого складу,%: картопляний крохмаль-4; кукурудзяне борошно-1; технічний казеїн - 0,1; БВК - 0,1; кукурудзяний екстракт - 0,05; амоній фосфорнокислий двозаміщений - 0,01; культивування в лабораторних умовах проводиться на круговій качалці, що має 240 об / хв, при 40 ⁰ С; початковому рН середовища 6,8, у колбах ємністю 750 мл з відбійниками (40 мл живильного середовища) протягом 46 ч. протеолітична активність склала 10 тис. од / мл.

Культуральну рідину (20 мл), що містить лужну протеіназу, наносять на хроматографічну колонку (1,5 '20 см), наповнену сілохромом С-80, модифікованим тріетоксілілмасляной кислотою (n = 2, RH-; 0,42 мг * екв / г сорбенту -зміст карбоксильних груп), врівноважену 0,005 М фосфатним буфером з рН 6,0. Колонку промивають тим же буфером, при цьому виходить основна частина пігменту, клітини продуцента і деякі супутні білки. Колонку промивають до тих пір, поки поглинання елюата при 280 нм не досягне фонових значень (D ₂₈₀ £ 0,1). Потім проводять елюція лужної протеїнази 0,005 М фосфатним буфером з рН 7,8, що містить 0,2 М NaCl. Вихід ферменту за активністю становить 92%. Питома активність ферменту в розрахунку на білок збільшується 5,4 рази. Елюат концентрують методом ультрафільтрації на мембрані УАМ-150, потім висушують ліофільно. Отриманий препарат світло-сірого кольору має активність 1000640 од / г препарату, вміст білка 530 мг / л. Питома активність 1888 од / мг білка.

3) Наступний спосіб отримання лужної протеази полягає в наступному. Культуральну рідину отримують вирощуванням продуцента Вacillus subtilis 72 на живильному середовищі такого складу,%: карфтофельний крохмаль-8; кукурудзяне борошно-3; технічний казеїн-1; БВК - 0,5; кукурудзяний екстракт - 1,0; амоній фосфорнокислий двозаміщений - 0, 05.

Культивування проводиться на гойдалці при 240 об / хв, при 40 ⁰ С, початкова рН середовища 6,9, в колбах ємністю 750 мл протягом 47 год культуральну рідину (40 мл) з активністю 12 тис. од / мл наносять на хроматографічну колонку (2,5 '35 см), заповнену сілохромом С-80, модифікованим тріетоксісілілундекановой кислотою (n = 9; RH-), врівноваженою дистильованою водою поки поглинання при 280 нм не досягне фонових значень. Потім проводять елюція лужної протеїнази 0,05 М фосфатним буфером з рН 8,0, що містить 0,2 М NaCl. Елюат концентрують методом ультрафільтрації на мембрані УАМ-150 і висушують ліофільно. Отримують препарат світло-сірого кольору з протеолітичної активністю 1056550 од / г препарату, вміст білка 550 мг / л / 39 /.

1.3 Мікробні ліпази

В останні роки для отримання різних ферментів знаходять широке застосування мікроорганізми, які характеризуються найціннішими властивостями, що забезпечують їм за короткий цикл розвитку на доступних поживних середовищах та у виробничих умовах синтез ферментів, необхідних для народного господарства / 40 /.

При цьому біосинтез багатьох гідролаз можна регулювати і здійснювати направлено шляхом підбору відповідних умов культивування, і перш за все складу живильного середовища. Більш того, багато мікробні ферменти утворюються у відповідь на дію індуктора, що вноситься в живильне середовище, причому активність індукованого ферменту у відповідь на додавання специфічного субстрату зростає в процесі росту мікроорганізму багаторазово, тоді як на середовищі без відповідного індуктора фермент утворюється в мінімальних кількостях / 41 / .

Особливість мікроорганізмів полягає в тому, що вони здатні синтезувати позаклітинні ферменти, активність яких у багато разів перевищує рівень активності внутрішньоклітинних. Таким чином, за певних умов мікробна клітина може здійснювати «сверхсинтезу». Одним з промислово важливих ферментів, які продукуються мікроорганізмами, є ліпази, які інтенсивно досліджуються в усьому світі. Ліпаза - трігліцерідгідролаза - фермент, що каталізує гідроліз жирів, широко поширена в природі. Вона присутня у тваринних і рослинних клітинах, а також в мікроорганізмах. Експериментальні дослідження свідчать про те, що мікробні ліпази є ферментами з широкою специфічністю і великою різноманітністю властивостей. Властивості ліпаз і характер липолитической активності навіть у одного роду можна різному варіювати. Вивчення мікробних ліпаз представляє великий теоретичний і практичний інтерес, оскільки вони можуть бути використані при гідролізі різноманітних жирових субстратів / 42 /.

1.3.1 Субстратна специфічність мікробних ліпаз

Мікробна ліпази здатні гідролізувати тваринні жири, рослинні олії, а також синтетичні моно-, ди-і тригліцериди. Синтетичні тригліцериди є кращими субстратами для багатьох мікробних ліпаз. Ліпази можна розділити на дві групи: специфічні і неспецифічні. Ферменти з першої групи гідролізують складноефірні зв'язку в першому чи другому положенні. Багато мікробні ліпази зазвичай гідролізують первинні складноефірні зв'язку (a-ефірні зв'язку). У гідролізітах за участю таких ферментів зазвичай виявляються жирні кислоти, 2,3 - і 1,2 - дигліцериди, 2-моногліцериди. При більш тривалих гідролізу жирнокислотний залишок з 2-моногліцериди мігрує в перше положення з утворенням 1-моногліцериди, який легко гідролізується специфічною ліпазою з утворенням гліцерину і жирної кислоти. До цієї групи відносяться ліпази з Rhizopus arrhizus, Rhizopus delemar, Rhizopus microsporus, Mucor miechei, Aspergillus niger, Pseudomonas sp. і т.д. Ліпази другої групи не розрізняють ефірні зв'язку у всіх трьох положеннях трігліцерідной молекули і здатні піддавати субстрат тотального гідролізу. У гидролизатах тригліцеридів з участю цих видів ліпаз виявляються, як правило, залишки тригліцеридів (негідролізованная частина), гліцерин та жирні кислоти. Такі ліпази були виділені з Geotrichum candidum, Oospora lactis, Humicola lanuginosa і т.д. Активність ліпаз залежить від довжини ланцюжка і ступеня насиченості жирної кислоти. Дженсон описав, що ліпаза Geotrichum candidum виявляла високу специфічність до олеїнової і лінолевої кислот незалежно від їх положення в молекулах тригліцеридів. Такими ж властивостями володіють ліпази з Achromobacter lipolyticum, тоді як ліпаза з Aspergillus niger виявляла більшу специфічність до стеаринової кислоти і молекулам субстратів / 44 /.

1.3.2 Виділення мікробних ліпаз з мікроорганізмів

Відомі мікроорганізми, які продукують ліпази, оптимум дії яких знаходиться в області високих температур: 50-55 ⁰ С Pseudomonas fragi, 70 ⁰ С Pseudomonas mephitica. У зв'язку з цим представляється актуальним пошук активних продуцентів ліпаз, специфічних до твердих жирів, що містяться в промислових відходів, а також продуцентів ліпаз з більш високими температурними оптимуму дії. Такі дослідження мають велике значення у зв'язку з екологічними проблемами, пов'язаними з очищенням стічних вод в олійно-жирової промисловості / 45 /.

Спочатку скринінг продуцентів ліпаз проведено якісним методом Ейкман, при якому в стерильні чашки Петрі розливають тонким шаром простерилізовані тваринний жир і після його застигання вводять агаризованому живильному середовищі. Культури висівали на живильне середовище для отримання гігантських колоній. Чашки витримували в термостаті при 28-30 ⁰ С для мезофільних та 38-40 ⁰ С для термофільних культур протягом 5-7 діб, враховували і відбирали культури, навколо колоній яких утворювалися непрозорі зони гідролізу жирів. Активними вважали культури, що утворюють зони, що перевищують діаметр колоній. Для кількісного визначення ліпазной активності гриби вирощували в глибинних умовах у колбах Ерленмейера об'ємом 250 мл з 50 мл живильного середовища на круговій качалці (150 об / хв) протягом 3-4 діб при 36-40 ⁰ С. Посівним матеріалом для іннокуляціі живильного середовища служила суспензія спор гриба. Ліпазную активність визначали в фільтраті культуральної рідини. За одиницю ліпазной активності приймали таку кількість ферменту, що звільняє 1 мкМ олеїнової кислоти з 40% емульсії оливкової олії в 10% розчині полівінілового спирту за 1 год в умовах досвіду.

При глибинних умовах вирощування ліпазную активність культур виявляли на різних поживних середовищах (%):

1) видозмінена середу Чапека:

а) KH ₂ PO ₄ - 0,1; MgSO ₄ * 7H ₂ 0 - 0,05; FeSO ₄ * 7H _два 0-0,01; CaCO ₃ -0,3; бавовняна олія і пептон - по 0,1;

б) мінеральний склад з додаванням бавовняного масла і кукурудзяного екстракту по 1,0;

2) середовище з 7% екстракту солодових паростків з додаванням (NH _{4) 2} SO ₄ - 0,3; CaCO ₃ - 0,1 і бавовняного масла - 1,0;

3) середовище з гідролізатом БВК -1,0; (NH _{4) 2} SO ₄ - 0,3; CaCO ₃ та бавовняне масло - по 0,1; рН поживних середовищ - 6,5-7,0.

Внутрішньоклітинну ліпазную активність визначали в гомогенаті сирої біомаси. Для цього 0,5 г біомаси, ретельно вимитій дистильованої води, розтирали у фарфоровій ступці з кварцовим піском, доводили об'єм до 50 мл дистильованої води і витримували 2 год при кімнатній температурі, потім фільтрують через паперовий фільтр і фільтрат використовували для аналізу. Активність розраховували на 1 г абсолютно сухої біомаси / 46 /.

Інший спосіб біосинтезу ліпази полягає в наступному. Спочатку була отримана культура дріжджів Candida paralipolytica 739. Робота почалася з використання живильного середовища наступного складу (%): (NH _{4) 2} SO ₄ - 0,3; MgSO ₄ - 0,07; NaCl - 0,05; Ca (NO _{3) 2} - 0,04; KH ₂ PO ₄ - 1,0; K ₂ HPO ₄ - 0,1; глюкоза - 0,5; дріжджовий автолізат - 0,1 (по сухій речовині). В якості посівного матеріалу використовували 48-годинну культуру, вирощену на косому агарі. Для дослідів культуру дріжджів вирощували при 30 ⁰ С в колбах ємністю 750 мл з 100 мл середовища на гойдалці при 240-250 об / хв протягом 2-х діб. Ліпазную активність в культуральній рідині визначали за кількістю олеїнової кислоти, що утворилася в результаті дії ферменту на оливкову олію. У міжнародній практиці емульсію оливкової олії в полівінілового спирту в якості субстрату використовують для визначення ліпазной активності і, зокрема, для екзоліпази дріжджовий культури Candida paralipolytica / 47 /. У даному досвіді реакційна суміш містила 2,5 мл 40%-ної емульсії оливкової олії в 2%-ном полівінілового спирту, 2 мл 1 / 15 М фосфатного буферу з рН 8 і 0,5 мл ферментного розчину. Реакцію проводили при 37 ⁰ С протягом 1 год і переривали додаванням 15 мл етанолу. Отриману суміш титровали 0,05 н. NaOH в присутності індикатора тимолової синього. Контрольні зразки обробляли так само, але без попередньої інкубації і негайно оттітровивалі. Результати титрування визначали по різниці між контролем та досвідом. За одиницю активності брали кількість, здатне вивільнятися 1 мк / моль олеїнової кислоти з 40%-ної емульсії оливкової олії при рН 8,0 і температурі 37 ⁰ протягом 1 год / 48 /.

При біосинтезі ферментів мікроорганізмами велике значення мають умови розвитку культури і в першу чергу складу живильного середовища. У зв'язку з цим становило інтерес вивчити вплив солей середовища не біосинтез ліпази культурою Candida paralipolytica 739. Шляхом почергового виключення солей встановили, що всі мінеральні солі, що входять до складу живильного середовища необхідні для біосинтезу ферменту. Виявили, що на освіту ліпази позитивно впливають солі амонію та сечовина, нітрати помітно знижують активність ліпази. Також перевіряли залежність ліпазной активності в культуральній рідині від віку посівного матеріалу. Отримані дані дозволяють зробити наступні висновки:

1) при біосинтезі ліпази дріжджами Candida paralipolytica 739 максимальна липолитическая активність досягається в середовищах при використанні в якості джерела вуглецю глюкози; дисахариди мальтоза, сахароза і лактоза дещо знижують активність ферменту, а оцтова кислота повністю припиняє його синтез;

2) у вуглеводної середовищі солі амонію мають перевагу в порівнянні з нітратами як джерелом азоту;

3) при біосинтезі важливу роль відіграє вік посівного матеріалу, максимальні показники відповідають дводобової культурі / 49 /.

Для визначення липолитической активності використовували метод, заснований на титрометричним визначення вільних жирних кислот, що утворилися при гідролізі ліпідів. Як субстрат використовували оливкова олія, емульгованих полівініловим спиртом (ступінь полімеризації 1725, в'язкість 30 сП). Емульсію готували наступним чином: до 100 мл оливкової олії додавали 150 мл 2%-ного водного розчину полівінілового спирту і емульгованими протягом 20 хв при кімнатній температурі (рН 8). Емульсія була стабільна 24 год Реакційна суміш містила 5 мл субстрату, 4 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН = 7,8). Реакційну суміш витримували 10 хв при температурі 34 ^0, додавали 1 мл ферментного розчину. Після 60-хвилинного інкубування реакцію зупиняли додаванням 20 мл етанолу та ацетону (1:1). Утворену олеїнову кислоту оттітровивалі 0,05 н. лугом у присутності тимолфталеїну. За одиницю ліпазной активності приймали таку кількість ферменту, яка відщеплює 1 мкмоль жирних кислот від емульсії тріолеата за 1 год при 34 ^0.

Ферментативний препарат ліпази отримували за наступною схемою: 1) відділення біомаси від ферментативного розчину, 2) осадження ферменту органічним розчинниками або висолювання, 3) звільнення ферменту від солей і низькомолекулярних домішок за допомогою хроматографії на колонці з сефадекса Г-25 або діалізом; 4) ліофілізація або осадження ацетоном.

Ферментативний розчин центрифугували 20 хв при 4000 об / хв для відділення біомаси. Згідно з літературними даними, для отримання сухого, частково очищеного препарату використовують фракційне осадження органічними розчинниками (ізопропанол, етанолом, ацетоном). Оптимальний варіант для отримання ліпазного препарату з ферментативного розчину Candida paralipolytica 739 - висолювання ферменту сульфатом амонію / 50 /.

Фермент з ферментативного розчину облягали фракціонуванням сульфатом амонію в інтервалі насичення 0,4-0,7. Ферменту з найвищою липолитической активністю осаджувався при ступені насичення сульфатом амонію 0,5. При більш високого ступеня насичення разом з ферментом випадав і білок, що не володіє липолитической активністю. Концентрований розчин ферменту звільняли від солей і низькомолекулярних домішок на колонці з сефадекса Г-25 і діалізом (вода) протягом 24 ч. Після діалізу або гель-фільтрації розчин ферменту ліофілізована або брали в облогу ацетоном. Препарат добре витримував ліофілізацію і не втрачав активності при зберіганні в ліофілізованому стані при температурі 4 ⁰ С протягом 6 місяців.

Таким чином, можна зробити висновок, що досліджений препарат у подальшому може бути використаний для отримання високоочищеної і кристалічної ліпази, а також у деяких галузях народного господарства.

1.3.3 Застосування мікробних ліпаз

Використання мікробних ліпаз в першу чергу пов'язано з потребою масложирової промисловості. Вони стали широко використовуватися для модифікації жирів і масел. Слід зазначити, що безконтрольний ліполіз може викликати неприємний присмак, пов'язаний з накопиченням вільних жирних кислот, для видалення яких потрібно додаткове центрифугування. З іншого боку, специфічний смак сиру частково обумовлений присутністю коротко жирних кислот, що утворюються в результаті часткового гідролізу молочного жиру під дією ліпаз, продукованих мікроорганізмами, і ліпаз, присутніх в самому молоці. Пікантний і характерний смак італійських сирів зумовлений дією спеціально додається в молоко ліпази, специфічною до коротко жирних кислот. Ліпази можуть бути рекомендовані для модифікації жирів, що використовуються у виробництві хлібобулочних виробів. Використання модифікованих жирів покращує смак, колір, м'якість і структуру хліба. У шкіряної промисловості мікробні ліпази використовуються для знежирення шкіри. Ліпази мікроорганізмів в комплексі з іншими ферментами застосовуються для біологічного очищення стічних вод / 51 /.

Існує ще ряд причин, які роблять вивчення ліпаз цікавим і перспективним. Перш за все це стосується їх використання в медицині. Так, управління липолитической активністю, ймовірно, буде відігравати важливу роль у майбутніх методах лікування порушень жирового обміну, і, отже, у контролі за серцево-судинними захворюваннями. Визначення активності сироваткової ліпази широко використовується в клініці для діагностики деяких захворювань. Вроджена гіперліпемія може виникнути через дефіцит ліпопротеідліпази, а порушення процесів депонування жирів пов'язують з холестерол-естерази і сфінгоміеліназой. У ще більшою мірою обнадіює і сприяє появі нових гіпотез той факт, що ефіри холестерину з жирними кислотами є основними компонентами атеросклеротичних бляшок і що миелинизация мозку, що розвивається корелює зі зменшенням вмісту ефірів холестерину / 52 /.

Останнім часом проводяться цілеспрямовані дослідження з використання мікробних ліпаз у складі миючих засобів, шампунів, кремів і профілактичних зубних паст. Важливість застосування ліпаз у складі миючих засобів визначається не тільки їх високою ефективністю, а й пов'язана з охороною навколишнього середовища. Відомо, що фосфати, використовувані як синтетичних миючих засобів, призводять до загрязененію стічних вод. Іншим важливим чинником є те, що використання ферментів у складі синтетичних миючих засобів дозволяє проводити прання при більш низьких температурах, отже, призводить до економії енерговитрат / 40 /.

За кордоном ліпазу використовують для надання приємного запаху молочним продуктам. Для створення букета запаху в молочних продуктах використовують ліпази, специфічні до коротко жирних кислот. Для цих цілей давно використовують ферменти з підшлункової залози різних тварин. Широке застосування ліпаз у різних областях призвело до збільшення числа компаній, що виробляють мікробні ліпази / 41 /.

Таким чином, спектр застосування мікробних ліпаз досить широкий. Ефективність використання їх залежить загону факторів, насамперед від специфічності ліпаз та умов проведення конкретного біотехнологічного процесу.

Таким чином, на основі літературного огляду можна зробити висновок, що представники роду Pseudomonas широко поширені в природі. Вони можуть розвиватися в самих різних умовах в природі, використовуючи найрізноманітніші сполуки вуглецю і азоту в енергетичному і конструктивному обміні. Псевдомонади здатні розщеплювати СПАР. ПАР здатні взаємодіяти з різними компонентами клітинних стінок бактерій, включаючи муреіновий шар, білки, ліпіди, ліпопротеїни, ліпополісахариди.

Позаклітинні лужні протеїнази виконують ряд важливих катаболічних функцій поза клітини. Найбільш очевидною функцією лужних протеїназ є розщеплення білків та інших високомолекулярних субстратів, що містяться у живильному середовищі, і перетворення їх у форму, здатну легко проникати всередину мікробної клітини. Найбільш активними культурами щодо утворення лужних протеїназ є різні види з роду Bacillus, головним чином Bac. Subtilis.

Мікроорганізми мають особливістю, яка полягає в тому, що вони здатні синтезувати позаклітинні ферменти. Одним з промислово важливих ферментів, які продукуються мікроорганізммамі, є ліпази. Вивчення мікробних ліпаз представляє великий теоретичний і практичний інтерес, так як вони можуть використовуватися в різних галузях промисловості (олійно-жирової, кондитерської, шкіряно-хутряної, в медицині та ін)

2. Об'єкти і методи дослідження

Метою даної роботи було виділення, вивчення властивостей концентрованого ферментного препарату та його застосування в процесі знежирення хутряної овчини.

2.1 Об'єкти дослідження

ПРЕВОЦЕЛЛ W-OF-7 являє собою продукт оксиетильований технічних жирних спиртів. За зовнішнім виглядом Превоцелл воскоподібні маса білого кольору, розчиняється при температурі 40-45 ⁰ С, стійкий у жорсткій воді, а також в кислих і лужних розчинах. Має хорошу смачивающей здатністю.

WETTER HAC - 100% активний, неіоногенні змочувальний і відмочували агент, посилений спеціальними бактерицидів і фунгіцидами. На вигляд світло-бурштинова, трохи в'язка рідина, розчинність необмежена, рН - (вода) 6,8-7,2 (1% розчин). Застосовується в отмоке разом зі звичайним кількістю солі, концентрація 1 г / л. Переваги: ​​охороняє шерсть від витікання і шкіру від пошкодження різними бактеріями; володіє прекрасними миючими якостями, полегшуючи виміщення надлишкових природних жирів, засохлої крові і чужорідних матеріалів як з волосся, так і з кожевой тканини.

DE-SOL-A - нізкорастворімое миючий засіб, на вигляд являє собою білу пасту з рН 8-8,5 (1% розчин), розчинність - 10% дисперсійні. Застосовується для миття та знежирювання хутряної та шубної овчини (1,5 г / л DE-SOL-A, 1 г / л кальцинованої соди). Переваги: ​​гарантує для шкурки: менше 1% жиру в волосі і мінімум натуральних жирів в кожевой тканини; дозволяє чисте мездрение і більш рівномірний поглинання в Пікель і дубленні; знижує можливість звалювання хутра; випускає шкурки біліше, чистіше і залишає волосся розсипчастим і відкритим, покращує рівномірність забарвлення хутра і шкіри, зганяючи з кожевой тканини натуральні жири перед Пікель; стабільний у широкому діапазоні рН, а також ефективний перед фарбуванням для вирівнювання кольору.

ГАММА представляє собою суміш високоякісних аніонних, неіоногенних ПАР, корисних добавок. Препарат має високу обезжирюючі здатністю по відношенню до натуральних жирів. Рекомендується для знежирення шкір ВРХ. Ефективний в жорсткій воді, а також у присутності електролітів і дубителів. Легко розчинний у воді, в тому числі і жорсткою.

АГАР-АГАР являє собою порошок білого кольору без стороннього запаху, смаку. Наявність цвілі і видимих ​​сторонніх включень не допускається. Фізичні та хімічні показники повинні відповідати вимогам, зазначеним у табл 1.

Таблиця 1. Фізичні та хімічні показники агар-агару

2.2 Методи дослідження

2.2.1 Методика приготування живильних середовищ для культивування мікроорганізмів

Мясопептонний агар (МПА)

При культивуванні мікроорганізмів велике значення має забезпечення їх відповідним харчуванням. Білковою основою для всіх середовищ є поживний бульйон. Основою для приготування мясопептонного бульйону (МПБ) є м'ясна вода. Її готують таким чином: 15 г. сухого бульйону розчиняли в 1 дм ³ дистильованої води і кип'ятили 1-3 хв. Для приготування щільного живильного середовища МПА до 1 дм ³ МПБ додають 2-2,5% агар-агару від об'єму середовища і розплавляють в автоклаві.

Синтетична середу

До 1 дм ³ дистильованої води для задоволення потреби мікроорганізмів в макро-та мікроелементів, без яких клітина рости не може, в синтетичну середу вводили солі наступного складу (г / дм ^3): NaH ₂ PO ₄ -1,0; NH ₄ NO ₃ -1,0; KCl - 0,5; MgCl ₂ -0,1. Як джерело вуглецю в конструктивному і енергетичному обміні використовували шерстний жир в кількості 1 г / дм ^3. Також додавали СПАР - 1 г / дм ³ та агар-агар в кількості 2-2,5% від обсягу рідкого середовища і автоклавування.

2.2.2 Виділення чистої культури

Приготування розведень. Розведення роблять у стерильній водопровідній воді. Готують певний обсяг цього розчину і стерилізують при 1 атм в автоклаві. В ході одного досвіду користуються постійним коефіцієнтом розведення, тому що в цьому випадку зменшується вірогідність помилки. Найчастіше роблять десяткові розведення. Для цього беруть пробірку з 10 см ³ стерильного розчину і переносять стерильною піпеткою 1 см ³ досліджуваного матеріалу в дану пробірку. Суспензію цього розведення ретельно перемішують з допомогою нової стерильної піпетки, вбираючи в піпетку і випускаючи з неї отриману суміш кілька разів. Це забезпечує перемішування суспензії і зменшує адсорбцію клітин на стінках піпетки. Потім цією ж піпеткою беруть 1 мл отриманого розведення і переносять його у 2-у пробірку. Таким чином, готують і наступні розведення. Ступінь розведення визначається передбачуваним кількістю мікроорганізмів у зразку і відповідно число розведень тим більше, чим більше мікроорганізмів у вихідному субстраті.

Для приготування кожного розведення обов'язково використовують окрему піпетку. Нехтування цим правилом може привести до отримання помилкового результату. Помилка пов'язана з адсорбцією мікроорганізмів на стінках піпетки, в результаті чого не всі клітини видаляються з піпетки при приготуванні відповідного розведення. Частина клітин, що залишилася на стінках піпетки, може потім потрапити в одне з наступних розведень, що і стане причиною отримання завищеного результату.

Посів на агаризованому середовища в чашки Петрі. У стерильні чашки Петрі наливають розплавлену на киплячій водяній бані агаризованому середу, по 20-30 см ³ в кожну. Чашки залишають на горизонтальній поверхні, поки не охолоне агар. Для посіву відбирають чашки, середовище в яких залишилася стерильною. Коли використовують елективні середовища або виділяють і враховують мікроорганізми, які потребують підвищеної вологості, посів проводять відразу ж або незабаром після застигання агару.

Посів роблять з певних розведень в залежності від передбачуваної кількості мікроорганізмів у досліджуваному субстраті. Стерильною піпеткою наносять певний обсяг (зазвичай 0,05; 0,1 або 0,2 мл) відповідного розведення, попередньо ретельно перемішаного, на поверхню агарового платівки в чашки Петрі. Цей обсяг розподіляють по поверхні середовища стерильним шпателем. Потім цим же шпателем проводять по всій поверхні в другій чашці, куди посівний матеріал не вносили. При виявленні мікроорганізмів, кількість яких у субстраті відносно не велике, посівний матеріал розподіляють по поверхні середовища тільки в одній чашці.

З кожного досліджуваного розведення роблять таким чином 2-3 паралельних висіву. Для паралельних висівів з одного розведення можна користуватися однією піпеткою і одним шпателем. Для посівів з різних розведень використовують іншу стерильну піпетку та іншої шпатель. Чашки з засіяними середовищами поміщають у термостат, відрегульований на певну температуру, сприятливу для розвитку виявляються мікроорганізмів.

Підрахунок колоній, що виросли проводять через певний час після посіву, що залежить від швидкості росту виявляються мікроорганізмів на використовуваної в досвіді середовищі і даній температурі.

Підраховують кількість колоній, що виросли при висіві з певного розведення на двох (одній) чашки Петрі. Результати паралельних висівів підсумовують і визначають середнє число колоній, що виросли при висіві з цього розведення. Колонії вважають, як правило, не відкриваючи чашки. Для зручності відзначають прораховану колонію точкою на зовнішній стороні дна чашки, користуючись склографом або чорнилом по склу. При великій кількості колоній дно чашки ділять на сектори, підраховують кількість колоній в кожному секторі та результати підсумовують або використовують напівавтоматичні лічильники.

2.2.3 Методика вивчення культуральних властивостей

Культуральні властивості визначають за характером росту мікробної культури на щільною і рідкої поживних середовищах. Характер зростання на щільному живильному середовищі вивчали з докладним описом форми, величини, кольору, поверхні, консистенції, країв і структури колоній, утворених на МПА.

Мікроскопічне вивчення колоній проводять під мікроскопом. Розглядаючи колонії в світлі, що неозброєним поглядом, описують наступне: форму колоній; діаметр колоній; колір, який обумовлюється пігментом; рельєф колоній; поверхню; її блиск, прозорість, характер країв колоній; структуру колоній, її консистенцію.

З колоній готують мазки, потім фарбують за Грамом і Трухільо. Техніка фарбування за Грамом полягає в наступному:

1) на знежиреному склі роблять мазки мікроорганізмів. Мазки висушують на повітрі і фіксують під полум'ям пальника;

2) мазки забарвлюють протягом 1 хв генціанвіолетом;

3) препарат промивають в слабкій струмені водопровідної води протягом 2 сек.;

4) забарвлюють препарат розчином Люголя протягом 1 хв.;

5) промивають препарат слабким струменем водопровідної води;

6) занурюють препарат на 30 сек в 96%-ний спирт, збовтуючи останній, після чого препарат підсушують промокальним папером;

7) забарвлюють мазки розчином фуксину Пфейфера протягом 30 сек.;

8) промивають препарат в слабкій струмені водопровідної води до зникнення забарвлення в стоці, підсушують промокальним папером і мікроскопіруют.

Грампозитивні бактерії забарвлюються в синій або фіолетовий колір, а грамнегативні в червоний.

Забарвлення за Трухільо полягає в наступному:

1) мазок зафіксувати запалом;

2) завдати водний розчин малахітової зелені (2%) і протягом 3 хв підігріти на спиртівці до відходження вологи;

3) промити водою;

4) опустити на 1 хв в 0,25%-ний водний розчин основного фуксину;

5) промити водою;

6) висушити фільтрувальним папером і мікроскопіювати.

Забарвлення джгутиків по Леффлера

Забарвлення жгутков полягає в наступному:

Суспензію петлею наносять на чисте знежирене предметно скло, нахиляють її під кутом 45 ⁰ і висушують на повітрі. Висушений мазок заливають на 15-20 хв протравов Леффлера. Необхідно стежити, щоб протрава не підсихала. За цей час завдяки осіданню протрави на поверхні джгутиків вони стають видимими в светопольний мікроскоп.

Препарат промивають дистильованою водою і фарбують карболовим фуксином Циля протягом 3 хв. Фарбу змивають, препарат висушують і мікроскопіруют. Клітини і джгутики пофарбовані в червоний колір.

2.2.4 Метод роздавленої краплі

Застосовується при дослідженні морфології і рухливості мікроорганізмів.

Краплю мікробної суспензії поміщають на поверхню чистого знежиреного предметного скла. При роботі з культурою, яка постала на твердому середовищі, на предметне скло наносять краплю водопровідної води, потім стерильною піпеткою беруть невелику кількість культури і перемішують її краплі. Покривні скло поміщають ребром на предметне і обережно поміщають його на суспензію, стежачи за тим, щоб між стеклами не було бульбашок повітря. Надлишок рідини видаляють смужкою фільтрувального паперу.

2.2.5 Протеолітичні властивості мікробів

Протеолітичні властивості виявляються виділенням в зовнішнє середовище протеолітичних ферментів, які розщеплюють білки до проміжних продуктів (пептони, поліпептиди, амінокислоти) або до продуктів кінцевого розпаду (індол, сірководень, аміак та ін)

Для виявлення протеолітичних ферментів досліджувану культуру засівають в живильне середовище, що містить той чи інший білок (МПЖ, молоко та ін)

Посіви у МПЖ культивують 5 ... 7 діб при кімнатній температурі, так як желатин розплавляється в термостаті. Мікроби, що володіють протеолітичними властивостями, розріджують желатин. Багато протеолітичні мікроорганізми дають різний характер розрідження: пошарове (що йде рівно, зверху вниз), воронкообразное, кратерообразной, ріпоподібно, у формі панчохи і т.д.; мікроорганізми, що не володіють протеолітичної здатністю, дають у МПЖ зростання без розрідження желатину.

Для виявлення сірководню робиться посів уколом (всередину стовпчика) по стінці в агар з ацетатом свинцю (МПА з 5% пептона і 0,25% ацетату свинцю) або в пробірку з МПБ, в яку під пробку над середовищем поміщається смужка стерильною фільтрувального паперу, просоченою розчином ацетату свинцю. Якщо досліджувана культура при розкладанні білка виділяє сірководень, то з'являється темно-буре забарвлення (почорніння) за місцем уколу в щільному середовищі або на фільтрувальному папірці (у МПБ).

Визначення аміаку починають з того, що під пробірку з бульонной культурою поміщають рожеву лакмусовий папірець, культуру термостатують при 37 ⁰ С протягом 1 ... 3 діб. При наявності аміаку лакмусовий індикаторний папірець набуває синього забарвлення.

Редукує здатність визначають посівом культури на молоко з метиленовим синім. До стерильному молоку додають по краплі 1%-ний водний розчин метиленового синього до блакитного забарвлення. Після культивування засіяного матеріалу бактерії, що володіють редукуючої активністю, знебарвлюють лакмусовим молоко (під редукцією розуміють хімічний процес, що полягає в відщепленні від речовини кисню або приєднання до нього водню).

Для визначення каталази в 3 ... 5 добову бульйонну культуру, вирощену в пробірці, вносять 1 см ³ 3%-ного розчину пероксиду водню. При наявності ферменту каталази виявляють рясне виділення бульбашок відщеплення кисню, тобто утворюється так звана «піниста шапка».

2.2.6 Приготування бактеріальної суспензії

Як джерело вуглецю, використовуваного прокариотическими мікроорганізмами в конструктивно-енергетичному обміні є жир і СПАР. Приготовлену синтетичну середу піддаємо дробовому автоклавуванню (1; 0.5; 0.5 МПа) протягом 30 хв. Після закінчення цього часу, середовища розливали в стерилізовані конічні колби по 50 см ^3.

Для отримання біомаси досліджуваної культури мікроорганізмів, виділеної в першій серії експерименту, робимо посів на скошений агар.