Як у клітці виникає різниця потенціалів
Можливо, в результаті нашої розповіді створюється враження, що Дюбуа-Реймон був «чистим» експериментатором. Але це абсолютно невірно. Він мав, як уже говорилося, наукову позицію: «Не можна приписати часткам матерії в організмі яких-небудь нових сил, які б не діяли і поза організмом». Виходячи з цієї позиції, він і запропонував перше теоретичне пояснення потенціалу пошкодження: електричні явища в живих організмах виникають тому, що уздовж м'язів і нервів нібито тягнуться ланцюжка особливих «електромоторні» молекул. Кожна така молекула є як би два гальванічні елементи, з'єднаних позитивними полюсами, так що назовні виходять тільки негативні полюси. Де б не розрізати м'яз, на розрізі розкриються негативні полюси, чим і пояснюється потенціал ушкодження.
Тут чітко видно, як біологічна теорія будується на підставі аналогії з сучасною їй фізичною теорією: останнім словом про магнетизм була тоді теорія Ампера про те, що властивості постійних магнітів пояснюються тим, що кожна молекула є маленьким магнітиком.
Дюбуа-Реймон придумав, як тепер сказали б, модельний експеримент для перевірки своєї гіпотези. Він напаяні багато маленьких елементіков «мідь - цинк», з'єднав їх попарно позитивними полюсами, зміцнив на дерев'яній дошці і, зануривши всю систему в розчин солі, став проводити на цій «штучної м'язі» такі ж експерименти, які він проводив на м'язі живий. Виявилося, що розподіл струмів в такій моделі дійсно було схоже з розподілом струмів у реальної м'язи.
Завдяки такій оригінальній розробці, а почасти й авторитету Дюбуа-Реймона теорія електромоторні молекул, незважаючи на її фантастичність, була загальновизнаною майже чверть століття з моменту її висунення молодим Дюбуа в 1846 р.
Але от підросли учні Дюбуа-Реймона - вони-то і виявилися «подривателямі устоїв». Все почалося з Людвіга Германа, в якому Дюбуа-Реймон виховав повагу до технічних деталей, ретельність і точність в експериментах. Справа в тому, що за моделлю Дюбуа-Реймона в нормальній цілої м'язі теж повинні йти струми, так як в області сухожиль стирчать нічим не скомпенсованих «самі останні в ряду» негативні кінці електромоторні молекул. Дюбуа-Реймон виявляв такі струми, не роблячи спеціального розрізу. Але коли акуратний Герман навчився так препаровать м'яз, щоб дійсно не пошкодити її, виявилося, що в таких умовах ніякі струми не виникають.
Значить, міркував Герман, в нормальній цілої м'язі і нерві взагалі немає ніяких струмів і потенціалів. Струми виникають тільки тоді, коли м'яз чи збуджують, або ушкоджують. І причиною цього, припустив Герман, є хімічні реакції, які починають йти на кордоні недоторканою і пошкодженої протоплазми.
Заперечення Германа не збентежили Дюбуа-Реймона: ну, і що ж, значить, в кінці м'яза є інші молекули - позитивні, які екранують негативні полюси. Але все одно всередині м'язи струми є завжди, а пошкодження потрібно тільки, щоб їх виявити.
На цьому і зосередився другий «велика суперечка» в електробіологіі: чи виникає електрику в м'язі тільки в момент ушкодження або існує до пошкодження.
Одним з найвагоміших аргументів у наукових суперечках є експеримент, проте буває й так, що одна група вчених придумує гарний досвід, цілком переконливо його тлумачить, і всі вважають, що вона перемогла, але потім з'ясовується, що досвід може мати і зовсім інше тлумачення.
Суперечка двох гіпотез про виникнення електрики в живих тканинах в цьому відношенні дуже цікавий: якщо подумати, можна прийти до висновку, що вирішення цього спору прямим експериментом неможливо. Адже якою б досвід для вимірювання різниці потенціалів між зовнішньою і внутрішньою частинами м'язи ні поставити, неминуче доведеться проникати в цю внутрішню область, а тоді прихильники гіпотези альтерації скажуть, що нанесено пошкодження. З тієї ж причини прихильники гіпотези альтерації не можуть довести, що в незайманій м'язі не існує різниці потенціалів між її внутрішніми і зовнішніми частинами.
Однак це міркування, мабуть, не спало на думку учасників дискусії, і для підтвердження тієї чи іншої гіпотези ставилися численні нові досліди, які хоча і не могли переконати противників, але істотно сприяли розвитку електрофізіології.
Наприклад, Герман поставив такий досвід. Він дуже швидко розрізав м'яз і показав, що потенціал реєструється не відразу після розрізу, а приблизно через 0,02 с. Ця обставина він пояснив тим, що потрібен час для розвитку необхідних хімічних реакцій. Але навіть якщо б досвід був вірний, він не спростував би гіпотезу предсуществования: Дюбуа-Реймон вважав, що при порушенні молекулярні батарейки вимикаються і потім через деякий час знову включаються; те ж саме може відбуватися і при пошкодженні.
Однак в 1904 р, Бернштейн, який до цього часу став науковим противником Германа, і його співробітник Чермак, повторивши досвід Германа, показали, що вже через 0,3 мс після розрізу можна зареєструвати різницю потенціалів. Але це не набуло ніяких наслідків. Герман просто вирішив, що реакції в результаті пошкодження розвиваються швидше, ніж він спочатку думав.
То чи можна взагалі вирішити, хто правий у цій суперечці? Звичайно, можна. Адже впевнений, наприклад, кожен з нас, що насіння всередині кавуна існують там до того, як ми його розрізали, а не з'являються в момент розрізання і в результаті розрізання,
А, власне, чому? Чому ми так упевнені в існуванні насіння всередині кавуна, хоча ніяк не можемо це перевірити, не розрізаючи його? Таку впевненість нам дає розуміння того, як виникають ці насіння. Точно так само і у випадку з біопотенціалами: для того щоб вирішити суперечку Дюбуа-Реймона і Германа, треба було пояснити механізм виникнення цього потенціалу або до пошкодження, або в результаті пошкодження. При цьому слід будувати це пояснення так, щоб воно не суперечило іншим науковим даним і вписувалося в загальну картину. Тобто основний зміст суперечки було не в тому, коли виникає потенціал, а як він виникає.
Творцем теорії біопотенціалів став учень Дюбуа-Реймона Юліус Бернштейн.
А різні ідеї, факти і відкриття, на яких ця теорія грунтується, накопичувалися в науці дуже довго.
Відступ про детективах. Наукове дослідження часто схоже на детектив. Вірніше, не на літературний детектив, а на реальне даний слідство. Щоб з'ясувати істину: як все сталося і хто винуватець, а головне - зібрати докази, доводиться проробляти величезну роботу. Тут все важливо: і збір свідчень свідків, та уточнення окремих фактів аж до найдрібніших деталей. При цьому переважна більшість даних виявляються не мають відношення до справи, а тим не менше їх потрібно збирати - адже заздалегідь це не відомо. І найважче, мабуть, виділити в цьому наборі відомостей ту систему, яка призведе до істини і дозволить потім вибудувати струнку ланцюжок доказів.
А ось коли слідство описується в книзі, то автору вже відома розгадка. Він тоді знає, які деталі істотні, а які ні; але різні автори використовують ці деталі по-різному. Одні автори включають у тканину розповіді всі дані, необхідні для отримання розгадки. Але читач, як правило, їх не помічає чи не надає їм значення. І тільки потім, коли Шерлок Холмс розповідає доктор Ватсон, як він знайшов розгадку, читач розуміє, чому було важливо, що на вечерю був часниковий соус, а собака не гавкав. Читачеві іноді навіть стає прикро, що він сам не здогадався про все.
Дуже рідко детектив починається з розповіді про розгадку.
Історію ж наукових відкриттів, як правило, пишуть саме так, відразу повідомляючи відповідь. Ми ж намагалися включити в свій виклад, принаймні, ті факти та ідеї, які були важливі для наукового слідства, не маючи можливості розглянути численні помилкові версії, що виникали по ходу справи.
Зараз настав час вибудувати з, здавалося б, іноді зовсім не відносяться до справи відомостей ту ланцюжок, яка покаже, хто винуватець «злочини», тобто «тваринної електрики», і яким зброєю «злочинець» користувався ».
Від осмосу до електрики
На самому початку нашої розповіді ми обмовилися побіжно, що абат Нолле знаменитий відкриттям осмосу. У той час нікому й на думку не могли прийти, що саме дослідження цього явища буде першим кроком до розгадки таємниці «тваринної електрики». Це сталося так.
У 1826 р. паризький лікар і фізіолог А. Дютроше зацікавився таким чудовим властивістю рослини, як кореневий тиск, що жене сік із зрізаного стовбура. Якщо укласти стовбур рослини в трубку, то сік піднімається по ній на помітну висоту.
І зараз нам здається дивним, як це печериця своєю м'якою капелюшком пробиває асфальт, а набряклий у трюмі горох може розірвати пароплав. А тоді це здавалося дивом: звідки у слабких коренів рослин така сила, що вони ламають камені? Недарма А. Н. Толстой у своєму фантастичному романі «Аеліта» придумав, що атланти, які переселилися на Марс, використовували для двигунів своїх космічних кораблів «рослинну силу насіння».
Дютроше подумав: а чи не можна всі ці чудеса пояснити осмосом - явищем, відкритим ще в 1748 р. абатом Нолле?
Нагадаємо, що осмос - це явище самовільного переходу розчинника в розчин, відділений від нього перетинкою, через яку проходить розчинник, але не проходить розчинена речовина. Такі плівки називають напівпроникні. Напівпроникливості мають різні плівки біологічного походження: шкіра жаби, стінка сечового міхура і т. д. Якщо взяти скляну трубку і затягнути один її кінець напівпроникні матеріалом, потім налити в трубку розчин цукру і опустити її затягнутим кінцем у воду, то вода буде проникати з зовнішнього судини в трубку і рівень розчину в трубці підніметься вище, ніж у зовнішньому посудині, створивши так зване осмотичний тиск.
Дютроше припустив, що це-то тиск і є причиною чудових властивостей рослин. Проте знаменно, що саме явище осмосу Дютроше вважав проявом «життєвої сили». Він спробував замінити бичачий міхур або інші тканини біологічного походження посудиною з пористої глини, вважаючи, що такий досвід безнадійний, адже «життєвої сили» в глині немає. Але глиняний посуд працював нітрохи не гірше! Заслуговує глибокої поваги наукове мужність Дютроше, який зміг повністю переглянути свої наукові погляди. З того часу він, за його словами, «... назавжди з'єднав фізику з фізіологією». Дютроше багато зробив для пояснення поглинання води з грунту, підйому води вгору по стовбуру, рухів листя мімози та ін Всі ці явища він намагався пояснити осмосом.
Але найголовніше, Дютроше показав, що осмос - це чисто фізичне явище. З цього моменту прихильники фізико-хімічного напряму в біології почали численні дослідження ролі осмосу в організмі, зокрема в організмі тварин. Осмосом почали пояснювати всмоктування їжі в кишечнику, а К. Людвіг намагався пояснити на основі осмосу роботу нирок. До цих пір кореневий тиск пояснюється на основі осмосу в принципі так само, як це було зроблено в 60-х роках минулого сторіччя німецьким фізіологом рослин Ю. Саксом.
Основну роль у дослідженні осмосу зіграли в цей час роботи ботаніків. Саме ботаніки першими почали вивчати живе, як тепер кажуть, на клітинному рівні. І це природно, тому що вперше клітини були виявлені саме в рослин: вони часто більш великі, ніж тварини клітини, і, головне, відокремлені один від одного чітко видимою під мікроскопом перегородкою.
Головне завдання полягало в тому, щоб з'ясувати, які речовини і як швидко можуть проникати в клітку. Уявімо собі, що рослинну клітину помістили на концентрований розчин якоїсь речовини. Якщо ця речовина не проникає в клітину, то за рахунок осмосу вода почне виходити з клітини назовні і клітина повинна зменшити обсяг, стиснутися. Але вивчення осмосу показало, що видима в мікроскоп клітинна оболонка зовсім не стискається, вона веде себе як міцний жорсткий каркас, а от обсяг внутрішнього вмісту клітини змінюється за законами осмосу. Звідси німецьким ботаніком В. Пфеффер був зроблений висновок, що має надзвичайно важливе значення для розвитку біології. Він припустив, що на поверхні рослинної клітини під «панциром» є ще одна, невидима в мікроскоп оболонка - клітинна мембрана, яка і грає на самому справі роль напівпроникною оболонки.
Пфеффер зробив також наступний принциповий крок у вивченні осмосу - він виміряв осмотичний тиск. Для цього Пфеффер скористався штучними напівпроникну мембрану. Ці неміцні плівки він наносив на пористий глиняний посуд, який не давав їм лопатися від надлишкового осмотичного тиску. Приєднавши до такого судині ртутний манометр, Пфеффер отримав прилад для кількісного вимірювання осмотичного тиску - Осмометри. Вимірюючи це тиск для різних розчинів, він виявив, що для кожного розчину воно прямо пропорційно концентрації розчиненого речовини, не проходить через мембрану. Але чому для різних розчинів при одній і тій же концентрації виходять різні тиску, ботанік Пфеффер здогадатися не зумів.
Ми вже говорили з вами про тісний взаємозв'язок різних наук. У більшості випадків, про які йшлося вище, фізика допомагала біології, готувала її розвиток. Однак, як мовиться, за позику віддяка. Без робіт Гальвані не був би так швидко відкритий електричний струм, без відкриття ботаніка Броуна повільніше розвивалася б молекулярно-кінетична теорія, а без робіт ботаніка Пфеффера ... Але про це ми зараз і розповімо.
У 70-х роках минулого століття молодий голландський ботанік X. Де Фриз займається впливом осмосу на зміну об'єму клітин рослин у розчинах різної концентрації.
У 1894 р. Де Фриз розповів про роботи Пфеффера по осмотичного тиску молодому хіміку Я. Вант Гоффу. Експериментальні дані Пфеффера виявилися для Вант-Гоффа тим же, чим дані Тихо де Браге для Кеплера. Уважно розглянувши ці дані, Вант-Гофф побачив, що осмотичний тиск у різних розчинах виходить однаковим, якщо вимірювати концентрацію не в грамах на літр, а в молях, тобто істотною є не маса, а число молекул розчиненої речовини. Природно вважати, що молекули розчиненої речовини ведуть себе як молекули ідеального газу. Таким чином, для вираження осмотичного тиску можна використовувати рівняння Менделєєва-Клапейрона
де m - Маса розчиненої речовини, i - Маса моля, Л - газова стала, Т - температура, V - об'єм. За теорію розчинів Вант-Гофф через 15 років отримає Нобелівську премію з хімії. Ось який важливий внесок у науку вніс Де Фриз, поговоривши з Вант-Гоффом.
Теорія Вант-Гоффа чудово виконувалася для розчинів багатьох речовин, наприклад для сахарози, для водного розчину С0 2. Але для деяких речовин осмотичний тиск чинився більше розрахункового, і не на які-небудь 10-15%, а вдвічі! Похибка становила 100%. Навряд чи таку погрішність можна пояснити неточністю вимірювань.
Обдумування можливих причин цієї розбіжності призвело до найважливішого відкриття. т.
Однодумець Вант-Гоффа шведський вчений С. Арреніус здогадався, що якщо, наприклад, для кухонної солі тиск виявляється удвічі більше розрахункового, то значить, у розчині вдвічі більше часток, ніж молекул NaCl, т. в воде распадается на две частицы: Na и Cl. Из сопоставления этого факта с другими Аррениуе пришел к идее электролитической диссоциации, к идее, что частицы, на которые распадаются многие вещества, и есть те самые ионы — носители электрических зарядов, с помощью которых еще Фарадей объяснял законы электролиза. е. молекула NaCl у воді розпадається на дві частинки: Na і Cl. Із зіставлення цього факту з іншими Арреніуе прийшов до ідеї електролітичної дисоціації, до ідеї, що частинки, на які розпадаються багато речовин, і є ті самі іони - носії електричних зарядів, за допомогою яких ще Фарадей пояснював закони електролізу.До Арреніуса вважалося, що іони виникають під дією електричного струму, але їх участь в явищі осмосу показало, що це не так: іони предсуществующей в розчині! Вже в самому розчині без дії струму є і рухаються заряджені атоми і молекули.
Так вивчення осмосу призвело до відкриття двох головних «винуватців» виникнення «тваринної електрики» - клітинних мембран та іонів; але про їх роль поки ще ніхто не здогадувався.
Гаряче! Зовсім гаряче!
У 1887 р. вийшли статті Вант-Гоффа і Арреніуса в першому номері «Журналу фізичної хімії», заснованого В. Оствальдом. Всі навколо говорили про новий підхід до хімії, про доведення існування іонів.
А в Берліні цього року закінчив університет 23-річний В. Нернст. Він стане знаменитим фізиком і хіміком, відкриє третій початок термодинаміки, отримає Нобелівську премію з хімії та змінить М. Планка на посаді директора Інституту фізики в Берліні. А поки він скромний асистент Оствальда, хоча й не нова в науці. Працюючи як експериментатор, він вже встиг відкрити нове явище: виникнення електричного поля в тілах, в яких створено градієнт температури, якщо їх помістити в магнітне поле. Тепер він зайнявся дисертацією і взявся за теоретичну роботу про гальванічних елементах. Звичайно, до нього такою теорією займалися великі уми: У. Томсон, Гіббс, Гельмгольц. Але ж тоді не знали про іонах! Нернст вирішив розглянути зв'язок е.р.с. гальванічних елементів з дифузією іонів.
У 1889 р. його дисертація була готова і опублікована. У ній, зокрема, була розвинена ідея Вольта про те, що електричні явища можуть виникати при зіткненні двох різних рідин.
Що таке Нернстовскій потенціал
Нехай у якійсь частині судини знаходиться електроліт, а в іншій - чистий розчинник. Як буде йти дифузія солі? Позитивно і негативно заряджені іони мають різну масу, по-різному взаємодіють з водою, отже, рухаються в рідині з різними швидкостями. Нехай негативні іони хлору рухаються швидше і при дифузії «тікають» вперед від катіонів - виникає «розшарування» негативних і позитивних іонів. Це розшарування викликає поява в розчині електричного поля, яке буде гальмувати втекли вперед аніони і підганяти відсталі катіони, вирівнюючи швидкості їх дифузії.
Природно, Нернст у своїй дисертації не обмежився таким якісним описом, а як справжній фізик вивів формулу для дифузійного потенціалу У д, що виникає на межі контакту двох розчинів з концентраціями електроліту З 1 і С 2:
— газовая постоянная, Р — число Фарадея, Т — температура.
де і - швидкість більш швидкого іона, і - швидкість більш повільного іона, F - газова постійна, Р - число Фарадея, Т - температура.Ця формула давала можливість піддати прямий кількісної перевірки гіпотезу Германа, згідно з якою біопотенціали виникають на межі двох ділянок протоплазми - нормального і пошкодженого, і через сім років таку перевірку зробить чудовий російський вчений Василь Юрійович Чаговець. Це буде перша робота щодо застосування точних кількісних методів до дослідження біопотенціалів.
Коли була опублікована дисертація Нернста, Чаговець ще навчався у київській гімназії. У 1892 р. він вступив до Петербурзької військово-медичну академію. Лабораторією фізіології там керував І. Р. Тарханов - учень Сєченова. Тарханов запропонував студенту третього курсу Чаговця зайнятися вивченням електричних явищ в нерві жаби, точно так само, як за 50 років до того І. Мюллер запропонував подібну тему студенту третього курсу Дюбуа-Реймон.
Чаговець, звичайно, вважав за краще гіпотезу Германа фантастичним електромоторні молекулам Дюбуа. Але й гіпотеза Германа була занадто абстрактною. Вона говорила про якісь реакціях в протоплазмі, про якісь молекулах, межі ... І Чаговець розвиває конкретний варіант теорії пошкодження, вперше пояснюючи виникнення біопотенціалів дифузією іонів.
Але яке ж конкретну речовину створює потенціал пошкодження?
Як видно з формули, бажано, щоб аніони і катіони речовини мали різну рухливість, а також, щоб його концентрація в місці розрізу сильно відрізнялася від концентрації в непошкодженому ділянці. Чаговець вирішив, що ця речовина - вугільна кислота. Він міркував так: розріз, як будь-яке подразнення, посилює обмін речовин, а значить і виділення С0 2. На підставі даних, отриманих ще Л. Германом, Чаговець прийняв, що концентрація вугільної кислоти в місці розрізу збільшується в 6,5 разів. Різниця швидкостей іонів Н + і СОз _ давала для першого сомножителя формули значення 0,8. Чаговець зробив розрахунок потенціалу пошкодження м'яза при кімнатній температурі, вийшло приблизно 35 мВ. Насправді потенціал пошкодження м'яза становив 50-60 мВ. Різниця була не дуже велика, але все-таки цілком відчутна.
Робота Чаговця під назвою «Про застосування теорії дисоціації Арреніуса до електричних явищ на живих тканинах» вийшла в 1896 р., а на наступний рік її короткий виклад було опубліковано в «Журналі фізичної хімії» Оствальда. У своїй роботі Чаговець намагався пояснити розбіжність результатів розрахунку з експериментом тим, що концентрація вугільної кислоти при розрізі може бути вище, ніж при стомленні м'язи. Але це припущення було спростовано прямими експериментами: наприклад, нейтралізація вугільної кислоти лугом практично не змінює потенціалу ушкодження.
Чаговець зупинив свою увагу на вугільній кислоти не тільки тому, що знав про виникнення різниці її концентрації при роботі м'язи, а ще й тому, що при її дисоціації виникає іон водню - найшвидший з усіх іонів. Швидкості найбільш поширених іонів приблизно однакові, так що перший співмножник у формулі для них замість 0,8 буде 0,01-0,2, і в результаті вийдуть значення різниці потенціалів,, ще більш далекі від реальних. Вигадувати ж якісь фантастичні іони було зовсім не в дусі Чаговця. На перший погляд, ідея дифузії іонів як основи біопотенціалів зайшла в глухий кут. Однак, хоча конкретний варіант теорії біопотенціалів, запропонований Чаговця, виявився помилковим, основна ідея Чаговця виявилася абсолютно правильною; Чаговець був дуже близький до вирішення загадки.
Загадка вирішена
Ще в 1890 р. Вільгельм Оствальд, який продовжував займатися напівпроникні штучними плівками, припустив, що напівпроникливості може викликати не тільки осмос, а й електричні явища. Осмос виникає тоді, коли плівка пропускає маленькі молекули води 1 але не пропускає великі молекули цукру. Але ж і іони можуть мати різні розміри! Тоді мембрана буде пропускати іони тільки одного знака, наприклад, позитивні. Оствальд прямо показав, що на штучних мембранах можуть виникати помітно великі різниці потенціалів, ніж при вільній дифузії іонів на кордоні розчинів з різною концентрацією. І не потрібно швидкий іон водню: годиться будь-який іон, який вміє проходити через мембрану і має різні концентрації по різні її сторони.
Дійсно, якщо подивитися на формулу і припустити, що мембрана для аніонів непроникна, тобто V = 0, то можна бачити, що повинні виходити великі значення для дифузійного потенціалу:
Таким чином, Оствальд об'єднав формулу Нернста і знання про напівпроникних мембранах. Він припустив, що властивостями такої мембрани пояснюються потенціали м'язів і нервів і дивовижне дію електричних органів риб.
Ця ідея Оствальда, як не дивно, пройшла повз біологів, хоча члени самої передової тоді школи фізіологів - школи Дюбуа-Реймона - були зайняті суперечкою якраз про ту проблему, шлях до вирішення якої дав Оствальд. А може бути, саме суперечка завадила сприйняти цю ідею: Герман 1 як автор гіпотези ушкодження, не думав про мембрані, а Бернштейн, який очолив прихильників гіпотези предсуществования, не думав про іонах. До того ж і Герман,; і Бернштейн були вже не молоді: і того й іншого перевалило за 50,; вік 9 коли нелегко сприймати нові ідеї.
І все ж для Бернштейна це виявилося можливим. Він оцінив ідею Оствальда, і, може бути, чималу роль у цьому відіграло те, що в самому головному мембранна гіпотеза була дуже в дусі школи Дюбуа, ніякої таємничої «життєвої сили», ніяких складних невідомих властивостей клітини або протоплазми! все, що вона вимагає, - це мембрани і електроліти. Вирішальний крок, який довелося зробити Бернштейна, полягав у тому, щоб пояснити електричні властивості м'язів і нервів не пристроєм цих органів в цілому, а властивостями клітин, з яких складаються всі тканини я органи. Нарешті-то був прямо вказано «винуватець», що створює «тварина електрику», - клітинна мембрана, а «зброя» - перенесення іонів. Таким чином, в гіпотезі Бернштейна об'єднуються електрохімія та клітинна теорія.
Ю. Бернштейн вважається засновником, так званої мембранної теорії біопотенціалів. Його перша стаття з мембранної теорії вийшла в 1902 р. Починався нове століття в електробіологіі.
Мембранна теорія
Давайте ж подивимося, спочатку чисто якісно, як пояснюється цією теорією виникнення біопотенціалів.
Що було важливо для Бернштейна в будові органів і клітин? М'яз або нерв складаються з клітин, оточених міжклітинної рідиною. Кожна клітина являє собою мішечок чи пляшечку, покритий оболонкою і містить рідину іншого складу.
Оболонка клітини - це і є мембрана. Вона відділяє клітини не один від одного, а внутрішнє середовище клітини від міжклітинного середовища.
Нехай тепер всередині клітини є багато вільних іонів якогось елементу, наприклад калію, а зовні таких іонів немає або їх набагато менше. Нехай клітинна мембрана пропускає тільки іони К + і не пропускає жодних інших іонів. Тоді іони К + почнуть виходити з клітки, де їх багато, назовні. Разом з ними буде виноситися назовні їх позитивний заряд. Всередину через мембрану буде проходити мало іонів, так як зовні мало калію. У результаті на клітинній мембрані буде виникати різниця потенціалів: зовні клітки - «плюс», а всередині - «мінус». Ця різниця потенціалів буде гальмувати рух нових позитивних заряджених іонів калію назовні, і збільшувати потік цих іонів всередину. Коли потоки іонів назовні і всередину зрівняються, встановиться динамічна рівновага і на мембрані буде підтримуватися постійна різниця потенціалів. Це і є потенціал спокою. Його величина описується формулою Нернста.
Щоб вивести цю формулу, скористаємося тим, що відповідно до теорії розчинів Вант-Гоффа перехід іонів з розчину з більшою концентрацією З 2 в розчин з меншою концентрацією С х являє собою як би розширення «іонного газу»: якщо в розчині з концентрацією С 2
деяка кількість іонів займає об'єм V 2, то в розчині з концентрацією С г вони займуть обсяг V lt С г У г . При этом меняется внутренняя анергия ионного газа, которая и переходит в потенциальную энергию зарядов, равную причому C 1 V 1 = З р У р. При цьому змінюється внутрішня енергія іонного газу, яка і переходить в потенційну енергію зарядів, рівну qE, де q - Заряд, а Е - виникла різниця потенціалів.Так як зміна внутрішньої енергії газу визначається тільки його початковим і кінцевим станами і не залежить від того, яким способом відбувся перехід з одного стану в інший, спробуємо знайти зміна енергії в самому простому випадку - коли при розширенні газу відбувається механічна робота.
Нехай у нас є циліндр з газом, закритий поршнем, і нехай газ, розширюючись, рухає поршень, здійснюючи роботу, рівну добутку сили на шлях: А = FI. Сила дорівнює добутку тиску газу на площу поршня, тобто А = PSI. Але твір площі на переміщення є зміна обсягу газу. Отже, зміна енергії газу при розширенні визначається формулою AW = PаV.
т.
Якщо б тиск Р при розширенні, тобто при зміні обсягу, не змінювалося, то робота була б дорівнює добутку Р, т. тобто площі прямокутника ABCD. Але з рівняння газового стану = PV RT = PV випливає, що зі збільшенням обсягу тиск падає за законом Р = ЯП / У. Значить, при постійній температурі Т робота розширення одного моля газу від У пана до У 2 дорівнює площі криволінійної трапеції під гіперболою і може бути обчислена за формулою
А так як концентрація газу назад пропорційна обсягу, то У 2 = СУС 2 та А = ІТ 1п.
Отже, якщо при розширенні іонного газу його концентрація змінилася від С р до З 2, то внутрішня енергія цього газу змінюється
Робота розширення газу при постійному тиску Р х дорівнює площі прямокутника з вершинами I, II, III, IV, т. е А = Р 1 {У 2-У 1). Робота при змінному тиску Р = ВТ'IV дорівнює площі криволінійної трапеції. т. е.
на величину А І 7 = ЯП на кожен моль. Але, з іншого боку, кожен моль одновалентних іона переносить заряд, рівний - числу Фарадея. Звідси й одержуємо, що ВТ 1п = ЕР і остаточно . Таким чином, ми отримали формулу Нернста, і ви тепер розумієте, звідки в цій формулі з'явилася газова стала.
Нам дуже хотілося, щоб, глянувши на формулу Нернста, ви не просто зрозуміли її зміст, але й побачили, яка праця за нею стоїть. Це труд ботаніків, вимірявши осмотичний тиск; фізиків, з'ясувати закони електрики, поповнили науку поняттями заряду і різниці потенціалів, які відкрили закони електролізу і газові закони; хіміків, які створили теорію розчинів і електролітичної дисоціації; математиків, праці яких дозволили Ньютону і Лейбніца створити диференціальне та інтегральне числення. Про деякі з цих робіт ми вам коротко розповіли, а про багатьох не можемо розповісти, так як вони лежать далеко в стороні від нашої основної теми. Але на цьому прикладі нам хотілося показати, як в одній формулі зібралися воєдино праці та ідеї тисяч учених різних часів і країн.
Знову про Бернштейн
Але не слід думати, що достатньо було тільки висловити загальну ідею, щоб усі відразу з нею погодилися, і самому Бернштейна, а потім і його послідовникам потрібні були роки й десятиліття напруженої праці, суперечок, сумнівів і розчарувань, поки, нарешті, вдалося довести свою правоту . Сама ж по собі гіпотеза мембранного потенціалу виглядала в той час аніскільки не краще, ніж гіпотеза пошкодження або навіть гіпотеза електромоторні молекул. Тому першу статтю з викладом своїх поглядів Бернштейн випустив у світ тільки тоді, коли він зумів отримати експериментальні дані, які могли послужити аргументом, хоча і непрямим, в їх користь.
Знайти один з таких аргументів Бернштейна допомогла все та ж формула Нернста. У цю формулу крім невідомих концентрацій невідомо якого іона входить ще Т - температура, а вже її-то можна було не тільки виміряти, але й змінювати на свій розсуд.
Провівши серію дослідів на м'язі жаби, Бернштейн показав, що якщо нагрівають поздовжню неушкоджену поверхню м'яза, то в певному діапазоні реєстрований потенціал ушкодження, дійсно, прямо пропорційний Т, як і випливає з формули Нернста. Нагрівання самого розрізу, навпаки, не впливало на значення потенціалу. Це і був аргумент проти теорії пошкодження.
Інша серія дослідів була ще більш ефектною. Бернштейн показав, що якщо нагрівати один кінець цілої непошкодженою м'язи, то від нагрітого до холодного місцем поверхні м'язи потече струм, Цей результат також прямо випливає з теорії: в більш теплому місці поверхні виникає більший позитивний потенціал, ніж у холодному.
Як ми вже згадували, у 1902 р, вийшла перша стаття Бернштейна з мембранної теорії. Цей рік і вважається роком її народження.
Дуже слабким місцем мембранної гіпотези була повна відсутність даних про те, який саме іон викликає потенціал. Але от у 1905 р. в Берліні молодий співробітник Нернста Гебер виявляє, що всі солі, що містять калій, надають подібне дію на м'яз: ділянка м'язи, на який діє розчин такої солі, набуває негативний потенціал по відношенню до інших ділянок м'язи.
Бернштейн відразу оцінює значення роботи Гебер - адже мембранна теорія пояснює ці результати дуже просто: варто лише припустити, що К + і є тим іоном, який створює потенціал. Усі солі, що містять калій, діссоцііруя в розчині, збільшують зовнішню концентрацію іонів калію, при цьому відношення концентрацій СУСН падає, і область, на яку діють сіллю, набуває менший, ніж інші ділянки, потенціал.
Факти самі по собі мало про що говорять. Герман, майже за 40 років до Берпштейна, спостерігаючи вплив температури на м'яз, бачив, що при нагріванні ділянки, віддаленого від розрізу, потенціал зростає. Ці факти не мали тоді тлумачення і тому були напівзабутих. Вплив солей калію на потенціал, виявляється, теж було описано за 10 років до Гебер в книзі Бідерман, присвяченій електробіологіі, і на це теж не звернули уваги. Тільки теорія надає експериментальним фактам сенс, дозволяє відокремити суттєві від другорядних, висвітлює їх значення внутрішнім світлом,
У 1912 р. вийшла в світ велика книга Бернштейна «Електробіологія». У цій книзі дано пояснення не тільки потенціалу спокою, але і багатьох інших явищ, про що ми розповімо далі. Але дуже важливо, що Бернштейн пророкує набагато більш загальне значення мембранної теорії, ніж просто пояснення роботи м'язи і нерва. Адже з мембранної теорії для виникнення ПП ніяких спеціальних властивостей від клітини не потрібно, і цілком природно було припустити, що ПП властивий не тільки цим тканинам, що всі клітини можуть виробляти електрику. Бернштейн пояснює роботу електричного органу риб, роботу залоз, руху комахоїдних рослин і навіть намагається пояснити рух внутрішньоклітинних часток - хромосом - при діленні клітин клітинними потенціалами.
Ця книга примушує згадати про іншу книзі, книзі В.Ю. Чаговця, що вийшла в 1903 р. Мимоволі виникає враження, що Вернштейн йде прямо по стопах Чаговця, у якого в книзі ми бачимо ті ж голови: про роботу залоз і шкірних потенціалах, про роботу електричних органів, про потенціали в рослинних клітинах. Прийшов час узагальнень. Накопичений за століття матеріал виявилося можливим побачити з єдиної точки зору.
Однак і після виходу в світ книги Бернштейна мембранна теорія не викликала особливого захоплення. І це закономірно, оскільки не дивлячись на досить глибоку розробку теорії, проведену Бернштейном, всі експериментальні її підтвердження були непрямими: вони доводили слідства теорії, а як добре розуміють математики, якщо з А слідує Б, то це не означає, що з Б слід А . Тому всі основні твердження мембранної теорії були по суті гіпотезами, і для доказу її істинності не було іншого шляху, як довести правильність гіпотез, покладених в її основу, а саме довести, що:
а) клітини мають мембрану, проникну для якогось іона,
б) концентрація цього іона всередині клітини сильно відрізняється від його концентрації в зовнішній середовищі;
в) потенціал виникає на мембрані тільки за рахунок її проникності для цього іона і тому дорівнює нернстовскому потенціалу.
Поки даних, прямо підтверджують істинність цих фундаментальних положень мембранної теорії, не було, слідство з неї могло отримати і одержувало в тривав суперечці інше тлумачення. Так, вплив температури могло пояснюватися прискоренням хімічних реакцій нехай не в місці пошкодження, а на поверхні м'яза; вплив калію на величину ПП також могло бути витлумачено як його хімічну взаємодію з речовиною клітини і т. п.
Найбільшим нападкам піддавалася основа основ теорії - саме існування мембрани, яку ніяк не вдавалося побачити у найсильніший мікроскоп. Заперечення ставилися не тільки до якісної картині явищ: були створені теорії, які пояснювали ПП властивостями протоплазми і передбачали ту ж лінійну залежність ПП від температури.
Таким чином, встановити, яка теорія вірна, за допомогою непрямих експериментів виявилося неможливим. А прямі експериментальні докази мембранної теорії були отримані дуже нескоро: вони вимагали досліджень на клітинному рівні, а в той час клітина як така ще не стала об'єктом електрофізіологічного експерименту.
Докази мембранної теорії. Що зовні? Що всередині?
З трьох основних «діючих осіб» мембранної теорії - мембрана, зовнішня середовище, внутрішнє середовище - досить добре була досліджена лише зовнішня середовище, і не тільки тому, що вона була найбільш доступною. Хімічним складом середовища, що оточує клітини організму, біологам вже давно довелося займатися поза всяким зв'язком з мембранної теорією. За будь-яких експериментах на ізольованих органах їх потрібно тримати у спеціально підібраному розчині. Наприклад,, серце жаби не можна залишати просто на повітрі - воно висохне і перестане працювати, але не можна помістити його і в воду - під дією осмосу клітини органу загинуть.
Природно, підбір таких розчинів був пов'язаний з дослідженням складу крові, гемолімфи і т. д., тому цей склад і був досить добре відомий.
Тому важливий для підтвердження мембранної теорії сольовий - а значить і іонний - склад таких позаклітинних рідин був добре відомий. Виявилося, що «головний постачальник» іонів всіх таких розчинів - звичайна кухонна сіль. Припускають, що в цьому відбивається походження тварин, головні іони морської води - теж натрій і хлор.
Особливо цікаво і дуже істотно з точки зору мембранної теорії те, що хоча абсолютна концентрація солей в тканинної рідини різних організмів в залежності від умов їх проживання сильно варіює, але співвідношення концентрацій іонів натрію і калію в середовищі, що оточує клітини організму, приблизно однаково для всіх тварин - від медузи до людини. Концентрація калію приблизно в 50 разів менше, ніж натрію. Таким чином, у всіх тварин це середовище по суті являє собою більшою чи меншою мірою розбавлену морську воду.
Набагато важче було визначити іонний склад внутрішньоклітинного вмісту. Вчені намагалися використовувати для визначення цього складу найрізноманітніші методи, про які ми не будемо вам докладно розповідати, по всі дані, отримані цими методами, були лише приблизними: клітини занадто малі, а між ними завжди є міжклітинну речовину і рідина. Крім того, прихильникам мембранної теорії треба було не просто показати наявність калію всередині клітин, а наявність саме вільних, незв'язаних іонів калію. Ця проблема була, як вже не раз траплялося, вирішена за допомогою двох підходів: і розробкою нових методів вимірювання, і підбором відповідного об'єкта.
У 1936 р. англійський фахівець з головоногим молюскам Дж. Юнг виявив у кальмарів нервове волокно, діаметр якого сягав до міліметра, тобто по клітинних масштабами гігантське, хоча сам молюск зовсім не був гігантським. Таке волокно, виділена з організму і вміщений у морську воду, не гинуло. Нарешті-то з'явилася жива клітина, в яку можна було проникнути, з якою можна було працювати.
У 1939 р. англійські вчені А. Ходжкін і його учень А. Хакслі вперше виміряли різницю потенціалів на мембрані тваринної клітини. Вдалося також довести, що усередині цього волокна дійсно багато іонів калію, що ці іони являють собою «іонний газ», тобто можуть брати участь у створенні мембранного потенціалу. При цьому розрахункове значення ПП непогано збігалося з безпосередньо виміряним.
Поширити ці дані з унікальною клітини - гігантського аксона - на звичайні клітини стало можливим, коли в 1946 р. американські вчені Джерард і Лінг розробили нову методику - методику мікроелектродів. Мікроелектрод - це витягнута ІЕ нагрітої скляної трубочки тоненька піпетка з діаметром кінчика менше 1 мкм, заповнена розчином електроліту.
Скло грає роль ізолятора, а електроліт - провідника. Такий електрод можна ввести в будь-яку клітину, практично її не пошкоджуючи.
Нова техніка експерименту швидко отримала широке поширення в самих різних дослідженнях і за кілька років буквально завоювала світ. Сам Джерард в США зареєстрував ПП м'язи жаби, скорочення якої спостерігав Гальвані і струми ушкодження, в якій вивчав Дюбуа-Реймон. Дж. Екклс в Новій Зеландії зареєстрував ПП клітини мозку, Б. Катц в Англії почав вивчати за допомогою нових електродів дію нерва на м'яз; у Швейцарії С. Вайдман першим зумів ввести крихкий мікроелектрод в скорочувалося серце. У нашій країні піонером Мікроелектродна досліджень став співробітник Київського державного університету Платон Григорович Костюк, який почав застосовувати цю техніку в середині 50-х років.
Незабаром були отримані досить повні дані про величину ПП для різних клітин, ПП був виявлений не тільки у м'язових і нервових клітин, а й у еритроцитів, клітин шкіри, печінки та ін Якщо вважати, що причиною ПП служить різниця концентрацій іонів калію у внутрішній і зовнішньої середовищах клітин, розділених мембраною, а всі клітини в цьому відношенні влаштовані в загальному схоже, то наявність ПП абсолютно закономірно, хоча і не ясно, навіщо знадобився ПП, наприклад, клітинам слинної залози або печінки.
Про користь бракованих мікроелектродів
Тепер, коли досить точне вимірювання ПП в окремій клітці не представляло проблеми для перевірки мембранної теорії за формулою Нернста, залишалося зробити останній крок - навчитися так само точно визначати іонний склад у клітці. І чудово, що розвиток мікроелектронної техніки допомогло вирішити і це завдання.
Справа в тому, що виготовлення мікроелектродів - це ціле мистецтво: і скло підібрати, щоб добре тягнулося, і режим нагріву і швидкість витягування, щоб куприк не обламувати і внутрішній канал не закупорював, і т. д. і т. п. І раптом виявилося , що навіть якщо в досвіді використовувався поганий, «бракований» електрод, у якого на кінчику взагалі не було отвору, потенціал все одно реєструвався, як ніби скло було не ізолятором, а провідником. Коли стали в цьому розбиратися, виявилося, що, дійсно, тоненькі стінки мікроелектродів з деяких сортів скла представляють собою - що б ви думали? - Напівпроникну мембрану, тобто вибірково пропускають іони будь-якого сорту.
Якщо такий електрод, заповнений розчином з відомою концентрацією досліджуваного іона, опустити в розчин, що містить той же іон, то, знаючи значення виник нернстовского потенціалу, можна використовувати формулу Нернста для розв'язку оберненої задачі - визначити невідому концентрацію іона в досліджуваному розчині.
Використання таких електродів у поєднанні з методом мічених атомів та іншими методами дозволило визначити іонний склад внутрішньоклітинного вмісту. Виявилося, що, як і передбачала мембранна теорія, всередині клітин концентрація іонів калію в 30-40 разів вище, ніж у зовнішній середовищі. Виявилося також, що співвідношення калію і натрію всередині клітин тварин зовсім інше, ніж поза ними: у той час як поза клітини багато натрію, в клітинах, навпаки, калію майже в 10 разів більше, ніж натрію.
Високий вміст іонів калію було виявлено не тільки в нервових, але і в різних інших клітинах організму. Таким чином, внутрішній вміст всіх клітин тварин виявилося не схожим на морську воду. У ході еволюції ці клітини створили свою особливу внутрішнє середовище.
Клітинна мембрана
Отже, питання про іонному складі внутрішнього і зовнішнього середовища, а також про величину ПП були вирішені; це побічно свідчило й існування мембрани.
Побачити мембрану вдалося лише в середині 50-х років нашого століття. Це було зроблено за допомогою електронного мікроскопа, так як товщина мембрани складає всього 7 -15 нм і в світловий мікроскоп її побачити не можна. Однак ще до того, як її безпосередньо побачили, сумніви в її існуванні практично зникли; численні дослідження, що спираються на факти з різних областей, свідчили, що мембрана існує, більше того, до цього часу було відомо досить багато про її устрій і властивості: товщині , електричному опорі і т. д.
Зазвичай, кажучи про наукові передбачення, розповідають про відкриття «на кінчику пера» планети Нептун, або про пророкування існування атомів і молекул, або про пророкування Менделєєвим хімічних елементів, які заповнили залишилися порожніми відповідні клітини його таблиці. Але і в біології можна знайти чимало прикладів таких наукових передбачень. Наприклад, Гарвей, створюючи теорію кровообігу, передбачив існування капілярів, але побачити їх зміг тільки М. Мальпігі після винаходу мікроскопа. Точно так само клітинна мембрана була передбачена задовго до появи електронного мікроскопа.
Дуже багато відомостей про властивості мембрани дало вивчення проникнення різних речовин в клітку. Це особливий, дуже захоплюючий і дуже заплутаний розповідь, який ми не можемо тут навести. Але загальний висновок з нього дуже повчальний. Справа в тому, що, як зараз з'ясовано, різні речовини потрапляють в клітину різними способами: одні, розчиняючись в жирах мембрани, проникають у клітину прямо через них, інші речовини, які не можуть проходити через жири, проникають через особливі «пори», освічені мембранними білками, треті - зовсім інакше, наприклад, «захоплюючи» кліткою, в якій утворюється отшнуровивающійся і йде всередину мембранний пухирець, і це ще не всі способи. Тим часом вчені намагаються пояснити деяке явище з єдиної точки зору. Для науки ідеалом є, наприклад, теорія Максвелла, яка дозволила зв'язати воєдино електричні, магнітні та оптичні явища, описавши їх основні властивості кількома рівняннями. Таку ж єдину теорію шукали і вчені, які вивчали клітинну проникність. Однак, як ми тепер розуміємо, у разі клітинної проникності такої єдиної теорії просто не існувало. При наявності багатьох принципово різних способів проникнення речовин в клітку для кожної теорії, що претендує на повне пояснення фактів з єдиної точки зору, перебував спростовує її експеримент. Ми всі стикалися з аналогічною ситуацією; згадайте, як Вольта намагався пояснити з єдиної точки зору і контактну різницю потенціалів, і роботу хімічних елементів. Так, природне прагнення вченого до створення єдиної теорії іноді грає роль гальма в розвитку науки. Але повернемося до мембрани.
Поверхня всякого організму відіграє особливу роль, так як це - місце зіткнення організму і середовища. Саме на поверхні знаходиться захисний шар; на поверхні знаходяться органи чуття; через поверхню організм одержує воду, їжу і кисень. Всі ці міркування можна застосувати й до окремій клітці. Через поверхневу мембрану клітина отримує різні речовини, через неї ж виводяться назовні продукти обміну. У мембрану вбудовані особливі білки-рецептори - «органи чуття» клітини. Але мембрана покриває не тільки поверхню клітини, всередині клітини теж є безліч мембран, які ділять клітину на відсіки, оточують її органели. Особливою двошарової ядерною мембраною оточене ядро клітини, свою мембрану мають «енергетичні станції клітки» - мітохондрії. У бульбашках з мембран - лізосомах - зберігаються деякі клітинні ферменти і т. д.
Про мембрани тепер відомо так багато, що виникла особлива наука - мембранологія; в нашій країні виходить спеціальний журнал «Біологічні мембрани», а за кордоном журнал «Біологія мембран». Для докладної розповіді про мембранах потрібно було б написати окрему книгу. Такі книги вже написані, тому ми розповімо тут про мембранах лише те, що буде нам абсолютно необхідно для подальшого.
Клітинна мембрана являє собою рідку плівку, утворену жироподібні речовини - ліпідами. Вона складається з двох шарів ліпідних молекул, в які вбудовані молекули білка.
Нас, перш за все, будуть цікавити, звичайно, електричні характеристики мембрани, які були визначені за допомогою самих різних методів. Ця робота була розпочата ще в 1910 р. в лабораторії Нернста і в ній брав участь той самий Гебер, який відкрив вплив солей калію на потенціал м'язів. Виміри проводилися на суспензії клітин. Основний метод вимірювання полягав у тому, що через суспензію пропускали струм різної частоти і визначали її питомий опір. Була розвинена теорія, яка дозволяла окремо визначити опору мембрани клітини і її протоплазми, так як їх ставлення залежало від частоти пропускається струму.
Розвиваючи цей напрямок, Г. Фрікке в 1925 р. показав, що мембрана веде себе в дослідах як паралельно з'єднані опір і ємність, тобто, як кажуть, з'ясував еквівалентну схему мембрани. Схема ця спочатку була встановлена Для мембрани еритроцитів; Фрікке використовував при вимірах частоти до 4,5 Мгц, так що успіху його роботи сприяв розвиток фізичних приладів - поява генераторів високої частоти. У подальшому на самих різних клітинах вдалося виміряти опір мембрани, її ємність, а також питомий опір протоплазми. Г. Фрікке і Г. Кертіс працювали з еритроцитами, лейкоцитами, одноклітинної водорості - хлорела, дріжджами; К. Кількість працював з яйцеклітинами голкошкірих, м'язовими і нервовими клітинами.
Виявилося, що питома ємність мембрани у всіх вивчених клітин складає приблизно 1 мкФ / см 2. Не дуже сильно відрізняється у різних клітин і питомий опір протоплазми, воно зазвичай близько до 100 Ом-см, тобто приблизно таке ж, як у морської води. Навпаки, питомий опір мембрани у різних клітин виявилося досить різним! Так, наприклад, у яйцеклітин морського їжака питомий опір мембрани складає всього 100 Ом-см 2, а у водорості нігелли - 100 000 Ом-см 2 *).
Чому ж у різних клітин мембрана має однакову питому ємність і настільки різне питомий опір? Справа в тому, що ємність мембрани визначається її ліпідним шаром, який можна розглядати як діелектрик, що знаходиться між двома пластинами конденсатора.
А ось опір мембрани визначається не ліпідами, а тими молекулами білка, які вбудовані в рідкий ліпідний шар і плавають в ньому, як айсберги, «прошиваючи» мембрану наскрізь. Ці молекули в різних клітинах відрізняються і за кількістю, і за властивостями - звідси і різне питомий опір. Якщо прибрати з ліпідного бішару білок, то питомий опір такій «чистої» мембрани виявляється досить високим - порядку 10 8 Ом-см 2.
За допомогою ізотопних і інших методів було показано, що клітинна мембрана дійсно є напівпроникною: вона добре пропускає позитивні іони калію, але не пропускає клітинні аніони. Але повернемося до мембранної теорії.
Досліди на «голої» мембрані - торжество мембранної теорії
У 1961 р. А. Ходжкін і його співробітники Бекер та Шоу поставили дуже гарний досвід. Ще коли Юнг відкрив гігантський аксон у кальмара, він зауважив, що при натисканні на такий перерізаний аксон його вміст видавлюється з нього, як паста з тюбика, і залишається порожня «шкурка». Ось з цією оболонкою, тобто мембраною аксона, і почали працювати Ходжкін і його співробітники. Вони брали аксон, клали його на гумову підкладку, щоб не пошкодити, і за допомогою гумового ролика вичавлювали з нього протоплазму. Виходила порожня трубка з однієї мембрани. Цю трубку через піпетку, вставлену в торець, можна було заповнювати різними розчинами. Таким чином, з'явилася можливість працювати на мембрані нервового волокна, змінюючи довільно концентрацію речовин як зовні, так і всередині аксона.
Виявилося, що при заповненні аксона розчинами, що містять таку ж концентрацію К +, як і протоплазма, у аксоні виникав нормальний потенціал спокою близько 50-60 мВ. При цьому з'ясувалося, що природа негативних іонів, які вводилися в волокно разом з калієм, не дуже істотна. Якщо концентрація калію всередині волокна і в зовнішній середовищі була однаковою, то потенціал спокою в повній відповідності з формулою Нернста не виникало. Якщо ж всередину волокна накачували морську воду, а в зовнішнє середовище - розчин з високою концентрацією калію, то знак потенціалу спокою змінювався: усередині волокна виникав знак «плюс», а зовні - «мінус»; при цьому величина ПП відповідала формулою Нернста. Таким чином, введення всередину волокна сольових розчинів різного складу підтвердило результати, отримані раніше при зміні зовнішньої концентрації іонів калію.
Ці досліди показали, по-перше, вирішальну роль мембрани у виникненні ПП - адже протоплазма з усіма органелами і білковими молекулами просто не існувало, а по-друге, - вирішальну роль іонів калію в цьому процесі. Мембрана нервового волокна працювала так, як це передбачалося мембранної теорією Бернштейна.
Мембранна теорія вимагає уточнень
Часто, коли теорія досягає зрілості, отримує визнання, живе, починає зростати точність вимірювань і виявляються відступу від теорії, що вимагають пояснень. Закони Кеплера стверджували, що планети рухаються по еліпсах, але при більш точних спостереженнях виявилося, що орбіти не цілком еліпси, що існують обурення, які були пояснені як результат дії на планету сили тяжіння інших планет. Саме облік збурень дозволив відкрити планету Нептун.
Те ж саме відбулося і з мембранної теорією. Коли методи вимірювання ПП і іонних концентрацій досягли досить високої точності, виявилося, що насправді вимірюваний ПП завжди нижче, ніж обчислений теоретично за формулою Нернста. Ясно, що існував якийсь «збурює» чинник, не врахований теорією Бернштейна.
Знайти причину розбіжності експерименту і теорії допоміг знову-таки кальмар. Працюючи з гігантським аксонів, А. Ходжкін і Б. Катц встановили, що ПП, вимірюваний в досвіді, виявляється ближче всього до теоретичного в одному особливому випадку: якщо з зовнішньої середовища забирається натрій.
Але причому тут натрій? Якщо, як вважав Берн-штейн, мембрана проникна тільки для калію, то натрій взагалі не повинен впливати на ПП! А що якщо припущення Бернштейна помилково? Що буде, якщо, посягнувши на "основу основ» мембранної теорії, припустити, що натрій теж проходить через мембрану? Легко зрозуміти, що тоді іони натрію, яких зовні клітини набагато більше, ніж усередині, будуть йти по градієнту концентрації всередину, створюючи свій нернстовскій потенціал, протилежний за знаком того, що створюється калієм, і отже, будуть знижувати ПП. Це рівнозначно тому, що до мембрани підключений не один, а два з'єднаних назустріч один одному джерела е.р.с. Е.р.с. цих джерел визначаються концентраційними градієнтами калію і натрію. Ходжкін і Катц перевіряють своє припущення експериментально, змінюючи концентрацію натрію в зовнішньому середовищі і порівнюючи значення ПП із теоретичними. Виявилося, що для збігу експериментальних даних з розрахунковими доводиться прийняти, що опір, через який йдуть іони натрію в 25 разів більше, ніж для калію. Це означає, що проникність мембрани для іонів натрію, хоча і в 25 разів менше, ніж для калію, але все ж не дорівнює нулю.
Незабаром припущення, що іони натрію можуть проходити через мембрану гігантського аксона, було прямо доведено в дослідах з радіоактивним ізотопом натрію. У ході цих робіт учені відкрили особлива речовина, тетродотоксин, блокуючу рух натрію через мембрану. Наразі вдалося показати, що якщо додати в морську воду, навколишнє гігантський аксон, тетродотоксин і натрій перестає йти через мембрану, то ГШ починає наростати і досягає значення, в точності що дорівнює сумі, яке передбачається формулою Нернста. Тим самим роль натрію була повністю доведена.
На перший погляд здається, що уточнення, внесені Ходжкіна і Катцу в мембранну теорію Бернштейна, несуттєві. Всього-то і виявилось, що мембрана пропускає, крім калію, трохи натрію: калій створює потенціал одного знака, натрій - іншого, в результаті виходить ПП трохи нижче, ніж тільки від калію.
Проте насправді ситуація змінюється докорінно.
На мембрані встановлюється певний проміжний потенціал, який, природно, не є рівноважним ні для одного з цих іонів. Тому і той і інший іон будуть рухатися по градієнту концентрації: іони натрію - всередину, а іони калію - назовні, поки не зрівняються концентрації, принаймні, одного з них.