Лізосома
Лізосоми - це гетерогенні органели. Вони надзвичайно різноманітні за формою і розміром, але можуть бути ідентифіковані як одне сімейство органел методами гістохімії. Лізосоми були виявлені у всіх еукаріотичних клітинах.
Лізосоми спеціалізуються на внутрішньоклітинному розщепленні речовин. Вони містять унікальні мембранні білки і велику кількість різних гідролітичних ферментів, які краще всього працюють при кислих значеннях pH (pH5), характерних для вмісту лізосом. Кислий pH в лізосомах підтримується за допомогою АТР-залежної протонної помпи в їх мембранах. Знову синтезовані білки лізосом переносяться в порожнину ЕР, потім транспортуються через апарат Гольджі і з транс-мережі Гольджі за допомогою транспортних бульбашок доставляються в проміжний компартмент (ендолізосому). Таким чином гетерогенність лізосом відображає широкий спектр реакцій розщеплення, що протікають за участю кислих гідролаз, зокрема шляхом розщеплювання внутрішньо-і позаклітинних відходів, переварювання фагоцитованих мікроорганізмів і навіть харчування клітини (оскільки лізосоми - це основне місце накопичення холестеролу з надходять у клітку шляхом ендоцитозу сиворочних ліпопротеїнів). На цій підставі лізосоми іноді розглядають як групу різнорідних органел, загальною властивістю яких є високий вміст гідролітичних ферментів.
Лізосомні гідролази містять N-зв'язані олігосахариди, які модифікуються в ціскомпартменте Гольджі таким чином, що їх залишки манози фосфорилюються. Ці манози-6-фосфатні (М6Ф) групи пізнаються в транс-мережі Гольджі М6Ф-рецептором, який відбирає гідролази та допомагає упаковувати їх у відбруньковуються покриті клатріном бульбашки. Транспортні бульбашки, що тримають рецептор манози-6-фосфату, діють подібно човникам, доставляючи рецептор від транс-мережі Гольджі до ендолізосомам і назад. Низький рівень pH у ендолізосомах викликає дисоціацію комплексу лізосомної гідролази та рецептора, роблячи транспорт гідролаз односпрямованим.
Всі білки, що проходять через апарат Гольджі, крім тих, які залишаються там в якості постійних компонентів, сортуються відповідно до місця кінцевого призначення в транс-мережі Гольджі. Особливо добре механізм цієї сортування вивчений для білків, що прямують в порожнину лізосом.
Лізосома є трансмембранним мішок, наповнений гидролитическими ферментами, які служать для контрольованого внутрішньоклітинного розщеплення макромолекул. Пошкодження мембрани лізосом, викликане осмотріческім лізисом або старінням препарату, призводить до вивільнення цих ферментів з лізосом у неосаждаемой формі.
Відомо близько 40 гідролітичних ферментів, що містяться в лізосомах. Це різні протеази, нуклеази, глікозідази, ліпази, фосфоліпази, фосфатази і сульфатази. Крім того, всі вони - кислі гідролази, що володіють найбільшою активністю при pH5. Саме таке значення pH підтримується в лізосомах. У нормі мембрана лізосом не проникна для цих ферментів, але навіть у разі їх витоку необхідність кислого pH для функціонування гідролаз захищає цитоплазму від руйнування.
Лізосоми не тільки містять унікальний набір ферментів, але і оточені незвичайної, несхожою на інші, мембраною. Ця мембрана, наприклад, містить транспортні білки, що дозволяють продукти розщеплення макромолекул залишати лизосому, після чого вони можуть або виділятися з клітки, або використовуватися усередині неї вдруге. Крім того вважають, що в мембрані лізосоми знаходиться спеціальний білок, що використовує енергію АТР для накачування іонів водню в лизосому. Саме це підтримує в порожнині даної органели pH близько 5. Більшість білків лізосомної мембрани незвично сильно гліколізірованного, що, можливо, захищає їх від дії протеаз в порожнині органели.
Транспорт молекул в лізосоми відбувається по-різному і залежить від джерела цих молекул. Найбільш добре вивчений шлях, по якому йде розщеплення матеріалу, поглиненого шляхом ендоцитозу. Він включає облямовані ямки, ендосоми, і, нарешті, лізосоми.
Заклопотані шляхом ендоцитозу молекули проходять послідовно від периферичних до перинуклеарних ендосомам. Ті компоненти, які не були витягнуті з цих ендосом, щоб повернутися в плазматичну мембрану, потрапляють потім у третій «проміжний компартмент», який одержує новосинтезовані лізосомні гідролази та білки лізосомної мембрани з апарату Гольджі. Оскільки середовище в цьому ендолізосомном компартменте слабокисла, вважають, що саме тут починається гидролитическое розщеплення ендоцірованного матеріалу. Для перетворення ендолізосом в зрілі лізосоми необхідно, щоб вони втратили певні компоненти мембран, а рівень pH всередині них ще знизився. Як відбувається це перетворення, невідомо.
Існує і другий шлях транспорту матеріалу в лізосоми. Саме з ним пов'язано руйнування відпрацьованих частин самої клітини - процес, званий аутофагія. Відомо, наприклад, що в клітинах печінки середній час життя однієї мітохондрії становить близько 10 днів. На електронних мікрофотографіях нормальних клітин можна побачити лізосоми, що містять мітохондрії і секреторні пухирці. Ймовірно, це відпрацьовані органели, які повинні бути утилізовані в лізосомах. Процес деградації, мабуть, починається з оточення органели мембранами, які походять з ЕР, в результаті чого утворюється аутофагосома. Потім, як вважають, аутофагосома зливається з лізосомами (або ендолізосомой), утворюючи аутофаголізосому, в якій вже починається процес деградації. Цей процес добре відрегульований; окремі компоненти клітини можуть направлятися в лізосоми для розщеплення у разі необхідності: наприклад, гладкий ЕР, що утворився в клітинах печінки у відповідь на лікарські препарати, після виведення препарату з організму видаляється шляхом аутофагії.
Третій шлях надходження матеріалу в лізосоми є тільки у клітин, спеціалізованих для фагоцитозу великих часток і мікроорганізмів. Такі клітини, як макрофаги і нейтрофіли, можуть поглинати великі об'єкти, утворюючи фагосоми. Припускають, що фагосомою перетворюється на фаголізосому тим же способом, який описаний для аутофагосоми.
Лізосоми утворюються шляхом синтезу специфічних лізосомних гідролаз і мембранних білків. І ті, і інші білки синтезуються в ЕР та транспортуються через апарат Гольджі. Транспортні бульбашки, що доставляють їх у ендолізосоми, відокремлюються від транс-мережі Гольджі. Ці бульбашки повинні включати саме лізосомні білки і не включати безліч інших білків, які упаковуються в інші транспортні бульбашки і доставляються в інші органели.
Механізм впізнавання лізосомних білків і точність відбору на молекулярному рівні відомий тільки для одного класу ферментів - лізосомних гідролаз. Вони мають унікальний маркер - манози-6 - фосфат, який приєднується до N-пов'язаним олігосахариду цих розчинних лізосомних ферментів. Реакція протікає в просторі цис - компартмента Гольджі. Відповідні маннозофосфатние рецептори групуються на мембрані і потім концентруються в покритих клатріном облямованих пухирцях. Ці рецептори є трансмембранні білки, які зв'язують лізосомні ферменти, відокремлюючи їх таким чином від всіх інших білків і збираючи в облямовані транспортні бульбашки. Ці бульбашки швидко втрачають свою облямівку і зливаються з ендолізосомамі.
У деяких клітинах невелика кількість рецепторів манози-6-фосфату присутній в плазматичній мембрані, де вони беруть участь у ендоцитозу лізосомних ферментів, які були виділені в позаклітинне середовище. Завдяки цим рецепторам ферменти через облямовані ямки потрапляють до ендосомам, а звідти до лізосом. Таким незвичайним шляхом, за допомогою «лахмітників» і доставляються в лізосоми гідролази, які уникли процесу пакування в транс-мережі Гольджі і були тому транспортовані до клітинної поверхні і виведені назовні.
Маннозофосфатний рецептор зв'язує специфічний олігосахарид при pH7 і відщеплює його при pH6; саме такий pH існує всередині ендолізосом. Лізосомні ферменти в ендолізосоме відокремлюються від білка - рецептора манози-6-фосфату і починають розщеплювати поглинений матеріал, який містився в ендосомах. Відокремившись від «своїх» ферментів, рецептори відновлюють структуру і повертаються в мембрану транс-мережі Гольджі, можливо, у складі облямованих бульбашок. Такий механізм повернення мембран з ендолізосом назад в апарат Гольджі вельми нагадує кругообіг мембран між ендосомамі і плазматичною мембраною при опосередкованому рецепторами ендоцитозу. Опосередкований рецепторами транспорт лізосомних гідролаз з апарату Гольджі до ендолізосомам аналогічний ендоцитозу позаклітинних молекул, направляючим їх від плазматичної мембрани в ендосоми. В обох випадках рецептори збираються в покритих клатріном ділянках мембрани (званих облямованими ямками); ці ділянки отшнуровиваются від мембрани, утворюючи вкриті клатріном облямовані бульбашки. Бульбашки доставляють потім ліганд до наступного компартмент, що має кисле середовище, і звідти рецептори повертаються у вихідну мембрану.
Кругообіг маннозофосфатного рецептора було простежено за допомогою специфічних антитіл, що дозволяють локалізувати цей білок у клітці. У нормі рецептори манози-6-фосфату виявляють у мембрані апарату Гольджі і мембрані ендолізосом, але не в зрілих лізосомах. Показано, що переміщення рецептора назад в апарат Гольджі сприяє його конформационное зміна, пов'язане з відщепленням гідролази.
Човникова система рецептора манози-6-фосфату є специфічною - бульбашки, що несуть цей рецептор, зливаються тільки з потрібними органелами-мішенями, а не, наприклад, з мембраною ЕР. Вважають, що клатріновая облямівка на формуються бульбашках діє подібно до «молекулярному фільтру», ізолюючому рецептор і його ліганд всередині бульбашок. Однак клатрін може відповідати за специфічність доставки бульбашок, так як облямівка видаляється незабаром після їх утворення. Видалення клатріна каталізується hsp 70-подібним білком, а відповідна реакція вимагає гідролізу АТР. Один або декілька білків, що залишаються на зовнішній стороні мембрани пухирця, ймовірно служать специфічними «сигналами навантаження», які пізнаються комплементарним «приймальником» на мембрані органели-мішені.
Вивчення механізмів сортування лізосомних гідролаз дає уявлення про протікають в клітинах еукаріот процесах переносу речовин за допомогою транспортних бульбашок. Неважливо, що олігосахаридних маркери, мабуть, більше ніде не використовуються, всі інші події - розпізнавання «вантажу» мембранним рецептором при відбруньковування бульбашки, злиття бульбашки із специфічною мембраною-мішенню, вивільнення «вантажу» в компартмент - мішень і повернення звільнився рецептора в вихідний компартмент - ймовірно, є загальними для всіх видів везикулярного транспорту.
Для приєднання маннозофосфатних груп до лізосомних гідролаз необхідна послідовна робота двох ферментів. N-ацетилглюкозамін - фосфотрансфераз (GlcNAc-фосфотрансфераз) переносить GlcNAc-P-частина молекули нуклеотид-цукру UDP-GlcNAc до залишку манози в олігосахариди, а другий фермент - фосфоглікозідаза - потім видаляє кінцевий GlcNAc, залишаючи фосфат, в результаті утворюється манози-6- фосфат. Фосфотрансфераз специфічно зв'язується з гідролазою завдяки дільниці (або сайту) впізнавання, який не збігається з активним центром цієї реакції
Мабуть, в даному випадку сигнал впізнавання є тривимірний ділянку, а не сигнальний пептид. Про це свідчить той факт, що при частковому розгортанні гідролази розпізнавання практично припиняється.
Як тільки фосфотрансфераз дізнається сигнал на гідролаз, вона приєднує GlcNAc-P до одного або двох маннозним залишкам в кожній олігосахаридних ланцюга. Оскільки більшість лізосомних гідролаз несуть численні олігосахариди, вони набувають багато залишків М6Ф, що призводить до багаторазового посилення сигналу. Якщо при зв'язуванні звичайної лізосомної гідролази з сайтом впізнавання фосфотрансферази К (а) становить 100000 л / моль, то для множественно фосфорильованій гідролази та маннозофосфатного рецептора відповідний показник дорівнює 1000000000 л / моль, тобто їх зв'язок в 10000 разів міцніше.
Загальна назва спадкових захворювань, пов'язаних з порушенням функції лізосом - внутрішньоклітинних органел, які здійснюють переварювання екзогенного матеріалу або відпрацьованих органел клітини за допомогою ферментів. Генетично детерміноване порушення синтезу одного або декількох ферментів лізосом призводить до накопичення в них специфічного субстрату цих ферментів. Виявляються суттєвого відкладенням речовини певного типу (наприклад, глікогену, глікозаміногліканів (мукополісахаридів)) у клітинах різних тканин. Прикладами таких захворювань є глікогенози, мукополісахаридози.
Хвороби накопичення ліпідів характеризуються рядом постійних ознак:
1) у тканинах накопичуються складні ліпіди, структурним компонентом яких є церамід;
2) швидкість синтезу запасаемого ліпіду порівнянна зі швидкістю його біосинтезу у здорових людей;
3) при цих захворюваннях спостерігається недолік специфічного ферменту в лізосомах, необхідного для гідролізу ліпіду;
4) ступінь зниження активності ферменту у всіх тканинах однакова. З урахуванням усіх вищевикладених ознак були розроблені спеціальні методи діагностики даних захворювань. Стало можливим також виявляти гетерозиготних носіїв дефектних генів, відповідальних за розвиток цих захворювань, і визначати сфінголіподістрофію у плода.
Лізосомні хвороби накопичення зіграли вирішальну роль в розкритті механізму сортування лізосомних гідролаз. Ці хвороби обумовлені генетичними порушеннями, в результаті яких одна або кілька лізосомних гідролаз виявляються дефектними. Нерозщеплений субстрат такий гідролази накопичується в лізосомах, що й обумовлює патологію. Зазвичай такі хвороби викликаються мутацією в структурному гені, що кодує окрему гідролаз. Найбільш важкі симптоми характеризують рідкісну форму патології, звану I-клітинної хворобою (inclusion cell disease). У таких хворих в лізосомах фібробластів відсутні майже всі гідролітичні ферменти, а відповідні нерозщеплені субстрати накопичуються в клітинах у вигляді великих «включень. I-клітинна хвороба обумовлена рецесивною мутацією єдиного гена. Це означає, що вона проявляється тільки у людей, що отримали дефектні копії гена від обох батьків.
При вивченні I-клітинної хвороби виявилося, що в лізосомах всі гідролази відсутні, але в крові вони виявляються. З цього випливає, що структурні гени, що кодують їх, не пошкоджені. Аномалія в даному випадку викликана порушеннями процесу сортування в апараті Гольджі, в результаті чого гідролази замість того, щоб ходити в лізосоми, секретуються. Неправильна сортування відбувається через пошкодження або відсутності GlcNAc-фосфотрансферази. Лізосомні ферменти в таких клітинах не фосфорилюються і маннозофосфатний рецептор не може зібрати їх облямовані бульбашки в транс-мережі Гольджі. Замість цього вони доставляються до клітинної поверхні і секретуються. Ті олігосахариди, які у нормальних лізосомних ферментів містили б М6Ф, перетворюються на олігосахариди «складного» типу, що містять GlcNAc, галактозу і сіалових кислот. Це показує, що в нормі фосфорилювання манози в ціскомпартменте Гольджі запобігає наступний процесинг олігосахаридів гідролаз в складні форми в проміжному компартменте Гольджі і транс - компартменте Гольджі.
Встановлено, що всі лізосомні ферменти мають загальний маркер - манози-6-фосфат; виділені і очищені рецептор манози-6-фосфату, GlcNAc - фосфотрансфераз, крім того була з'ясована роль апарату Гольджі в механізмі сортування лізосомних гідролаз.
При I-клітинної хвороби лізосоми в клітинах деяких типів, наприклад, в гепатоцитах, містять стандартний набір лізосомних ферментів. Це означає, що існує й інший механізм, що направляє гідролази в лізосоми, який використовується в одних клітинах і не використовується в інших. Природа цього М6Ф - незалежного шляху в даний час невідома. Можливо, в даному випадку сортування гідролаз відбувається шляхом прямого впізнавання їх сигнальних ділянок. Подібний М6Ф-незалежний шлях існує у всіх клітинах в транс-мережі Гольджі для сортування лізосомних мембранних білків і направлення їх у ендолізосоми. Незрозуміло, чому клітці необхідний більш ніж один спосіб побудови лізосом.
Гіпертригліцеридемія є одним з ознак як хвороби Гоше, так і порушення запасання глікогену, і, як було показано, зникає після операції портакавального шунтування.