Лейкоцитоспермия в діагностиці бактеріальних інфекцій

Сорокін Костянтин Володимирович

Введення

Лейкоцитоспермия, обумовлена ​​ВООЗ як концентрація лейкоцитів> 1 млн / мл сперми, спостерігається приблизно у 20% чоловіків з безпліддям, але її вплив на якість сперми не з'ясовано. У деяких дослідженнях виявлено негативний вплив лейкоцитоспермия на якість сперми, в інших впливу не виявлено або спостерігалося навіть поліпшення якості сперми [1-5]. В останніх дослідженнях показано, що активні форми кисню, які виробляються, зокрема, лейкоцитами, можуть пошкодити ДНК сперматозоїдів [6,7]. Це призводить до важливих висновків: більшість чоловіків, які страждають на безпліддя, здають сперму для штучного запліднення, і необхідно уникнути пошкодження сперматозоїдів та інфікування яйцеклітини.

Походження лейкоцитів в еякуляті часто залишається нез'ясованим. В основному, вони відбуваються з придатка яєчка, оскільки зникають після вазектомії [2], і з'являються при інфікуванні. Однак, у більшості чоловіків, які звернулися до андрологічний клініку з приводу безпліддя, не спостерігалося проявів інфекції (наприклад, епідидиміту). Крім того, наявність лейкоцитів слабо корелює з присутністю бактерій [8,9]. Бактериоспермия, яка ймовірно пов'язана з контамінацією, виявлялася більш ніж в 50% випадків [10] незалежно від лейкоцитоспермия. Дезінфекція шкіри повинна зменшувати кількість хибнопозитивних посівів за рахунок виключення контамінації ентеральним бактеріями [11]. Однак чутливість визначення патогенних бактерій в зразках сперми за критеріями ВООЗ складає лише 20% [12].

Аналізи сперми виконуються різними спеціалістами (андрологами, урологами, гінекологами, лікарями-лаборантами), і критерії ВООЗ не завжди строго дотримуються. Зазвичай замість пероксидазної реакції для оцінки кількості лейкоцитів використовують фазову мікроскопію, або ж Пероксидазну реакцію використовують, якщо кількість лейкоцитів перевищує певний рівень (наприклад, 1 млн / мл). Однак цим досить простим методом підраховуються не тільки всі лейкоцити (гранулоцити, лімфоцити, макрофаги), але і інші круглі клітини, наприклад, круглі сперматиди, сперматоціти, сперматоспори і слущенний епітелій. Як показав Keel [13], який досліджував 500 американських клінічних лабораторій, в більшості з них не знають про відмінності цих методів. 35% з цих лабораторій не були ознайомлені з інструкціями ВООЗ або навіть не мали жодного примірника керівництва, в якому йдеться про важливість використання та поширення стандартних методів аналізу сперми.

Бо ж замість визначення кількості лейкоцитів за допомогою реакцій до цих пір широко поширений підрахунок, мета даного дослідження - вивчити кореляцію між лейкоцитоспермия і присутністю в спермі бактерій, а, отже, визначити діагностичну цінність підрахунку лейкоцитів для визначення бактериоспермии. Всі аналізи проводили строго за інструкціями ВООЗ.

Матеріали і методи

Були обстежені 143 чоловіки, що звернулися в клініку андрології для аналізу сперми. Причиною звернення до клініки було безпліддя. Усіх пацієнтів обстежували клінічно, включаючи огляд і пальпацію пеніса, мошонки і простати, а також ретельно збирали анамнез. Всі пацієнти здавали сперму для аналізу та посіву. До здачі аналізу не повинно було відбуватися еякуляції принаймні протягом 3-5 днів. Пацієнти повинні були помочитися перед здачею аналізу, а також вимити пеніс, мошонку і руки водою з милом. Їм видавали широко відкривається пластикову банку і просили принести сперму в лабораторію не пізніше, ніж через півгодини після еякуляції. Якщо це було неможливо, еякуляція відбувалася в спеціальній кімнаті в клініці. Всі зразки сперми отримували в результаті мастурбації.

Аналіз сперми проводив один спеціально навчений лаборант не пізніше, ніж через годину після еякуляції. Аналіз проводився повністю за інструкцією ВООЗ [14]. Враховували концентрацію сперматозоїдів, рН насінної рідини, вміст лейкоцитів і вік пацієнта. pH вимірювали за допомогою індикаторних паперових смужок фірми Merck (Merck KGaA, 64271 Дармштадт, Німеччина) (робочий інтервал pH 6.5-10.0). Проте надалі аналізували тільки вміст лейкоцитів і наявність росту бактерій в посівах.

Підраховували всі клітини (макрофаги, гранулоцити), не можуть бути визначені як статеві клітини і їх попередники. Не використані ніяких спеціальні методи забарвлення, таких як Пероксидазна реакція і т.п. Для визначення морфології клітин використовували предметні скельця марки Testsimplets; Waldeck GmbH, Мюнстер, Німеччина, пофарбовані метиленовим синім або ацетатом крезоловий фіолетового. Лаборант поміщав краплю сперми на предметне скло, витримував її при кімнатній температурі протягом 2 годин і розглядав під збільшенням в 600 разів.

Концентрацію лейкоцитів підраховували за інструкцією ВООЗ:

N - кількість лейкоцитів в тому ж полі зору, де знаходяться 100 сперматозоїдів,

S - концентрація сперматозоїдів (млн / мл). Підраховують не менше 200 лейкоцитів.

Найменша вміст лейкоцитів, визначається цим методом - 3700 клітин / мл.

Після аналізу зразки сперми відправляли у відділення медичної мікробіології для посіву. Посів проводили на економічно доступні агарові середовища. Надалі аналізували тільки зростання патогенних бактерій. Нормальну флору уретри не враховували і включали до групи нормальної бактеріальної флори геніталій.

Статистичний аналіз проводили за допомогою статистичного пакету програм для соціальних наук (SPSS 10.0.7, SPSS.Inc. 1989-1999). Всі демографічні дані представлені медіаною і 25-м і 75-м квартилей. Для визначення діагностичної цінності лейкоцитоспермия при виявленні росту бактерій обчислювали чутливість, специфічність, позитивне і негативне Предсказательная значення (positive divdictive value - PPV, negative divdictive value - NPV), і відношення правдоподібності (likelihood ratio (LR)).

Таблиця 1 - Результати посівів сперми: проведений посів 143 зразків, узятих у чоловіків з безпліддям. Визначали загальне переважання виду (в цілому в двох групах), включаючи різні ізоляти

Позначення: група I - немає лейкоцитів, група II - присутні лейкоцити.

Таблиця 2 - Кількість ізолятів патогенних бактерій

Позначення: група I - немає лейкоцитів, група II - присутні лейкоцити.

Результати

З 143 зразків 81 не містили лейкоцитів (група I), а в 62 зразках лейкоцити були виявлені (група II). Медіана концентрації лейкоцитів у групі II склав 0,63 млн / мл (0,44-1,00 млн / мл). Проявів інфекції (наприклад, епідидиміту) не спостерігалося. Найбільш поширеними були такі види бактерій: Ureaplasma urealyticum (група I: n = 16; група II: n = 18), Enterococcus faecalis (група I: n = 15; група II: n = 9), Escherichia coli (група I: n = 4; група II: n = 6), бета-гемолітичний стрептокок (група I: n = 5; група II: n = 4) і Prevotella sp. (Група I: n = 3; група II: n = 6) (Таблиця 1). Патогенні бактерії були виявлені в 48,2% (39/81), з групи I і в 54,8% (34/62), з групи II. Нормальна бактеріальна флора геніталій була виявлена ​​в 34 зразках з групи I і в 26 зразках з групи II, тоді як у 8 зразках групи I і в 2 зразках групи II зростання флори не було. Деякі зразки містили бактерії декількох ізолятів (Таблиця 2).

Для визначення діагностичної цінності лейкоцитоспермия при виявленні бактерій, були обрані граничні значення концентрації лейкоцитів> 0.25,> 0.5,> 0.75, і> 1 млн / мл. Результати представлені в Таблиці 3. Чутливість визначення бактерій при концентрації лейкоцитів> 0,25 млн / мл склала 0,47 при специфічності 0,60. Чутливість і специфічність при концентрації лейкоцитів> 1 млн / мл склали 0,16 і 0,84 відповідно. Найбільше відношення правдоподібності (likelihood ratio - LR) - 1,29, було отримано для концентрації лейкоцитів> 0,5 млн / мл при чутливості і специфічності 0,37 і 0,72 відповідно.

У групах з різною концентрацією лейкоцитів було підраховано відсоткове співвідношення зразків, що містять бактерії. Бактерії були виявлені у 27 (57,5%) зразках з концентрацією лейкоцитів> 0,5 млн / мл, у 16 ​​(51,6%) зразках з концентрацією лейкоцитів> 0,75 млн / мл, у 12 (52,2% ) зразках з концентрацією лейкоцитів> 1 млн / мл і в 34 (54,8%) зразках в с концентрацією лейкоцитів> 0,25 млн / мл.

Обговорення результатів

У 51,1% (73/143) обстежених на предмет фертильності зразків сперми незалежно від наявності лейкоцитів були виявлені бактерії.

Таблиця 3 - Чутливість, специфічність, позитивне і негативне Предсказательная значення (PPV і NPV) і відношення правдоподібності (LR) різного рівня лейкоцитоспермия для передбачення бактериоспермии

Нормальна флора шкіри геніталій була виявлена ​​в 42,0% (60/143) зразків, і лише 7,0% (10/143) зразків були стерильні. Найбільш часто виявляли U. urealyticum (23,8% (34/143) зразків). Цей вид бактерій зазвичай можна виділити у молодих людей при частих статевих контактах і викликає уретрит. Лейкоцити виявлені в 43,4% (62/143) зразків, при цьому у 16,1% (23/143) з них концентрація лейкоцитів перевищувала 1 млн / мл.

У літературі зустрічаються результати аналогічного дослідження сперми, в якому лейкоцитоспермия (за критеріями ВООЗ) спостерігалась у 10-20% [15]. У нашому дослідженні містила лейкоцити значно більша частина зразків (43,4% (62/143)). У нашій лабораторії не використовували Пероксидазну реакцію, тому відмінність можна пояснити неправильним визначенням лейкоцитів. Крім того, в літературі термін «лейкоцитоспермия» часто застосовують для концентрації лейкоцитів> 1 млн / мл, тому такі дані можуть бути занижені. Для порівняння, лейкоцитоспермия за критеріями ВООЗ спостерігалася у 16,1% (23/143) зразків, що цілком співвідноситься з даними літератури. Але в групі II патогенні бактерії виявляли в 54,8% (34/62) зразків, а в групі I - в 48,2% (39/81) зразків.

Подібні результати переконують у тому, що виявити кореляцію між лейкоцитоспермия і бактериоспермия вкрай важко. Найімовірніше, лейкоцитоспермия має обмежену діагностичну цінність для виявлення не тільки бактериоспермии, але і бактеріальних інфекцій. У жодного з 143 чоловіків на момент обстеження не було ознак інфекцій. Отже, більш актуально обговорювати виявлення бактериоспермии, а не інфекцій. Згідно з рекомендаціями ВООЗ, учасників дослідження просили мити руки і пеніс водою з милом, але не обробляти шкіру антисептиками. Незважаючи на те, що така підготовка запобігає хибнопозитивні результати, зазвичай її не проводять. Основна мета дослідження полягала в тому, щоб оцінити найпоширеніші методи аналізу, суворо дотримуючись рекомендацій ВООЗ.

У всіх групах, виділених у залежності від концентрації лейкоцитів, більше 50% зразків містили бактерії. Чутливість зменшувалася від 0,47 в групі з мінімальною концентрацією лейкоцитів (> 0,25 млн / мл) до 0,16 у групі з максимальною концентрацією (> 1 млн / мл). У цих же групах специфічність підвищувалася від 0,60 до 0,84. PPV і NPV в різних групах значуще не змінювалися (0,55 і 0,52; 0,52 і 0,49). LR не був вирішальним параметром (змінювався в діапазоні від 1,16 до 1,04). Тим не менш, найбільше значення LR приймало в групі з концентрацією лейкоцитів> 0,5 млн / мл. PPV і NPV в цій групі були також найбільшими.

З цих даних можна зробити висновок про те, що лейкоцитоспермия не може служити для визначення бактериоспермии. Такий результат узгоджується з висновками Punab і співроб. [12]. Однак у цьому дослідженні під лейкоцитами розуміли лише лімфоцити, тоді як до лейкоцитам також відносяться макрофаги і гранулоцити. За даними цього дослідження, у групі зразків з лейкоцитоспермия за критеріями ВООЗ чутливість склала 25% (у нашому дослідженні з урахуванням всіх типів лейкоцитів - 16%), а оптимальне співвідношення чутливість / специфічність було при концентрації лейкоцитів> 0,2 млн / мл (чутливість 45% і специфічність 69%). Ми отримали схожі результати в групі з концентрацією лейкоцитів 0250000 / мл - чутливість 47%, специфічність 60%. LR в цій групі склало 1,16, а в групі, виділеної за критеріями ВООЗ, - 1,04.

Крім цього, результати, отримані для лейкоцитоспермия як маркера бактериоспермии, узгоджуються з дослідженнями, в яких застосовували Пероксидазну реакцію [8,9]. Trum і співроб. [8] виявили у 39% чоловіків бактеріальні інфекції та у 11% - вірусні. Площа під кривою receiver operating склала 0,55 та 0,56 відповідно, і був зроблений висновок про низьку діагностичної цінності лейкоцитоспермия для виявлення бактеріальних інфекцій. Площа під кривою в нашому дослідженні склала 0,53 (95% довірчий інтервал 0,44-0,63) (Див. Рис.1), що порівнянно з результатами більш швидкого підрахунку лейкоцитів. Rodin і співроб. [9] використовували різні методи забарвлення лейкоцитів (за Грамом, Пероксидазну, крезоловий фіолетовим - метиленовим синім) і також не отримали кореляції між наявністю лейкоцитів і бактерій. Отже, можна зробити висновок про те, що лейкоцитоспермия має невелике значення у виявленні бактериоспермии і дефектів сперми.

Вісь x - специфічність, вісь y - чутливість

Рис. 1 - Крива receiver operating для різних концентрацій лейкоцитів і бактериоспермии. Площа під кривою 0,53 (95% довірчий інтервал 0,44-0,63), Див дані в Таблиці 3.

Висновок

У даному дослідженні лейкоцити були виявлені в 43,4% (62 з 143) зразків сперми чоловіків, які звернулися в урологічну клініку для діагностики безпліддя, а патогенні бактерії - у 51,1% (73/143) з них. Ставлення чутливість / специфічність для визначення бактериоспермии при концентрації лейкоцитів> 1 млн / мл (лейкоцитоспермия за критеріями ВООЗ) було одно 0,16 / 0,84. Найбільше відношення чутливість / специфічність спостерігалося в групі з концентрацією лейкоцитів> 0,5 млн / мл, LR в цій же групі склав 1,29. Тим не менш, підрахунок лейкоцитів у спермі не має предсказательной здібності для бактериоспермии. Цей висновок узгоджується з даними літератури про те, що підрахунок лейкоцитів без використання спеціального фарбування, незважаючи на простоту виконання, має невелику діагностичну цінність.

Список літератури

[1] Wolff H, Politch JA, Martinez A, Haimovici F, Hill JA, Anderson DJ. Leukocytospermia is associated with poor semen quality. Fertil Steril 1990; 53:528-36.

[2] Wolff H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril 1995; 63:1143-57.

[3] Tomlinson MJ, Barratt CL, Cooke ID. Prospective study of leukocytes and leukocyte subpopulations in semen suggests they are not a cause of male infertility. Fertil Steril 1993; 60:1069-75.

[4] Kiessling AA, Lamparelli N, Yin HZ, Seibel MM, Eyre RC. Semen leukocytes: friends or foes? Fertil Steril 1995; 64:196-8.

[5] Alvarez JG, Sharma RK, Ollero M, Saleh RA, Lopez MC, Thomas AJ, et al. Increased DNA damage in sperm from leukocytospermic semen samples as determined by the sperm chromatin structure assay. Fertil Steril 2002; 78:319-29.

[6] Erendiviss J, Hlevicka S, Zalkalns J, Erendivisa J. Effect of leukocytospermia on sperm DNA integrity: a negative effect in abnormal semen samples. J Androl 2002; 23:717-23.

[7] Saleh RA, Agarwal A, Kandirali E, Sharma RK, Thomas AJ, Nada EA, et al. Leukocytospermia is associated with increased reactive oygen species production by human spermatozoa. Fertil Steril 2002; 78:1215-24.

[8] Trum JW, Mol BW, Pannekoek Y, Spanjaard L, Wetheim P, Bleker OP, et al. Value of detecting leukocytospermia in the diagnosis of genital tract infection in subfertile men. Fertil Steril 1998; 70:315-9.

[9] Rodin DM, Larone D, Goldstein M. Relationship between semen cultures, leukospermia, and semen analysis in men undergoing fertility evaluation. Fertil Steril 2003; 79:1555-8.

[10] Cottell E, Harrison RF, McCaffrey M, Wealsh T, Mallon E, Barry-Kinsella C. Are seminal fluid microorganisms of significance or merely contaminants? Fertil Steril 2000; 74:465-70.

[11] Kim FY, Goldstein M. Antibacterial skin divparation decreases the incidence of false-positive semen culture results. J Urol 1999; 161:819-21.

[12] Punab M, Loivukene K, Kermes K, Mandar R. The limit of leukocytospermia from the microbiological viewpoint. Andrologia 2003; 35:271-8.

[13] Keel B. How reliable are results from the semen analysis? Fertil Steril 2004; 82:41-4.

[14] World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction. 4th ed. Cambridge: Cambridge University Press; 1999.

[15] Aziz N, Agarwal A, Lewis-Jones I, Sharma RK, Thomas AJ. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril 2004; 82:621-7.

Коментар Wolfgang Weidner, Гессен, Німеччина

ВООЗ [1] висуває пропозицію використовувати підвищений вміст пероксидаза-позитивних лейкоцитів у спермі і висівання значної кількості патогенних бактерій в якості ознак інфекцій придаткових залоз у чоловіків. У 1995 році [2] експерти прийшли до висновку про те, що звичайні методи забарвлення не дозволяють достовірно виявити лейкоцити в спермі. Більше того, хоча преоксідазний метод можна застосовувати для підрахунку гранулоцитів, золотий стандарт визначення всіх типів лейкоцитів - це іммуноцітологіческіе методи [2]. Нещодавно були отримані дані про те, що пероксидазної метод може виявитися неточним через екзоцитозу вмісту гранулоцитів у ході запалення [3].

Навіть не враховуючи методику аналізу, можна сказати, що лейкоцитоспермия може виникнути спонтанно [4], в результаті фагоцитарної активності [5] і корелює з процесом апоптозу [6] в спермі. Крім того, лейкоцитоспермия може бути пов'язана з виділенням лейкоцитів простатою, яка формує основний об'єм еякуляту [7]. З цих даних випливає, що вміст лейкоцитів у спермі залежить від безлічі різних і не цілком з'ясованих факторів.

Ці фактори повинні враховуватися при дослідженні кореляції між лейкоцитоспермия і бактериоспермия. При концентрації лейкоцитів> 1 млн / мл [6] чутливість для визначення значимої бактериоспермии відповідно до кривими receiver operating characteristic вкрай низька [8]. З урахуванням того, що можна значно знизити кількість хибнопозитивних результатів шляхом простої підготовки шкіри [9], звертають на себе увагу дані більш пізнього дослідження [10], в якому оцінювали вміст бактерій в першій порції сечі, середній порції сечі, спермі, підвищену концентрацію лейкоцитів в спермі і настання вагітності. Між вмістом бактерій в спермі, лейкоцитоспермия і настанням вагітності кореляції виявлено не було.

У цілому, на даний момент у всіх дослідженнях підтверджується висновок авторів (Lackner і спів.) Про те, що підрахунок лейкоцитів без використання спеціальних методів не може бути використаний для діагностики бактериоспермии.

[1] Rowe PJ, Comhaire FH, Hargreave TB, Mahmoud AMA. WHO manual for the investigation, diagnosis and manage-ment of the infertile men. Cambridge University Press; 2000.

[2] Wolff H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril 1995; 63:1143-57.

[3] Villegas J, Schulz M, Vallejos V, Henkel R, Miska W, Sanchez R. Indirect immunofluorescence using monoclonal antibodies for the detection of leukocytospermia: comparison with peroxidase staining. Andrologia 2002; 34:69-73.

[4] Yanushpolsky EH, Politch JA, Hill JA, Anderson DG. Antibiotic therapy and leukocytospermia: a prospective, ran-domzided, controlled study. Fertil Steril 1995; 63:142-7.

[5] Tomlinson MJ, White A, Barratt CLR. Bolton AE, Cooke ID. The removal of morphologically abnormal sperm forms by phagocytes: a positive role for seminal leukocytes. Human Reproduction 1992; 7:517-22.

[6] Ricci G, Perticarari S, Fragonas E, Giolo E, Canova S, Pazzo-bon C, et al. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the divsence of leukocytes. Human Reproduction 2002; 17:2665-72.

[7] Ludwig M, Vidal A, Diemer Th, Pabst W, Failing K, Weidner W. Chronic prostatitis / chronic pelvic pain syndrome: seminal markers of inflammation. World J Urol 2003; 21:82-5.

[8] Punab M, Loivukene K, Kermes K, Mandar R. The limit of leukocytospermia from the microbiological viewpoint. Andrologia 2003; 35:271-8.

[9] Kim FY, Goldstein M. Antibacterial skin divparation decreases the incidence of false-positive semen culture results. J Urol 1999; 161:819-21.

[10] Cottell E, Harrison RF, McCaffrey M, Walsh T, Mallon E, Barry-Kinsella З Are seminal fluid microorganisms of significance or merely contaminants. Fertil Steril 2000; 74:465-70.

Для підготовки даної роботи були використані матеріали з сайту http://www.uroweb.ru/