Реферат студента 2-го курсу Бабицького Мирослава
Білоруський Державний Університет
Біологічний факультет
Мінськ 2003
Класифікація живильних середовищ.
При складанні поживних середовищ для мікроорганізмів необхідно враховувати їх потреба в елементах живлення. За складом живильні середовища поділяються на дві групи: природні (натуральні) і синтетичні. Природними зазвичай називають середовища, які складаються з продуктів тваринного або рослинного походження, що мають складний невизначений хімічний склад. Основою таких середовищ є різні частини зелених рослин, тваринні тканини, солод, дріжджі, овочі, гній, грунт, вода морів, озер і мінеральних джерел. Більшість з них використовується у вигляді екстрактів або настоїв. На природних середовищах добре розвиваються багато мікроорганізмів, тому що в цих середовищах є, звичайно, всі компоненти, необхідні для росту і розвитку. Однак середовища з невизначеним складом малопридатні для вивчення фізіології обміну речовин мікроорганізмів, оскільки вони не дозволяють врахувати споживання низки компонентів середовища, а з іншого боку, з'ясувати, які речовини утворюються в процесі розвитку мікроорганізмів. Це пов'язано з тим, що склад природних середовищ дуже складний; крім того, він не є постійним, так як суттєво коливається в залежності від сировини і способу приготування середовищ. Це помітно впливає на ріст мікроорганізмів. Природні середовища невизначеного складу використовуються головним чином для підтримки культур мікроорганізмів, накопичення їх біомаси і для діагностичних цілей. До числа середовищ невизначеного складу відносять і так звані напівсинтетичні середовища. До їх складу поряд із з'єднаннями відомої хімічної природи входять речовини невизначеного складу. Синтетичні середовища - це такі середовища, до складу яких входять тільки певні, хімічно чисті сполуки, взяті в точно зазначених концентраціях. Синтетичні середовища слід готувати на дистильованій воді. Для розробки синтетичних середовищ, які забезпечують нормальний ріст досліджуваного мікроорганізму або максимальний біосинтез якого-небудь продукту його життєдіяльності, необхідно знати особливості обміну речовин даного організму і його потреби в джерелах живлення. В даний час у розпорядженні мікробіологів є достатня кількість синтетичних середовищ, які не поступаються за своїми якостями складним середах невідомого складу. Синтетичні середовища можуть мати відносно великий набір компонентів, але можуть бути і досить простими за складом. Синтетичні середовища найбільш зручні для дослідження обміну речовин мікроорганізмів. Знаючи точний склад і кількість вхідних в середу компонентів, можна вивчити їх споживання і перетворення у відповідні продукти обміну. С. М. Виноградским в практику мікробіології введені елективні (виборчі) середовища для певних груп мікроорганізмів. Ці середовища забезпечують переважний розвиток одного виду або групи споріднених мікроорганізмів і менш придатні або зовсім не придатні для розвитку інших. Знаючи фізіологічні особливості відповідної групи мікробів, можна підібрати такі умови культивування (склад середовища, її активну кислотність, умови аерації, температуру та ін), при яких будуть розвиватися лише мікроорганізми цієї групи. Це дозволяє вести різні біологічні процеси в лабораторії і у виробництві без попередньої стерилізації середовища. Такі середовища застосовуються головним чином для виділення мікроорганізмів з місць їх природного проживання, для отримання накопичувальних культур. Поняття «елективні середовища» входить у більш широке поняття «елективні умови». Живильні середовища застосовують різної консистенції: рідкі, щільні, напіврідкі. Щільні живильні середовища використовують для обліку кількості бактерій, виділення їх у чисту культуру і інших цілей. Такі середовища готують з рідких, додаючи 1,5-2,5% агар-агару або 10-15% желатини. При приготуванні напіврідких середовищ вносять агар-агар в кількості 0,1-0,2%. За призначенням середовища поділяють на елективні та диференційно-діагностичні. Елективні середовища забезпечують переважний розвиток одного або цілої фізіологічної групи мікроорганізмів. Наприклад, для переважного виділення грамнегативних бактерій буває достатнім додавання в живильне середовище тріфенілметанової барвників (кристалічний фіолетовий, малахітовий зелений і т. д.). Для виділення стафілококи в середу може бути доданий хлористий натрій в концентрації 7,5%. При цій концентрації зростання інших бактерій придушується. Елективні середовища застосовуються на першому етапі виділення чистої культури бактерій, тобто при отриманні накопичувальної культури. Диференційно-діагностичні середовища застосовуються для швидкої ідентифікації близькоспоріднених видів мікроорганізмів, для визначення видової приналежності, в клінічній бактеріології та ін Принцип побудови диференційно-діагностичних середовищ заснований на тому, що різні види бактерій розрізняються між собою за біохімічною активністю і мають неоднаковий набір ферментів, що розщеплюють субстрати, що входять до складу живильного середовища. До складу диференційно-діагностичної середовища входять: а) основна живильне середовище, що забезпечує розмноження бактерій, б) певний хімічний субстрат, ставлення до якого є діагностичною ознакою для даного мікроорганізму; в) кольоровий індикатор, зміна забарвлення якого свідчить про біохімічної реакції і наявності цієї ферментної системи у досліджуваного мікроорганізму. Наприклад, середовище Ендо дозволяє відрізнити клони, зброджують лактозу від клонів, які не володіють цією властивістю. Основними компонентами цього середовища є живильний (пептонний) агар, вуглевод і основний Фусинь, знебарвлені сульфитом (реактив Шиффа). Вихідна живильне середовище забарвлена в рожевий колір. Мікроорганізми, не зброджують лактозу, утворюють безбарвні колонії. При зброджуванні лактози до ацетальдегіду останній реагує з сульфитом і развівівается червоне забарвлення відповідних колоній. Середа з еозином і метиленовим синім (середовище Левіна) як індикаторів містить еозин і метиленовий синій і початково пофарбована в чорно-синій колір. Клітини, що здійснюють бродіння, утворюють колонії, пофарбовані в чорний з металевим блиском колір, а колонії, що не володіють цією властивістю, безбарвні. Подібні зміни забарвлення відбуваються тому, що барвники присутні в середовищі не у вигляді самостійних сполук, а у вигляді комплексів з речовинами живильного середовища. При низьких значеннях рН ці комплекси випадають в осад, вихідні ж фарбники в цих умовах розчиняються, при великих рН комплекси барвників безбарвні, тоді як метиленовий синій набуває синього забарвлення. Дане середовище дозволяє диференціювати бактерії роду Escherichia від бактерій роду Proteus.
Склад поживних середовищ.
Агар-агар - рослинний колоїд, одержуваний з деяких морських водоростей. До його складу входять головним чином полісахариди з незначним вмістом азотистих речовин. Желатину - кислий азотовмісних продукт, що видобувається шляхом виварювання кісток і хрящів. Як щільних поживних середовищ широко застосовують також гелеві пластини, введені в мікробіологічну практику С. Н. Виноградским. Для вирощування мікроорганізмів, що використовують органічні форми азоту, часто вживають мясопептонний середовища: мясопептонний бульйон, мясопептонний агар та мясопептонном желатину. Мясопептонний бульйон (МПБ). Для приготування м'ясо-пептонний середовищ використовують м'ясний бульйон, який отримують так: 500 г дрібно порубану свіжого м'яса без кісток, жиру і сухожиллі заливають в емальованій каструлі 1 л водопровідної води, нагрітої до 50 ° С, і залишають наполягати 12 годин при кімнатній температурі або 1 год при 50-55 ° С. М'ясо віджимають, екстракт проціджують через марлю з шаром вати, кип'ятять протягом 30 хв для згортання колоїдних білків і фільтрують двічі (перший раз через марлю з ватою, другий - через паперовий фільтр). Фільтр доливають водою до 1 л, розливають у колби, закриваю! ватними пробками і стерилізують при 120 ° С 20 хв (пробки колб закривають зверху ковпачками з буму ги). Ватні пробки повинні бути щільними, так як вони є фільтром, що перешкоджає проникненню бактерій з повітря після стерилізації. М'ясний бульйон може бути використаний в будь-який час для приготування відповідних середовищ. Якщо їх готують відразу, то попередня стерилізація зайва. Нерідко в лабораторних умовах м'ясної настій кип'ятять разом з м'ясом, а потім м'ясо віджимають. Бульйон виходить хорошої якості. Якщо бажано мати м'ясний бульйон особливо високої поживності, під час настоювання м'яса з водою додають трохи пепсину та підкисляють бульйон соляною кислотою. Пепсин додатково гідролізує білкові сполуки м'яса, і кількість засвоюваних бактеріями поживних речовин зростає. М'ясо можна замінити м'ясним екстрактом, беручи його по 5 г на 1 л середовища. Для приготування мясопептонного бульйону до 1 л м'ясного бульйону додають 5-10 г пептона (пептон - перший продукт гідролізу білка з високою молекулярною масою) для підвищення калорійності середовища і 5 г кухонної солі з метою створення осмотичної активності. Середу нагрівають до розчинення пептона, постійно помішуючи. Потім встановлюють нейтральну або слаболужну реакцію середовища, припливу 20%-ний розчин NagCOa (до посиніння вологою червоного лакмусового папірця, при цьому фенолфталеїн ще не показує лужну реакцію - при додаванні його до середовища у фарфоровій чашці рожеве забарвлення не виявляється). Зручно використовувати індикатор бромтімолблау. 1-2 краплі його вносять скляною паличкою у фарфорову чашку і додають краплю бульйону. У нейтральному середовищі бромтімолблау темно-зелений, у кислому - жовтий, в лужному - синій. Після встановлення реакції середу знову кип'ятять 5-10 хв і білки, коагульовані від зміни реакції, фільтрують через паперовий фільтр без освітлення бульйону або освітліться його білком. Прозорий М'ясо-пептонний бульйон розливають у пробірки, закривають ватними пробками і стерилізують при 120 ° С протягом 20 хв. М'ясо-пептонний агар (МПА). До 1 л м'ясо-пептонному бульйону додають 15-20 г дрібно нарізаного агар-агару. Середу нагрівають до розчинення агару (температура плавлення його 100 ° С, застигання -40 ° С), встановлюють слаболужну реакцію середовища 20%-ним розчином Na2COa і через воронки розливають в пробірки (але 10 мл для заливки в чашки - агар стовпчиком і по 5 мл для отримання скошеного, похилого агару). При розливі агару необхідно стежити потім, щоб краї пробірки були сухими, інакше пробки прилипають до скла. Пробірки із середовищем стерилізують в автоклаві при 120 ° С протягом 20 хв. М'ясо-пептонний желатину (МПЖ). В 1 л мясопептонного бульйону завадять 100-150 г желатину. Температура плавлення залежить від процентного вмісту в середовищі. 10%-ная желатину плавиться при 24 ° С, 15%-паю - при 25 °. У літній час середовища готують, додаючи 15% желатини. Після розчинення желатину при обережному нагріванні в середовищі встановлюють слаболужну реакцію (як і для МПБ і МПА), кип'ятять протягом 5хв, потім охолоджують-до 40-50 ° С. Одночасно яєчний білок збивають з невеликою кількістю води, вливають його в охолоджену желатинову середу, добре збовтують і знову нагрівають. Середовище після випадання білків стає прозорою. Її фільтрують через гарячу воронку, розливають у пробірки і стерилізують в кип'ятильнику Коха текучою парою, прогріваючи середу по 30 хв через 24 год 3 рази.
Картопляний агар. 200 г очищеного і промитого водою картоплі нарізують скибочками, заливають 1 л водопровідної води, варять 30 хв. Відвар фільтрують через вату і доводять до початкового об'єму. До отриманої рідини додають 2% агару, кип'ятять до його розчинення і встановлюють нейтральну реакцію середовища (рп 7,0). Середовище стерилізують при 1 атм протягом 20 хв. Пивне сусло. Зерна ячменю замочують у холодній воді і пророщують при 35 ° С. Після того як паростки будуть вдвічі більше довжини зерна, останнє висушують до повітряно-сухого стану (можна при слабкому підігріванні) і одержують солод. Для приготування сусла солод крупно розмелюють і 250 г його беруть на 1 л води. Суміш підігрівають при 57 ° С (для кращого виділення ферменту амілази) до зникнення реакції на крохмаль (синє забарвлення з йодом). Проби на оцукрювання крохмалю проводять у фарфоровій чашці у краплі рідини. Сусло проціджують через вату, потім фільтрують через паперовий фільтр. Таке сусло містить 10 - 20% цукру. Визначивши його зміст по щільності розчину за допомогою сахариметрів, сусло розбавляють водою до концентрації цукру 6-8%, стерилізують при 115 ° С (тиск 0,5 атм) протягом 30 хв. Готове сусло можна отримати на пивоварному заводі. Сусло-агар. До приготовленого сусла додають 2,5-3% агару, кип'ятять до його розплавлювання, фільтрують через вату і стерилізують таким же способом, як пивне. Знежирене молоко. Для приготування поживних середовищ вживають зняте молоко, так званий обрат (жир у молоці несприятливо впливає на ріст деяких мікроорганізмів). Відвійки отримують сепаруванням молока, нагрітого до 34 ° С. Жир можна видаляти і при відстоюванні молока. При стерилізації молока слід враховувати, що його не можна тривалий час витримувати в автоклаві, так як лактоза (молочний цукор), що міститься в молоці, може карамелізований. Знежирене молоко розливають у стерильні пробірки і витримують при 115 ° С (тиск 0,5 атм) 15 хв. Перед стерилізацією кислотність відвійок не повинна перевищувати 22 ° Тернера, інакше молоко згорнеться. Після стерилізації його витримують три доби в термостаті при 30 ° С, щоб спровокувати розвиток спороутворюючих та інших стійких до нагрівання форм. Через 3 дні кожну пробірку з молоком переглядають і пробірки, в яких розвинулися мікроорганізми, вибраковують. При стерилізації в автоклаві іноді спостерігається побуріння молока внаслідок карамелізації молочного цукру і пептонізаціі казеїну. При тривалій стерилізації на дно пробірки випадає осад казеїну, який може частково пептонізіроваться. Перегріте побурілої молоко в якості середовища використовувати не можна. Дріжджові середовища. Дріжджова вода. 50-100 г сухих дріжджів розмішують в 1 л води, кип'ятять 10 хв, фільтрують через паперовий фільтр і стерилізують текучою парою по півгодини протягом трьох днів щодня. Дріжджовий автолізат. 200 г пресованих дріжджів розводять в 1 л води, додають 2 г Na2HPO4, 1 н. розчин NaOH (до рН 6,1) та 5 мл хлороформу, витримують при 37 ° С дві доби, доводять до рН 7,4, кип'ятять 30 хв, фільтрують через паперовий фільтр, розливають в посуд і стерилізують при 115 ° С півгодини. Дріжджовий екстракт. 1 кг пресованих дріжджів розводять в 1 л води, суміш кип'ятять 1 год, тричі фільтрують через паперовий фільтр і стерилізують при 115 ° С 30 хв. Бобовий відвар. 50 г квасолі (краще білої) заливають 1 л водопровідної води і варять до готовності так, щоб боби не зварилися. Отриманий відвар фільтрують через вату, додають до нього 10 г цукру і доводять до початкового об'єму. Встановлюють слаболужну реакцію середовища, розливають у колби і стерилізують в автоклаві при тиску пари 1,5 атм протягом 30 хв.
Елективні культивування.
Пізнанням різноманіття мікроорганізмів ми зобов'язані двом обставинам. Деякі мікроорганізми вже порівняно давно привернули до себе увагу через те, що вони утворюють колонії або скупчення або ж викликають які-небудь помітні зміни в навколишньому середовищі. Багато з таких, легко виявляються мікроорганізмів піддаються прямому виділенню; відносите л ьпо неважко підібрати умови, які забезпечували б їх зростання. Існують, однак, і багато інших мікроорганізми (різних фізіологічних типів), які стали доступними для дослідження лише після того, як Виноградський і Бейеріпк розробили техніку накопичувальних культур. І в принципі і на практиці метод дуже простий. Підбором ряду факторів (джерела енергії, вуглецю та азоту; акцептор електронів, світло, температура, рН і т. п.) створюють певні умови і інокуліруют середу змішаною популяцією, яка є, наприклад, у грунті або у мулі. У такому середовищі найбільш добре пристосований до пий тип мікроорганізмів зростає і витісняє всі інші, супутні, організми. За допомогою багаторазових пересівань в рідке середовище такого ж складу і розсіву за такою ж щільному середовищі можна без праці виділити накопичений штам. Частий пересівши з рідкого середовища на рідку запобігає зростання супутніх організмів, які могли б використовувати продукти виділення або навіть автолиза клітин первинної культури і рости за рахунок них. Прекрасним матеріалом для інокуляції служать проби з тих місць, де вже є «природне збагачення». Так, можна виділяти мікроорганізми, що використовують окис вуглецю, з стічних вод газових заводів; мікроорганізми, що використовують гемоглобін, - з стічних вод боєнь і бактерії, що окислюють вуглеводні, - з нафтоносних порід, з грунтів, забруднених нафтою, і з нафтових відстійників. Метод накопичувальних культур дозволяє виділяти мікроорганізми з будь-якою комбінацією потреб у поживних речовинах за умови, зрозуміло, що шуканий тип взагалі існує в природі. Для вкрай спеціалізованих мікроорганізмів особливо легко створити елективні умови. Так, мінеральна середовище, не містить пов'язаного азоту, на світлі суворо вибіркова для "синьо-зелених водоростей, які фіксують N2. Якщо ту ж середу доповнити органічним джерелом енергії та вуглецю, то на ній в темряві в аеробних умовах розвиватиметься Azotobacter, а при виключенні доступу повітря - Clostridium. Для успішного отримання накопичувальних культур потрібно обмежитися задоволенням мінімальних потреб тільки того мікроорганізму, який хочуть виділити. Якщо, наприклад, хочуть виділити бактерії, здатні окислювати метан або водень з нітратом або сульфатом в якості акцептора водню, то слід подбати про виключення доступу кисню, інакше будуть домінувати аеробні форми, що окислюють метан або водень. Для відбору можна також використовувати стійкість або толерантність мікроорганізмів до кислот і лугів, до високих температур плі випромінювання. Нерідко разом з «позитивною» селекцією проводиться і «негативна» - за допомогою вибірково діючих інгібіторів. На живильному середовищі, що містить азид, в аеробних умовах ростуть, наприклад, молочнокислі бактерії, а зростання інших аеробних мікроорганізмів пригнічується. Азид, ціанід і H2S надають виборче дію па ті аеробні організми, в диханні яких беруть участь цитохроми. У медичній діагностиці користуються виборчим придушенням для виявлення Corynebacterium diphtheriae (застосування поживних середовищ, що містять телур) і патогенних Enterobacteriaceae (агаризованому середовища з додаванням вісмуту). У посівному матеріалі можуть бути присутніми різні штами з однаковим типом обміну речовин, що відрізняються один від одного лише незначно, наприклад лише по оптимальному значенню рН або за швидкістю зростання. Якщо для отримання накопичувальної культури використовувати такий матеріал, то домінувати буде найбільш адаптований до даних умов або найбільш швидко зростаючий штам, всі ж інші будуть подавлені і виділити їх не вдасться. Тому в тих випадках, коли хочуть виділити максимальне число штамів, що ростуть за певних елективних умовах, посів слід проводити безпосередньо в чашки. На твердих елективних середовищах штами, яким умови сприяють, утворюють колонії. При досить великій відстані між колоніями конкуренція за поживні речовини не може мати місця; штами, що ростуть повільніше, не придушуються зростаючими швидше, так що ті й інші можуть бути виділені окремо. У цієї оглядової таблиці об'єднані дані щодо отримання накопичувальних культур у мікроорганізмів з різними типами обміну речовин. Чисту культуру мікроорганізму (останній етап виділення) отримують зазвичай па (або в) щільному поживному середовищі . Процедура починається з відділення від популяції клітин однієї-єдиної клітини. Обов'язкова вимога полягає в тому, щоб виростає з клітки колонія залишалася ізольованою від інших клітин або колоній. Аеробні бактерії виділяють або за методом Коха - розсіву суспензію по поверхні середовища в чашках, або, що легше, розмазуючи краплю платинової петлею з агаризованому середовищі. Анаеробні бактерії суспендують у розплавленому агарі з температурою 45 ° С і проводять інкубацію без доступу повітря. Ретельне відділення однієї колонії, повторне суспендированием в рідині і повторне нанесення мазка або розведення в агарі дозволяють отримувати чисті культури більшості мікроорганізмів.
Список літератури
Е.З Теппер та ін «Практикум з мікробіології» М. «Колос» 1979
Г. Шлегель «Загальна мікробіологія» М. «Світ» 1972.