Використання методу люмінесцентної мікроскопії в дослідженні мікроводоростей

ф=2,3* I в* Е λ* К λ* Z * L , (До λ): I ф = 2,3 * I в * Е λ * До λ * Z * L,

– длина оптического пути в объекте. де L - довжина оптичного шляху в об'єкті. , т.е. Вимірювана інтенсивність флуоресценції дає інформацію про величину До λ * Z, тобто про кількість флуоресціюючих молекул та їх здатності флуоресцировать (квантовий вихід). Це рівняння справедливе при поглинанні об'єктом менше 5% збуджуючого світла, що зазвичай має місце у фізіологічних дослідах. При поглинанні більше 5% світла спостерігається нелінійна залежність. [8]

Для характеристики флуоресценції крім її інтенсивності і квантового виходу, можна використовувати значення зсуву максимуму флуоресценції за спектром, час життя флуоресценції молекули і ступінь поляризації флуоресценції. Перераховані параметри дозволяють отримати інформацію про характер взаємодії флуоресцентних молекул між собою і з навколишнім їх середовищем. [6]

1.2 Розвиток флуоресцентної мікроскопії

Люмінесцентна мікроскопія - метод мікроскопії, що дозволяє спостерігати первинну чи вторинну люмінесценцію мікроорганізмів, клітин, тканин або окремих структур, що входять до їх складу.

Колір люмінесценції, тобто довжина хвилі випромінюваного світла залежить від хімічної структури і від фізико-хімічного стану мікроскопіруемого об'єкта, що й обумовлює можливість використання люмінесцентної мікроскопії з метою мікробіологічної та цитологічної діагностики, для диференціювання окремих компонентів клітин. Первинна люмінесценція властива ряду біологічно активних речовин, таких, як ароматичні амінокислоти, порфірини, хлорофіл, вітаміни А, В2, В1, деякі антибіотики (тетрациклін) і хіміотерапевтичні речовини (акрихін, риванол). Вторинна, або наведена, люмінесценція виникає в результаті обробки мікроскопіруемих об'єктів флюоресцентними барвниками - флюорохромами, що дозволяє проводити люмінесцентно-цитологічний і люмінесцентно-цитохимический аналіз. [16]

В історії розвитку люмінесцентної мікроскопії виділяють кілька етапів, пов'язаних з удосконаленням методики.

Люмінесцентна мікроскопія з'явилася на початку минулого століття як різновид ультрафіолетової мікроскопії. У 1910 році А. Келлер довів принципову можливість створення люмінесцентного мікроскопа. У 1911 р. винайдений люмінесцентний мікроскоп, який був використаний російською ботаніком М.С. Кольором для вивчення люмінесценції хлорофілу рослинних клітин. Прогрес люмінесцентної мікроскопії надалі був пов'язаний з введенням в практику флуоресцентних барвників, так званих флуорохромів, які були розроблені Хайтінгером і його співробітниками в 1935 році. Застосування сильно розбавлених розчинів флуорохромів, вибірково зв'язуються з певними структурами клітин, і перш за все акридинового помаранчевого, було введено Штруггером в 1940 році. Відбувалося і удосконалення апаратури (розробка методу збудження люмінесценції падаючим світлом через об'єктив мікроскопа з використанням інтерференційної светоделітельной пластинки), розробка нових люмінесцентно-цитохімічних методів, дослідженням нових областей її застосування, що знайшли широке застосування в мікробіології, імунології та інших областях медико-біологічних досліджень.

В даний час розрізняють кілька типів люмінесцентної мікроскопії в залежності від характеру освітлення.

При висвітленні об'єкта проходять світлом (звичайний шлях освітлення) мають справу зі светопольной люмінесцентної мікроскопії.

Заміна светопольного конденсора конденсором темного поля дає можливість здійснити люмінесцентну мікроскопію в темному полі (люмінесцентна ультрамікроскопія).

У разі висвітлення об'єкта зверху - мають справу з люмінесцентної мікроскопії в падаючому (відбитому) світлі. [11]

1.3 флуорохромами і флуорохромірованіе

У переважної більшості біологічних об'єктів їх власна неяскрава люмінесценція не дозволяє проводити люмінесцентно-мікроскопічні дослідження і для виборчого виявлення певних структур застосовують люмінесцентні барвники - флуорохромами. Деякі з цих барвників дифузно розподіляються в клітинах, інші вибірково зв'язуються з певними структурами клітин або навіть з певними хімічними речовинами.

Відомо кілька десятків органічних сполук, з успіхом використовуються як флуорохромів. До них відносяться барвники: тіазоловие, хінолінові, азобарвники і особливо акрилові похідні. Добрими флуорохромами є деякі природні пігменти (хлорофіл, ліпохроми), алкалоїди (берберин, хінін), вуглеводні (бензопірен, дібензаантрацен). Флуорохромами застосовуються в сильно розведених водних чи спиртових розчинах (від 1:1000 до 1:100000). Вуглеводні (бензіпрен) розчиняють в насиченому водному розчині кофеїну.

Флуорохромірованіе проводять або прижиттєво, або на фіксованих препаратах. Прижиттєве флуорохромірованіе у свою чергу може бути здійснено або на цілому тваринному або рослинному організмі (шляхом ін'єкції або введення з їжею), або на окремих тканинах і клітинах. Прижиттєве флуорохромірованіе особливо корисно при дослідженнях функціонального стану та фізико-хімічної характеристики органів, тканин, клітин. [3]

Переваги флуоресціюючих барвників перед звичайними цитологічними або гістологічними реактивами полягає передусім у можливості застосовувати флуорохромами в самих мінімальних кількостях і в дуже слабких концентраціях (1:100000 - 1:5000000). Завдяки цьому хімічна, шкідливу дію на клітини зводиться до мінімуму, об'єкт вивчається в найбільш фізіологічних умовах. Відносна нешкідливість флуорохромірованія дозволяє так само широко використовувати метод прижиттєвої забарвлення, має великі переваги, особливо в цито-і гістофізіології.

Друге велике достоїнство методу флуорохромірованія складається у швидкості роботи. Для проведення дослідження звичайно потрібні частки хвилини. Навіть найтриваліша забарвлення препаратів займає максимум 20-30 хвилин. Витрата флуоресціюючих фарб з-за великих розведень дуже невеликий.

Вибір флуорохромами диктується метою дослідження, характером об'єкта, природою флуоресціюючої речовини, його кислотністю, кольором і ін

За фізико-хімічними властивостями флуоресцентні барвники можна розділити на три групи.

1. Лужні флуорохромами - характеризуються тим, що знаходяться в кислому середовищі в сильно діссоціірованном стані. Флуоресціюючим компонентом фарби є позитивно заряджений катіон. У сильно лужних розчинах такі фарби знаходяться у недиссоциированной стані.

2. Кислі флуорохромами - дисоціюють у лужному середовищі. Флуоресціюючим компонентом фарби є негативно заряджений аніон.

Електронейтральні флуорохромами - слабо кислі або слабко лужні фарби, дисоціація яких при флуорохромірованіі не має практичного значення, оскільки флуоресціюючими властивостями володіє ціла молекула. [5]

РОЗДІЛ 2. ОБ'ЄКТИ І мето ДОСЛІДЖЕННЯ

2.1 Об'єкти люмінесцентної мікроскопії

Власна (первинна) люмінесценція властива тільки деяким структурам у досліджуваних мікроскопічних препаратах. Більшість речовин біологічного походження має вельми мало інтенсивну блакитну, синю або фіолетову люмінесценцію (максимуми в спектрах люмінесценції багатьох з них лежать в ультрафіолетовій області спектра), тому порушувати люмінесценцію біологічних об'єктів необхідно ультрафіолетовим світлом, а як «замикаючого» світлофільтру вибирати такий, який відсікає тільки ультрафіолет.

Природними люминесцирующими речовинами рослинної клітини є хлорофіл, порфірин, фікоеритрин, а також клітковина, пектин, хітин. Представники різних систематичних відділів рослин володіють різним набором хлорофілів і фікобіліни. Дифузне розподіл пігментів, специфічне для клітин водоростей, викликає світіння самих клітин. У вищих рослин спостерігається світіння пластид. Пігментний склад, а значить і спектральні характеристики, у тому числі люмінесцентні, одноклітинних водоростей більш варіабельні, ніж у багатоклітинних водоростей і вищих рослин, і більшою мірою залежать від умов проживання, віку, сезону року і т.д. [1]

Деякі вітаміни (А, В _2), пігменти (ліпофусцин, хлорофіл), а так само інші речовини під впливом більш-менш тривалого освітлення ультрафіолетовим випромінюванням зазнають фотохімічні зміни і перестають люминесцировать. Тому мікроскопування таких речовин слід проводити по можливості швидко, часто міняючи місця спостереження в досліджуваному об'єкті. [2]

В даний час люмінесцентна мікроскопія знаходить все більш широке застосування в різних областях наукової та практичної роботи: у вірусології, гістології (нормальної і патологічної), фізіології, ботаніки, онкології, радіобіології, а так само при проведенні лабораторно-клінічних аналізів, в санітарних і судово -медичних дослідженнях. Великий інтерес представляє запропонований Кунсом і його співробітниками винятково чутливий люмінесцентно-імунохімічний метод мічених антитіл.

Люмінесцентна мікроскопія, поряд з іншими флуоресцентними методами, застосовується у фізіології рослин. Часто об'єктами досліджень є представники рослинних угруповань водойм: фітопланктону, фітобентосу, фітообрастаній, макрофіти, донні відкладення, а також лабораторні культури водоростей. и Chlorella vulgaris , синезелёной водоросли Microcystis aeruginosa , а так же культуру морской жёлто-зелёной водоросли Phaeodactilum tricornutum . Наприклад, для тестування вод різного ступеня забрудненості перспективно використовувати альгологіческі чисті культури зелених водоростей Scenedesmus quadricauda і Chlorella vulgaris, синьо-зелені водорості Microcystis aeruginosa, а так само культуру морської жовто-зеленої водорості Phaeodactilum tricornutum. Зелені і синьо-зелені водорості повсюдно поширені у водоймищах помірної зони, а жовто-зелені водорості широко представлені в морях. [12]

2.2 Можливості флуоресцентної мікроскопії

Перевагами методу флуоресцентної мікроскопії є швидкість оцінки життєвого стану клітин водоростей і вищих рослин без будь-якого їх пошкодження. Вони економічні за часом і точні, за короткий час можна досліджувати велику кількість проб на невеликій за обсягом матеріалі (наприклад, досить 0,5-1,0 мл суспензії водоростей). Особливо зручний метод для експрес-аналізу токсичності різних речовин або стічних вод, а так само для виявлення ступеня забрудненості різних водойм.

Метод добре поєднується з біологічними показниками: зміна чисельності клітин водоростей, видовим розмаїттям, дає швидку і чітку оцінку стану фітоматеріала в цілому біоценозі, що дозволяє провести біоіндикаційних оцінку окремих компонентів біоценозу (фітопланктону, фітобентосу, фітообрастаній, вищих рослин). Одночасне використання люмінесцентної мікроскопії і вимірювання флуоресценції хлорофілу дає можливість встановити первинні ураження рослинної клітини, а так само тривалість і глибину цього явища і супроводжуючі їх процеси адаптації при низьких концентраціях токсичних речовин.

РОЗДІЛ 3. ВИКОРИСТАННЯ МЕТОДУ ілюмінісцентний мікроскоп В ДОСЛІДЖЕННІ МІКРОВОДОРОСТЕЙ

3.1 Виявлення фізіологічного стану клітин мікроводоростей

Фотосинтетичний апарат рослинних організмів досить чутливий до дії різних забруднюючих речовин і одним з перших реагує на їх вплив. Методом люмінесцентної мікроскопії можливе виявлення фізіологічного стану клітин мікроводоростей на різних етапах автолиза, не вловимо при візуальних спостереженнях, але виразно проявляється по зміні спектрів світіння клітин при люмінесценції (визначення живих і мертвих клітин водоростей). Техніка використання люмінесцентної мікроскопії для діагностики фізіологічного стану водоростей була розроблена С.В. Горюнової. Цей метод заснований на тому, що при мікроскопірованіі водоростей в ультрафіолетових променях клітини, що розрізняються за своїм фізіологічному стану, дають різні за забарвленням і яскравості відтінки світіння. [1]

Діатомові, деякі зелені та інші види водоростей здатні до накопичення жиру (іноді до 60%). У таких форм процеси розпаду зовні протікають швидко, тобто клітини втрачають характерні контури з утворенням жирових крапель, що світяться певний період яскраво-червоною люмінесценцією. , Microcystis и др.), имеют длительный период распада, и визуальные наблюдения не отражают изменений окраски водорослей. Водорості, основним складовим речовиною клітини яких є специфічні вуглеводи, що складають іноді до 70% від загальної кількості органічних речовин, як наприклад синьо-зелені водорості (пологів Oscillatoria, Microcystis та ін), мають тривалий період розпаду, і візуальні спостереження не відображають змін забарвлення водоростей. Такі визначення можливі при люмінесцентної мікроскопії. Живі клітини мають яскраво-червоне свічення. Клітини водоростей на різних стадіях відмирання мають різноманітну гаму світлових переходів. В основному зміна спектру свічення клітин водоростей відбувається за такими етапами:

1) Яскраве пурпурово-червоне свічення характерно для хлорофіллсодержащіх клітин найбільш високої життєздатності - клітини знаходяться в активному стані, інтенсивно діляться або готуються до поділу (логарифмічна фаза росту).

2) Червоне світло меншою яскравості (тьмяно-бордове або рожево-червоне), притаманне клітинам на стаціонарній фазі росту культури водоростей.

3) Помаранчево-червоний відтінок світіння дають клітини, пригноблені під впливом якого-небудь фактора, а блідо-оранжеве світіння мають клітини з дуже низьким рівнем життєвої активності, але ще живі. 4) Тьмяно-червоним світяться старі клітини з ослабленою життєвою активністю.

5) Блакитно-зелене і оливково-зелене свічення характерно для мертвих клітин і детриту, а також нитчастих форм, коли залишаються тільки контури оболонок. Зазвичай цей тип світіння властивий нитчасті форми, що зустрічаються в мулових відкладеннях. Синє світіння мертвих клітин водоростей, залишків вищої водної рослинності спостерігається в забруднених джерелах.

Відтінки свічення при перегляді придонного і культурального матеріалу ясно помітні і можуть бути ідентифіковані шляхом порівняння спектрів. У стадії інтенсивного росту клітин у культурі мертві клітини можуть бути відсутні, що пов'язано з їх швидким лізисом.

Шляхом підрахунку живих і мертвих клітин водоростей у культурах і їх автолиза за допомогою люмінесцентної мікроскопії встановлюється специфічність процесів розвитку та розпаду різних видів водоростей. За ступенем швидкості розвитку і розпаду можна виділити наступні групи водоростей: 1) що швидко ростуть і швидко автолізується, 2) що швидко ростуть і повільно автолізується, 3) повільно ростуть і швидко автолізується, 4) повільно ростуть і повільно автолізується. Швидкість росту і розпаду в окремих видів водоростей при дії токсикантів може значно варіювати. Так у діатомових водоростей (без внесення токсикантів) при досягненні найвищої точки розмноження клітин наступає швидкий їх розпад (2-3 дні) аж до розчинення стулок. , нарастание и развитие которых происходит в лабораторных культурах в течение нескольких лет; длителен и процесс их распада. Найбільшою тривалістю життя мають клітини синьо-зеленої водорості Oscillatoria, наростання і розвиток яких відбувається в лабораторних культурах протягом декількох років; тривалий і процес їх розпаду. Наявність потужної слизової оболонки, що виконує захисну роль і складається з важко гідролізуемих вуглеводів, мабуть, забезпечує надійний захист цих водоростей від несприятливих зовнішніх впливів. Тому і вплив токсиканту на клітину буде утруднено, світіння її з-за наявності товстої вуглеводної оболонки буде більш блідим. [2]

Використання люмінесцентних мікроскопів дає можливість проведення досить швидкої і точної оцінки ступеня життєздатності клітин водоростей. Даний метод показує глибоку ураженість кожної окремої клітини, дає можливість оцінити специфічність процесів розвитку та розпаду різних видів водоростей. Ранні зміни в пігментному апараті можна встановити, спостерігаючи за зміною флуоресценції хлорофілу або тривалим післясвіченням (уповільнена флуоресценція). [4]

На підставі цих знань можна провести визначення стану клітин водоростей в мулових відкладеннях, грунтових зразках, піщаних відкладах та ін

Дослідження проводиться за наступною методикою. Поверхневу частину донного зразка з границі розділу іл / вода акуратно наносять тонким шаром (до 0,5 мм) на предметне скло. Муловим мазком покривають приблизно 2 / 3 поверхні скла. При нанесенні мулових відкладень на скло необхідно прагнути до максимальної вирівняні поверхні. Стекла з муловим мазком розглядають в УФ-світлі (освітлення зверху через опак-ілюмінатор). На темній поверхні мазка яскраво флуоресціюють клітини водоростей, частинки детриту.

Можливі три варіанти перегляду препарату на предметному склі: 1) на предметне скло наноситься крапля води з водоростями, накривається покривним склом і мікроскопують; 2) нанесена крапля проглядається за допомогою водного імерсійного об'єктива, 3) крапля наноситься на мембранний фільтр щоб уникнути плинності препарату, накривається покривним склом і проглядається під мікроскопом. На покривне скло наносять краплю анизола для більш чіткої видимості об'єкта.

Підрахунок клітин у відбитому світлі із застосуванням термопольного конденсатора проводять з урахуванням в подальшому загальної чисельності клітин, отриманої при світлі клітин в камері Горяєва. У польових умовах при перегляді природного фітопланктону підраховують клітини основних переважаючих груп водоростей: зелених, синьо-зелених, діатомових. При кількісних підрахунках співвідношення живих, мертвих і відмерлих клітин і колоній водоростей готують серію мулових мазків (4-10), в кожній з яких прораховують 10 полів зору по довжині мулового мазка (а для отримання достовірних результатів число полів зору слід збільшувати до 50-100 ). Співвідношення клітин на різних фізіологічних етапах виражають у відсотках від загальної чисельності або в мільйонах (тисячах) на 1 мл (мільярдах на 1 літр). Отримані результати представляють графічно у вигляді таблиці при порівнянні з такими в контролі.

При підрахунку враховують три категорії світіння: яскраві пурпурово-червоні клітини або колонії з високою життєвою активністю; клітини з тьмяно-червоним і оранжево-червоним світінням - відмирають, з низькою життєвою активністю; салатно-зелені - мертві. На підставі проведеного прорахунку визначають відсоткове співвідношення різних клітин (колоній) водоростей в залежності від їх фізіологічного стану. [2]

3.2 Кількісна реєстрація інтенсивності флуоресценції

За характером нативного світіння в УФ-променях можна з достатньою точністю діагностувати ступінь життєздатності клітин водоростей. Однак окомірні оцінки інтенсивності світіння вимагають вираження їх у визначених і досить об'єктивних кількісних показниках. У зв'язку зі зміною спектру флуоресценції клітин водоростей при різних фізіологічних станах (див. вище) виникає необхідність розробки методів швидкої кількісної реєстрації інтенсивності нативного світіння хлорофіллсодержащіх клітин, як джерела об'єктивної інформації про стан їх життєвої активності.

Для кількісного вимірювання інтенсивності свічення може бути використана спеціальна установка, зібрана з окремих блоків - мікроскопа МЛД-1, ФЕУ-22, джерела живлення Б5-24 (ВС-22), мікрорентгенометра, автоматичного потенціометра ЕПП-09.

Мікроскопування альгологіческіх об'єктів проводиться за допомогою люмінесцентного мікроскопа МЛД-1, призначеного для візуального спостереження об'єктів у світлі їх люмінесценції, порушуємо ультрафіолетової областю спектру. Принцип роботи приладу заснований на використанні явища люмінесценції об'єктів, що виникає під дією променів певного спектрального складу.

Об'єкти висвітлюють зверху через опак-ілюмінатор і об'єктив за методом світлового поля. Збудження люмінесценції через об'єктив, тобто з того ж боку, що і її реєстрація, дозволяє значною мірою зменшити помилки, пов'язані з реабсорбцією люмінесценції.

Інтенсивність світіння зразків реєструється за допомогою фотоелектронного помножувача ФЕУ-22, приєднаного до мікроскопа через наявне у верхній частині головки отвір для фотографування. ФЕУ живиться від стабілізованого джерела живлення. Реєстрація сигналів з ​​ФЕУ здійснюється підсилювачем постійного струму за допомогою мікрорентгенометра і подальшою фіксацією на стрічці автоматичного потенціометра ЕПП-09. Для інтенсивності флуоресценції відображає дзеркало відкидають за допомогою рукоятки. При цьому направляють світловий потік на ФЕУ, а величину фотоструму реєструють мікрорентгенометром.

Величину ділянки флуоресціюючого препарату регулюють за допомогою діафрагм, наявних в оптичній схемі мікроскопа. Використовуючи числові показники, можна знімати інтенсивність флуоресценції строго з визначеного за величиною ділянки. Останній може бути представлений цілим трихома, колонією, пучком трихома або одиничної клітиною.

Особливе значення має техніка приготування препарату. Для щільних суспензій водоростей з розмірами клітин більше 10 μ мікроскопують краплю досліджуваного зразка. Її наносять на предметне скло, прикривають покривним і мікроскопіруют. При дослідженні нещільних суспензій з розмірами клітин в межах 4-7 μ окрему клітку можна виділити тільки при використанні імерсійної системи і об'єктивів із збільшенням 60-90 і більше разів. Тому необхідно провести попереднє згущення зразка. Це роблять або шляхом центрифугування - мікроскопують осад, або після фільтрування певного об'єму суспензії (1-10 мл) через мембранний фільтр. Налаштування і чіткість видимості деталей препарату здійснюють за допомогою макро-і мікровінта при відсутності сигналу на ФЕП. Величина фотоструму пропорційна інтенсивності світіння і з достатньою чутливістю реєструється мікрорентгенометром.

Змонтована за вказаною блок-схемі установка дає можливість не тільки вимірювати інтенсивність ділянок препарату і отримувати кількісні характеристики флуоресценції, що відповідають певним життєвим станам клітин водоростей, але й знімати тимчасову характеристику зміни інтенсивності світіння, яка дозволяє судити про стан хлорофіл-білково-ліпоїдного комплексу. [13]

3.3 Оцінка ступеня токсичності окремих речовин для водоростей

Методи люмінесцентного аналізу та виміру флуоресценції хлорофілу були застосовані для оцінки ступеня токсичності окремих речовин для водоростей, макрофітів, фітообрастаній в лабораторних, польових та експедиційних умовах, на модельних екосистемах, а також для оцінки токсичності стічних вод і забруднення природних водойм.

За допомогою цього методу можна провести тестування на культурах водоростей різних речовин: пропаніда, суміші Сатурна і пропаніда, метафос, суміші фенолу і формальдегіду. Вимірювання флуоресценції хлорофілу показує швидку реакцію фотосинтетичного апарата клітин різних видів водоростей на внесення речовин (самими токсичними є пропанід, метафос, суміш пропаніда і Сатурна). и Scenedesmus quadricauda внесение токсикантов не вызывает. Результати люмінесцентного микроскопирования показують, що глибокої зміни в клітинах водоростей Chlorella vulgaris і Scenedesmus quadricauda внесення токсикантів не викликає. наблюдается лизис мёртвых клеток в присутствии пропанида и значительное (в 7 раз) снижение численности клеток после внесения в культуру метафоса. Більш чутлива до даних речовин морська жовто-зелені водорості Phaeodactilum trucornutum спостерігається лізис мертвих клітин у присутності пропаніда і значне (в 7 разів) зниження чисельності клітин після внесення в культуру метафос.

Експерименти, проведені в даному напрямку, дозволяють припустити, що якщо у водойми будуть постійно надходити забруднюючі речовини в невисоких концентраціях, то при сприятливих температурних умовах і достатній кількості поживних речовин можуть розвиватися синьо-зелені водорості, клітини яких мають захисний шар слизу, через яку надходження токсичної речовини утруднено, а продукція цінних у кормовому відношенні водоростей буде подавлена. Такі зміни в подальшому можуть призвести до перебудови біоценозу: водоймище з цінного рибогосподарського може перетворитися на малоцінний зі зміненим складом води. [15]

3.4 Визначення вмісту вітамінів у рослинних клітинах

За допомогою флуоресцентної мікроскопії можливе визначення вмісту вітамінів у зразках, завдяки їх власної флуоресценції і з застосуванням флуорохромів. У багатьох випадках цей метод дає кращі результати, ніж самий тонкий хімічний аналіз, який не дозволяє, наприклад, судити про розподіл вітамінів в органах і тканинах. У зв'язку з цим метод особливо широко застосовується в медицині і фізіології тварин.

Вітамін А характеризується світло-зеленої швидко затухаючої флуоресценцією. Її можна спостерігати у свіжому нефіксованим вигляді, але більш плідним є метод фарбування тканин за допомогою флуорохромів. Флуоресцентне мікроскопування в даному випадку може служити методом диференціації вітамінів А ₁ і А _2: вітамін А ₁ дає характерну світло-зелену флуоресценцію, а вітамін А ₂ - червонувату. Різниця в інтенсивності флуоресценції з успіхом використовується для аналізу суміші вільного вітаміну А та його ефірів.

Вітамін В ₂ володіє власною зеленої флуоресценцією (у деяких тварин клітинах виявлена ​​так само жовто-зелена флуоресценція). Оптимум люмінесценції даної речовини знаходиться при рН від 3 до 9, що необхідно враховувати при проведенні досліджень. Типова флуоресценція рибофлавіну залежить від присутності вільної 3-аміногрупи. Ця флуоресценція (максимум на 565 нм при рН 60) служить для кількісного визначення вітаміну В _2. Інтенсивність флуоресценції порівнюється з яких-небудь стандартом (найчастіше чистий рибофлавін), вона прямо пропорційна вмісту вітаміну.

Вітамін В ₁ не флуоресціює ні в чистому вигляді, ні у водному розчині. Здатність до синьо-зеленої флуоресценції проявляє тіамін тільки в комплексі з носієм. При окисленні вітамін В ₁ перетворюється на тіохром - жовте речовина з інтенсивно синьою флуоресценцією. У лужному розчині тіохром дуже чутливий до світла і флуоресценція його зникає безповоротно. Властивістю вітаміну В ₁ окислюватися в тіохром користуються в тесті на цей вітамін: водний розчин тіаміну окислюється допомогою железосинеродистого калію в тіохром, флуоресценція якого визначається фотоелектричні після екстракції тіохрома ізобутилового спирту. Інтенсивність флуоресценції залежить від лужності розчину і кількості знаходиться там тіохрома. Результати, одержані цим методом, знаходяться в повній відповідності з біологічними тестами.

Нікотинова кислота і її амід так само пов'язані з колоїдальних носієм. Амід нікотинової кислоти присутнє у двох коферменту: Кодегідраза-1 і Кодегідраза-2. Кодегідраза-2 зустрічається практично у всіх живих клітинах. Властивості його дуже близькі до властивостей кодегідрази-1: обидві речовини безбарвні, розчиняються у воді, нерозчинні в органічних розчинниках. Ці носії дають хорошу флуоресценцію при освітленні в УФ-світлі, що використовується для їх визначення.

Вітамін С у водному розчині не флуоресціює. Тільки при великій концентрації аскорбінової кислоти з колоїдним носієм з'являються зелені, досить лабільні по відношенню до ультрафіолетових променів краплі.

Вітамін К дає типову адсорбцію з максимумом при 234, 248, 261, 270 і 320 нм (в ультрафіолетовій області). Вітамін До володіє білою флуоресценцією у світлі аргоновою лампи. Н.А. Андрєєв і В.М. Букін (1949) розробили кількісний флуоресцентний метод визначення фолієвої кислоти в клітинах. Ними побудована крива розподілу інтенсивності в спектрі флуоресценції кислоти, показано зміна інтенсивності в спектрі флуоресценції кислоти, показано зміна інтенсивності світіння залежно від рН розчину. Описано метод екстрагування кислоти, її адсорбції на активованому вугіллі (обробленому аніліном) з наступним елуірованіем спиртом: отриманий розчин упарюють і окислюють перманганатом. Вимірювання інтенсивності флуоресценції автори проводять при рН 4,0-4,5, користуючись світлофільтром (470 нм), застосовуючи в якості стандарту розчин фолієвої кислоти концентрації 2 мл в 100 мл води. Для повного вилучення фолієвої кислоти необхідно піддавати додаткової ферментативної обробці продукти, які містять багато білкових речовин. [1,3]

ВИСНОВОК

Величезну роль в дослідженнях фізіології рослинних організмів на сучасному етапі грають флуоресцентні методи. Їх невід'ємною частиною є люмінесцентна мікроскопія, що отримала широке застосування у вивченні різних параметрів життєдіяльності вищих і нижчих рослин. Цей метод має низку переваг, які полягають у швидкості, різнобічності і високої точності досліджень.

Зокрема, метод люмінесцентної мікроскопії дозволяє швидке виявлення фізіологічного стану клітин мікроводоростей, що важливо для вивчення «цвітіння» водойм, визначення якості водного середовища.

Постійно зростаюча антропогенне навантаження на біоценози вимагає швидких і точних методик біотестування вод. Для вирішення цієї проблеми методом люмінесцентної мікроскопії проводиться оцінка ступеня токсичності окремих речовин для водоростей.

Кількісна реєстрація інтенсивності флуоресценції, яка може бути визначена за допомогою розглянутого методу дослідження, є відправною точкою у вивченні фотосинтетичного апарату мікроводоростей, який, як відомо, в першу чергу реагує на найменші зміни умов середовища.

Особливістю люмінесцентної мікроскопії є можливість якісного та кількісного визначення нефлуоресцірующіх речовин: вітамінів, специфічних білків, ферментів.

Люмінесцентна мікроскопія, в середині минулого століття знайшла застосування у вивченні фізіології мікроводоростей, займає особливе місце в сучасній системі методів наукового дослідження. Завдяки розвитку сучасної науки, відкриття нових флуорохромів вона набуває все більшого значення для виявлення фізіологічного стану мікроводоростей та визначення якості водного середовища.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Бергольц, М.В. Люмінесцентна мікроскопія / В.М. Бергольц - М: Медгиз, 1953. - 312-314с.

2. Веселовський, В.А. Люмінесценція рослин / В.А. Веселовський, Т.В. Веселова. - М.: Наука, 1990.

3. Владимиров, Ю.А. Фізико-хімічні основи фотобиологических процесів / Ю.О. Владимиров, А.Я. Потапенко. - М.: Вища школа, 1989. - 30-35с.

4. Питання фотосинтезу / Под ред. М.М. Окунцова. - Томськ: Видавництво Томського університету, 1970. - 48-49с.

5. Ізместьева, Л.Р Методи дослідження фітопланктону / Л.Р. Ізместьева, Н.Б. Усенко, О.М. Кожова / / Сб. Моніторинг фітопланктону. - К.: Наука, 1992. - 26-30с.

6. Інге-Вечтомова, Н.І. Спектрофлуорометріческіе методи дослідження біологічних об'єктів / Н.І. Інге-Вечтомова, О.Ю. Батов; Під ред. В.В. Польового, Г.Б. Максимова - Л.: Вид-во ЛДУ, 1986. - 102-118с.

7. Люмінесцентні методи визначення мікрокількостей елементів / Відп. ред. М.А. Остапенко. - М.: Всесоюзний науково-дослідний ін-т хім. Реактивів, 1962. - 25-34с.

8. Маторін, Д.М. Люмінесценція хлорофілу в культурах мікроводоростей в природних популяціях фітопланктону / Д.М. Маторін, П.С. Венедиктов / / Підсумки науки і техніки ВІНІТІ, серія Біофізика - Т.40. - 1900. - 50-62С.

9. Методичні питання вивчення первинної продукції планктону внутрішніх водойм / Відп. ред. І.Л. Пирін. - С-Пб.: Гідрометіздат, 1993. - 120-132с.

10. Методи біотестування вод [збірник статей] / Под ред. О.М. Крайнюкова. - К.: Наука, 1988. - 41-49с.

11. Методи біотестування якості водного середовища / За ред. О.Ф. Філенко. - М.: Изд-во МГУ, 1989. - 23-25с.

12. Опрітов, В.А. Теоретичні основи і методи вивчення біофізичних процесів у рослин / В.А. Опрітов, В.А Калінін, В.Г. Ретівін. - Горький: Вид-во ГГУ, 1979. - 36-40с.

13. Сіренко, Л. А. Методи фізіолого-біохімічного дослідження водоростей у гідробіологічної практиці / Л. А. Сіренко, А. І. Сакевич, Л.Ф. Осипов та ін - Київ: Наукова думка, 1975. - 57-63С.

14. Федоров, В.Д. Про методи вивчення фітопланктону і його активності / В.Д. Федоров. - К.: Наука, 1979. - 115-130с.

15. Франк, О.М. Вивчення розподілу фітопланктону оптичними методами / Н.А. Франк. - К.: Наука, 1988. - 96с.

16. Еколого-фізіологічні дослідження фотосинтезу і водного режиму рослин в польових умовах. Праці всесоюзного наради / Відп. ред. Р.К. Василя. - Іркутськ: Іркутська обласна друкарня № 1, 1983. - 27-32с.

SUMMARY

In the given work the scope of a method of luminescent microscopy is investigated. By means of this method it is possible to carry out various researches of microseaweed: revealing of a physiological condition of separate cells, an estimation of degree of toxicity of separate substances for seaweed, definition of the maintenance of vitamins in vegetable cells, quantative registration of intensity of fluorescence. This method is successfully applied in biotesting of quality of the water environment. Luminescent microscopy - a perspective direction in modern physiology of plants.