Зміст
Введення
1. Літературний огляд
1.1 Кадмій, як основне джерело забруднення, шляхи надходження у навколишнє середовище і дію на метаболічні процеси в організмі
1.2 Роль і структура аспартатамінотрансферази і аланінамінотрансферази
1.2.1 Коротка історія відкриття реакції переамінування
1.2.2 Структура аспартатамінотрансферази
1.2.3 Механізм реакції переамінування
1.2.4 Біологічна роль трансаміназ
2. Матеріали і методи
2.1 Експериментальна частина
2.1.1 Експериментальні тварини
2.1.2 Підготовка біологічного матеріалу
2.1.2.1 Підготовка сироватки крові
2.1.2.2 Підготовка гомогенатов тканин і органів
2.2 Визначення активності амінотрансфераз методом Райтмана-Френкеля
2.2.1 Хід визначення активності аспартатамінотрансферази і аланінамінотрансферази в сироватці крові
2.2.2 Визначення активності аспартатамінотрансферази і аланінамінотрансферази в гомогенатах органів
3. Результати та обговорення
Висновки
Список використаних джерел
Додаток
СПИСОК Скорочена назва
АСТ - аспартатамінотрансфераза
АЛТ - аланіамінотрансфераза
ГДК - гранично допустима концентрація
ВООЗ - Всесвітня організація охорони здоров'я
ПОЛ - перекисне окислення ліпідів
АМ - альвеолярні макрофаги
ПНЛ - поліморфонуклеарних лейкоцити
АТФ - аденозинтрифосфорная кислота
ПЛФ - піридоксальфосфат
ПМФ - пірідоксамінфосфат
ПВК - піровиноградна кислота
2,4-ДНФГ - 2,4 дінтрофенілнідразін
ЦТК - цикл трикарбонових кислот
АДФ - аденозиндифосфат
Введення
Відомо, що важкі метали мають виражені кумулятивними властивостями, високою біохімічною активністю по відношенню до сульфгідрильних, тіолових, карбоксильні та іншим активним групам білків та амінокислот. Беручи до уваги здатність важких металів до трансплацентарному переходу і високу чутливість організму на ранніх етапах онтогенезу, стає очевидним, що новонароджені і діти грудного віку складають групу ризику розвитку предпатологіческіх і патологічних станів / 1 /.
) является одним из опасных загрязнителей природной среды.
Кадмій (Cd) є одним з небезпечних забруднювачів природного середовища. Адсорбуючись через легені та шлунково-кишковий тракт, вже через кілька хвилин він виявляється в крові. Кадмій має канцерогенну, гонадотропним, ембріотропним, мутагенними та нефротоксичну дією. Реальна загроза несприятливого впливу на населення навіть при низьких рівнях забруднення пов'язана з високою біологічною кумуляцією цього металу. Наслідки короткого контакту з високими концентраціями кадмію в повітрі призводять до легеневому фіброзу, стійкого порушення легеневих і печінкових функцій. , попавшего в организм ингаляционным путем. У легенях осідає до 50% Cd, що потрапив в організм інгаляційним шляхом. в среднем состовляет 5%. У шлунково-кишковому тракті адсорбція Cd в середньому состовляет 5%. являются печень, почки, костный мозг, сперма, трубчатые кости и отчасти селезенка. Органами - мішенями Cd є печінка, нирки, кістковий мозок, сперма, трубчасті кістки і почасти селезінка. Кадмій депонується в печінці та нирках, де його міститься до 30% від загальної кількості в організмі / 2 /.сказывается, прежде всего, на потомстве, поскольку, проникая через плаценту, кадмий способен изменять ее ферментативный статус/3/.
Токсичний вплив Cd позначається, насамперед, на потомство, оскільки, проникаючи через плаценту, кадмій здатний змінювати її ферментативний статус / 3 /. систем. беременным и кормящим крысам, у потомства обнаруживают повреждения репродуктивной системы и задержке физического развития/4/. При введенні Cd per os вагітним і годуючим щурам, у потомства виявляють ушкодження репродуктивної системи і затримки фізичного розвитку / 4 /. является скелетные нарушения, нарушения обмена белков, липидов, ингибирование ряда ферментативных Результатом пренатального і постнатального впливу Cd є скелетні порушення, порушення обміну білків, ліпідів, інгібування ряду ферментативнихОдним з найбільш поширених видів біологічної дії хімічних речовин є їх здатність впливати на білковий і амінокислотний обмін в організмі. Найбільш важливими з практичної точки зору і добре вивченими ферментами є аспартатамінотрансфераза і аланінамінотрансфераза - ферменти, що каталізують міжмолекулярних перенесення аміногруп між аміно - і кетокислот / 5 /.
Метою даної роботи було вивчення впливу азотнокислого кадмію на активність аланінамінотрансферази та аспартатамінотрансферази в сироватці крові і тканинах органів у потомства білих щурів, які зазнали токсичного дії в неонатальний період.
Відповідно до мети були поставлені наступні завдання:
визначити активність АСТ і АЛТ у сироватці крові, тканинах печінки, головного мозку, серця, нирках потомства щурів, які зазнали хронічного дії іонами кадмію в період лактації;
вивчити вплив різних доз токсиканту на активність АСТ і АЛТ у сироватці крові і тканинах.
1. Літературний огляд
1.1 Кадмій, як основне джерело забруднення, шляхи надходження у навколишнє середовище і дію на метаболічні процеси в організмі
Сучасний рівень розвитку промислових технологій не дозволяє перейти до екологічно чистого проізводству/6/.Однім з найбільш поширених забруднювачів навколишнього середовища є іони важких металів, зокрема кадмій. Індустріальне забруднення кадмієм характерно для багатьох промислових районів Росії. Кадмій здатний адсорбуватися на твердих частках і переноситися на великі відстані.
Джерелами більшості антропогенних забруднень є відходи від металургійних виробництв, зі стічними водами гальванічних виробництв (після кадміювання), інших виробництв, в яких застосовуються кадмійсодержащіе стабілізатори, пігменти, фарби і в результаті використання фосфатних добрив. Кадмій присутня в повітрі великих міст внаслідок стирання шин, ерозії деяких видів пластмасових виробів, фарб і клеючих матеріалів / 1 /. Однак найбільше в навколишнє середовище кадмій надходить у вигляді побічного продукту металургійного виробництва (наприклад, при виплавці і електролітичної очищенню цинку), а також при зберіганні і переробці побутових та промислових відходів / 7 /. Навіть у незабруднених районах з вмістом кадмію в повітрі менше 1 мкг / м, його щоденне надходження в організм людини при диханні складає близько 1% від допустимої добової дози / 2 /.
Додатковим джерелом надходження кадмію в організм є куріння. Одна сигарета містить 1-2 мкг кадмію, і близько 10% його надходить до органів дихання. У осіб викурюють до 30 сигарет на день, за 40 років в організмі накопичується 13-52 мкг кадмію, що перевищує його кількість, що надходить з їжею / 7 /.
У питну воду кадмій потрапляє внаслідок забруднення вододжерел виробничими скидами, з реагентами, що використовуються на стадії водопідготовки, а також в результаті міграції з водопровідних конструкцій. Частка кадмію, що надходить в організм з водою, в загальній добовій дозі становить 5-10% / 8 /. Середньодобове споживання кадмію людиною складає приблизно 50 мкг з окремими відхиленнями в залежності від індивідуальних і регіональних особливостей / 2/.Предельно допустима концентрація (ГДК) кадмію в атмосферному повітрі становить 0,3 мкг / м, в воді вододжерел - 0,001 мг / л, у грунтах піщаних і супіщаних кислих і нейтральних 0,5, 1,0 і 2,0 мг / кг відповідно / 2 /.
Всесвітньою організацією охорони здоров'я (ВООЗ) встановлений допустимий рівень вмісту кадмію в організмі 6,7 - 8 мкг / кг / 2,8 /. Обмін кадмію в організмі характеризується наступними основними особливостями / 9 /: відсутністю ефективного механізму гомеостатичного контролю; тривалим утриманням (кумуляцією) в організмі. На затримку кадмію в організмі впливає вік людини. У дітей і підлітків ступінь його всмоктування в 5 разів вище, ніж у дорослих / 2 /. Виведення кадмію відбувається повільно. Період його біологічної напіввиведення в організмі коливається, за різними оцінками, в межах 10-47 років / 10,11 /. Від 50 до 75% кадмію від потрапив кількості утримується в організмі. Основна кількість кадмію з організму виводиться з сечею (1-2 мкг / добу) і калом (10-50 мкг / добу) / 2 /.
Хронічний вплив кадмію на людину призводить до порушень ниркової функцій легеневої недостатньою, остеомаляції, анемій і втрати нюху. Існує дані про можливе канцерогенний ефект кадмію і про ймовірну участь його в розвитку серцево-судинних захворювань / 12 /. Найбільш важкою формою хронічного отруєння кадмієм є хвороба "ітай-ітай" характеризується деформацією скелета з помітним зменшенням росту, поперековими болями, болючим явищами в м'язах ніг, качиної ходою. Крім того, відзначаються приватні переломи розм'якшених кісток, а також порушення функцій підшлункової залози, зміни в шлунково-кишковому тракті, гіпохромна анемія, дисфункція нирок та ін / 9 /. Кадмій здатний накопичуватися в організмі людини і тварин, так як порівняно легко засвоюється з їжі та води і проникає в різні органи і тканини. Токсична дія металу проявляється вже при дуже низьких концентраціях / 6 /. У сучасній науковій літературі вивчення токсичної дії кадмію присвячено чимало робіт. Найбільш типовим проявом отруєння кадмієм є порушення процесів поглинання амінокислот, фосфору і кальцію в нирках. Після припинення дії кадмію ушкодження, викликані його дією в нирках, залишаються незворотними. Показано, що порушення процесів обміну в нирках може призвести до зміни мінерального складу кісток / 8 /. Відомо, що кадмій накопичується переважно в кірковому шарі нирок, а його концентрація в мозковому шарі і ниркових мисках значно нижче / 13 /, що пов'язано з його здатністю депонуватися в паренхіматозних органах і повільним виведенням з організму.
Імовірно прояв токсичної дії іонів кадмію пов'язано синтезом в організмі білка металіотеонеіна, який зв'язує і транспортує його в нирки. Там білок майже повністю реадсорбіруется і швидко деградує зі звільненням іонів кадмію, стимулюючих металліотіонеіна в клітинах епітелію проксимальних канальців. Деградація комплексу кадмій-металліотіонеін призводить до підвищення рівня іонів кадмію спочатку в лізосомальної фракцій, а потім у цитозолі, де відбувається зв'язування з нирковим металліотіонеіном. При цьому в клітинах з'являються везикули, і підвищується кількість електронно-щільних лізосом, появою низькомолекулярної протеїнурії та кальційуріей / 9,14 /.
Роль білка металіотінеіна у зниженні токсичності кадмію вельми значна. Експериментальне внутрішньовенне введення кадмію, пов'язаного з даним білком, запобігає розвитку некрозу в ниркової тканини у мишей, тоді як аналогічні дози неорганічного кадмію викликає розвиток некрозу в нирках. Це доводить участь металіотіонеіна у зниженні токсичності металу. Однак цей механізм обмежений у кількісному відношенні, тому що при тривалому надходженні кадмію також розвивається пошкодження тубулярної епітелію / 14 /.
Численними дослідженнями було показано можливий зв'язок між кадмійіндуцірованним пошкодженням клітин нирок, міжклітинним зміною змісту іонів кадмію та індукцією синтезу стресових білків. показано, что кадмий активирует секрецию этого гормона, который через усиление потока кальция в клетку может повреждать цитоскелет /9/.
Першим кандидатом на роль стресового білка є кальмодулін, так як in vitro показано, що кадмій активує секрецію цього гормону, який через посилення потоку кальцію в клітину може пошкоджувати цитоскелет / 9 /.Кадмій викликає розвиток протеїнурії, глюкозурії, аміноацидурією та інші патологічні процеси. При тривалому надходженні кадмію в організм розвивається нирковий тубулярний ацидоз, гіперкальційурія і формуються камені в сечовому міхурі. У важких випадках хронічної інтоксикації кадмієвої може також спостерігатися нефрокальцідоз. Накопичення кадмію в клітинах культури нирок відбувається паралельно підвищенню ступеня його токсичності. Однак характер розподілу його в клітині не залежить від вираженості цитотоксичної дії: більше 90% металу пов'язане з цитозолі, інша частина - мікросомной, мітохондріальної, ядерної фракціями і клітинними фрагментами / 8 /.
Вивчення субклітинного розподілу кадмію в печінці дозволило розшифрувати механізм виникнення толерантності до даного металу. Встановлено, що зниження чутливості до кадмію обумовлено зміною його розподілу не в тканинах, а цитозольної субклітинні фракції печінки, що є органом - мішенню, де відбувається зв'язування його з металіотіонеіном. У дозі 2,4 мг / кг кадмій знижує синтез білка в мікросомальної фракції печінки щурів, не порушуючи його в ядрах та мітохондріях. Накопичуючись на внутрішніх мембранах мітохондрій, даний метал зменшує енергопостачання і стимулює перекисне окислення ліпідів (ПОЛ) при концентраціях 10 - 100 мкмоль / 15,16 /.
У першу добу після введення кадмію в дозі 4 мг / кг в м'язі серця щурів у порівнянні з контролем збільшилися зміст дієнових коньюгантов в 2,1 разів, активність глутатіонпероксидази - на 3,2%. У корі великих півкуль головного мозку зміст шіффових підстав зростала у 2,2 рази. На сьому добу спостереження у тварин, які отримували кадмій, концентрація шіффових підстав у неокортексі залишалася підвищеною на 59,3%, у серці - збільшилася в 2,4 рази в порівнянні з контролем; зміст коньюгантов в міокарді в дозі 1 мкмоль відбувається порушення цілісності мембран мітохондрій , але стимуляція ПОЛ не спостерігається / 16 /.
При хронічному інгаляційному впливі кадмій викликає важкі ураження легень. Як показали проведені шопів В. Л. з співробітниками дослідження / 17 /, відсоток альвеолярних макрофагів (АМ) при впливі кадмію в перший день значно знижувався (до 11,5%). Цей ефект спостерігався і на п'ятнадцятий день - АМ склав 45,5% від вихідних значень. Одночасно різко підвищувався відсоток поліморфонуклеарних лейкоцитів (ПНЛ), серед деяких зустрічалися і незрілі форми. Середня площа АМ після хімічного впливу збільшувалася за рахунок підвищення відсотка дуже великих клітин, а не за рахунок рівномірного збільшення площі всіх клітин. При цьому великі АМ мали вакуолізований пінисту цитоплазму. Зустрічалися і клітини з ядрами пикнотические, Каріолізис і каріорексисом. Все це вказує на те, що сполуки кадмію суттєво знижують вміст внутрішньоклітинного АТФ і інгібують клітинне дихання.
В основі механізму токсичної дії іонів важких металів, у тому числі кадмію, лежить їх взаємодія з компонентами клітин, молекулами клітинних органел і мембран.
Іони металів можуть впливати на процеси, що протікають в клітині, тільки проникаючи всередину її та фіксуючи у субклітинних мембранах. Кадмій проникає в клітину через потенціал залежні кальцієві канальці. Вплив кадмію на внутрішньоклітинні процеси дуже різноманітні. Так, метал виявляє помітний вплив на обмін нуклеїнових кислот і білка. включение тимидина в ДНК регенерирующей печени, угнетает синтез белка в печени крыс на стадии инициации трансляции, нарушая образования полирибосом, тогда как процесс элонгации, напротив, ускоряется в результате активирования факторов EF – 1 и EF – 2 /9/.
Він інгібує in vivo включення тимідину в ДНК регенерує печінки, пригнічує синтез білка в печінці щурів на стадії ініціації трансляції, порушуючи освіти полірібосом, тоді як процес елонгації, навпаки, прискорюється в результаті активування факторів EF - 1 і EF - 2 / 9 /. , Cu , Se , Fe ), что может вызывать их дефицит. Надлишок іонів кадмію інгібує синтез ДНК, білків і нуклеїнових кислот, впливає на активність ферментів, порушує засвоєння та обмін ряду мікроелементів (Zn, Cu, Se, Fe), що може викликати їхній дефіцит. Слід зауважити, що при достатньому надходженні цинку в організм токсичність кадмію знижується / 8 /.За допомогою електронної мікроскопії було встановлено, що кадмій викликає ультраструктурні зміни клітинних мембран, мітохондрій, цистерн апарату Гольджі, мережі трубочок, хроматину, ядерця, мікрофіламентів і рібосом/18 /.
Поразка клітинної оболонки є найбільш ранньою ознакою дії даного металу, особливо при тривалому надходженні, хоча клітини могли переносити поразки клітинної оболонки, а також мітохондрій і в деякій мірі - апарату Гольджі/16 /.
на митохондриальную мембрану выявили, что ионы кадмия повышают проницаемость мембраны к ионам H , K , Mg , а это приводит к активации дыхания энергизованных нефосфорилирующих митохондрий/15/.
При дослідженні впливу кадмію in vitro на мітохондріальну мембрану виявили, що іони кадмію підвищують проникність мембрани до іонів H, K, Mg, а це призводить до активації дихання енергізованних нефосфорілірующіх мітохондрій/15 /.Відомо, що деякі ферменти в своїй структурі мають іони металів. периода таблицы химических элементов, которые способны замещаться на любой двухвалентный ион металла (близкий по положению в таблице Д. И. Менделеева) /12/, в частности, к таким ферментам относятся щелочная фосфатаза и ряд протеаз /19/.
Існує група ферментів, до складу простетичної частини яких входять іони металів IV періоду таблиці хімічних елементів, які здатні заміщатися на будь-який двовалентний іон металу (близький по положенню в таблиці Д. І. Менделєєва) / 12 /, зокрема, до таких ферментів відносяться лужна фосфатаза і ряд протеаз / 19 /. На підставі проведених експериментів можна припустити, що в результаті заміщення іонів у простетичної частини ферменту один на інший відбувається зміна просторової конфігурації активного центру ферменту, що приводить до зміни рівня його активності.Своє токсичний вплив кадмій робить і на репродуктивні функції організму / 20 /. Ефект залежить від дози речовини і часу впливу. Грунтуючись на експериментальних даних, вважають, що тератогенну дію кадмійсодержащіх речовин може бути пов'язано з інгібуванням активності карбоангідрази / 16 /. Так, впливаючи на тканини сім'яників, кадмій викликає зменшення синтезу тестостерону / 20 /. Цей метал може приводити до гормональних порушень у самок, запобігає запліднення, може викликати кровотечі і навіть призводити до смерті ембріонів / 9,21 /. Встановлено також, що кадмій здатний накопичуватися в плаценті і викликати її пошкодження / 7 /. У дослідженнях / 9,21 / було з'ясовано вплив різних доз кадмію на ембріональну смертність. Так, при введенні металу в дозі 5 мг / кг вперше виявляються мертві ембріони, при 10 мг / кг спостерігається зниження середньої маси плоду, збільшення ембріональної смертності в 2,8 рази, а при дозі 20 мг / кг - максимальне число мертвих ембріонів на одне жівотное/20, 22 /.
У літературі описано також віддалене вплив кадмію на розвиток потомства. Зокрема, в результаті введення самкам розчину кадмію під час вагітності та в період лактації, у потомства, що піддавався дії металу в ембріогенезі, спостерігалися нейрохімічні зміни в мозочку і в смугастому тілі, і зміни моторної активності в дорослому состояніі/23 /.
Таким чином, грунтуючись на літературних даних, можна відзначити, що токсичність сполук кадмію слід розглядати двояко. З одного боку - це безпосередня дія іонів на організм. З іншого боку - вплив на потомство особин, які зазнали дії сполук цього важкого металу.
1.2 Роль і структура аспартатамінотрансферази і аланінамінотрансферази
1.2.1 Коротка історія відкриття реакції переамінування амінокислот
Реакція переамінування амінокислот була відкрита вченими А. Є. Браунштейном і М.Г. Кріцман в 1937 році при вивченні дезамінування глутамінової кислоти у м'язовій тканині / 24 /. -кетоглутаровая кислота и аланин без промежуточного образования аммиака; добавление аланина и
Було відмічено, що при додаванні до гомогенату м'язів глутамінової та піровиноградної кислот утворюється L-кетоглутарової кислота і аланін без проміжного утворення аміаку; додавання аланіну іРеакції переамінування протікають за участю специфічних ферментів, названих А.Є. Браунштейном аміноферазамі (або по сучасній класифікації, трансаміназ). Теоретично ці реакції можливі між будь-аміно - і кетокислот, але найбільш інтенсивно вони протікають в тому випадку, коли один з партнерів представлений дикарбонової аміно - або кетокислот. У тканинах тварин і у мікроорганізмів доведено існування реакції переамінування також між монокарбонові аміно - і кетокіслотамі/26 /.
У перших же роботах, присвячених до відкриття ферментативного переамінування, А.Є. Браунштейн і М.Г. Кріцман висловили пропозицію про освіту в ході цієї реакції основи Шиффа, що піддається тавтомерне перетворення і гідролізу; при цьому вказувалося на можливість участі в реакції проміжного акцептора аміногрупи. Це припущення отримало пошкодження після відкриття в 1944 році американським біохіміком Е. Снеллом нових біологічно активних форм вітаміну - Піридоксаля і піридоксаміну, яким була приписана роль переносника аміногрупи. У 1945-47г.г. були отримані докази того, що фосфорильованих похідних піридоксаля-піродоксаль -
-Фосфат є коферментом аспартат-трансаміназ бактеріальної і тваринного проісхожденія/27 /. У 1954 році А. Майстер і співавтори встановили, що частково очищена апотрансаміназа активується за допомогою піродоксаль -
- Фосфату в рівній мірі. Ці дані відповідали раніше висловленими пропозиціями, згідно з якими піридоксальфосфат і пірідоксамінфосфат піддаються взаємоперетворення в ході каталізує фермент реакції, яка може бути представлена у вигляді суми двох напівреакцій / 28 /:
-аппарат + ПЛФ
L-апарат + ПЛФ ПМФ + 2 - оксоглутарат – глутамат + ПЛФ
ПЛФ - піридоксальфосфат, ПМФ-пірідоксамінфосфат.
Остаточні докази цього механізму були отримані в кінці 50-х років отримання високоочищених препаратів аспартат-трансамінази з серця свині. - глутамат или L - аспартат вызывает превращение обращается при добавлении 2 – оксоглутарата или оксалацетата/25/.
Досліджуючи ці препарати, вдалося підтвердити наявність міцно пов'язаного пиридоксальфосфата в трансаміназ і довести за допомогою хімічних і спектрофотометричних методів, що L - глутамат або L - аспартат викликає перетворення звертається при додаванні 2 - оксоглутарата або оксалацетата/25 /. У реакції переамінування бере участь1.2.2 Структура аспартат-трансамінази
Трансамінази є у всіх тваринних і рослинних клітинах, а також в мікроорганізмах. В даний час відомо близько 60 трансаміназ, що розрізняються за субстратної специфічності. З них найкраще досліджена аспартат-трансаміназ, при вивченні якої вдалося найбільш близько підійти до розкриття молекулярного механізму переамінування. Важливим етапом у вивченні аспартат-трансамінази стало визначення її просторової структури за допомогою методу рентгеноструктурного аналіза/29 /.
На початку 60-х років було виявлено, що в тканинах тварин містяться два ізоферменту аспартат-трансамінази: цитозольний і мітохондріальний; їх ізоелектрична точки рівні відповідно ~ 6 і 9 / 30 /. -оптимуму активности.
Незважаючи на ідентичність основного каталітичного механізму, цитозольний і мітохондріальний ізоферменти розрізняються за багатьма каталітичним параметрами: питомої активності та спорідненості до піродоксальфосфату, спорідненості до субстрату і PH-оптимуму активності. Обидва ізоферменту мають більшу спорідненість до субстрату з четирехуглеродной ланцюжком, ніж до пятиуглеродного субстратів. -аспартат в несколько раз лучше, а 2-оксоглутарат существенно хуже по сравнению с цитозольным изоферментом. Але мітохондріальний ізофермент пов'язує L-аспартат в кілька разів краще, а 2-оксоглутарат істотно гірше в порівнянні з цитозольним ізоферментом. Ізоферменти розрізняються за здатністю каталізувати переамінування ароматичних амінокислот, спорідненості до аніонів, доступності інактивації трипсином і деякими реагентами, термостабільності і іонізації фосфатної групи кофермент.У 1972 році під керівництвом Ю.А. Овчиннікова і А.Є. Брауцштейна була завершена робота з визначення первинної структури цитозольної аспартат-трансамінази з серця свіньі/31 /. До теперішнього часу визначені повні амінокислотні послідовності двох цитозольних ізоферментів (з серця свині, курки, з печінки щура і індика). Молекули обох ізоферментів побудовані з двох ідентичних поліпептидних ланцюгів (субодиниць), кожна з яких містить одну молекулу міцно пов'язаного з білком пиридоксальфосфата. Поліпептидний ланцюг цитозольних аспартат-трансаміназ свині і курки складається відповідно з 412 і 411 амінокислотних залишків і має молекулярну масу близько 46,5 кДа. Поліпептидний ланцюг мітохондріальних ізоферментів свині і курки складається з 401 амінокислотного залишку і має молекулярну масу близько 45 кДа. 2 –конце дополнительный пептид (“сигнальный”), состоящий из 29 аминокислотных остатков.
Обидва ізоферменту синтезуються на рибосомах в цитоплазмі клітини, причому мітохондріальний фермент-у вигляді проферменту, який містить на NH 2-кінці додатковий пептид ("сигнальний"), що складається з 29 амінокислотних залишків. Освіта активної форми ферменту пов'язано з відщепленням цього пептіда/28 /.У 1977 році була визначена тривимірна структура трансамінази. Пізніше за кордоном були розпочаті рентгеноструктурні дослідження інших ізоферментних форм аспартат-трансамінази/29 /. Визначення тривимірної структури дозволяє виявити зв'язки між особливостями структури і функції ізоферментів. Розглянемо результати вивчення тривимірної структури цитозольної курячої аспартат-трансамінази.
Молекула складається з двох ідентичних субодиниць. Максимальні розміри молекули складають 110 × 70 × 60 А. Білок характеризується високим вмістом вторинної структури, на частку α-спіралей, β-шару і реверсивних поворотів припадає відповідно 47,13 і 9% амінокислотних залишків. Субодиницю аспартат-трансамінази можна умовно розділити на 3 частини: великий домен, малий домен і перехідні ділянки між ними. Великий домен утворений залишками з 75 по 300; його основу складає сильно вигнутий шар (β-шар), що складається з 7 β-ланцюжків, оточених α-спіралями. Великий домен є найбільш стабільною частиною субодиниці, до нього приєднаний пірідоксальфосфат. 2 –и СООН – концевых участков полипептидной цепи, а именно из остатков с 15 по 50 и с 360 по 412.
Малий домен складається з тісно зближених NH 2-і СООН - кінцевих ділянок поліпептидного ланцюга, а саме із залишків з 15 по 50 і з 360 по 412. 2 – концевой фрагмент цепи, который пересекает вход в активный центр и затем вплотную прилегает к поверхности большого домена смежной субъединицы. З малого домену виходить NH 2 - кінцевої фрагмент ланцюга, який перетинає вхід в активний центр і потім впритул прилягає до поверхні великого домену суміжної субодиниці. 2 – конца – участком цепи, состоящим из остатков 300-360. Великий і малий домени пов'язані двома перехідними ділянками: з NH 2 - кінця - ділянкою ланцюга, що складається із залишків 300-360. Обидва перехідних ділянки утворені переважно - спіралями, що лежать на поверхні молекули/29 /.Обидва активних центру аспартат-трансамінази розташовані в глибоких западинах на протилежних сторонах молекули на межі між субодиницями. Стінки кожного з активних центрів утворені великим і малим доменом однієї субодиниці і краєм великого домену іншій суміжній субодиниці. До складу активного центру входять амінокислотні залишки, що належать обом субодиниця; цим пояснюється відсутність каталітичної активності у мономеру, кофермент пов'язаний в глибині щілини активного центру на відстані ~ 8-10 А ° від поверхні молекули. -140 (стороны пиридинового кольца обозначены в соответствии номенклатурой JUPAC ).
Сторона А пірідірованого кільця звернена до β - шару і метильної групи залишку Т rp -140 (сторони піридинового кільця позначено відповідно номенклатурою JUPAC). Кут між площинами піридинового і індольного кілець становить ≈ 40-45 °, між кільцями можливо Стекінг-взаємодія. 2-группой лизина-258. Залишок пиридоксальфосфата пов'язаний альдімінной зв'язком з ε-NH 2-групою лізину-258. Коферментами трансаміназ є похідні піридоксину-піридоксальфосфат і пірідоксамінфосфат. Обидва коферменту оборотно переходять один в одного в ході реакції переамінування. Трансамінази для каталізу вимагають обидва коферменту, на відміну від інших ферментов/13 /.1.2.3 Механізм реакції переамінування
Загальна теорія пірідоксалевого капіталізму була розроблена в 1952 році А.Є. Браунштейном і М.М. Шемякіним, а трохи пізніше - Д. Є. Мецлер і Е. Снеллом. Відповідно до цієї теорії дію пірідоксалевих ферментів обумовлена здатністю альдегідної групи пиридоксальфосфата утворювати з амінокислотами альдіміни (основи Шиффа) (Рисунок1) / 27 /. У образующемся альдіміне є система пов'язаних подвійних зв'язків, за якою відбувається зміщення електронів від α - вуглецевого атома амінокислоти до електрофільній атому азоту піридинового кільця кофермент. Зниження електронної густини у α - вуглецевого атома призводить до поляризації і ослаблення зв'язків у цього атома.
кофермента.
Рисунок 1 - Зсув електронів до атому N кофермент.Проведені А.Є. Браунштейном і Е. Снеллом модельні експерименти показали, що виборчий розрив тільки однієї з цих зв'язків з утворенням карбаніона, визначається особливостями будови активного центру ферменту. Ці уявлення отримали підтвердження при дослідженні очищених фосфопірідоксалевих ферментів. У 1966 році Донатан висунув і теоретично обгрунтував важливе положення про те, що в альдіміне, фіксованому в активному центрі ферменту, повинна розриватися та з зв'язків у α - вуглецевого атома, яка орієнтована перпендикулярно до площини піридинового кільця пиридоксальфосфата. При такій орієнтації енергія, необхідна для розриву зв'язку, мінімальна внаслідок перекривання електронної орбіталі зв'язку з сполученої π - системою коферменту (σ - π - перекриття). Донатан припустив, що конформація може контролюватися апоферментом, можливо за допомогою зв'язування карбоксилат - іона, а також, що імін може приймати одну з трьох можливих конформацій/29 /.
Тут прямокутником позначена площину піридинового кільця, вертикальної лінією зображено σ - зв'язок. Конформамація (1) сприяє переамінування.
2 – группой остатка лизина в белке.
Методами спектрального аналізу було встановлено, що альдегідна група пов'язаного в активному центрі пиридоксальфосфата утворює так зване "внутрішнє" основа Шиффа з ε-NH 2 - групою залишку лізину в білку. 2 – группу лизина из связи с коферментом (стадия трансальдиминирования). З цього випливає, що на початковому етапі каталітичної реакції α - аміногрупа субстрату витісняє ε-NH 2 - групу лізину із зв'язку з коферментом (стадія трансальдімінірованія). На підставі вивчення спектральних, хімічних і кінетичних властивостей аспартат - трансамінази був зроблений висновок про те, що як пряма, так і зворотна реакція переамінування складаються з восьми стадій; інтермедіатів, що виникають на цих стадіях, представлені на малюнку 2 / 27, 28 /.На першому стадії відбувається приєднання до ферменту субстратної амінокислоти з утворенням нековалентно комплексу Міхаеліса. Далі один з проток аміногрупи субстрату переходить на атом азоту внутрішньої імін зв'язку (стадія 2); в результаті аміногрупа набуває нуклеофільні властивості, необхідні для атаки на атом С-4 'кофермент. 2 – группы остатка лизина из связи с пиридоксальфосфатом и возникновение "внешнего" или субстратного альдимина (стадия 5), одной из форм которого является хинолоид показанный на рис.2.
Ця атака призводить до утворення проміжного тетраедричного з'єднання (гемінального діамін, стадія 3); за цим слідує звільнення ε-NH 2 - групи залишку лізину із зв'язку з пиридоксальфосфатом й виникнення "зовнішнього" або субстратного альдіміна (стадія 5), однією з форм якого є хінолоід показаний на рис.2. Подальше протонування атома С-4 'дає кетімін (стадія 6), при гідролізі якого утворюється ПМФ - форма ферменту і оксокіслота (стадії 7 і 8). Далі реакція йде у зворотному напрямку між ПМФ - формою трансамінази та іншої ококіслотой і призводить до регенерації ПЛФ - форми ("внутрішнього" альдіміна) і утворення нової амінокислоти.Таким чином, реакції переамінування є оборотними та універсальними для всіх живих організмів. Піридоксальфосфат в цих реакціях виконує роль переносника аміногрупи і в кінцевій стадії звільняється і може знову вступити в ферментативний процес.
Рисунок 2 - Основні інтермедіати, що утворюються в ході реакції переамінування.
а - внутрішній альдімін;
б - нековалентних комплекс Міхаеліса;
в - те ж, що σ, але атом імін азоту протонувати;
г-гемінальний діамін;
д-зовнішній альдіміі;
е - хінолоід;
ж - кетімін;
з - карбіноламін;
і-пірідоксамінфосфат.
1.2.4 Біологічна роль трансаміназ
Амінокислоти, не використані для синтезу білків та інших похідних, не накопичуються в організмі у великих кількостях. Вони піддаються різним ферментативним перетворенням і, в кінцевому рахунку, розпаду / 32 /. Важливу роль у азотистом обміні відіграють процеси переходу одних амінокислот на інші, в результаті ферментативних реакцій переамінування. 2 – группы от L – аминокислоты на L – кетокислоту без промежуточного образования аммиака.
При цьому відбувається зворотній перенесення NH 2 - групи від L - амінокислоти на L - кетокислот без проміжного утворення аміаку. – аминокислота как донор и L – кетокислота как акцептор аминогруппы. Таким чином, в реакції переамінування беруть участь L - амінокислота як донор і L - кетокислот як акцептор аміногрупи. Ці реакції катализируются особливими ферментами трансаміназ. фосфат, который и является промежуточным переносчиком аминогруппы от аминокислоты на кетокислоту/27/. Коферментом трансаміназ є піридоксаль - 5 '- фосфат, який і є проміжним переносником аміногрупи від амінокислоти на кетокіслоту/27 /.- и Д – аминокислотам, высокая каталитическая активность в процессах переаминирования послужили предметом детального исследования роли этих ферментов в обмене аминокислот/33/.
Широке поширення трансаміназ у тваринних тканинах, у мікроорганізмів і рослин, їх висока резистентність до фізичних, хімічних і біологічних факторів, абсолютна стереохимическая специфічність по відношенню до L - і Д - амінокислотам, висока каталітична активність у процесах переамінування послужили предметом детального дослідження ролі цих ферментів в обміні амінокіслот/33 /. Тип каталізуються хімічної реакції в поєднанні з назвою субстрату служить основою для систематичного найменування ферментів. Відповідно до Міжнародної класифікації трансамінази відносять до 2 класу трансфераз, 4 підкласу - амінотрансферази; найменування їх складається за формою «донор - транспортується група - трансфераза» / 34 /. А. Є. Браунштейн висунув гіпотезу про можливість існування в живих тканинах не прямого шляху дезамінування амінокислот через реакції переамінування, названого їм трансдезамінірованіем. – глутаминовая кислота. Основою для цієї гіпотези послужили дані про те, що з усіх природних амінокислот в тваринних тканинах з високою швидкістю дезамініруются тільки L - глутамінова кислота. – кетоглутаровой кислотой в реакции переаминирования с образованием глутаминовой кислоты к соответствующей кетокислоте/30/. Відповідно до цієї теорії більшість природних амінокислот спочатку реагують з L - кетоглутарової кислотою в реакції переамінування з утворенням глутамінової кислоти до відповідної кетокіслоте/30 /. Новоутворена глутамінова кислота зазнає окисного дезамінування під дією глутаматдегідрогенази. Механізм трансдезамінірованія можна представити у вигляді такої схеми / 13 /: 1 - CH ( NH 2 )- COOH
1 - CO - COOH
трансаміназ глутаматдегідрогенази
– кетокислоты.
Обидві реакції (переамінування та дезамінування глутамінової кислоти) є оборотними, створюються умови для синтезу будь амінокислоти, якщо в організмі є відповідні L - кетокислот. - кетокислот) так называемых незаменимых аминокислот, этой способностью обладают только растения и многие микроорганизмы. Організм тварин і людини не має здатність синтезу вуглеводневої скелета (L - кетокислот) так званих незамінних амінокислот, цією здатністю володіють тільки рослини і багато мікроорганізмів.– кетокислот и аммиака, этот процесс был назван А. Е. Браунштейном трансреаминированием.
У живих організмах здійснюється синтез природних амінокислот з L - кетокислот та аміаку, цей процес був названий А. Є. Браунштейном трансреамінірованіем. – кетоглутаровой кислоты, с образованием глутаминовой кислоты, и к последующему переаминированию глутамата с любой L – кетокислотой. Сутність його зводиться до відбудовного амінування L - кетоглутарової кислоти, з утворенням глутамінової кислоти, і до подальшого переамінування глутамату з будь-якою L - кетокислот. – аминокислота, соответствующая исходной кетокислоте, и вновь освобождается L – кетоглутаровая кислота, которая может акцептировать новую молекулу аммиака/35/.Схематически роль трансаминаз в дезаминировании в биосинтезе аминокислот можно представить в следующем виде/28/: У результаті утворюється L - амінокислота, що відповідає вихідної кетокислот, і знову звільняється L - кетоглутарової кислота, яка може акцептувати нову молекулу амміака/35/.Схематіческі роль трансаміназ у дезамінування в біосинтезі амінокислот можна представити в наступному віде/28 /: -Аминокислота Пиридоксальфосфат L -Глутамат НАД
ПФ HOOC-(CH 2 ) 2 -CH(NH 2 )-COOH НАДФ
Трансаміназ
ПФ HOOC-(CH 2 ) 2 -C(NH)-COOH НАДН 2
-кетокислота Иминоглутарат
L-кетокислот Іміноглутарат Пірідоксамінфосфат Н 2 О
-( CH 2 )- C - COOH
-кетоглутарат NH 3
Схема показує, що трансаміназ каталізує опосередковано через глутаматдегідрогенази як дезамінування природних амінокислот (стрілки вниз), так і біосинтез амінокислот (стрілки вгору).
Шляхом переамінування більшість амінокислот може перетворюватися одна в іншу або замінюватися відповідної кетокислот. Тому реакції переамінування - один з найважливіших процесів при біосинтезі замінних амінокислот. Особливо легко переамініруются глутамінова і аспарагінова кислоти, так як відповідні їм трансамінази мають дуже високу активність. – кетоглутаровая и щавелевоуксусная кислоты), осуществляют связь углеродного и белкового обмена /36/.
Кетокислот, одержувані з цих амінокислот (L - кетоглутарової щавелевоуксусной кислоти), здійснюють зв'язок вуглецевого та білкового обміну / 36 /.Таким чином, трансамінази грають важливу роль в азотистом обміні, беруть участь у біосинтезі амінокислот. Біологічний сенс реакцій переамінування амінокислот полягає в тому, щоб об'єднати аміногрупи розпадаються амінокислот у складі молекул одного типу амінокислоти, а саме глутамінової / 31 /.
Трансамінази відносяться до універсально-поширеним ферментам. У тканинах різних органів міститься значна кількість трансаміназ, в сотні і тисячі разів перевищує рівень активності їх у сироватці крові. - и γ - глобулинами.
При електрофорезі вони мігрують з L - і γ - глобулінами. Особливо високою активністю АСТ (КФ.2.6.1.1.) Відрізняються серце, печінка, м'язова тканина, нирки, підшлункова залоза (перелік подано в порядку убування активності АСТ). АЛТ (КФ.2.6.1.2.) У найбільших кількостях виявляється в печінці, у зв'язку з цим її називають печінкових трансаміназ, потім в підшлунковій залозі, серці, скелетних м'язах.Значні відмінності в активності трансаміназ в окремих органах і в сироватці крові визначають його важливе клінічне діагностичне значення, тому що при ураженні тканини виникає різкий стрибок рівня активності трансаміназ у крові. Найбільше значення представляє підвищення активності АСТ при інфаркті міокарда. Ступінь підвищення відображає масовість ураження серцевого м'яза і тяжкість інфаркту. Характерна динаміка активності АСТ при інфаркті міокарда: початок підйому - через кілька годин після виникнення захворювання, максимальний підйом - до кінця першої доби, нормалізація можлива протягом першого тижня хвороби. При інших захворюваннях серця підвищення активності АСТ або не відбувається, або носить помірний характер. Проте активність АСТ підвищується і при ураженні інших органів і тканин. Багато авторів схильні розглядати визначення АСТ як цінний тест при проведенні диференціальної діагностики між інфарктами серця і легенів. Підставою до цього служить значно вища (у 50 разів) активність ферменту в м'язі серця, в порівнянні з тканиною легені. Активність трансаміназ у сироватці крові є однією з найбільш цінних і найпоширенішим в клінічній практиці показником ураження печінки, що характеризують протікають в ній цитолитические процеси / 37 /.
Підвищення активності амінотрансфераз, і, перш за все АЛТ, виявляється вже в ранній, інкубаційний, переджовтяничний період вірусного гепатиту, що має принципове епідеміологічне значення для виявлення хворого ще до появи жовтяниці. У результаті значного підвищення активності АЛТ у хворих на вірусний гепатит знижується коефіцієнт Де Рітісом (АСТ: АЛТ) нижче 1 при нормі 1 - 3, а при гострому інфаркті міокарда, навпаки, різке зростання цього коефіцієнта / 38 /.
При хронічних гепатитах і цирозах печінки співвідношення трансаміназ змінюється, і коефіцієнт підвищується вище норми. Важливо мати на увазі, що механічні жовтяниці (непрохідність жовчних проток у зв'язку з жовчнокам'яною хворобою або пухлиною) не супроводжуються вираженим підвищенням трансаміназной активності. Можливе підвищення активності трансаміназ при запальних захворюваннях різних органів і тканин, при м'язових дистрофіях і т. д. / 37,38 /.
Таким чином, в даний час встановлено, що переамінування є досить важливим і поширеним процесом біологічного розпаду і синтезу амінокислот; він протікає в різних тканинах тварин, рослин і в мікроорганізмах. Тому дослідження цього процесу має велике фундаментальне і прикладне значення.
2. Матеріали і методи
2.1 Експериментальна частина
2.1.1 Експериментальні тварини
( NO 3)2) во время лактации.
Експеримент проводився на самках білих безпородних щурів середньої маси 250-300 г. Тварини піддавалися токсичного дії азотнокислого кадмію (Cd (NO 3) 2) під час лактації. в течение 10 дней (с 1 по 10 день после рождения потомства) в дозах 0,5 мг/кг и 2 мг/кг /39/. Введення нітрату кадмію вироблялося самкам per os протягом 10 днів (з 1 по 10 день після народження потомства) в дозах 0,5 мг / кг і 2 мг / кг / 39 /. Після досягнення потомством експериментальних тварин чотиримісячного віку їх декапітованих й виробляли відбір органів і тканин для визначення активності АСТ і АЛТ.В якості контролю використовували тварин, яким у період лактації вводили у відповідному обсязі фізіологічний розчин.
2.1.2 Підготовка біологічного матеріалу
2.1.2.1 Підготовка сироватки крові
Після декапітації тварин кров збирали в пробірки гепаринизированную і для отримання сироватки піддають центрифугированию, при 3000 об / хв, протягом 15 хвилин. Після центрифугування отримували сироватку, що не містить формених елементів крові. Потім відбирали сироватку в пробірки, і виробляли визначення активності АСТ і АЛТ методом Райтмана - Френкеля/40 / за допомогою стандартних наборів реактивів.
2.1.2.2 Підготовка гомогенатов тканин і органів
Витягнуті органи (печінка, головний мозок, серце, нирки) відмивали від крові фізіологічним розчином, зважували 1-2 грама тканини, подрібнювали ножицями і розтирали в ступці. Всі операції виробляли на холоду. , 0,1 N K С l , pH 7,4) в отношении 1: 50 для головного мозга, сердца и почек, и 1:100 – для печени.
Потім додавали середу виділення (0,005 N Tris, 0,1 N K З l, pH 7,4) у відношенні 1: 50 для головного мозку, серця і нирок, і 1:100 - для печінки. Отриманий гомогенат переносили в центрифужні пробірки і центрифугували при 4500 об / хв 10 хвилин. Після центрифугування супернатант переносили в інші пробірки, а осад викидали. Далі в супернатанті виробляли визначення активності АСТ і АЛТ методом Райтмана - Френкеля / 40 / за допомогою стандартних наборів реактивів.2.2. Визначення активності амінотрансфераз методом Райтмана - Френкеля
- кетоглутарата катализирует реакцию переаминирования L - -аспартата с образованием оксалоацетата, который декарбоксилируется до пирувата /41/:
АСТ у присутності L - кетоглутарату каталізує реакцію переамінування L --аспартату з утворенням оксалоацетата, який декарбоксилуєтся до пірувату / 41 /:– кетоглутарат + L - аспартат → L – глутамат + оксалоацетат → ПВК
L - кетоглутарат + L - аспартат → L - глутамат + оксалоацетата → ПВК– кетоглутарата катализирует реакцию переаминирования L – аланина с образованием пирувата /41/:
АлАТ у присутності L - кетоглутарату каталізує реакцію переамінування L - аланіну з утворенням пірувату / 41 /:– кетоглутарат + L - аланин → L – глутамат + ПВК
L - кетоглутарат + L - аланін → L - глутамат + ПВКПіруват з 2,4 - дінітрофенілгідразіном (2,4 - ДНФГ) у лужному середовищі утворює забарвлений гідразон, інтенсивність забарвлення якого прямо пропорційна активності АСТ і АЛТ.
2.2.1 Визначення активності аспартатамінотрансферази і аланінамінотрансферази в сироватці крові
– аспартат ( L - аланин) 0,1 моль/л, L – кетоглутарат 2 ммоль/л, фосфатный буфер 0,1 моль/л) и 0,1 мл сыворотки крови.
У звичайні пробірки наливали 0,5 мл субстрату (L - аспартат (L - аланін) 0,1 моль / л, L - кетоглутарат 2 ммоль / л, фосфатний буфер 0,1 моль / л) і 0,1 мл сироватки крові. Паралельно ставили контрольні проби, в які не додавали сироватку. Проби ретельно перемішували і инкубировали протягом 1 години - АСТ і 30 хвилин - АЛТ при 37С на водяній бані. Після цього до досвідчених і контрольним пробам доливали по 0,5 мл розчину 2,4 - ДНФГ. У пробірки з контролем тільки після додавання 2,4 - ДНФГ доливали 0,1 мл сироватки крові. , хорошо перемешивали и через 5-10 минут фотометрировали против холостой пробы в интервале длин волн 500-560 нм ( opt 537нм) в кюветах толщиной 1см. Через 20 хвилин (20-25 о С) у пробірки доливали по 5 мл 0,4 моль / л розчину NaOH, добре перемішували і через 5-10 хвилин фотометріровалі проти холостої проби в інтервалі довжин хвиль 500-560 нм (opt 537нм) у кюветах товщиною 1см.Розрахунок активності ферментів у сироватці крові проводили по калібрувальним графіком. Каталітичну активність АСТ (АЛТ) розраховували в нмоль / (с · л) за формулою: каталітична концентрація АСТ (АЛТ) = (Епр - Ек) К, де К - коефіцієнт розрахований за калібрувальним графіком: К = С / Е, Епр - екстінція проби, Ек - екстінція контролю.
Калібрувальний графік для визначення активності амінотрансфераз будували таким чином, щоб у пробах знаходилося від 0,05 до 0,30 мл стандартного розчину пірувату. До пробам, що містить від 0,5 до 0,25 мл субстрату (0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 025; 0,30 мл пірувату), додавали 0,5 мл розчину 2,4 - ДНФГ , инкубировали при кімнатній температурі протягом 20 хвилин. , хорошо перемешивали и через 30 минут в пробирках № 2-6 измеряли оптическую плотность при 537 нм против раствора в пробирке № 1.
Потім в усі пробірки доливали по 5 мл 0,4 Н NaOH, добре перемішували і через 30 хвилин в пробірках № 2-6 вимірювали оптичну щільність при 537 нм проти розчину в пробірці № 1. Калібрувальний графік будували, відкладаючи на осі ординат значення оптичної щільності для кожної проби, а на осі абсцис - відповідні їм значення активності АСТ і АЛТ.2.2.2 Визначення активності аспартатамінотрансферази і аланінамінотрансферази в гомогенатах органів
У пробірки наливали 0,1 мл розведеного гомогенату тканин печінки, головного мозку, серця, нирок і 0,5 мл субстрату (субстрат попередньо нагрівали на водяній бані до 37 о С). Паралельно ставили контрольні проби, в які не додавали субстрату. Проби добре перемішували і инкубировали протягом 1 години при 37 о С на водяній бані. Після цього до досвідчених і контрольним пробам додавали по 0,5 мл розчину 2,4 - ДНФГ. У пробірки з контролем тільки після додавання 2,4 - ДНФГ доливали 0,5 субстрату. , тщательно перемешивали и через 30 минут измеряли оптическую плотность при 505 нм, в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см.
Проби залишали на 20 хвилин при кімнатній температурі, потім в усі пробірки доливали по 5 мл 0,4 Н NaOH, ретельно перемішували і через 30 хвилин вимірювали оптичну щільність при 505 нм, в кюветах з товщиною поглинаючого шару 1 см.Розрахунок активності ферментів в гомогенатах органів виробляли по калібрувальним графіком. Каталітичну активність АСТ (АЛТ) розраховували в нмоль / (с · л) за формулою: АСТ (АЛТ) = (Епр-Ек) К, де К - коефіцієнт розрахований за калібрувальним графіком: К = С / Е, Епр - екстінція проби, Ек - екстінція контролю.
Калібрувальний графік для визначення амінотрансфераз в гомогенатах тканин будували так само, як для сироватки крові. Для розрахунку активності ферментів враховували всі розведення гомогенату і виражали в перерахунку на 1 грам тканини (мг білка).
Всі експериментальні групи містили від 7 до 9 тварин, отримані дані були піддані статистичній обробці. Достовірність відмінностей між групами оцінювали з урахуванням критерію Стюдента, відповідно до загальноприйнятої методикою / 42 /.
Результати та обговорення
Трансамінази є найважливішими ферментами обміну речовин. Аспартатамінотрансфераза (АСТ) і аланінамінотрансфераза (АЛТ) - близькі за дією ферменти, за участю яких в організмі людини здійснюється міжмолекулярних перенесення аміногруп з амінокислот на кетокислот. Цей процес - трансамінування - відповідальний за синтез і руйнування окремих амінокислот в організмі. У процесі переамінування, здійснюють зв'язок вуглецевого та білкового обміну / 36 /. У зв'язку з цим, вивчення впливу іонів кадмію як поширеного екотоксиканти, що належить до групи важких металів, представляє безперечний інтерес.
У ході дослідження активності аланінамінотрансферази (КФ.2.6.1.2.) Та аспартатамінотрансферази (КФ.2.6.1.1.) Були отримані наступні результати.
Таблиця 1 - Активність аланінтрансамінази в сироватці крові і гомогенатах органів 4-х місячних самок щурів зазнали хронічного дії кадмію в неонатальний період
Група | Сироватка (М ± m) | Печінка (М ± m) | Мозок (М ± m) | Серце (М ± m) | Нирки (М ± m) |
контроль | 0,003 ± 0,0015 | ,0 ±0.2 3, 0 ± 0.2 | 0.65 ± 0.05 | 0,094 ± 0,022 | 1,05 ± 0.25 |
Кадмій 0,5 мг / кг | 0,008 ± 0,0005 | , 5±0.6 1, 5 ± 0.6 | 0.55 ± 0.1 | 0,094 ± 0,004 | 0.4 ± 0.1 |
Кадмій 2 мг / кг | 0,001 ± 0,0003 | , 6±0.3 1, 6 ± 0.3 | 0.55 ± 0.15 | 0,17 ± 0,0037 | 0.3 ± 0.15 |
У результаті експерименту було встановлено зниження активності АлАТ у гомогенаті печінки у вибраних дозах в 2 рази (р <0,003) по відношенню до контролю, як показано в таблиці 1 і на рисунку Б.1.
У самок дослідної групи в сироватці крові відбувалося збільшення достовірне збільшення активності АлАТ у групі 0,5 мг / кг в 2,7 р (р <0.02) і в групі 2 мг / кг в 3 рази (р <0,001) таблиця 1, рисунок А .1.
У гомогенаті мозку нами не було виявлено достовірних відмінностей у зміні активності АЛТ, хоча спостерігалася тенденція до її зниження, що відображено у таблиці 1 і на малюнку В. 1.
У гомогенаті нирок при дозі 0,5 мг / кг активність АЛТ зменшилася в 2,5 рази (р <0,004) по відношенню до контролю, а при дозі 2 мг / кг по відношенню контролю зменшилася більш, ніж в 3 рази (р <0,005 ) (таблица1, малюнок Д.1). Статистично достовірних відмінностей в активності ферменту між дозою 0,5 мг / кг і 2 мг / кг виявлено не було.
У гомогенаті серця достовірних змін активності АлАТ у дозах як 0,5 мг / кг, так і 2 мг / кг не спостерігалося (таблиця 1 Додаток Г.1).
У роботі також було вивчено зміну активності аспартатамінотрансферази у потомства білих щурів, які зазнали токсичного дії солей кадмію в період лактації.
Активність АСТ у гомогенаті печінки при дозі 0,5 мг / кг у порівнянні з контролем достовірно не змінилася, тоді як при дозі 2 мг / кг - підвищилася більш ніж у 2,5 рази (р <0,03) таблиця 2, додаток Б .2.
При введенні експериментальним тваринам нітрату кадмію в дозі 0,5 мг / кг, у їх потомства не спостерігалося статистично достовірного зміни активності АСТ у сироватці крові в порівнянні з контролем. При дозі 2 мг / кг відзначено зменшення активності АСТ сироватці приблизно 6 разів (р <0,05) у порівнянні з контролем. Отримані дані представлені в таблиці 2, рисунку А.2.
Таблиця 2-Активність аспартаттрансамінази в сироватці крові і гомогенатах органів 4-х місячних самок щурів зазнали хронічного дії кадмію в неонатальний період
Група | Сироватка (М ± m) | Печінка (М ± m) | Мозок (М ± m) | Серце (М ± m) | Нирки (М ± m) |
контроль | 0,02 ± 0,0075 | , 9±0,5 1, 9 ± 0,5 | , 3 1,7 ± 0, 3 | 0,14 ± 0,03 | 0,7 ± 0,15 |
Кадмій 0,5 мг / кг | 0,009 ± 0,004 | , 2±0,7 2, 2 ± 0,7 | 1,85 ± 0,7 | 0,2 ± 0,02 | 0.8 ± 0,2 |
Кадмій 2 мг / кг | 0,003 ± 0,001 | , 8±1 , 2 4, 8 ± 1, 2 | 3,25 ± 0,65 | 0,15 ± 0,05 | 1,6 ± 0,25 |
У таблиці 2, рисунку В.2 показано, що гомогенаті мозку при дозі 0,5 мг / кг активність АСТ достовірно не змінилася (р <0,84) в порівнянні з контролем. Введення лактуючим щурам нітрату кадмію в дозі 2 мг / кг призводить до збільшення активності АСТ у гомогенаті мозку потомства майже в 2 рази (р <0,05) по відношенню до контролю.
При вивченні токсичної дії іонів кадмію на потомство білих щурів було виявлено, що в гомогенаті нирок при дозі 0,5 мг / кг активність АСТ в порівнянні з контролем достовірно не змінювалась (р <0,68) (таблиця 2, малюнок Д. 2). При дозі 2 мг / кг активність АСТ збільшилася 2,3 разів (р <0,02 у порівнянні з контролем) (таблица2, малюнок Д.2).
Визначення активності аспартатамінотрансферази в гомогенаті серця показало збільшення активності 1,4 рази (р <0,02) в порівнянні з контрольними значеннями при дозі 0,5 мг / кг. Збільшення дози токсиканту до 2 мг / кг не приводило до статистично достовірним змінам активності ферменту по відношенню до контролю таблиця 2, малюнок Г.2.
Отримані в результаті експерименту дані можна пояснити наступним чином: Печінка і нирки є органами мішенями при кадмієвої інтоксикації виявлене зменшення активності АлАТ у гомогенаті печінки можна пояснити тим що, кадмій пошкоджує клітини печінки (гепатоцити), що супроводжується виходом ферменту в кровотік / 44 /. Оскільки максимальна кількість АЛТ міститься в печінці / 54 /, то при ураженні клітин печінки активність АлАТ у крові зростає, хоча АЛТ є внутрішньоклітинним ферментом, і його вміст у сироватці крові здорових людей невелика / 41,44 /. Тому визначення активності ферменту в сироватці крові широко використовується для діагностики хвороб печінки.
У мозку і серце нами не було виявлено достовірних змін в активності АЛТ, оскільки АЛТ є маркером периферичної зони катаболізму / 55 /, і його вміст у цих тканинах мало, порівняно наприклад з печінкою, зміна активності даного ферменту не може бути індикатором важких порушень відбуваються в них, що ми не можемо сказати про активність АСТ, яка підвищувалася в цих органах.
Спостережуване нами зменшення активності АлАТ у нирках може бути наслідком того, що відбувається інгібування даного ферменту іонами кадмію, можна припустити, що реакція переамінування аланіну при цьому протікає повільніше, що призводить до зниження утворення глутамату, який є одним з основних учасників системи знешкодження аміаку в організмі . У результаті в організмі може відбуватися збільшення вмісту аміаку в клітинах, який є токсичним для організму і повинен знешкоджуватися, в цьому бере участь фермент АСТ (див. нижче).
Другий фермент, активність якого ми досліджували-АСТ - ключовий фермент обміну речовин, саме він забезпечує надходження субстратів в цикл трикарбонових кислот (ЦТК) / 55 /, займаючи «центральну» роль у метаболізмі. Субстрати цього ферменту: аспартат, глутамат, піруват і α - кетоглутарат є найдавнішими і присутні у всіх біологічних об'єктів, займаючи ключову роль в обміні речовин. Значна активність АСТ забезпечує інтенсифікацію як надходження метаболітів у ЦТК, так і прискорює роботу останнього, що і веде до посилення окисного фосфорилювання / 47 /.
У ході нашого дослідження було виявлено збільшення активності АСТ у печінці. Це збільшення можна пояснити тим, що в печінці відбувається посилений синтез цього ферменту, це може бути пов'язано з тим, що відбувається розпад білків під дією іонів кадмію, що збільшує вміст вільних амінокислот в організмі, це «субстрат» для трансамінування / 46 /. - группами, что наблюдается в значительном снижении активности /49/.
Зниження цього ферменту в сироватці крові говорить про зв'язуванні ферменту по двох його активним центрам з його SH - групами, що спостерігається в значному зниженні активності / 49 /.Збільшення активності АСТ в мозку, можливо, є компенсаторним на зменшення синтезу глутамату в результаті зниження швидкості реакції каталізуються АЛТ / 43 /. Зменшення синтезу глутамату призводить до підвищення рівня аміаку в крові, який здатний проникати через гематоенцефалічний бар'єр в головний мозок, де надає нейротоксіческій ефект / 43 /. Аміак може посилювати нейротоксіческій ефект меркаптанів і коротко жирних кислот концентрація яких може бути підвищена в клітинах печінки при їх ураженні / 49 /. У астроцитах мозку аміак знешкоджується в результаті глутаматсінтазной реакції з утворенням глутаміну. Освіта глутаміну в астроцитах призводить до відтоку глутамату, який в результаті посилення активності АСТ частково відновлює витрата глутамату / 55 /. Коли відбувається відтік глутамату з малат-аспартатного човника мітохондрій відбувається зниження синтезу АТФ, яку астроцит використовує не тільки для внутрішніх потреб, але і для постачання нею нейронів, що призводить до гіпоенергетіческому станом ЦНС. Збільшення активності АСТ призводить до збільшення освіти глутамату, відповідального за зв'язування аміаку. Часткове знешкодження аміаку відбувається за рахунок синтезу аспарагіну з аспартату, що є одним з субстратів реакції трансамінування / 48 /. Як було відзначено, відтік глутамату супроводжується зниженням синтезу АТФ що призводить до гіпоенергетіческому станом, і це не може не змінити активності іншого ферменту відповідального за зв'язування аміаку в організмі - глутаматдегідрогенази, що є регуляторним механізмом обміну амінокислот. Зниження концентрації аденозиндифосфату (АДФ) активує цей фермент, тобто низький енергетичний рівень у клітинах стимулює руйнування амінокислот з утворенням a - кетоглутарату, частина якого зв'язується з аміаком, а частина надходить в ЦТК як енергетичний субстрат. Клітини мозку потребують притоку енергії, вони чутливі до токсичної дії аміаку, в мозку крім підвищення активності АСТ існує безліч механізмів забезпечують нормальне функціонування цієї тканини.
Підвищення активності АСТ у нирках, можливо, пов'язано з видаленням іонів амонію утворився при розпаді білків, дезамінування амінокислот / 47,55 /
Збільшення активності АСТ при захворюваннях серця є діагностичною ознакою в клінічній практиці / 41 /. Підвищення активності АСТ у результаті інтоксикації, пов'язане з адаптивним синтезом ферменту / 55 /; можливо пов'язане з необхідністю видалення надлишків іонів амонію при ураженні серцевого м'яза / 50 /.
У результаті нашої роботи спостерігалося збільшення активності АСТ і зменшення активності АЛТ це може відбуватися і на оборот, можливо, це тонкий механізм, який організм виконує при посиленні або пригніченні тих чи інших процесів метаболізму, тим самим, адаптуючи організм до несприятливих умов. Як видно з результатів обговорення ці ферменти відіграють не останню роль і в знешкодженні аміаку в організмі, крім свого основного участі в процесах обміну амінокислот.
Висновки
Показано, що введення лактуючим самкам щурів азотнокислого кадмію в дозі 0,5 мг / кг викликає підвищення активності аланінамінотрансферази в сироватці крові, зниження активності - в гомогенатах печінки і нирок.
Встановлено, що в дозі 2 мг / кг збільшення активності аланінамінотрансферази не спостерігалося, тоді як в гомогенатах печінки і нирок вона зменшувалася.
Виявлено підвищення активності аспартатамінотрансферази при введенні експериментальним тваринам азотнокислого кадмію в дозі 0,5 мг / кг в гомогенаті серця.
Встановлено підвищення активності аспартатамінотрансферази при дозі 2 мг / кг в гомогенатах печінки, головного мозку, нирок і зменшення у сироватці крові.
Список використаних джерел
Ярушкіна В.Ю. Важкі метали в біологічній системі мати-новонароджений в умовах техногенної біогеохіміческойпровінціі / / Гігієна та санітарія - 1992. - № 6. - С. 13-15.
Ревич Б.А. Екологічна епідеміологія, М.: Академія., 2004 .- 206 с.
Wloch S. Dunamics of morphological and cytochtmical changel in the placenta following cadmium chloride intoxication / / Ginecol. . – 1992 . – Vol . 63 - № 6 – P . 264 – 275 .
Corpas I., Antonio M T. Study of alteration produced by cadmium and cadmium / leand administration during gestational and early lactation periods in the reproductive organs of the rat / / Ecotoxicol. . Saf . – 1998 . – Vol . 41 – № 2 – P . 180-188 .
Рапопорт С.М. Медична біохімія., М.: Медицина., 1966. - 143 с.
Алабастер Дж. Критерії якості води для прісноводних риб. М.: Легка і харчова промисловість., 1984. - 344 с.
Куценко С.А. Основи токсикології., Санкт - Петербург., 2002. - 390 с.
Лікулова І.В., Бєлова О.О. Специфічна дія кадмію при перроральном надходженні в організм з водою. / / Гігієна і санітарія. - 1987. - № 6. - С. 70-74.
Авцин А.П. та ін мікроелементози людини (етіологія, класифікація, органопатологии)., М.: Медицина, 1991. - 564 с.
Е tal Nephropathy induset in Nephrology, bari, Itali, apr.
Franchini I., Mutti A. Tubulointerstiliar nephropaties by industrial chemicals / / Proceedings of the 4 th Bari seminar in Nephrology, Bari., 1990. - P. 119-127.
Войнар А.І. Біологічна роль мікроелементів в організмі тварин і людини., М., 1960. - 245 с.
Дюга Г., Пенні К. Біологічна хімія. Хімічні підходи до механізму дії ферментів., М., 1983. - 460 с.
Османов І.М. Роль важких металів у формуванні захворювань органів сечової системи / / Російський вісник перінетологіі та педіатрії. - 1996. - № 1. - С. 36-40.
Коротков С.А., Глазунов В.В., Дія гідрофобного органічного комплексу кадмію на іонну проникність мітохондріальної мембрани і дихання мітохондрій печінки щурів. / / Біохімічні мембрани. - 1996. - № 2. - С. 178-183.
Трахтенберг І.М., Іванова Л.А. Важкі метали та клітинний метаболізм. / / Медицина праці та промислова екологія. - 1999. - № 11. - С. 28-32.
Нурмухамбетов О.М., Кащеєва Є.П. Індукція кадмієм перекисного окислення ліпідів у тканинах білих щурів та її профілактика аскорбінової кислотою. / / Гігієна і санітарія. - 1989. - № 3. - С. 77-78.
Скельний А.В. Мікроелементи людини (діагностика та лікування), М.: КМК., 1999. - 49 с.
Калоус В., Павлічек З. Біофізична хімія., М.: Світ, 1985. - 446 с.
Gunarson D., Nordberg G., Cadmium - induced decrement of the receptor expression and c AMP levels in the testis of rats / / Toxicology. - 2003. - Feb. 1:183 (1-3) - p. 57-63.
Литвинов М.М. До питання про дозоеффектівной залежності ембріотоксичної дії хлористого кадмію. / / Гігієна і санітарія. - 1989. - № 4. - С.86.
Міщенко В.П. Токсичні метали і вагітність. / / Російський вісник перинатології та педіатрії. - 1997. - № 6. - С. 59.
Antonio MT, Lores N. Pb and Cd poisoning during development alters cerellar and striatal function in rats / / Toxicjlogy. - 2002. - Iul. 1:176 (1-2) - p. 59-66.
Кретович В.Л. Введення в ензимології., М., 1986. - 250 с.
Майстер А. Біохімія амінокислот. / Під. ред. А. Є. Браунштейна., М.: Видавництво іноземної літератури., 1961. - 240 с.
Пилипович Ю.Б. основи біохімії., М., 1985. - 130 с.
Катунума Н. Хімія і біологія пірідоксалевого каталізу., М., 1968. - 170 с.
Торчинський Ю.М. Молекулярний механізм ензиматичного трансамінування: 40-е Баховское читання., М., 1987. - 70 с.
Діксон М., Уебб Е. Ферменти., (Том 2), М., 1982. - 450 с.
Берхард С. Структура та функції ферментів., М., 1971. - 380 с.
Фершт Е. Структура і механізм дії ферментів. / Пер. з анг. Ю.Б. Гребеньщікова., М., 1980. - 430 с.
Амінокислоти, їх похідні та регуляція метаболізму. / Під. ред. З.Г. Броновицький., Ростов-на-Дону., 1983. - 124 с.
Мецлер Т. Біохімія. Хімічні реакції в живій клітині. (Том 2), М., 1980. - 270 с.
Березів Т.Т., Коровкін Б.Ф. Біологічна хімія., М.: Наука. - 2004. - 540 с.
Якубко Х.Ф., Амінокислоти, пептиди, білки. М., 1985. - 340 с.
Функціональна активність ферментів та шляхи її регулювання. / Під. ред. С.Є. Северина, Г.А. Кочетова, М.: Видавництво МДУ, 1981. - 180 с.
Анісімов А.А. Медична ензимологія., Горький., 1978. - 150 с.
Коровкін Б.Ф. Ферменти в житті людини., М., 1972. - 270 с.
Халімов С.З. Порівняльна оцінка ембріотоксичної дії різних сполук кадмію. / / Гігієна і санітарія. - 1985. - № 4. - С. 11-14.
Reitman S., Frankel A. Colorimetric methol for the deter mination of serum glutamic oxaloacetic and glutamic pyruvic transaminases. - Amer. I Clin. Pathol. - 1957. - № 28. - P. 56-63.
Комаров Ф.І., Коровкін Б.Ф. Біохімічні дослідження в клініці., М., 2001. - 215 с.
Рокицький П.Р. Біологічна статистика., Мінськ., 1973. - 319 с.
Немова Н.С. Вплив аміаку і ацетилхоліну на аспартат-і аланінамінотрансферазную активність тканини головного мозку. / / Питання медичної хімії. - 1966. - № 5. - С. 514-516.
Покровський А.А. Зміна активності сорбітдегідрогенази, аланіамінотрансферази і фосфогексоізомерази в плазмі крові щурів при гострому токсичному ураженні печінки. / / Питання едіцінской хімії. - 1967. - № 5. - С. 511-515.
Корчак В.І. Активність аланінаінотрансферази в сироватці крові і печінки в умовах впливу на щурів хімічних речовин. / / Гігієна і санітарія. - 1985ю - № 8. - С. 11-14.
Мосс Д.В., Баттерворт П.Д. Ензимологія і медицина. М., 1978. - 365 с.
Талакін Ю.М. Про деякі біохімічних змінах в організмі при дії низьких концентрацій важких металів. / / Гігієна і санітарія. - 1973. - № 9. - С. 17-19.
Любліна Є.І., Мінкіна Н.А. Адаптація до промислових отрут як фаза інтоксикації., Ленінград., - 1971. - 567 с.
Магарламов А.Г. Аспартат-і аланінамінотрансферазная активність в печінці та сироватці крові щурів при парентеральному азотистом харчуванні на тлі білкового голодування. / / Український біохімічний журнал. - 1980. - № 6. - С. 720-725.
Мушина Є.В. Вивчення спільного біологічної дії свинцю і кадмію в експерименті на тваринах. / / Гігієна і санітарія. - 1989. - № 9 - с.89-90.
Охріменко С.М., Гур'єва Н.Г. Адаптації ферментів ліпідного та азотистого обміну у щурів при оксидативному стресі, викликаному стресі, викликаному солями кобальту і ртуті / / Вісник Харківського національного університету. - 2005. - № 2. - С.56-60.
Філімонов К.Р. Лабораторна та інструментальна діагностика захворювань внутрішніх органів. - М.: Наука, - 1995. - 342 с.
Kowalczyc E., Koff A. Effect of anthocyanins on selected biochemical parameters in rats exposed to cadmium / / Acta Biochemica Polonica. - 2003. - Vol. 50. № 2 - P. .
Надінская М.Ю. Печінкова енцефалопатія: патогенний підхід до лікування. / / Гостроентерологія. - 2006. - № 1. - С. 12-16.
Сіліванов М.П. Клінічна біохімія.М.: Світ, 1984. - 543 с.