Пензенська ДЕРЖАВНИЙ ПЕДАГОГІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ В. Г. Бєлінський
На правах рукопису
Сметанін Володимир Анатолійович
ВПЛИВ алкогольної інтоксикації на АКТИВНІСТЬ ОСНОВНИХ карбоксипептидази В ТКАНИНАХ самок щурів На різних стадіях естрального циклу
03.00.04 - Біохімія
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Науковий керівник доктор біологічних наук професор Генгін М.Т.
Пенза 2004
ЗМІСТ
СПИСОК СКОРОЧЕНЬ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ............ 5
ВСТУП ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 6
РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .......... 10
1.1. Біологічна роль нейропептидів та їх обмін ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .10
1.2. Функціонування пептідергіческіх систем на різних стадіях естрального циклу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 12
1.2.1. Рівень нейропептидів на різних стадіях естрального циклу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... 12
1.2.2. Ферменти обміну нейропептидів на різних стадіях естрального циклу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 17
1.3. Етанол і його вплив на пептідергіческіе системи ... ... ... ... ... ... ... ... .21
1.3.1. Вплив етанолу на рівень нейропептидів в організмі ... .................. 21
1.3.2. Вплив етанолу на активність ферментів обміну нейропептидів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... .... ... ... 29
1.4. Карбоксипептидаза Н ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ........... 32
1.5. ФМСФ-інгібіруемая карбоксипептидаза ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... 35
1.6. Карбоксипептидаза М ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... ... ... ........ 37
РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ... ... ... ... ... ..... ... 39
2.1. Матеріали дослідження ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ........... 39
Методи дослідження ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... 40
2.2.1. Метод визначення активності карбоксипептидази Н і карбоксипептидази М ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ......... 40
2.2.2. Метод визначення активності ФМСФ-інгібіруемой карбоксипептидази ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... .. 41
2.2.3. Статистична обробка результатів дослідження ... ... ... ... ... ... .... ... 42
2.3. Схема експерименту ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... 43
РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ........ 44
3.1. ДОСЛІДЖЕННЯ АКТИВНОСТІ ОСНОВНИХ карбоксипептидази В ТКАНИНАХ самок щурів На різних стадіях естрального циклу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .44
3.1.1. Вивчення активності карбоксипептидази Н в тканинах самок щурів на різних стадіях естрального циклу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ............ 44
а) Розподіл активності карбоксипептидази Н в тканинах інтактних самок щурів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... 44
б) Активність карбоксипептидази Н при введенні фізіологічного розчину в тканинах самок ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 45
в) Дослідження активності карбоксипептидази Н при введенні етанолу в тканинах самок щурів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 48
3.1.2. Вивчення активності ФМСФ-КП в тканинах самок щурів на різних стадіях естрального циклу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 59
а) Розподіл активності ФМСФ-КП в тканинах інтактних самок щурів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 59
б) Активність ФМСФ-КП при введенні фізіологічного розчину в тканинах самок ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .60
в) Дослідження активності ФМСФ-КП при введенні етанолу в тканинах самок щурів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 62
3.1.3. Активність карбоксипептидази М в тканинах самок щурів на різних стадіях естрального циклу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... ... ... 74
а) Визначення активності карбоксипептидази М у інтактних самок щурів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 74
б) Активність карбоксипептидази М при введенні фізіологічного розчину в тканинах самок ... ... ... ... .... ... ... ... ... ... ... ... .. 75
в) Дослідження активності карбоксипептидази М при введенні етанолу в тканинах самок щурів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .76
3.2. ДОСЛІДЖЕННЯ АКТИВНОСТІ ОСНОВНИХ карбоксипептидази В ТКАНИНАХ самців щурів ... ... ... ... ... ... ... ... .81
3.2.1. Вивчення активності карбоксипептидази Н в тканинах самців щурів ... 81
а) Розподіл активності карбоксипептидази Н в тканинах інтактних самців щурів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 81
б) Активність карбоксипептидази Н при введенні фізіологічного розчину в тканинах самців ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .82
в) Дослідження активності карбоксипептидази Н при введенні етанолу в тканинах самців щурів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .84
3.2.2. Вивчення активності ФМСФ-КП в тканинах самців щурів ... ... ... ... ... .. 91
а) Розподіл активності ФМСФ-КП в тканинах інтактних самців щурів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .91
б) Активність ФМСФ-КП при введенні фізіологічного розчину в тканинах самців ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .92
в) Дослідження активності ФМСФ-КП при введенні етанолу в тканинах самців щурів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 94
3.2.3. Активність карбоксипептидази М в тканинах самців щурів ... ... ... ... ... 100
а) Визначення активності карбоксипептидази М у інтактних самців щурів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 100
б) Активність карбоксипептидази М при введенні фізіологічного розчину в тканинах самців ... ... ... ... .... ... ... ... ... ... ... ... .. 100
в) Дослідження активності карбоксипептидази М при введенні етанолу в тканинах самців щурів ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 101
ГЛАВА 4. ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ ... ... ... ... .. 105
ВИСНОВКИ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .133
ЛІТЕРАТУРА ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ......... 135
СПИСОК СКОРОЧЕНЬ
АКТГ - адренокортикотропний гормон
АПМЯК - аминопропилмеркаптоянтарная кислота
АПФ - ангиотензинпревращающий фермент
ГГГС - гіпоталамо-гіпофізарно-гонадна система
ГГНГС - гіпоталамо-гіпофізарно-надниркової-гонадна система
ГГНС - гіпоталамо-гіпофізарно-надниркова система
ГРФ - гонадотропін-рилізинг-фактор
ГПЯК - гуанідінопропілянтарная кислота
ГЕМЯК - гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота
ДСІП - дельта-сон-індукуючий пептид
КПА - карбоксипептидаза А
КПВ - карбоксипептидаза У
ВПП - карбоксипептидаза Н
КПM - карбоксипептидаза M
– карбоксипептидаза N КП N - карбоксипептидаза N
ЛГ - лютеїнізуючий гормон
ЛКПА - лізосомальних карбоксипептидаза А
ЛКПВ - лізосомальних карбоксипептидаза У
ПОМК - проопиомеланокортина
ПХМБ - п-хлормеркурійбензоат
ПХМФС - п-хлормеркурийфенилсульфонат
ФМСФ - фенілметілсульфонілфторід
ФМСФ-КП - фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемая
карбоксипептидаза
ФСГ - фолікулостимулюючий гормон
ЕПР - ендоплазматичний ретикулум
ЕДТА - етилендіамінтетраацетат натрію
ВСТУП
Проблема алкоголізму, особливо жіночого, є вкрай актуальною для людства, як із соціальної, так і з медичної точки зору. Клінічні спостереження вказують на те, що під дією етанолу в організмі жінки виникають істотні зміни в ендокринній системі, що супроводжується порушеннями статевої функції [2, 81].
При алкоголізмі істотно змінюється рівень цілого ряду нейропептидів, багато з яких грають істотну роль в етіології і патогенезі даного захворювання [19, 61, 74, 88]. Зміна рівня біологічно активних пептидів при алкогольної інтоксикації багато в чому визначається ферментами їх обміну, до яких, зокрема, відносяться карбоксипептидаза Н, фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемая кар-боксіпептідаза і карбоксипептидаза М - основні карбоксипептидази, каталізують відщеплення залишків аргініну і лізину з С-кінця пептидів [ 28, 41, 144, 212].
Інтерес до цих ферментів викликаний тим, що вони беруть участь у процессингу, модуляції та інактивації біологічно активних пептидів [28, 41, 144]. У зв'язку з тим, що нейропептиди виконують функції нейромедіаторів, нейромодулятора і гормонів, вони беруть участь в регуляції практично всіх функцій організму, в тому числі і в регуляції функціонування статевого циклу [11, 72], а також залучаються у розвиток багатьох патологічних станів, серед яких для сучасної біології та медицини особливу значущість представляє алкоголізм [19, 74, 88]. Прогрес у вивченні природи цього захворювання невіддільний від розуміння нейробіологічних процесів, що лежать в його основі [80]. У зв'язку з цим видається дуже важливим дослідження активності основних карбоксипептидази при гострої алкогольної інтоксикації. Чим глибше будуть наші уявлення про ензімопатологіі, про роль протеолітичних ферментів у гомеостазі, тим більш цілеспрямованим буде пошук лікарських засобів для лікування алкоголізму серед регуляторів активності ферментів.
Одним з важливих аспектів проблеми алкоголізму є дослідження порушень, що відбуваються в організмі жіночих особин при алкогольної інтоксикації. Однак при цьому необхідний облік особливостей жіночого організму, пов'язаних з наявністю статевого циклу, який супроводжується комплексом фізіологічних, біохімічних та інших змін, що відбуваються у всьому організмі. У ході естрального циклу спостерігаються значні зміни у функціонуванні пептідергіческіх систем [11], що, безсумнівно, пов'язане зі зміною активності ферментів беруть участь в обміні біологічно активних пептидів [28, 41] і в свою чергу, ймовірно, визначає особливості відповідної реакції жіночого організму на гостру алкогольну інтоксикацію на різних стадіях естрального циклу [101, 164].
Крім того, відомо, що деякі аспекти прояви гострої алкогольної інтоксикації визначаються значною мірою підлогою. Припускають, що це пов'язано з відмінностями в гормональному статусі самців і самок [44]. Різний рівень нейропептидів, визначається активністю ферментів їх обміну, у особин різної статі призводить до появи відмінностей у кількості споживаного етанолу, у швидкості розвитку залежності, а також появи відмінностей протягом алкогольної інтоксикації у осіб протилежної статі [5, 19, 64, 65].
Вивчення активності карбоксипептидази-В-подібних ферментів при гострої алкогольної інтоксикації може сприяти уточненню біологічної ролі цих ферментів, а також з'ясування механізмів функціонування пептідергіческіх систем при даному патологічному стані.
Метою нашої роботи було вивчення активності основних карбоксипептидази (карбоксипептидази Н, фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемой карбоксипептидази і карбоксипептидази М) в тканинах самок щурів на різних стадіях естрального циклу при гострої алкогольної інтоксикації.
При виконанні роботи були поставлені наступні завдання:
Вивчити активність досліджуваних карбоксипептидази на різних стадіях естрального циклу в тканинах інтактних самок щурів.
Дослідити активність карбоксипептидази Н, фенілметіл-сульфонілфторід-інгібіруемой карбоксипептидази та карбокси-пептидази М у самок щурів на різних стадіях естрального циклу при введенні етанолу через різні проміжки часу.
Порівняти активність досліджуваних ферментів у самців і самок при гострої алкогольної інтоксикації.
Наукова новизна і практична цінність роботи. Вперше вивчено вплив гострої алкогольної інтоксикації на активність карбоксипептидази Н, фенілметілсульфонілфторід-інгібіруемой карбоксипептидази і карбоксипептидази Н в тканинах самок щурів на різних стадіях естрального циклу. Для визначення статевих відмінностей у перебігу і розвитку алкогольної інтоксикації досліджена активність цих ферментів у тканинах самців щурів. Встановлено залежність зміни активності досліджуваних ферментів від стадії естрального циклу, статі, дози етанолу і часу після його введення. Отримані результати становлять інтерес для розуміння механізмів функціонування пептідергіческіх систем і прояснюють роль основних карбоксипептидази в нормі, а також при алкогольній інтоксикації і можуть бути використані для розробки ефективних методів профілактики і лікування алкоголізму, порушень статевого циклу і безпліддя.
Апробація роботи. Матеріали дисертації були докладені на наукових конференціях Російської Академії Природознавства (Росія, Дагомис, жовтень 2003 р. і Єгипет, Хургада, лютий 2004 р.) та на підсумкових наукових конференціях ПДПУ (2002, 2003 рр..). За темою дисертації опубліковано 5 робіт.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з 6 розділів: вступ, огляд літератури за темою дисертації, матеріали і методи досліджень, результати, обговорення, висновки. Робота викладена на 162 сторінках, ілюстрована 6 рисунками, 21 таблицею та 2 схемами. Список літератури містить 268 найменувань російською та іноземними мовами.
РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
1.1. Біологічна роль нейропептидів та їх обмін.
Важливе місце в хімічній передачі інформації займають нейропептиди [72]. Багато хто з нейропептидів виконують функції нейромедіаторів, нейромодулятора, гормонів, факторів росту [9, 51, 77, 139, 164].
Ймовірно, саме біологічно активним пептидів належить важлива роль в інтеграції функціональних систем організму, забезпеченні їх злагодженої роботи в умовах, що змінюються навколишнього середовища. Вони грають ключову роль в регуляції статевого циклу, діяльності імунної системи, у морфогенезі, беруть участь у формуванні поведінкових реакцій, у процесах навчання, механізми консолідації пам'яті, впливають на статеву диференціацію [8, 11, 60, 70, 72, 210], залучаються до розвиток і патогенез багатьох психічних і неврологічних розладів, у тому числі й алкоголізму. Так, наприклад, у особин початково схильних до розвитку алкоголізму, виявлено центральний (тотальний або регіональний) дефіцит нейропептидів, функція яких пов'язана з активацією системи позитивного підкріплення (з ейфорізуючу, антистресовий, анксіолітичну дію). Одночасно відзначається збільшення змісту нейропептидів, що активують систему негативного підкріплення (проконвульсанти, пептиди, що індукують страх, агресію, дисфорию). Як правило, одноразове введення етанолу, особливо в низьких, анксіолітичних дозах, нівелює ці диспропорції, з чим, очевидно, і пов'язаний розвиток потягу до етанолу, особливо у схильних до алкоголізму індивідуумів [15, 19, 62, 80].
За сучасними уявленнями функціонування конкретного регуляторного пептиду зв'язується з місцем його утворення, вивільнення та наявності відповідних рецепторів [52, 53, 54, 69]. Таким чином, для розуміння механізмів дії нейропептидів істотним моментом є вивчення їх утворення та деградації.
Більшість біологічно активних пептидів синтезується в складі високомолекулярних неактивних попередників - препробелков, які піддаються посттрансляційної модифікації різного типу [75, 114, 181, 256]. Секретуються білково-пептидні продукти синтезуються на мембранозв'язаних рибосомах ЕПР [156, 256]. -конце препроформы нейропептида набора гидрофобных аминокислот, так называемой сигнальной последовательности, предшественник транслоцируется через мембрану ЭПР.
Завдяки наявності на N-кінці препроформи нейропептида набору гідрофобних амінокислот, так званої сигнальної послідовності, попередник транслоціруется через мембрану ЕПР. Усередині ЕПР сигнальна послідовність відщеплюється від поліпептидного ланцюга сигнальної пептидаз. Далі процесинг здійснюється в ході пересування молекул пропептид по гранулярному ЕПР, комплексу Гольджі і в секреторних везикулах [29, 256].- или, в основном, С-концевые остатки аминокислот.
Спочатку під дією ендопептидаз, розщеплюють нейропептиди по синглетний і дуплетним залишкам основних амінокислот, (фурин, РС1 / 3, РС2, РС4 [242], проопиомеланокортина-перетворює фермент [193, 194], тіолових прогормонконвертаза [96, 97], динорфин-перетворює фермент [129] та інших) утворюються неактивні пептиди [1, 29, 72], що містять, як правило, "зайві" N - або, в основному, С-кінцеві залишки амінокислот. Видалення цих амінокислот у секреторних везикулах здійснюється відповідно амінопептідазу-В-подібним (і) [41, 156] і карбоксипептидази-В-подібним (і) ферментами [27, 29, 41, 144, 145].Таким чином, рівень біологічно активних пептидів в організмі в значній мірі визначається активністю ферментів їх обміну.
Основним карбоксипептидази як ферментам, що беруть участь у кінцевих стадіях освіти і початкових стадіях деградації, належить важлива роль в регуляції рівня нейропептидів в організмі. У зв'язку з цим, великий інтерес представляє вивчення активності основних карбоксипептидази в нормі і при різних фізіологічних і патологічних станах організму, що супроводжуються зміною вмісту біологічно активних пептидів.
1.2. Функціонування пептідергіческіх систем на різних стадіях естрального циклу
1.2.1. Рівень нейропептидів на різних стадіях естрального циклу
Великий інтерес представляє вивчення гормонального статусу організму в різних фізіологічних станах, у тому числі в ході естрального циклу. У регуляції статевого циклу ключову роль грають пептидні гормони гіпофіза і гіпоталамуса: ГРФ, ЛГ, ФСГ, пролактин [57, 58, 57, 82, 84, 265], а також багато нейропептиди, основні функції яких не пов'язані зі статевою системою: енкефаліни [ 182], ендорфіни, АКТГ [264], речовина Р [224] та ін Встановлено, що рівень багатьох нейропептидів змінюється в залежності від стадії естрального циклу [11].
Так у щурів в преоптіческой області гіпоталамуса найвища концентрація люліберіна наголошується в діеструсе, найнижча - у еструс, в ході проеструса вона має проміжне значення. У медіобазальной гіпоталамусі концентрація люліберіна зростає від діеструса до проеструсу, потім зміст нейропептида зменшується, відбувається овуляція і настає еструс [11].
У плазмі крові протягом циклу концентрація люліберіна змінюється незначно. Істотні зміни простежуються тільки в проеструсе, коли концентрація люліберіна збільшується майже в 1,5 рази. Концентрації ФСГ і ЛГ у крові щурів на стадії діеструса залишаються практично постійними і тільки в проеструсе концентрації гормонів збільшуються в кілька разів, а з початком еструса зменшуються до вихідної величини [11]. Схожа динаміка зміни вмісту в плазмі крові ФСГ і ЛГ простежується у свиней [185].
У ході естрального циклу змінюється рівень не тільки ГРФ і гонадотропних гормонів, а й зміст інших нейропептидів, в тому числі опіоїдних.
Так у перивентрикулярної і вентромедіальному ядрах гіпоталамуса овець відбувається суттєве скорочення кількості утворюється проенкефаліна в фолікулярну стадію і під час преовуляторного викиду ЛГ у порівнянні з лютеальної стадією [263]. У антеровентрікулярних і перивентрикулярні ядрах преоптіческой області гіпоталамуса в проеструсе відбувається зниження рівня мРНК проенкефаліна щодо діеструса [246]. За іншими даними рівень мРНК проенкефаліна в медіобазальной гіпоталамусі щурів значно збільшувався в проеструсе, залишався високим до першого дня діеструса і повертався до вихідного рівня в другий день діеструса. Ці зміни були специфічні для вентромедіальному і вентролатеральних ядер гіпоталамуса, в той час як у дорсомедіально і аркуатне ядрах гіпоталамуса такі зміни не спостерігалися [155].
Рівень мРНК проенкефаліна значно змінюється протягом естрального циклу в яєчниках і матці (в 3-6 разів). Найвища концентрація мРНК проенкефаліна в яєчниках щури спостерігалася в еструс, а в матці - у метаеструсе і діеструсе. На відміну від мРНК проенкефаліна мРНК ПОМК залишалася на одному рівні в ході естрального циклу і в яєчниках, і в матці [174].
У нейронах антеровентрікулярного і паравентрикулярного ядер преоптіческой області найнижчий рівень мРНК продинорфіну спостерігається на стадії проеструса [246].
Рівень імунореактивного леуморфіна в гіпоталамусі і аденогипофизе щурів значно вище в проеструсе, ніж у еструс і метаеструсе. Збільшення концентрації імунореактивного леуморфіна в проеструсе корелює з вираженістю статевої поведінки протягом естрального циклу. Рівень імунореактивного леуморфіна не змінювався в гіпокампі і нейрогіпофізом в ході естрального циклу [257].
Під час естрального циклу змінюється не тільки рівень експресії самих опіоїдних пептидів, але і їх рецепторів [162, 219]. Так щільність і характер розподілу μ-рецепторів в медіальній преоптіческой області гіпоталамуса істотно змінювалися в ході естрального циклу. Висока концентрація μ-рецепторів спостерігалася в центральній частині медіальної преоптіческой області в метаеструсе і діеструсе. Виявлено також, що в цій частині мозку щільність і розподіл μ-рецепторів залежать як від стадії естрального циклу, так і від статі тварини. Цікаво відзначити, що для κ-рецепторів такої закономірності не виявлено [162]. -ала, D -лей-5]-энкефалин-связывающих δ- рецепторов в мозге хомяков.
Проте в роботі [219] вказується на наявність змін в ході естрального циклу і на відсутність статевих відмінностей у розподілі та щільності [3 Н] [D-ала, D-лей-5]-енкефалінів-зв'язуючих δ-рецепторів в мозку хом'яків. Ці дані вказують, на те що, швидше за все ендогенні та екзогенні опіоїдні пептиди роблять свій вплив на репродуктивну функцію через μ-і κ-рецептори, але не через δ-рецептори [219].Результати багатьох робіт вказують на те, що зміст ендогенних опіоїдів та їх рецепторів знаходиться під впливом стероїдних статевих гормонів [162, 163].
Після внутрішньочеревно введення прогестерону оваріоектомірованним щурам збільшувалася кількість μ-опіатних рецепторів в медіальній преоптіческой області, крім того зростала зміст мРНК ПОМК в нейронах, іннервують цю частину мозку [163]. В іншій роботі вказується, що збільшення кількості μ-рецепторів в медіальній преоптіческой області гіпоталамуса щурів відбувається тільки у випадку спільного введення естрадіолу і прогестерону [202].
У оваріоектомірованних мишей зменшувалася щільність μ-опіатних рецепторів у вентролатеральной преоптіческой області. Однак, якщо у мишей з віддаленими яєчниками проводилася замісна терапія статевими стероїдними гормонами, то відмінностей у розподілі μ-опіатних рецепторів у мозку в порівнянні з інтактними тваринами не спостерігалося [176].
Таке викликане гормонами зміна щільності μ-рецепторів в преоптичній області, ймовірно, може впливати на фізіологічні ефекти, викликані опіоїдними пептидами, по відношенню до секреції гонадотропінів і репродуктивного поведінці самок щурів [202].
У яєчниках пацюки і хом'яка 17 - β-естрадіол і прогестерон не впливали на рівень мРНК проенкефаліна. Однак прогестерон збільшував синтез мРНК проенкефаліна в яєчнику в 2-3 рази у разі попередньої обробки тварин естрадіолом [211].
У матці пацюки і хом'яка естрадіол не чинив значного впливу на транскрипцію мРНК проенкефаліна, але при дії прогестерону рівень транскрипції, а також зміст проенкефаліна збільшувалися. Глюкокортикоїди і андрогени надавали дію, схожу з прогестероном. Цікаво, що естрадіол надавав різний вплив на експресію мРНК проенкефаліна, стимульовану прогестероном у щурів і хом'яків. У щурів естрадіол придушував експресію мРНК проенкефаліна, а у хом'яків два гормони діяли синергічно, підвищивши в 15-16 разів вміст мРНК проенкефаліна [211].
Ці результати вказують на існування зворотного позитивного зв'язку між опіоїдними пептидами, які діють через μ-рецептори і статевими стероїдними гормонами, що є важливим компонентом у складних регуляторних процесах, які управляють відтворенням [176, 202].
У ході естрального циклу змінюється рівень не тільки опіоїдних, але й інших нейропептидів. Так найбільш високий рівень окситоцину в плазмі крові щурів спостерігається в проеструсе. Зміст цього гормону зменшувалася в паравентрикулярному і супраоптіческого ядрах у проеструсе і еструс в порівнянні з діеструсом і збільшувалося в нейрогіпофіз в проеструсе по відношенню до еструс і діеструсу [106].
Концентрація брадикініну, а також мРНК β2-рецепторів брадикініну і самих рецепторів в матці свині була найбільшою в еструс. У матці щурів найбільша кількість β2-рецепторів кініну виявлено в кінці проеструса і еструс [141].
в яичниках: более высокое содержание рецепторов было в эструсе, по сравнению с диэструсом [240].
Виявлено циклічні зміни в концентрації рецепторів ангіотензину II в яєчниках: більш високий вміст рецепторів було в еструс, в порівнянні з діеструсом [240].Циклічні зміни рівня гонадотропних гормонів гіпофіза за механізмом зворотного зв'язку приводить до змін рівня статевих стероїдних гормонів. Так, відомо, що рівень естрогенів збільшується в фолікулярну стадію циклу, досягаючи максимуму, як правило, до середини проеструса, і до початку еструса рівень естрадіолу наближається до рівня, характерного для діеструса. На початку циклу відзначається порівняно низька концентрація прогестерону, проте в середині до початку піку ЛГ спостерігається збільшення концентрації прогестерону в плазмі крові, після чого його концентрація знижується, але залишається вищою на стадії еструса в порівнянні з діеструсом [12, 17, 45].
У регуляцію естрального циклу крім гонадотропних гормонів гіпофіза, статевих стероїдних гормонів, опіодних пептидів залучаються і інші нейромедіаторні системи. Так, норадреналінергіческіе нейрони відіграють значну роль у стимуляції секреції ЛГ, викликаної кастрацією або естрогенним збудженням циклічного центру. Дофамін здатний стимулювати вивільнення ЛГ за рахунок активного впливу на нейрони аркуатне області. Серотонінергіческой нейрони можуть виступати в ролі як гальмують, так і стимулюючих виділення ЛГ факторів [46].
Таким чином, в ході естрального циклу відбувається зміна рівня гонадотропних гормонів, а також нейропептидів, основна функція яких не пов'язана зі статевою системою. Цікаво відзначити, що енкефаліни, β-ендорфін, вазопресин і статеві стероїдні гормони, рівень яких визначається гонадотропними гормонами, впливають на формування та підтримку потягу до етанолу, розвиток залежності і толерантності [19, 74, 88]. Тому здається цілком імовірним, що у самок щурів на різних стадіях естрального циклу можуть спостерігатися відмінності у розвитку і перебігу алкогольної інтоксикації [5], які частково пов'язані з функціональними особливостями ферментів, які беруть участь в обміні нейропептидів.
1.2.2. Ферменти обміну нейропептидів на різних стадіях естрального циклу
У ході естрального циклу спостерігаються зміни у рівні регуляторних пептидів, ці зміни пов'язані з перебудовами у функціонуванні ферментних систем, що беруть участь в їх синтезі і деградації [28, 41]. У зв'язку з цим видається цікавим вивчення активності ферментів обміну нейропептидів в ході естрального циклу в нормі і при різних патологічних станах, у тому числі при гострої алкогольної інтоксикації.
и соавт.
De Gandarias і співавт. виявили, що активність розчинної форми тірозінамінопептідази істотно збільшується в гіпоталамусі пацюки в проеструсе в порівнянні з іншими стадіями. Активність мембранозв'язаних форми не змінювалася у всіх вивчених відділах мозку. Однак було виявлено значне підвищення активності мембранозв'язаних пуроміцін-нечутливою активності в гіпоталамусі і гіпофізі в проеструсе [126]. При дослідженні фронтальної, парієтальної, окціпітальной кори, нюхових цибулин, таламуса, гіпоталамуса, гіпокампу, амігдали, стріатума і гіпофіза було виявлено, що лізин-і лейцин-амінопептідазная активність у гіпоталамо-гіпофізарної системі найбільш висока в проеструсе; лей-амінопептідазная активність зростала також і в окціпітальной корі. В інших досліджених відділах мозку активність ферменту не піддавалася змінам у ході естрального циклу [124, 125, 126]. Відзначається, що аргінін-амінопептідазная активність підвищувалася у всіх вивчених відділах мозку щура в проеструсе, щодо діеструса і еструса [128]. Активність аспартатамінопептідази не змінювалася протягом естрального циклу у всіх досліджених відділах мозку [124, 127]. У ході естрального циклу найбільш високий рівень сироваткової оксітоцінази у мишей відзначений у діеструсе в порівнянні з еструс і проеструсом [203].Ін'єкція 17 - β-естрадіолу приводила до помірного збільшення активності цістеінаріламідази незалежно від стадії циклу і ендогенного рівня гормонів. Найзначніша активація ферменту в гіпоталамусі у відповідь на застосування прогестерону відбувалася в такі періоди циклу, коли зміст ендогенного прогестерону була низькою. При введенні всередину шлуночків головного мозку ЛГ або простогландин Е 2 під час різних стадій циклу максимальне збільшення активності спостерігалося в діеструсе. На думку авторів, цістеінаріламідаза, ймовірно, грає модулюючим роль у регуляції тонічної секреції ЛГ протягом естрального циклу, але, очевидно, не впливає на ациклічні секрецію ЛГ [187].
Рівень активності пролілендопептідази і ендопептидаз-24.15 суттєво не змінювався в ході естрального циклу, хоча спостерігалася тенденція до зниження пролілендопептідазной активності під час преовуляторного піку ЛГ. Зниження активності пролілендопептідази спостерігалося у оваріоектомірованних овець, у яких підвищення концентрації ЛГ було викликано екзогенними естрогенами у порівнянні з контрольною групою овець. Ці дані свідчать про можливу наявність негативного зворотного зв'язку між активністю пролілендопептідази і рівнем естрадіолу. Можливо, що подібний зв'язок існує і між активністю ендопептидаз-24.15 і гонадний стероїдними гормонами, тому що після оваріоектомії активність ферменту в аденогипофизе, медіальних і латеральних преоптичного ядрах збільшувалася [105]. -[1( R , S )-карбокси-3-фенилпролил]-ала-ала-тир-п-аминобензоата не влияло на секрецию ЛГ. Введення інгібітора ендопептидаз-24.15 - N - [1 (R, S)-карбокси-3-фенілпроліл]-ала-ала-тир-п-амінобензоата не впливало на секрецію ЛГ. -пропролинала также не вызывало изменений в секреции ЛГ [190]. Крім того, введення інгібіторів пролілендопептідази - бацитрацину або більше специфічного - Z-пропролінала також не викликало змін в секреції ЛГ [190].
Виявлено, що в ГГНС системі мишей екзогенні тестостерон і прогестерон викликали, в основному, зниження активності ВПП і ФМСФ-КП. Зміна активності досліджуваних ферментів при введенні статевих стероїдних гормонів залежали від статі тварини і часу після ін'єкції і, практично, не залежали від дози введеного гормону. Найбільш істотна зміна активності ВПП і ФМСФ-КП при введенні тестостерону і прогестерону виявлено у гіпофізі і статевих залозах у тварин обох статей. Мінімальний вплив статевих стероїдних гормонів на активність ферментів виявлено в гіпоталамусі [78, 256].
Пептідгідролазная активність, здатна інактивувати ГРФ, в гіпоталамусі була знижена в проеструсе і в перший день діеструса в порівнянні з іншими стадіями естрального циклу щурів. Зменшення такої активності в проеструсе на думку авторів сприяє накопиченню ГРФ і ЛГ перед преовуляторних піком цих гормонів. Знижена пептідазная активність у гіпофізі в перший день діеструса можливо зменшує деградацію синтезуються в ньому рецепторів ГРФ, які синтезуються до проеструса [216].
Загальна кількість АПФ не змінюється в яєчниках щурів протягом естрального циклу. Зростаючі і атлетичних фолікули характеризуються високим рівнем АПФ, хоча в преовуляторних фолікулах АПФ або відсутня, або його рівень дуже низький. Можливо, що АПФ бере участь у ранніх стадіях фолікулярного дозрівання і атрезії [121]. Активність мембранозв'язаних форми АПФ в матці великої рогатої худоби значно вище в діеструсе, ніж у еструс [239]. Активність АПФ у фаллопієвих трубах свині була вище в ампулярною частини, ніж в перешийку незалежно від стадії естрального циклу. У свою чергу, в перешийку фаллопієвих труб спостерігалися періодичні зміни активності АПФ в ході циклу: у еструс і метаеструсе активність була вищою, ніж у проеструсе [138]. Високий рівень експресії мРНК і висока активність АПФ виявлені в кінці секреторної фази в ендометрії матки людини. Передбачається важлива роль АПФ в ініціації менструації [191].
Висока концентрація прореніна виявлена в фолікулах яєчника людини в середині менструального циклу. У кішок загальна кількість реніну в яєчниках було найнижчим в анеструсе, збільшувалося в еструс і ставало ще більшим у період овуляції [235]. Активність плазматичного реніну у щурів була збільшена в еструс в порівнянні з проеструсом і діеструсом [130]. Але такі зміни не спостерігалися, якщо щури були оваріоектоміровани. При спільній обробці естрадіолом і прогестероном таких щурів зміст прореніна змінювалося подібно до того, як воно змінювалося естрального циклі у інтактних тварин [130].
Експресія мРНК пролілолігопептідази і активність цього ферменту в яєчниках щурів збільшується в лютеальної фазу, що дозволяє припустити наявність зв'язку олігопептідази з формуванням і / або регресією жовтого тіла [184]. КПМ не виявляється в гранулярних клітинах зростаючих і незрілих фолікулів, але з'являється у великих кількостях на поверхні гранулярних клітин, оброблених лютеїнізуючим гормоном, і під час овуляції; виявляється в клітинах жовтого тіла під час менструації і на ранніх стадіях вагітності [267].
Таким чином, протеолітичних ферментів, ймовірно, належить важлива роль в регуляції рівня біологічно активних пептидів в організмі, а також у різних фізіологічних процесах, пов'язаних з функцією розмноження.
1.3. Етанол і його вплив на пептідергіческіе системи
1.3.1. Вплив етанолу на рівень нейропептидів в організмі
Гостра і хронічна алкогольна інтоксикація призводить до зміни рівня та / або співвідношення рівнів багатьох нейропептидів, що можна розглядати в якості одного з первинних патогенетичних факторів алкоголізму [88, 186].
Зміна ендогенної опіатної системи у експериментальних тварин при одноразовому та хронічному контакті з етанолом показано в ряді робіт. Однак внаслідок використання в них неідентичних фармакологічних моделей і антисироваток різної специфічності результати цих досліджень не відрізняються однорідністю. . Blum описал снижение суммарного содержания энкефалинов и позднее лей-энкефалина в базальных ганглиях мозга золотистых хомячков после добровольного потребления этанола в течение года [102].
Так K. Blum описав зниження сумарного вмісту енкефалінів і пізніше лей-енкефаліну в базальних гангліях мозку золотистих хом'ячків після добровільного споживання етанолу протягом року [102]. У той же час інші автори не виявили будь-яких змін у рівні мет-енкефаліну в гіпоталамусі і лей-енкефаліну в стріатумі, гіпоталамусі і корі мозку після гострого та хронічного введення етанолу [110, 236]. У той же час вказується на значне підвищення рівня мет-енкефаліну в стріатумі в результаті одноразової ін'єкції етанолу в дозі 2,5 г / кг і виражене зниження вмісту цього пептиду в стріатумі, в сумарному препараті довгастого мозку і мосту, в середньому мозку після 4 - тижневого примусового введення 20% етанолу [241].и соавт., исследовавших региональный уровень α- неоэндорфина, динорфина и мет-энкефалина в мозге крыс после хронического введения этанола в виде компонента жидкой диеты.
Ці дані знайшли своє підтвердження в роботах Seizinger і співавт., Що досліджували регіональний рівень α-неоендорфіна, динорфінів і мет-енкефаліну в мозку щурів після хронічного введення етанолу у вигляді компонента рідкої дієти. Такий вид алкоголізації викликав різке зниження вмісту мет-енкефаліну в стріатумі і гіпоталамусі, але рівень пептиду у середньому мозку і гіпокампі залишався незмінним. Иммунореактивность динорфінів і α-неоендорфіна зменшувалася більш ніж на 50% в гіпоталамусі і гіпокампі, але не змінювалася в середньому мозку, стріатумі, аденогипофизе і нейроінтермедіальной його частці [243]. Паралельність змін динорфінів і α-неоендорфіна, очевидно, зумовлена наявністю в них спільного попередника (проенкефаліна В), в той час як мет-енкефалінів є дериватом іншого пептиду - проенкефаліна А [72, 166].Стабільне зміст динорфин / α-неоендорфіна в стріатумі в умовах алкоголізації гарантує і підтримує нормальну продукцію лей-енкефаліну. Незмінний рівень лей-енкефаліну на тлі зниженого вмісту мет-енкефаліну демонструє дезинтегрирующий властивості етанолу на центральні енкефалінергічного системи мозку. Ймовірно, алкоголізація знижує швидкість біогенезу мет-енкефаліну й збільшує інтенсивність його ферментативної деградації [19, 165].
Більшість дослідників вказують на відсутність змін або незначне зниження імунореактивності β-ендорфіну в гіпофізі щурів після одноразової ін'єкції етанолу [241, 243]. и соавт.
Однак Gianoulakis і співавт. відзначають значне зниження β-ендорфін подібної імунореактивності у аденогипофизе, але не в нейропромежуточной частці [159].и соавт.[110], а при употреблении крысами 20% раствора уровень β- эндорфина в промежуточной доле гипофиза крыс снижался более чем на 70% [241].
Невелике зменшення гіпофізарного пулу β-ендорфіну і підвищення його в гіпоталамусі на 30% після 14 днів споживання 10% розчину етанолу в якості єдиного джерела рідини виявили Cheng і співавт. [110], а при вживанні щурами 20% розчину рівень β-ендорфіну в проміжній частці гіпофіза щурів знижувався більш ніж на 70% [241]. Підвищення рівня β-ендорфіну в гіпоталамусі після одноразової ін'єкції етанолу та зниження його при хронічному споживанні дозволяє припустити участь гіпоталамічних ендорфінергіческіх шляхів у реалізації емоціогенних ефектів етанолу, причому диференційованість цієї реакції може бути розцінена як прояв емоційно позитивних (гостре введення) і емоційно негативних (хронічне введення ) властивостей етанолу [19].При одноразовому введенні щурам 20% розчину етанолу внутрішньочеревно в дозі 4 г / кг в наднирниках вже через 15 хвилин відбувалося зниження рівня мет-енкефаліну, через 1 годину після введення етанолу величина цього показника істотно перевищувала контрольний рівень, а через дві години відповідала контрольним значенням. У плазмі крові тварин відразу ж після ін'єкції етанолу спостерігалося деяке підвищення концентрації мет-енкефаліну, але через 2 години рівень його був достовірно нижче в порівнянні з контролем. Автори приходять до висновку, що в дії етанолу на метаболізм енкефалінів в системі надниркові залози - кров можна виділити 2 фази: перша характеризується посиленим вивільненням мет-енкефаліну з надниркових залоз у кров на тлі незмінною швидкості утворення пептиду, друга - пригніченням вивільнення мет-енкефаліну на тлі спочатку посиленого, а потім зниженого його утворення в тканині наднирників [15].
Гостра алкогольна інтоксикація призводила до значного підвищення [94, 159, 222, 261], а хронічна - до зменшення рівня плазматичного β-ендорфіну у щурів [94, 104].
Рівень мРНК ПОМК в гіпоталамусі щурів зростав при хронічній алкоголізації [95] і значно зменшувався в разі гострої алкогольної інтоксикації [268].
ПОМК и пептидов, связанных с β- эндорфином, в промежуточной доле и в аденогипофизе.
Хронічна алкоголізація щурів підвищує швидкість синтезу de novo ПОМК і пептидів, пов'язаних з β-ендорфіном, в проміжній частці і в аденогипофизе. Незважаючи на це, ставлення β-ендорфіну, що визначається за допомогою моноклональних антитіл до сумарного β-ендорфіну + β-ЛПГ різко знижено у передній долі [243].Вважається, що пул біологічно активного β-ендорфіну зменшується в обох частках гіпофіза алкоголізірованних щурів, але за рахунок різних механізмів: в аденогипофизе шляхом уповільнення ензиматичного освіти β-ендорфіну з попередника інтермедіату β-ЛПГ, а в проміжній частці - за рахунок посилення інактіваціонних перетворень [ 243].
Гостра алкогольна інтоксикація самок оваріоектомірованних щурів призводить до значного зменшення вмісту β-ендорфіну і мет-енкефаліну в гіпоталамусі. До тих же результатів призводить підшкірне введення естрадіолу. Спільне введення етанолу та естрадіолу сприяє зниженню рівня мет-енкефаліну в гіпоталамусі та збільшення рівня цього пептиду в середньому мозку і гіпокампі, корі великих півкуль. Рівень β-ендорфіну в цих умовах знижувався в гіпоталамусі і середньому мозку. Наведені результати показують, що естрадіол може значно модифіковані відповідну реакцію опіоідергіческой системи на дію етанолу [107].
У реєстрі ендокринопатій, що викликаються введенням етанолу, перше місце займає поразка ГГГС [19]. Проте літературні дані, що стосуються рівня гонадотропних гормонів при алкогольної інтоксикації, досить суперечливі. Так, відзначено, що одиничний прийом спирту в дозі 0,5-1,5 г / кг маси тіла підвищував концентрацію ЛГ в крові чоловіків [135, 207], не змінював його [86, 135] або знижував [86]. Аналогічні результати отримані для жінок [135, 208]. Більш детально вплив етанолу на ГГГС досліджено на тваринах [108]. У них виявлено чіткий зв'язок між дозою вводиться етанолу і ступенем зниження концентрації ЛГ. У ряді дослідів після одноразової ін'єкції зафіксовано зменшення цього показника практично до незмірну величини [86].
Гостра алкогольна інтоксикація щурів в проеструсе скасовує преовуляторний пік ЛГ і овуляцію за рахунок придушення активності ядер гіпоталамуса, відповідальних за синтез і секрецію ГРФ, що в свою чергу призводить до зниження концентрації ГРФ в проеструсе. Екзогенне введення ГРФ щурам, які зазнали гострої алкогольної інтоксикації, викликало збільшення секреції ЛГ і овуляцію [179].
Ін'єкція етанолу щурам в дозі 0,5-3 г / кг приводила до значного зниження плазматичного рівня ЛГ, причому у самок ці зміни були виражені сильніше, ніж у самців [231]. У той же час рівень ФСГ у дослідних тварин достовірно не відрізнявся в порівнянні з контрольними [231].
Самки щурів, у яких секреція ЛГ була стимульована кастрацією або введенням налоксону, етанол викликає значне зниження концентрації гормону в плазмі крові. Депресивний ефект етанолу по відношенню до гонадотропинам у кастрованих щурів знімається введенням ГРФ [115].
Найбільш ймовірно, що ефект реалізується в гіпоталамусі, так як одноразове введення етанолу не змінює відповіді на ГРФ у здорових добровольців і тварин [189]. Нормальний відповідь може бути досягнутий навіть при дуже високих дозах спирту [248]. Всі ці дані, а також пряме вимірювання концентрації ГРФ в портальній крові гіпофіза після введення етанолу підтверджує тезу про те, що в даній експериментальної ситуації порушується функція гіпоталамуса [123]. Зниження вивільнення ГРФ при гострої алкогольної інтоксикації визначається, ймовірно, наявністю опіодних активності у етанолу [207].
Проте в роботі, проведеній на самках макак-резусів, було показано, що при гострої алкогольної інтоксикації рівень ФСГ у плазмі крові не змінюється у відповідь на введення синтетичного аналога ГРФ. Ймовірно, за рахунок цього етанол порушує нормальне дозрівання фолікулів яєчника, призводить до неадекватного протіканню послеовуляторной фази циклу або ановуляції, що часто спостерігається у жінок з алкогольною залежністю і у тварин зі змодельованим алкоголізмом [206].
До змін у функціонуванні ГГГС призводить і хронічна алкогольна інтоксикація. Підвищений вміст пролактину відзначено практично у всіх хворих алкоголізмом і у здорових чоловіків після гострого введення етанолу [66, 67, 206], подібні дані отримані щодо самок щурів [257].
У порівнянні з контрольною групою у чоловіків з хронічною інтоксикацією алкоголем виявлено зниження вмісту ФСГ [67] і ЛГ [135] у плазмі крові, за іншими даними зміст ЛГ достовірно не відрізняється від контрольної групи [66].
У самців щурів після хронічної алкогольної інтоксикації рівень ФСГ і ЛГ в плазмі крові більш ніж у 2 рази знижувався в порівнянні з контрольними тваринами, в той час як у гіпофізі рівень цих гормонів був схожий з контролем [238], у самок щурів в цих умовах спостерігалось зменшення рівня ЛГ, при незмінному рівні ФСГ [257].
Одноразове надходження алкоголю в організм супроводжується підвищенням активності ГГНС: посилюється утворення катехоламінів [88], КРФ [80], β-ендорфіну [94, 159, 222, 261], кортикостероїдів [80, 230]. .
Ефект, ймовірно, реалізується на найвищих рівнях регуляції цієї осі, так як знімається гіпофізектоміі або введенням антисироватки до КРФ і зумовлений значною мірою специфічної мембранотропних активністю етанолу [86], що підтверджується експериментами in vitro. Етанол дозозалежно збільшував звільнення АКТГ з суперфузіруемих аденогипофизом миші і фрагментів аденогипофизом щури [228]. . In vitro этанол влияет и на продукцию КРФ гипоталамусом, причем в концентрациях, соответствующих содержанию этилового спирта в тканях in vivo . При цьому відзначено зниження чутливості рецепторів до КРФ, що можна трактувати як додатковий стимул до секреції цього чинника in vivo. In vitro етанол впливає і на продукцію КРФ гіпоталамусом, причому в концентраціях, відповідних змісту етилового спирту в тканинах in vivo. Ефективні також дози на порядок вище [227, 228]. Цікаво відзначити, що секреція гіпофізом АКТГ у відповідь на різні дози етанолу була багатофазної і включала в себе 3 піку. Так як АКТГ і β-ендорфін виділяються зазвичай спільно, можна припустити, що β-ендорфін, подібно АКТГ, має хвилеподібну динаміку секреції. Ймовірно, це може частково пояснити неузгодженість результатів різних лабораторій щодо впливу етанолу на рівень β-ендорфіну [158].При гострої алкогольної інтоксикації, а також на ранніх стадіях розвитку алкоголізму спостерігається збільшення рівня плазматичного АКТГ у людей і тварин [158, 230]. Причому у самок секретується більше АКТГ і кортикостероїдів, ніж у самців у відповідь на однакову дозу етанолу [217]. Крім того, відповідь ГГНС на алкоголь був менше у інтактен самців в порівнянні і з іншими фемінізованих групами (гонадектомірованнимі самцями і самками). У самок щурів при гострої алкогольної інтоксикації більш висока концентрація АКТГ і кортикостероїдів у плазмі крові спостерігається протягом проеструса і еструса в порівнянні з діеструсом [230].
Проте тривала гіперфункція ДПС при значних термінах алкоголізації змінюється у більшості особин зниженням вмісту АКТГ і кортикостероїдів у плазмі крові, що пов'язано з виснаженням ДПС [232]. Так у щурів, з хронічною алкогольною інтоксикацією, концентрація АКТГ у плазмі крові становила приблизно половину від контрольного рівня [191].
, обладающего анксиолитическими свойствами, в гипоталамусе [136, 137, 173, 252].
Хронічне споживання етанолу тваринами (протягом 7 тижнів) знижувало рівень нейропептида Y, який володіє анксіолітичних властивостями, в гіпоталамусі [136, 137, 173, 252]. Одноразове введення етанолу в дозі 1г/кг внутрішньочеревно призводило до збільшення вмісту ДСІП в стріатумі [22], таламусі [22, 93] і середньому мозку [22]. Збільшення дози етанолу призводило до зниження ефекту. Хронічне введення етанолу змінює як синтез ДСІП в мозку, так і вражає системи, через які він реалізує свою дію синхронізатора біоритмів [22]. Гостра алкогольна інтоксикація призводить до підйому рівня гастрину і зниження рівня інсуліну в крові. У разі хронічної алкогольної інтоксикації спостерігалося підвищення рівня гастрину, нейротензин, речовини Р і зниження рівня інсуліну, соматотропного гормону, окситоцину, вазопресину в плазмі крові [3, 4].Однак не варто забувати, що алкогольна інтоксикація впливає не тільки на пептідергіческую систему, але і викликає дисфункції в інших нейромедіаторних системах: дофаминовой, серотоніновий, ГАМК-ергіческой, холінергічної та ін [19, 80, 88].
Так більшість дослідників схиляються до думки про те, що під впливом одноразового введення етанолу кругообіг дофаміну і серотоніну в мозку прискорюється. Дослідження в області прижиттєвої візуалізації мозку показали збільшення концентрації дофаміну в мозковій системі "винагороди". Ряд авторів вважає, що зміни дофаминовой нейромедиации є основною ланкою формування алкогольної залежності [80, 88].
Алкоголь викликає підвищення активності головною гальмує системи мозку - ГАМКергіческой. - внутрь клетки.
Доведено, що етанол впливає на комплекс рецептор ГАМК А / хлорний канал, викликаючи значне підвищення входу Cl - всередину клітини. Помічено, що стероїдні гормони здатні надавати модулюючий вплив на функцію ГАМК А, що може пояснити деякі статеві відмінності у молекулярних ефекти етанолу [80, 88, 120].Етанол специфічно і селективно змінює синаптическое дію глутамату - основного збуджуючого нейротрансмітера мозку. – рецептор в культуре нервных ткани [80].
Алкоголь в концентрації 0,03% інгібує потік іонів через NMDA - рецептор у культурі нервових тканини [80]. и in vivo , а также торможение вхождения ионов Na + в клетку. Етанол викликає дозозалежне пригнічення вивільнення ацетилхоліну у різних структурах мозку in vitro та in vivo, а також гальмування входження іонів Na + в клітину. Холінергічні синапси кори мозку більш стійкі до дії етанолу, ніж синапси підкіркових структур. При посмертному дослідженні мозку алкоголіків знайдений знижений рівень норадреналіну в різних структурах мозку. У тварин споживання етанолу підвищує рівень активності норадренергіческіх нейронів [80].Таким чином, алкоголь модифікує діяльність всіх ендокринних залоз, що призводить до якісних і кількісних змін метаболізму багатьох нейромедіаторів [8, 19, 62]. Проте варто відзначити, що дані про рівні різних нейромедіаторів дуже суперечливі, що, ймовірно, пов'язано з особливостями проведення експерименту.
1.3.2. Вплив етанолу на активність ферментів обміну нейропептидів
Під впливом етанолу відзначаються порушення у функціонуванні ферментних систем, в тому числі тих, які беруть участь в освіті та інактивації нейропептидів [26, 31, 36]. Останні в свою чергу безпосередньо або опосередковано можуть впливати на перевагу до етанолу, розвиток толерантності, а також залучаються у відповідну реакцію організму на алкогольну інтоксикацію. Тому дуже важливим видається дослідження активності ферментів обміну нейропептидів при алкогольної інтоксикації.
и соавт. Mayas і співавт. . вивчено вплив етанолу на активність амінопептідазу синаптосом головного мозку мишей in vitro. Під дією етилового спирту дозозалежно інгібувати аланінамінопептідаза; активність аргінін-, цистеїн-, лейцин-, тірозінамінопептідази під дією малих доз етанолу збільшувалася, великі дози надавали протилежний ефект. Інкубація синаптосом в середовищі 25 мМ К + у присутності етанолу призводить до інгібування всіх досліджених амінопептідазу [205].
При хронічної алкогольної інтоксикації зміст мРНК АПФ і нейтральною ендопептидаз помітно зменшується в мозку мишей [265]. Є дані про те, що активність нейтральної ендопептидаз в сироватці крові людей корелює з кількістю споживаного алкоголю [142], виявлено збільшення активності реніну в плазмі крові в осіб у стані алкогольного сп'яніння [63]. у людей с острой алкогольной интоксикацией не изменялась по сравнению с контролем, в то время как она увеличивалась в сыворотке у хронических алкоголиков [178]. Активність катепсину А і D у людей з гострою алкогольною інтоксикацією не змінювалася порівняно з контролем, в той час як вона збільшувалася в сироватці у хронічних алкоголіків [178].
Хронічне споживання етанолу самцями щурів призводить до зниження активності АПФ у гіпофізі, гіпоталамусі і стріатумі, що може сприяти підвищенню рівня опіоїдних і стрес-пептидів [31]. в сыворотке крови крыс, причем эти изменения зависят от дозы вводимого этанола. Гостра алкогольна інтоксикація веде до зміни активності КП N в сироватці крові щурів, причому ці зміни залежать від дози введеного етанолу. При гострому і хронічному споживанні етанолу тваринами спостерігається достовірне підвищення активності енкефалінази А в стріатумі, гіпоталамусі і середньому мозку. Авторами роботи висловлюється припущення, що порушення деградації енкефалінів грають ключову роль у реалізації дії етанолу на енкефалінергічного систему мозку [76].
Через 6 годин після внутрішньочеревно введення етанолу в дозі 1г/кг відбувалося підвищення активності ВПП у гіпофізі, гіпоталамусі, середньому мозку і стріатумі. У сірій речовині і гіпокампі активність ферменту не змінювалася. Введення етанолу в дозі 4 г / кг викликало підвищення активності ферменту в гіпофізі, гіпоталамусі і сірій речовині; в середньому мозку і стріатумі активність не змінювалася [26]. В іншій роботі вказується, що у самців щурів, яким вводили внутрішньочеревно етанол в дозі 4 г / кг через 3 і 6 годин після його введення відмічено підвищення питомої активності енкефалінконвертази в корі мозку і середньому мозку; в гіпокампі зміни активності ферменту носили синусоїдальний характер [14 ]. Хронічне споживання етанолу викликало зниження активності ВПП у гіпофізі [25, 26], гіпоталамусі [26], стріатумі [26, 36], корі мозку і середньому мозку [14]. У всіх досліджених відділах активність мембранозв'язаних форми змінювалася більш значно, ніж розчинної, що, ймовірно, пов'язано з мембранотропних ефектом етанолу [256].
Достовірні зміни активності КПМ при хронічному споживанні етанолу виявлені в гіпокампі, де активність КПМ збільшується, але знижується у великих півкулях, не виявлено достовірних відмінностей в активності ферменту в гіпоталамусі, стріатумі і четверохолміе [36]. Хронічна алкоголізація істотно впливала на активність ФМСФ-КП: активність ферменту підвищувалася в гіпоталамусі, стріатумі, четверохолміе, тобто тих відділах головного мозку, в яких при алкоголізації спостерігаються найбільш істотні зміни рівня енкефалінів та деяких інших нейропептидів. Активність ФМСФ-КП при хронічній алкогольній інтоксикації залишилася на колишньому рівні в гіпокампі і великих півкулях [36].
Цікаві дані про вплив внутрішньочеревно введення самцям щурів фізіологічного розчину на активність ферментів обміну нейропептидів наводяться в роботі Вернигори та співавт. [38]. в сыворотке. Ними виявлено підвищення активності ВПП у гіпофізі і стріатумі, АПФ у гіпофізі та сироватці крові, КП N в сироватці. Ці ферменти беруть участь в обміні цілого ряду НП, тому внутрішньоочеревинне введення фізрозчину може призводити до значних змін у функціонуванні пептідергіческіх систем. Причому ці зміни стосуються стрес-систему, опіоідергіческую і ангіотензин-брадікініновую систему. Тому при проведенні гострих експериментів необхідно розглядати всі явища, що спостерігаються з урахуванням змін, викликаних внутрішньочеревно ін'єкцією [38]. и АПФ вовлекаются в реализацию стресс-протективного действия этанола [26, 40]. У ряді робіт вказується, що, мабуть, ВПП, КП N і АПФ залучаються у реалізацію стрес-протективні дії етанолу [26, 40].
Таким чином, етанол викликає зміну активності ряду протеолітичних ферментів. Це, у свою чергу, веде до зміни рівня багатьох регуляторних пептидів, що можна розглядати як один з патогенетичних факторів алкоголізму.
1.4. Карбоксипептидаза H (КФ 3.4.17.10)
КПH (КПE, енкефалінконвертаза) вперше виділена і охарактеризована Fricker і Snyder з хромафінних гранул надниркових залоз бика, як фермент, який утворює енкефаліни з їх попередників [152]. Пізніше фермент був виділений і очищений з мозку [34, 153, 154], гіпофіза [153, 154], острівців Лангерганса підшлункової залози [122, 133, 161, 198]. Фермент, виділений з різних тканин різних видів тварин, має дуже близькі фізико-хімічні та каталітичні властивості.
КПH є одноланцюговим глікопротеїном і існує як у розчинній, так і в зв'язаній з мембранами формах [34, 122, 197]. Існують дві форми мембранозв'язаних КПH, що відрізняються за міцністю зв'язування з мембранами. Одна з цих форм екстрагується з мембран при pH 5,6 1 M розчином NaCl, друга - тільки за спільної дії 1 M NaCl і 1% Тритона X-100 [147, 258].
Фермент синтезується у вигляді неактивного зимогена з Mr 75000 [209], який перетворюється на активну форму під дією ферментів тріпсіноподобних в ході дозрівання секреторних везикул [140, 161]. Спочатку утворюється неактивна форма з Mr 65000 [168, 169], яка перетворюється в активні форми з Mr 52000 - 53000 і 55000 - 57000 [140, 161, 220]. Відмінності в Mr цих форм не пов'язані з відмінностями в ступені глікозилювання [161, 220, 221]. Форма з Mr 55000 - 57000 відрізняється від форми з Mr 52000 - 53000 присутністю N-кінцевого сигнального пептиду [220]. Обидві форми існують і в розчинній, і в зв'язаному з мембранами вигляді [161, 140]. Активність розчинної форми ферменту в розрахунку на молекулу ферменту вище, ніж мембранозв'язаних [143, 147]. Співвідношення між розчинної і мембранозв'язаних формами змінюється в міру дозрівання секреторних везикул [171]. За зв'язування ферменту з мембранами відповідає C-кінцева амфіфільних послідовність, яка присутня тільки у мембранозв'язаних форми [147]. Вона складається з 21 залишку чергуються гідрофобних і гідрофільних амінокислот. У амінокислотної послідовності КПH виявлений також Ca 2 +-зв'язуючий ділянку [213], але іони Ca 2 + впливають не на активність, а на стабільність, агрегацію та здатність до зв'язування з мембранами [255].
2+ [149, 153]. ВПП проявляє максимальну активність при рН 5,5-6,0, що відповідає рН всередині секреторних везикул і є тіолзавісімим металоферментів, в активному центрі якого знаходиться іон Zn 2 + [149, 153]. 2+ , ингибируется ионами С d 2+ и Cu 2+ , хелатирующими агентами: ЭДТА, о-фенантролином, при применении которых активность фермента восстанавливается добавлением ионов Zn 2+ . Даний фермент сильно (приблизно в 5-10 разів) активується іонами Со 2 +, у меншій мірі (у 2-3 рази) - іонами Ni 2 +, інгібується іонами З d 2 + і Cu 2 +, хелатирующими агентами: ЕДТА, про -фенантроліном, при застосуванні яких активність ферменту відновлюється додаванням іонів Zn 2 +. -этилмалеимидом и органическими кислотами, содержащими амино- или гуанидиновую группу: ГЭМЯК, ГПЯК, АПМЯК, АПЯГ, МГТК. Фермент також інгібується реагентами на сульфгідрильні групи: ПХМФС, ПХМБ, N-етілмалеімідом і органічними кислотами, що містять аміно-або гуаніновий групу: ГЕМЯК, ГПЯК, АПМЯК, АПЯГ, МГТК. 8,8 и 7,5 нМ соответственно. Найбільш ефективними інгібіторами є ГЕМЯК і ГПЯК з К i 8,8 і 7,5 нМ відповідно.
2+ и Mn 2+ не влияют на активность КПН [149, 152, 153, 167, 258]. ФМСФ, 2-меркаптоетанол, а також іони М g 2 + та Mn 2 + не впливають на активність ВПП [149, 152, 153, 167, 258].
КПH відщеплює залишки аргініну і лізину з C-кінця синтетичних і природних пептидів. Швидкість відщеплення залишків аргініну в кілька разів більше, ніж залишків лізину. Залишки гістидину відщеплюються з дуже маленькою швидкістю, порівняно із залишками лізину. Залишки ароматичних амінокислот не відщеплюються. Швидкість розщеплення субстратів залежить від попереднього амінокислотного залишку. Швидкість розщеплення данс-фен-ала-арг на порядок вище, ніж швидкість розщеплення данс-фен-гли-арг, данс-фен-лей-арг і данс-фен-мулі-арг [167, 172, 234, 254].
Локалізація ферменту в цілому відповідає розподілу біологічно активних пептидів і їх попередників [50, 144, 145]. Найбільш висока активність КПH виявлена в аденогипофизе, хромафінних гранулах надниркових залоз [152, 153, 154] і острівцях Лангерганса підшлункової залози [122, 161]. Більш низька (приблизно на порядок) активність ферменту виявляється в задній частині гіпофізу [172, 177], гіпоталамусі, стріатумі, гіпокампі, середньому мозку, корі великих півкуль [89]. Найнижча активність КПH виявлена в стовбурної частини головного мозку, спинному мозку, легенях, серці, шлунково-кишковому тракті, печінці та нирках. Встановлено, що КПH асоційована зі структурними елементами ЕПР, комплексу Гольджі і секреторними везикулами, де протікає процесинг попередників різних біологічно активних пептидів [144]. Фермент виявлений у секреторних везикулах, що містять енкефаліни [196], атріальний натрійуретичний фактор [197], глюкагон [161, 218], інсулін [122, 133], АКТГ [134, 201], пролактин [150], речовина P [111] , вазопресин і окситоцин [214, 234] та інші регуляторні пептиди. Різні інгібітори та активатори секреції координовано регулюють виділення КПH та енкефалінів [151, 170], АКТГ [182, 183, 201], пролактину [150], вазопресину [103, 200] та інсуліну [160].
Фізико-хімічні властивості, субстратна специфічність, тканинна, клітинному і субклітинному локалізація, особливості зміни активності ферменту при різних фармакологічних впливах на культури клітин, порушення синтезу нейропептидів у мишей з дефектною ВПП свідчать про те, що досліджуваний фермент залучається до процесинг багатьох біологічно активних пептидів, таких як енкефаліни, АКТГ, b-ендорфін, вазопресин, окситоцин, нейротензин, меланоцітстімулірующій гормон, речовина Р та ін
[39], имеются данные о наличии половых различий в активности фермента [78]. Показано, що ВПП залучається до визначення агресивності [52], схильності до споживання етанолу [56], у розвиток фізичної залежності від етанолу [14, 49, 52, 55], у відповідь на різні стрессірующіе впливу [30, 33, 48, 52 ], введення стероїдних гормонів in vivo [39], є дані про наявність статевих відмінностей в активності ферменту [78].
1.5. ФМСФ-інгібіруемая карбоксипептидаза
У 1995 р. Вернигора і співавт. виявили в розчинній фракції сірої речовини головного мозку кішки основну КП, активність якої повністю пригнічується ФМСФ [42].
100000; проявляет максимальную активность при рН 6,0-6,5, но сохраняет 40-45% активности при рН 5,5. Фермент, за результатами гель-фільтрації, має М r 100000; проявляє максимальну активність при рН 6,0-6,5, але зберігає 40-45% активності при рН 5,5. Фермент повністю ингибировал ФМСФ і ПХМБ, приблизно на 40% ингибировал іодацетамідом. -этилмалеимид, ионы Co 2+ и ГЭМЯК не влияли на его активность. ЕДТА, 2-меркаптоетанол, N-етілмалеімід, іони Co 2 + та ГЕМЯК не впливали на його активність. Фермент майже в 2 рази активувався 50 , несколько слабее – NaBr , KCl и KJ . мМ NaCl, дещо слабше - NaBr, KCl і KJ. не приводило к увеличению степени активации фермента [42, 47]. Підвищення концентрації NaCl не призводило до збільшення ступеня активації ферменту [42, 47].
Згідно з даними тонкошарової хроматографії частково очищений фермент відщеплює аргінін від лей 5-енкефалінів-арг 6 і данс-фен-лей-арг з утворенням лей 5-енкефалінів і данс-фен-лей відповідно. Більш глибокого гідролізу субстратів не спостерігалося. – карбобензокси-гли-лей [42, 47]. Фермент також не розщеплював субстрат КП A - карбобензоксі-гли-лей [42, 47]. . Таким чином, за субстратної специфічності ФМСФ-інгібіруемая карбоксипептидаза схожа з ЛКП B. 2+ ) отличают его от ЛКП B [1, 192]. Разом з тим фізико-хімічні властивості ферменту (інгібування ФМСФ, нечутливість до ЕДТА, ГЕМЯК і іонів Co 2 +) відрізняють його від ЛКП B [1, 192]. Інгібування ферменту ФМСФ дозволяє припустити, що він є серинових карбоксипептидази. (КФ 3.4.12.4, ангиотензиназа C , пролилкарбоксипептидаза). У тканинах ссавців виявлені дві серинові карбоксипептидази - ЛКПА (КФ 3.4.16.1, катепсин A, лізосомальних карбоксипептидаза L) і карбоксипептидаза C (КФ 3.4.12.4, ангіотензіназа C, пролілкарбоксіпептідаза). по молекулярной массе и субстратной специфичности [226, 249]. Але ФМСФ-інгібіруемая карбоксипептидаза відрізняться від карбоксипептидази C за молекулярною масою і субстратної специфічності [226, 249].
молекулярную массу, оптимум pH , ингибиторный профиль, но отличается от последней по субстратной специфичности и тканевой локализации [204, 226]. У той же час, ФМСФ-інгібіруемая карбоксипептидаза має схожі з ЛКП A молекулярну масу, оптимум pH, інгібіторний профіль, але відрізняється від останньої за субстратної специфічності і тканинної локалізації [204, 226].
Активність ФМСФ-інгібіруемой КП виявлена у всіх відділах мозку і в більшості тканин, за винятком нирок, в яких присутні лише сліди її активності. Найбільша активність ферменту наголошується в наднирниках, приблизно на 40% нижче - у гіпофізі, в печінці і селезінці його активність становить приблизно 30-35% від активності в гіпофізі. У сім'яниках активність ФМСФ-інгібіруемой КП приблизно в 2,5 рази нижче, ніж в наднирниках. У відділах мозку активність ферменту приблизно в 2-3 рази нижче, ніж у гіпофізі. Найбільш висока активність ФМСФ-інгібіруемой КП в мозку виявляється у нюхових цибулинах, найбільш низька - у четверохолміе і гіпокампі [35].
гидролиза – 48 мкМ), выше, чем сродство КПН (К m гидролиза – 96 мкМ). Звертає на себе увагу той факт, що спорідненість виявленого ферменту до данс-фен-лей-арг (До m гідролізу - 48 мкМ), вище, ніж спорідненість ВПП (До m гідролізу - 96 мкМ). Це дозволяє припустити, що енкефалінів-лей 5-арг 6 може бути кращим субстратом для ФМСФ-інгібіруемой КП, ніж для ВПП. ФМСФ-КП виявляє істотну активність при значеннях рН, відповідних такому всередині секреторних везикул. Таким чином, можливо, що виявлений фермент залучається до процесинг нейропептидів, зокрема енкефалінів-лей 5-арг 6, тим більше, що в літературі є дані про те, що регіональний розподіл ВПП та енкефалінів не завжди відповідає один одному [75].
ФМСФ-КП втягується у розвиток алкогольної залежності [36, 37], у відповідь на різні стрессірующіе впливу [13], виявлені статеві відмінності в активності ФМСФ-КП, причому у самок активність ферменту в багатьох тканинах вище, ніж у самців [44, 91 , 139].
1.6. Карбоксипептидаза M (КФ 3.4.17.2)
Карбоксипептидаза M являє собою мембранозв'язаних одноланцюговий глікопротеїн з молекулярною масою 62 кДа, заякорені в плазматичній мембрані за допомогою залишку глікозил-фосфатидилінозитолу [123, 248]. Обробка трипсином і фосфоліпазою C призводить до видалення гідрофобного хвоста і вивільнення ферменту з клітинної мембрани [121, 250].
Вивільнення КПM з плазматичної мембрани відбувається і in vivo, оскільки фермент виявлений в різних біологічних рідинах, зокрема в сечі та амніотичній рідини [250].
При хімічному деглікозілірованіі утворюється поліпептид з Mr 48000, який складається з 439 амінокислотних залишків [245, 251]. Амінокислотна послідовність ферменту на 41% ідентична КПN і КПH, на 15% - КПB і кПa. Багато залишки активного центру ідентичні таким кПa і КПB, але перехресної реакції з антисироватки до інших КП фермент не дає [251, 260].
Фермент відщеплює залишки тільки основних амінокислот, при відсутності іонів Co 2 + краще відщеплює аргінін, а в присутності Co 2 + - лізин. Естеразная активність ферменту значно вище, ніж пептідазная [123, 248]. КПM проявляє максимальну активність при pH 7,0, іони Co 2 + підвищують активність ферменту в 1,5-2 рази, причому ступінь активації зростає при зниженні pH [123]. Активність КПM пригнічується іонами Cd 2 +, о-фенантроліном, МГТК і ГЕМЯК [123, 248].
ПХМФС, HgCl 2, дітіотреїтолу, ФМСФ, апротинін, каптоприл і фосфорамідон не впливають на активність ферменту [123, 248].
Фермент локалізована переважно в плаценті, нирках, ендотеліальних клітинах кровоносних судин, виявлений у периферичній нервовій системі і головному мозку [123, 212].
отщепляет С-концевые остатки основных аминокислот от динорфина А 1-13, мет-энкефалин-арг 6 , мет-энкефалин-лиз 6 , лей-энкефалин-арг 6 , брадикинина [1, 123, 248,], фактора роста эпидермиса [175], образует интактные кинины и анафилотоксины С3а, С4а, С5а [223]. КПМ in vitro відщеплює С-кінцеві залишки основних амінокислот від динорфінів А 1-13, мет-енкефалінів-арг 6, мет-енкефалінів-ліз 6, лей-енкефалінів-арг 6, брадикініну [1, 123, 248,], фактору росту епідермісу [175], утворює інтактні кініни і анафілотоксинів С3а, С4а, С5а [223]. Припускають, що фермент може інактивувати або модулювати пептидні гормони перед або після взаємодії останніх з рецепторами [28].
Варто відзначити, що якщо фізико-хімічні властивості ВПП, ФМСФ-КП і КПМ вивчені досить добре, то біологічна роль даних ферментів, у тому числі їх участь у різних фізіологічних і патологічних процесах досліджені значно гірше. Тому представляється досить цікавим вивчення їх активності при різних процесах в організмі, у тому числі при гострої алкогольної інтоксикації.
РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали дослідження
Досліди проводили на самках і самцях білих безпородних щурів масою 150-200 г. Тварин утримували в стандартних умовах віварію.
У роботі використовували чотири групи тварин. У самок щурів визначали стадію естрального циклу за вагінального мазку [59], при цитологічному дослідженні якого тварин поділяли на три групи. Тварини першої групи перебували в стадії діеструса, другий - в стадії проеструса, третьої - в стадії еструса, четверту групу становили самці. Кожну з чотирьох груп розбивали на чотири підгрупи: перша - интактная. Тваринам другої підгрупи внутрішньочеревно вводили 5% розчин етанолу, в дозі 1 г на кг ваги тіла, а тваринам третьої - 20% розчин етанолу в дозі 4 г на кг ваги. Тваринам четвертої підгрупи вводили внутрішньочеревно еквівалентну кількість фізіологічного розчину. Тварин декапітованих через 0,5 години, 4 години і 18 годин після ін'єкції. Декапітацію самок щурів в стадії проеструса проводили тільки через 0,5 години і 4 години після ін'єкції, так як тривалість даної стадії естрального циклу близько 12 годин. Потім витягували гіпофіз, гіпоталамус, стріатум, надниркові залози і статеві залози. Тканини поміщали в заздалегідь охолоджений фізіологічний розчин, очищали від кровоносних судин і оболонок, висушували фільтрувальним папером.
в соотношении 1:100 (вес:объем) для отделов мозга, надпочечников и яичников, 1:50 для семенников. Для визначення активності ферментів тканини зважували, а потім гомогенізували в скляному гомогенизаторе з тефлоновим товкачиком в 10 мМ натрій-ацетатному буфері (рН 5,6), що містить 50 мМ NaCl у співвідношенні 1:100 (вага: обсяг) для відділів мозку, надниркових залоз і яєчників, 1:50 для насінників.
”, США) и ГЭМЯК (любезно предоставлена доктором О.Л. Варламовым). У якості специфічних інгібіторів застосовували ФМСФ ("Serva", США) і ГЕМЯК (люб'язно надана доктором О. Л. Варламовим). Субстрати данс-фен-ала-арг, данс-фен-лей-арг були синтезовані к.х.н. В.Н. Каліхевічем. Для внутрішньочеревно ін'єкцій застосовувався двічі перегнанной медичний спирт. ”, Германия), трис-НС l (“ Serva ”, США), все остальные реактивы были отечественного производства с квалификацией ”ХЧ” и ”ОСЧ”. У роботі використовували ацетат натрію ("Merck", Німеччина), трис-НС l ("Serva", США), всі інші реактиви були вітчизняного виробництва з кваліфікацією "хч" і "ОСЧ".
2.2. Методи дослідження
2.2.1. Метод визначення активності карбоксипептидази Н і карбоксипептидази М
и Snyder [153]. Активність ВПП визначали модифікованим методом Fricker і Snyder [153].
или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (в случае контрольной пробы). Для визначення активності ВПП 50 мкл гомогенату тканини додавали до 150 мкл (у разі дослідної проби) 50 мМ натрій-ацетатного буфера, рН 5,6, що містить 50 мМ NaCl або до суміші 140 мкл вищевказаного буфера і 10 мкл 25 мкМ водного розчину інгібітора ГЕМЯК (у разі контрольної проби). , рН 7,4. Для визначення активності КПМ робили також, з тією лише різницею, що в якості буфера використовували 200 мМ трис-Н Cl, рН 7,4. Далі проби преінкубіровалі 8 хвилин при 37 ˚ С. Реакцію починали додатком 50 мкл попередньо нагрітого до 37 ˚ С 210 мкМ розчину данс-фен-ала-арг, приготовленого на воді (кінцева концентрація в реакційній суміші 42 мкМ). Проби інкубували 60 хвилин при 37 ˚ С. . Реакцію зупиняли додаванням 50 мкл 1М розчину HCl.
Для екстракції продукту реакції данс-фен-ала до проб доливали по 1,5 мл хлороформу, інтенсивно струшували протягом 60 с. Хлороформний і водну фази поділяли центрифугуванням протягом 10 хвилин при 1000об/мін.
=360 нм и λ em =530 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе. Флюоресценцію хлороформно фази вимірювали на флюоріметре ФМЦ-2 при λ ex = 360 нм і λ em = 530 нм в кюветі товщиною 1 см. В якості стандарту використовували 1 мкМ розчин данс-фен-ала в хлороформі.
Активність ферменту визначали як різниця приросту флюоресценції у пробах, що не містять і містять ГЕМЯК, і виражали в нмоль данс-фен-ала, що утворився за 1 хвилину інкубації в перерахунку на 1 мг білка.
2.2.2. Метод визначення активності ФМСФ-інгібіруемой карбоксипептидази
Активність ФМСФ-КП визначали флюоріметріческі [42] з використанням данс-фен-лей-арг в якості субстрату.
У контрольні проби вносили 140 мкл 50 мМ натрій-ацетатного буфера, що містить 50 мМ NaCl, pH 5,6, 50 мкл препарату ферменту і 10 мкл 25 мМ ФМСФ, приготованого на етанолі. ФМСФ вносили у реакційну суміш після внесення препарату ферменту. Досвідчені проби містили 150 мкл зазначеного буфера і 50 мкл препарату ферменту. Проби преінкубіровалі 8 хв при 37 o C, потім вносили 50 мкл попередньо нагрітого до 37 o C 210 мкМ розчину данс-фен-лей-арг, приготовленого на воді. Далі проби обробляли як описано для КПH і КПМ. В якості стандарту використовували 1 мкМ розчин данс-фен-лей в хлороформі.
Активність ферменту визначали як різницю приросту флюоресценції у пробах, що не містять і містять ФМСФ і виражали в нмоль данс-фен-лей, що утворився за 1 хв інкубації в перерахунку на 1 мг білка.
и соавт.
Кількість білка в пробах визначали за методом Lowry та співавт. [195].2.2.3. Статистична обробка результатів дослідження
-критерия Стьюдента [68]. Достовірність відмінностей між середніми визначали з використанням t-критерію Стьюдента [68]. в Кореляційний та дисперсійний аналізи проводили за допомогою програми Statgraphics (версія 3.0) ("STSC, Inc." США) у и Multifactor ANOVA. Принадлежность подгрупп животных к разным гомогенным группам оценивали с помощью Multiple range analysis (Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США)). режимах Simple Correlation, One-Way ANOVA і Multifactor ANOVA. Приналежність підгруп тварин до різних гомогенним групам оцінювали за допомогою Multiple range analysis (Statgraphics (версія 3.0) ("STSC, Inc." США)). Належність експериментальних (тимчасових) підгруп до різних гомогенним групам проводили тільки у разі достовірності критерію Фішера. При цьому оцінювали кількість гомогенних груп, утворюваних експериментальними підгрупами, з рівнем достовірності р <0,05. Бали підгрупах привласнювали на підставі їх належності до різних гомогенним групам у міру збільшення середнього. При цьому мінімальний бал отримувала тимчасова підгрупа з мінімальним середнім, максимальний бал - тимчасова підгрупа з максимальним середнім, а дробовий бал отримували підгрупи, які входять одночасно в дві гомогенні групи. На підставі присвоєних балів судили про динаміку зміни активності ферментів.
2.3. Схема експерименту
Самки | Самці | ||||||||||||||
Визначення стадії естрального циклу | |||||||||||||||
Діеструс | Проеструс | Еструс | |||||||||||||
етанол | Етанол | контроль | Етанол | контроль | етанол | ||||||||||
1г/кг | 4г/кг | 1г/кг | 4г/кг | 1г/кг | 4г/кг | 1г/кг | 4г/кг |
Забій тварин через 0,5, 4 і 18 годин після впливу |
Визначення активності ВПП, ФМСФ-КП і КПМ |
3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ
3.1. Дослідження активності основних карбоксипептидази в тканинах самок щурів на різних стадіях естрального циклу
3.1.1. Вивчення активності карбоксипептидази Н в тканинах самок щурів на різних стадіях естрального циклу
а) Розподіл активності карбоксипептидази Н
в тканинах інтактних самок щурів
Результати досліджень показали, що в залежності від стадії естрального циклу змінюється активність ВПП у гіпофізі, гіпоталамусі, стріатумі і яєчниках (табл.1).
Різні стадії естрального циклу можуть бути розташовані в міру спадання активності ВПП у гіпофізі в ряд: проеструс-еструс-діеструс.
Таблиця 1. Активність ВПП на різних стадіях естрального циклу в нормі (нмоль продукту, що утворився за 1 хв інкубації на 1 мг білка, M ± m, n = 6 ¸ 8).
Відділ | Стадія естрального циклу | ||
Діеструс | Проеструс | Еструс | |
Гіпофіз | 0,445 ± 0,04 ^ ^ ^ | 1,229 ± 0,143 | 0,690 ± 0,048 <<, ^ ^ |
Гіпоталамус | 0,238 ± 0,019 | 0,211 ± 0,012 | 0,247 ± 0,011 ^ |
Стріатум | 0,153 ± 0,013 | 0,168 ± 0,015 | 0,195 ± 0,012 < |
Наднирники | 0,091 ± 0,012 | 0,071 ± 0,004 | 0,067 ± 0,009 |
Яєчники | 0,029 ± 0,015 ^ | 0,094 ± 0,027 | 0,042 ± 0,027 |
Примітка. Тут і в табл. <0,05, << – p <0,01 и ^ – p <0,05, ^^ – p <0,01, ^^^ – p <0,001 соответственно. 5 достовірність відмінностей критерію Стьюдента у порівнянні з діеструсом і проеструсом: <- p <0,05, <<- p <0,01 і ^ - p <0,05, ^ ^ - p <0,01, ^ ^ ^ - p <0,001 відповідно.
Відомо, що стадія проеструса характеризується найбільш високим рівнем секреції естрогенів дозріваючими фолікулами яєчника, а стадія діеструса низьким рівнем естрогену в організмі [12, 17, 45]. У свою чергу секреція естрогенів знаходиться під впливом ФСГ і ЛГ, концентрація яких також зростає в проеструсе і зменшується в діеструсе [11, 46]. Ці дані дозволяють припустити, що ВПП, можливо бере участь у регуляції рівня цих гормонів в гіпофізі на різних стадіях естрального циклу.
Активність ВПП у гіпоталамусі на стадії еструса вище ніж на стадії проеструса на 17%. У стріатумі в еструс активність ферменту вище по відношенню до діеструсу на 27%. Так як ВПП втягується у процес біосинтезу енкефалінів, то, можливо, що таке збільшення активності ферменту, що приводить до зростання вмісту енкефалінів в стріатумі, пояснює істотне зниження добровільного споживання етанолу самками щурів в еструс [19, 45].
У наднирниках достовірних змін активності ВПП у залежності від стадії естрального циклу не виявлено.
У яєчниках активність ВПП на стадії проеструса достовірно вище, ніж у діеструсе, що дозволяє припустити можливість залучення ферменту в циклічні зміни рівня біологічно активних пептидів у цьому органі [18, 240].
Таким чином, ймовірно, ВПП належить важлива роль в регулюванні рівня нейрогормонів на різних стадіях естрального циклу.
б) Активність карбоксипептидази Н при введенні фізіологічного розчину в тканинах самок
На стадії ДЕ через 4 години після введення фізіологічного розчину активність ВПП змінювалася в гіпофізі, гіпоталамусі і наднирниках (рис. 1). При цьому в гіпофізі вона зросла майже в 2 рази, а в гіпоталамусі і наднирниках зменшилася на 29% і 51% відповідно. Зменшення активності ВПП у гіпоталамусі, ймовірно, може сприяти збільшенню кількості виводиться з організму рідини, за рахунок зменшення утворення вазопресину [72]. Через 0,5 і 18 годин після ін'єкції достовірних змін активності ВПП не виявлено. У стріатумі і яєчниках введення фізіологічного розчину не впливало на активність ВПП.
На стадії проеструса активність ВПП у гіпофізі через 0,5 і 4 години після внутрішньочеревно введення фізіологічного розчину була достовірно нижче на 35% і 53% відповідно в порівнянні з інтактними самками. У наднирниках зниження активності ВПП відзначено тільки через 0,5 години після ін'єкції фізрозчину на 34% в порівнянні з інтактною групою щурів. Ймовірно, такі зміни активності ферменту пов'язані з особливостями чиниться впливу, при якому в організм поступає додаткова кількість рідини [38]. У гіпоталамусі, стріатумі і яєчниках активність ВПП достовірно не змінювалася при введенні фізіологічного розчину.
На стадії еструса в гіпофізі через 0,5 і 4 години після введення фізрозчину активність ВПП була нижчою за норму на 48% і 42% відповідно. У стріатумі через 0,5 години після ін'єкції активність ВПП була нижче на 25% в порівнянні з інтактною групою тварин. У гіпоталамусі, наднирниках і яєчниках активність ВПП достовірно не змінювалася при введенні фізіологічного розчину.
Порівняння активності ВПП на різних стадіях естрального циклу при введенні фізіологічного розчину показало, що на стадії еструса в гіпофізі через 0,5 години після здійснення впливу активність ферменту достовірно нижче по відношенню до діеструсу і проеструсу. Через 4 години після введення фізрозчину активність зменшувалася при переході від діеструса до проеструсу і далі до еструс. У гіпофізі через 18 годин після ін'єкції активність ВПП була достовірно вище в діеструсе в порівнянні з еструс.
У гіпоталамусі на стадії еструса через 4 години після внутрішньочеревно введення фізіологічного розчину активність ВПП вище, ніж у діеструсе і проеструсе, а через 18 годин на діеструсе нижче, ніж у еструс.
активность фермента была выше, чем в проэструсе. У стріатумі на стадії діеструса через 0,5 години після ін'єкції 0,9% розчину NaCl активність ферменту була вищою, ніж у проеструсе. Через 4 години після наданого впливу в стріатумі активність ВПП у еструс достовірно вище по відношенню до діеструсу і проеструсу, через 18 годин активність ферменту в еструс продовжувала залишатися на більш високому рівні, ніж у діеструсе.
У наднирниках на стадії діеструса активність ВПП через 0,5 години після введення фізіологічного розчину достовірно вище, ніж у еструс і проеструсе, а через 4 години співвідношення активностей ферменту на цих стадіях змінюється на протилежне.
У яєчниках на стадії проеструса активність ВПП достовірно вище, ніж на стадії еструса. Через 4 і 18 годин на діеструсе активність нижче в порівнянні з еструс. Таким чином, введення фізрозчину призводить до зміни співвідношення активності ферменту в досліджуваних відділах в ході естрального циклу і веде в свою чергу до зміни співвідношення нейропептидів, що, ймовірно відображає один з механізмів порушення функціонування статевої системи при стресі.
Введення фізрозчину не впливало на активність ВПП через 0,5 години після впливу на стадії діеструса і через 18 годин на стадіях діеструса і еструса. Активність ВПП у яєчниках не залежала від ін'єкції фізрозчину. , активность фермента была ниже, чем у интактных животных. Найбільш суттєві зміни після введення фізрозчину в активності ферменту спостерігалися в гіпофізі і менш істотні в гіпоталамусі, стріатумі і наднирниках, причому у всіх цих відділах, за винятком активності ферменту в гіпофізі через 4 години після введення ізотонічного розчину NaCl, активність ферменту була нижчою, ніж у інтактних тварин. Крім того, активність ВПП при введенні фізіологічного розчину на всіх вивчених відділах залежала від стадії естрального циклу. Все це призводить до того, що після ін'єкції фізрозчину співвідношення активностей ферменту в залежності від стадії естрального циклу у всіх органах відрізняється від норми.
в) Дослідження активності карбоксипептидази Н при введенні етанолу в тканинах самок щурів
На стадії діеструса в гіпофізі через 4 години після введення етанолу в дозі 1 г на кг ваги спостерігалося зниження активності ВПП на 33% у порівнянні з контрольною групою тварин. У гіпоталамусі, наднирниках і яєчниках через той же проміжок часу активність ферменту була вищою, ніж у контрольної групи тварин на 33%, 47% і 112% відповідно. У гіпоталамусі через 0,5 години після ін'єкції розчину етанолу активність ВПП була вище на 37% в порівнянні з контрольними самками (рис.1).
-эндорфина при острой алкогольной интоксикации [94, 158, 241], в биосинтезе которых принимает участие КПН [27, 28, 29]. Наші дані узгоджуються з відомостями про посилення освіти і секреції енкефалінів, АКТГ, β-ендорфіну при гострої алкогольної інтоксикації [94, 158, 241], в біосинтезі яких бере участь ВПП [27, 28, 29].Етанол в дозі 4 г / кг в діеструсе ізмененяются активність ферменту в гіпофізі: через 0,5 і 18 годин вона була вище контрольних значень на 43% і 140% відповідно, а через 4 години - нижче на 57%. У гіпоталамусі через 0,5 і 4 години після введення етанолу активність ВПП була вище на 26% і 38% відповідно, а через 18 годин - нижче на 31% у порівнянні з контрольною групою тварин. Зниження активності ферменту, можливо, спрямоване на нормалізацію пептідергіческіх систем. У яєчниках тільки через 0,5 години після ін'єкції етанолу в дозі 4г/кг активність ферменту була вища за таку в порівнянні з контролем у 3,6 рази. Збільшення активності ВПП при гострої алкогольної інтоксикації узгоджується з поданням про активацію багатьох пептідергіческіх систем при гострої алкогольної інтоксикації [19, 86].
Цікаво відзначити, що в стріатумі на стадії діеструса етанол не впливав на активність ВПП, що, ймовірно, може пояснюватися особливостями біохімічного та фізіологічного статусу тварин на різних стадіях естрального циклу [17, 45, 247].
Достовірні відмінності в активності ВПП у стадії діеструса при введенні різних доз етанолу виявлені в гіпофізі і гіпоталамусі через 18 годин, а також у яєчниках через 0,5 години після ін'єкції. При цьому етанол в дозі 1г/кг не викликав змін в активності ферменту, однак при введенні етанолу в дозі 4 г / кг активність ВПП зростала в 2 рази в гіпофізі, в 2,8 рази в яєчниках і зменшувалася в гіпоталамусі на 23%.
Таким чином, введення етилового спирту на стадії діеструса викликає різноспрямовані зміни активності ВПП. Крім того, через 18 годин після ін'єкції етанолу в дозі 1 г / кг активність ферменту залишалася на колишньому рівні в усіх розглянутих відділах.
Для більш повного розуміння характеру виявлених змін активності ферменту первинний експериментальний матеріал був підданий дисперсійному аналізі впливу часу після ін'єкції при введенні різних доз етанолу (табл.2).
Дисперсійний аналіз показав відсутність впливу часу на активність ВПП при введенні фізіологічного розчину і етанолу в дозі 1г/кг в діеструсе. Однак при ін'єкції етанолу в дозі 4 г / кг спостерігається достовірна залежність активності ВПП від часу в гіпофізі і гіпоталамусі. -образное изменение активности фермента, а в гипоталамусе активность фермента плавно снижалась с течением времени.
При цьому етанол в дозі 4г/кг викликав у гіпофізі U-образне зміна активності ферменту, а в гіпоталамусі активність ферменту плавно знижувалася з плином часу.Таблиця 2. Дисперсійний аналіз вплив часу на активність карбоксипептидази Н в діеструсе (значення відносини Фішера F Ф і бали експериментальних (тимчасових) підгруп).
Відділ | Вплив | ф F ф | Норма | Тимчасові підгрупи | ||
0,5 ч. | 4 ч. | 18 ч. | ||||
Гіпофіз | Физраствор | 3,45 * | 1 | 1 | 1 | 1 |
Етанол 1г/кг | 2,87 | - | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 7,03 ** | 1,5 | 2,5 | 1 | 3 | |
Гіпоталамус | Физраствор | 2,57 | - | - | - | - |
Етанол 1г/кг | 2,09 | - | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 4,03 * | 1,5 | 2 | 1,5 | 1 | |
Стріатум | Физраствор | 0,90 | - | - | - | - |
Етанол 1г/кг | 0,93 | - | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 1,05 | - | - | - | - | |
Наднирники | Физраствор | 0,56 | - | - | - | - |
Етанол 1г/кг | 0,52 | - | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 0,26 | - | - | - | - | |
Яєчники | Физраствор | 0,62 | - | - | - | - |
Етанол 1г/кг | 0,33 | - | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 2,79 | - | - | - | - |
Примітка. Тут і в табл.3-4, 6-8, 10-12, 14, 16, 18, 19 показана достовірність критерію Фішера: * - p <0,05, ** - p <0,01, *** - p <0,001; прочерк - визначення не проводилося.
На стадії проеструса активність ВПП при введенні етилового спирту (доза 1г на кг маси тіла) в гіпофізі через всі досліджені проміжки часу була нижче контрольних значень: на 45% через 0,5 години і на 24% через 4 години. В інших відділах етанол в дозі 1г/кг не змінював активність ВПП щодо контролю.
У дозі 4г/кг в проеструсе етанол викликав зниження активності в гіпофізі через 0,5 години і в наднирниках через 4 години на 32% і 48% відповідно в порівнянні з контрольною групою щурів. У яєчниках через
4 години після ін'єкції етанолу активність ферменту становила 174% по відношенню до контрольної групи.
На стадії проеструса достовірний вплив різних доз етанолу виявлено у надниркових і яєчниках через 4 години після наданого впливу: етанол в дозі 1 г / кг не змінював активність ВПП в порівнянні з контролем, проте в дозі 4 г / кг в наднирниках зменшував, а в яєчниках збільшував активність ферменту.
Слід зазначити, що в проеструсе введення етанолу в дозі 1 г / кг та 4 г / кг не впливало на активність ВПП у гіпоталамусі і стріатумі через всі досліджені проміжки часу.
Згідно з результатами дисперсійного аналізу активність ВПП у проеструсе не залежала від часу. Однак у гіпофізі ін'єкція фізрозчину або етанолу приводила до зниження активності ферменту через 0,5 і 4 години порівняно з нормою (табл. 3).
У стадії еструса етанол в дозі 1 г / кг через 0,5 години після ін'єкції збільшував активність ВПП у всіх досліджених органах, крім яєчників: у гіпофізі на 162%, в гіпоталамусі на 39%, в стріатумі на 29% і в наднирниках на 106 % в порівнянні з контрольною групою тварин. У гіпофізі активність ВПП підвищувалася і через інші досліджені проміжки часу: через 4 і 18 годин на 92% і 30% відповідно по відношенню до контролю. У той же час в стріатумі через 4 години після внутрішньочеревно введення етилового спирту в дозі 1 г / кг активність ферменту щодо контрольної групи зменшилася на 19%. У наднирниках через 18 годин після ін'єкції етанолу в дозі 1 г / кг активність ВПП була вище на 44%, ніж у контрольній групі тварин.
На стадії еструса через 0,5 і 18 годин після введення етанолу в дозі 4 г / кг в жодному органі активність ферменту не відрізнялася від контрольних
Таблиця 3. Дисперсійний аналіз вплив часу на активність карбоксипептидази Н в проеструсе (значення відносини Фішера F Ф і бали експериментальних (тимчасових) підгруп).
Відділ | Вплив | ф F ф | Норма | Тимчасові підгрупи | |
0,5 ч. | 4 ч. | ||||
Гіпофіз | Физраствор | 10,88 *** | 2 | 1 | 1 |
Етанол 1г/кг | 17,14 *** | 2 | 1 | 1 | |
Етанол 4 г / кг | 12,71 *** | 2 | 1 | 1 | |
Гіпоталамус | Физраствор | 1,12 | - | - | - |
Етанол 1г/кг | 0,36 | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 1,07 | - | - | - | |
Стріатум | Физраствор | 1,10 | - | - | - |
Етанол 1г/кг | 0,12 | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 0,97 | - | - | - | |
Наднирники | Физраствор | 3,80 * | 1 | 1 | 1 |
Етанол 1г/кг | 0,94 | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 3,63 | - | - | - | |
Яєчники | Физраствор | 1,55 | - | - | - |
Етанол 1г/кг | 2,71 | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 1,66 | - | - | - |
величин, крім яєчників, де через 18 годин після впливу активність ВПП зменшилася в 2,6 рази. У гіпоталамусі і стріатумі через 4 години після впливу етанолу в дозі 4 г / кг активність ферменту була нижчою на 24% і 52% відповідно по відношенню до контрольних самкам.
Статистично значущі відмінності у впливі різних доз етанолу на активність ВПП на стадії еструса виявлені в гіпофізі через 0,5 години, в гіпофізі, гіпоталамусі і стріатумі через 4 години, а також у надниркових і яєчниках через 18 годин після внутрішньочеревно ін'єкції алкоголю. При цьому етанол в дозі 1 г / кг підвищував активність ВПП у гіпофізі та надниркових, але не впливав на активність у дозі 4 г / кг у порівнянні з контролем. У гіпоталамусі і яєчниках менша доза алкоголю не викликала змін, а велика приводила до зниження активності ВПП. У стріатумі при введенні етанолу в дозі 4 г / кг активність ферменту була нижчою, ніж при введенні етанолу в дозі 1 г / кг у порівнянні з контрольною групою тварин. Відмінності у впливі двох доз етанолу, можливо, пов'язані зі специфікою дії великих і малих доз етанолу [19].
Активність ВПП у еструс залежала від часу при введенні фізіологічного розчину в гіпофізі і гіпоталамусі, а при введенні етанолу в дозі 1г/кг - в гіпоталамусі і надниркових і при ін'єкції етанолу в дозі 4 г / кг, як і у випадку з фізіологічним розчином - в гіпофізі і гіпоталамусі (табл.4).
При цьому в контрольній групі тварин активність ферменту в гіпофізі через 0,5 і 4 години була вище в порівнянні з нормою, а через 18 годин поверталася до вихідного рівня. У той же час при введенні етанолу в дозі 1 г / кг залежність від часу після ін'єкції не спостерігалася і активність ВПП достовірно не відрізнялася від норми. При введенні етанолу в дозі 4 г / кг активність ферменту мала тенденцію до зниження до 4 годин, до 18-ї години спостерігалося підвищення активності ферменту.
У гіпоталамусі на стадії еструса введення фізіологічного розчину призводило до поступового збільшення активності ВПП при переході від 0,5 години до 18-ї години, при введенні етанолу в дозі 4 г / кг через 0,5 години спостерігалося підвищення активності ферменту, до 4 годин активність знижувалася і поверталася до рівня, характерного для інтактних щурів через 18 годин, подібна тенденція спостерігалася і при введенні етанолу в дозі 1 г / кг.
У наднирниках вплив часу на активність ВПП спостерігається тільки при введенні етанолу в дозі 1 г / кг.
Таблиця 4. Дисперсійний аналіз вплив часу на активність карбоксипептидази Н в еструс (значення відносини Фішера F Ф і бали експериментальних (тимчасових) підгруп).
Відділ | Вплив | ф F ф | Норма | Тимчасові підгрупи | ||
0,5 ч. | 4 ч. | 18 ч. | ||||
Гіпофіз | Физраствор | 12,47 *** | 2 | 1 | 1 | 2 |
Етанол 1г/кг | 2,58 | - | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 7,17 ** | 2,5 | 1,5 | 1 | 3 | |
Гіпоталамус | Физраствор | 3,67 *** | 1,5 | 1 | 1,5 | 2 |
Етанол 1г/кг | 6,16 ** | 1 | 2 | 1 | 1,5 | |
Етанол 4 г / кг | 3,92 * | 1,5 | 2 | 1 | 1,5 | |
Стріатум | Физраствор | 3,26 * | 1 | 1 | 1 | 1 |
Етанол 1г/кг | 0,93 | - | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 3,03 | - | - | - | - | |
Наднирники | Физраствор | 3,01 | - | - | - | - |
Етанол 1г/кг | 7,95 ** | 1 | 1,5 | 1 | 2 | |
Етанол 4 г / кг | 0,60 | - | - | - | - | |
Яєчники | Физраствор | 1,07 | - | - | - | - |
Етанол 1г/кг | 0,42 | - | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 1,61 | - | - | - | - |
При порівнянні активності ВПП на різних стадіях естрального циклу при введенні етанолу було виявлено, що активність ферменту в гіпофізі через 0,5 години і гіпоталамусі через 4 години після ін'єкції етанолу в дозі 1г/кг достовірно вище в еструс, в порівнянні з діеструсом і проеструсом , крім того, в діеструсе вона вища, ніж у проеструсе. У гіпоталамусі через 0,5 години і гіпофізі через 4 години активність ферменту на стадії еструса і діеструса достовірно вище, ніж у проеструсе, а в наднирниках через 0,5 години після ін'єкції етанолу в дозі 1 г / кг вище в еструс по відношенню до проеструсу . У стріатумі і яєчниках активність ферменту при введенні етанолу в дозі 1 г / кг не змінювалася в залежності від стадії естрального циклу. У гіпофізі та гіпоталамусі через 18 годин після введення етанолу в кількості 1 г / кг активність ВПП була вище в еструс, ніж у діеструсе.
Через 0,5 години після ін'єкції етанолу в дозі 4 г / кг активність у гіпофізі і яєчниках на стадії діеструса була достовірно вище, ніж у еструс і проеструсе, але не відрізнялася вірогідно між останніми двома стадіями, а через 4 години на цих відділах висока активність ВПП була на стадії проеструса і низька в еструс і діеструсе. При введенні етанолу в дозі 4 г / кг в наднирниках активність ВПП у діеструсе і еструс була вищою, ніж у проеструсе. У гіпоталамусі через 18 годин після дії етанолу в дозі 4 г / кг актівнсть ВПП у еструс була достовірно більше в порівнянні з діеструсом.
Таким чином, гостра алкогольна інтоксикація призводить до существеннному зміни активності ВПП у тканинах самок, причому в більшості випадків активність ферменту збільшувалась, що узгоджується з даними, отриманими іншими дослідниками на самцях [14, 25, 26]. Найбільш істотні зміни змінювалася активність ферменту в гіпофізі і яєчниках. У ряді випадків активність ВПП залежала від дози введеного етанолу, причому ін'єкції етанолу в дозі 1 г / кг та 4 г / кг можуть надавати як подібне, так і різноспрямований вплив на активність ферменту в досліджуваних відділах. Залежність активності ВПП від часу знаходять у гіпофізі на всіх стадіях естрального циклу, в гіпоталамусі на стадії діеструса і еструса, а на останній стадії і в наднирниках, але тільки при введенні фізіологічного розчину. При ін'єкціях етанолу спостерігалася залежність активності ВПП від стадії естрального циклу у всіх досліджених відділах, причому, як правило, активність ферменту на стадії діеструса і еструса вище, ніж у проеструсе. Таким чином, внутрішньоочеревинне введення етанолу призводить до зміни активності ВПП на різних стадіях естрального циклу в порівнянні з інтактною і контрольною групами тварин, що, можливо, є одним з патогенетичних факторів алкоголізму і, ймовірно, може призводити до порушення нормального дозрівання фолікулів яєчника, до неадекватного протіканню фаз статевого циклу, ановуляції [2, 73].
3.1.2. Вивчення активності ФМСФ-інгібіруемой карбоксипептидази в тканинах самок щурів на різних стадіях естрального циклу
а) Розподіл активності ФМСФ-інгібіруемой карбоксипептидази в тканинах інтактних самок щурів
У ході проведення експерименту достовірне зміна активності ФМСФ-КП виявлено тільки в яєчниках. У цьому органі активність ферменту на стадії проеструса і еструса була в 1,7 і 1,9 рази відповідно вище в порівнянні з діеструсом (табл.5).
Наявність залежності активності ФМСФ-КП від стадії естрального циклу в яєчниках дозволяє припустити, що, ймовірно, вона, поряд з ВПП, може залучатися в циклічні зміни рівня біологічно активних пептидів у цьому органі, а також у процеси розвитку фолікула і жовтого тіла.
Таблиця 5. Активність ФМСФ-КП на різних стадіях естрального циклу в нормі (нмоль продукту, що утворився за 1 хв інкубації на 1 мг білка, M ± m, n = 6 ¸ 8).
Відділ | Стадія естрального циклу | ||
Діеструс | Проеструс | Еструс | |
Гіпофіз | 0,647 ± 0,087 | 0,529 ± 0,031 | 0,624 ± 0,064 |
Гіпоталамус | 0,218 ± 0,026 | 0,200 ± 0,030 | 0,216 ± 0,016 |
Стріатум | 0,170 ± 0,024 | 0,199 ± 0,011 | 0,218 ± 0,028 |
Наднирники | 0,810 ± 0,091 | 1,005 ± 0,079 | 1,069 ± 0,188 |
Яєчники | 0,258 ± 0,035 ^ ^ | 0,436 ± 0,034 | 0,481 ± 0,046 << |
б) Активність ФМСФ-КП при введенні фізіологічного розчину в тканинах самок
На стадії діеструса в гіпофізі через 4 після введення фізрозчину активність ФМСФ-КП зменшувалася на 46% в порівнянні з інтактними тваринами. У стріатумі через 0,5 години після впливу активність ферменту була вищою на 31%, ніж у нормі. У наднирниках через 0,5 і 18 годин після введення фізіологічного розчину спостерігалося підвищення активності ферменту на 70% і 50% відповідно. У яєчниках через усі досліджувані інтервали часу активність ФМСФ-КП була збільшена: через 0,5 години в 2,9 рази, через 4 години в 4,1 рази, через 18 годин в 8,5 разів у порівнянні з інтактними самками. У гіпоталамусі відмінностей від норми після введення фізрозчину не виявлено (рис. 2).
не изменяла активность ФМСФ-КП.
На стадії проеструса в гіпофізі, гіпоталамусі і наднирниках ін'єкція ізотонічного розчину NaCl не змінювала активність ФМСФ-КП. У стріатумі через 0,5 і 4 години відзначено зниження активності ФМСФ-КП на 24% і 28% відповідно, а в яєчниках збільшення активності ферменту через ті ж проміжки часу в 4,2 і 3 рази відповідно по відношенню до інтактним щурам.На стадії еструса в гіпофізі активність ФМСФ-КП після введення фізіологічного розчину зменшувалася через 0,5 і 18 годин на 32% і 45% відповідно в порівнянні з нормою. У гіпоталамусі і стріатумі зниження активності відбувалося тільки через 18 годин після ін'єкції фізрозчину на 25% і 33% відповідно. У яєчниках через 0,5 години після введення фізіологічного розчину активність ФМСФ-КП не відрізнялася від норми, через 4 години була вище на 339%, а через 18 годин нижче на 35% в порівнянні з нормою. У наднирниках введення фізіологічного розчину не впливало на активність ФМСФ-КП.
Порівняння активності ФМСФ-КП на різних стадіях естрального циклу при введенні фізіологічного розчину виявило, що в гіпофізі через 4 години після ін'єкції активність ферменту на стадії еструса достовірно вище, ніж у діеструсе, через 18 годин після впливу співвідношення активностей ФМСФ-КП на цих стадіях змінюється на протилежне.
У гіпоталамусі і наднирниках через 0,5 години після внутрішньочеревно введення фізіологічного розчину активність у ферменту в еструс і проеструсе нижче, ніж у діеструсе; через 4 години спостерігається більш висока активність у еструс в порівнянні з проеструсом, а через 18 годин на стадії еструса вона нижча , ніж у діеструсе.
У стріатумі через 0,5 години на еструс і діеструсе активність ФМСФ-КП була більш високою, ніж у проеструсе. Через 4 години після внутрішньочеревно ін'єкції активність ферменту зменшувалася в ряді: еструс-діеструс-проеструс. активность ФМСФ-КП в эструсе была выше по сравнению с диэструсом и проэструсом.
У наднирниках через 4 години після введення ізотонічного розчину NaCl активність ФМСФ-КП в еструс була вищою порівняно з діеструсом і проеструсом. У яєчниках через 0,5 після ін'єкції фізрозчину найбільш висока активність ферменту спостерігалась у проеструсе, найнижча - у еструс і була проміжної за своїм значенням в діеструсе, через 4 години на еструс фермент був більш активний, ніж у проеструсе, де в свою чергу активність ферменту була вищою, ніж у діеструсе. Через 18 годин після внутрішньочеревно введення фізіологічного розчину в яєчниках активність ФМСФ-КП в еструс була нижчою в порівнянні з діеструсом.Таким чином, ін'єкція фізрозчину викликає зміну активності ФМСФ-КП у всіх досліджуваних відділах і призводить до появи залежності активності ферменту від стадії естрального циклу в гіпофізі, гіпоталамусі, стріатумі, наднирниках, чого не спостерігалося у інтактних щурів, що, по-відімомому, призводить до зміни співвідношення різних нейропептидів на різних стадіях естрального циклу і призводить до порушення овуляції і іншим аномалій у функціонуванні статевої системи [2, 73].
в) Дослідження активності ФМСФ-інгібіруемой карбоксипептидази при введенні етанолу в тканинах самок щурів
У діеструсе при введенні етанолу в дозі 1 г / кг активність ферменту зростала в гіпофізі і яєчниках через 0,5 години на 55% і 252%, через 4 години на 116% і 89% відповідно, але не відрізнялася від контролю через 18 годин. В інших досліджених органах активність ФМСФ-КП збільшувалася тільки через 4 години після ін'єкції етилового спирту в дозі 1г/кг: у гіпоталамусі на 36%, в стріатумі на 26% і в наднирниках на 55% в порівнянні з контрольною групою тварин (рис.2 ).
На стадії діеструса при введенні етанолу в дозі 4 г / кг через 4 години активність ФМСФ-КП була вище, ніж в контролі в гіпофізі на 128%, в гіпоталамусі на 46%. Через 18 годин після введення етанолу в дозі 4 г / кг активність ферменту знижувалася в гіпофізі на 50%, в гіпоталамусі на 38% по відношенню до контрольних самкам. У яєчниках спостерігається поступове зниження активності ФМСФ-КП у часі: через 0,5 години активність ферменту вище контрольних значень в 4,4 рази, через 4 години в 1,5 рази, а через 18 годин нижче контролю в 9,5 разів.
Варто відзначити, що введення етанолу в дозі 4 г / кг в діеструсе не приводило до зміни активності ФМСФ-КП в стріатумі і наднирниках через всі досліджені проміжки часу.
Таким чином, на стадії діеструса найбільш суттєві зміни в активності ферменту спостерігалися в яєчниках.
Достовірні відмінності у впливі різних доз спирту на активність ФМСФ-КП виявлені в гіпофізі через 0,5 години, в стріатумі через 0,5 і 4 години, в гіпоталамусі і яєчниках через 18 годин після ін'єкції. При цьому етанол в дозі 1 г / кг в гіпофізі і стріатумі через 4 години активував ФМСФ-КП, але не змінював активність ферменту при введенні етанолу в дозі 4 г / кг у порівнянні з контрольними тваринами. У стріатумі велика доза етанолу через 0,5 години після впливу сильніше активувала фермент, чим менша. У гіпоталамусі при введенні етанолу в дозі 1 г / кг не було виявлено зміни активності, однак при збільшенні дозування етилового спирту спостерігалося зменшення активності ФМСФ-КП по відношенню до контрольних самкам. Після введення етанолу в дозі 1 г / кг активність ФМСФ-КП в яєчниках не відрізнялася від контролю, але була в 7,8 рази вище в порівнянні з активністю ферменту при введенні етанолу в дозі 4 г / кг.
Таким чином, на стадії діеструса етанол в дозі 1 г / кг підвищував або не чинив впливу на активність ферменту, а в дозі 4г/кг надавав різноспрямований вплив.
Результати дисперсійного аналізу впливу часу на активність ФМСФ-КП в діеструсе виявили, що активність залежала від часу при введенні фізіологічного розчину і етанолу в дозі 4г/кг в гіпофізі і гіпоталамусі (табл.6). У стріатумі впливу часу на активність ферменту не виявлено. У наднирниках залежність від часу після введення розчинів етилового спирту і хлориду натрію виявилася схожою: при введенні фізрозчину активність збільшувалася до 0,5 години, трохи знижувалася до 4 годин і в інтервалі 4 -18 годин достовірно не змінювалася, у разі введення етанолу зниження спостерігалося при переході до 18-ї години. У яєчниках введення фізрозчину викликало поступове збільшення активності ФМСФ-КП; через 0,5 години після ін'єкції етанолу в дозі 1 г / кг активність ферменту увелічічалась і залишалася на цьому рівні аж до 18 годин. Введення етанолу в дозі 4 г / кг призводило до того, що активність ферменту в яєчниках різко збільшувалася через 0,5 години, а потім поступово знижувалася, досягаючи до 18-ї години вихідного рівня.
У проеструсе етанол в дозі 1 г / кг не викликав змін в активності ФМСФ-КП в гіпофізі і яєчниках.
Таблиця 6. Дисперсійний аналіз вплив часу на активність ФМСФ-КП в діеструсе (значення відносини Фішера F Ф і бали експериментальних (тимчасових) підгруп).
Відділ | Вплив | ф F ф | Норма | Тимчасові підгрупи | ||
0,5 ч. | 4 ч. | 18 ч. | ||||
Гіпофіз | Физраствор | 4,43 * | 1,5 | 1,5 | 1 | 2 |
Етанол 1г/кг | 0,69 | - | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 3,40 * | 1,5 | 1,5 | 2 | 1 | |
Гіпоталамус | Физраствор | 4,74 * | 1,5 | 2 | 1 | 1,5 |
Етанол 1г/кг | 1,38 | - | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 4,65 * | 1,5 | 2 | 2 | 1 | |
Стріатум | Физраствор | 1,54 | - | - | - | - |
Етанол 1г/кг | 2,39 | - | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 2,71 | - | - | - | - | |
Наднирники | Физраствор | 4,49 * | 1 | 2 | 1,5 | 1,5 |
Етанол 1г/кг | 6,19 ** | 1 | 2 | 2 | 1,5 | |
Етанол 4 г / кг | 6,14 ** | 1 | 2 | 2 | 1,5 | |
Яєчники | Физраствор | 22,24 *** | 1 | 1,5 | 2 | 3 |
Етанол 1г/кг | 16,74 *** | 1 | 2 | 2 | 2 | |
Етанол 4 г / кг | 63,60 *** | 1 | 3 | 2 | 1 |
У гіпоталамусі і стріатумі через 4 години після ін'єкції етанолу в дозі 1 г / кг активність ферменту була на 24% і 36% вище, якщо доза етанолу становила 4 г / кг, то активність ферменту була на 52% і 61% відповідно вище в порівнянні з контрольною групою тварин.
На стадії проеструса в наднирниках через 0,5 години після введення етанолу в дозі 1 г / кг активність ферменту була на 25%, а через 4 години на 19% вище, ніж у контролі. Підвищення активності ФМСФ-КП узгоджується з даними про збільшення синтезу і секреції енкефалінів, β-ендорфіну, АКТГ, пролактину при гострій алкгольной інтоксикації [94, 158, 241] і дозволяє припустить причетність цього ферменту до процесингу регуляторних пептидів.
Етанол в дозі 4 г / кг знижував активність ферменту щодо контрольної групи в гіпофізі, надниркових і яєчниках через 0,5 години в 2,2, 1,9 і 5,5 разів відповідно. У гіпоталамусі, стріатумі і яєчниках при введенні етанолу в дозі 4 г / кг через 4 години спостерігалася активація ФМСФ-КП на 52%, 61% і 63% відповідно по відношенню до контрольної групи.
Таким чином, на стадії проеструса при введенні етанолу в дозі 1 г / кг найбільш суттєві зміни в активності ФМСФ-КП відбувалися в стріатумі, а при введенні етанолу в дозі 4 г / кг - в яєчниках. Крім того, етанол в більшій дозі викликав більш значимі зрушення в активності ферменту, що узгоджується з мембранотропних ефектом етанолу, сила якого збільшується зі зростанням концентрації алкоголю [10,19, 88].
У проеструсе виявлено достовірну відмінність у дії, який чинять різні дози алкоголю: в гіпоталамусі через 4 години після ін'єкції етанолу в дозі 4 г / кг ФМСФ-КП активується сильніше, ніж при ін'єкції етанолу в дозі 1 г / кг. Крім того, в яєчниках через 0,5 години під впливом етанолу в дозі 4 г / кг активність ферменту зменшувалася, а при внутрішньочеревно ін'єкції етанолу в дозі 1 г / кг не відрізнялася від контрольних значень; через 4 години після впливу етанолу в дозі 4 г / кг спостерігалося збільшення активності ферменту, а при введенні етанолу в дозі 1 г / кг відмінностей від контролю зафіксовано не було.
Згідно з результатами дисперсійного аналізу в проеструсе залежність активності ФМСФ-КП від часу після впливу в гіпофізі і наднирниках спостерігається тільки при введенні етанолу в дозі 4 г / кг (табл. 7). У гіпоталамусі на стадії проеструса активність ферменту не залежала від часу. У стріатумі залежність виявлена тільки при введенні фізіологіческго розчину (активність ФМСФ-КП з часом зменшується), тоді як у яєчниках активність ферменту
Таблиця 7. Дисперсійний аналіз вплив часу на активність ФМСФ-КП в проеструсе (значення відносини Фішера F Ф і бали експериментальних (тимчасових) підгруп).
Відділ | Вплив | ф F ф | Норма | Тимчасові підгрупи | |
0,5 ч. | 4 ч. | ||||
Гіпофіз | Физраствор | 1,41 | - | - | - |
Етанол 1г/кг | 3,18 | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 6,03 * | 2 | 1 | 1,5 | |
Гіпоталамус | Физраствор | 1,19 | - | - | - |
Етанол 1г/кг | 0,25 | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 1,06 | - | - | - | |
Стріатум | Физраствор | 5,40 * | 2 | 1,5 | 1 |
Етанол 1г/кг | 0,15 | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 0,93 | - | - | - | |
Наднирники | Физраствор | 1,21 | - | - | - |
Етанол 1г/кг | 1,23 | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 9,05 ** | 2 | 1 | 2 | |
Яєчники | Физраствор | 28,41 *** | 1 | 2 | 2 |
Етанол 1г/кг | 7,73 | 1 | 2 | 1,5 | |
Етанол 4 г / кг | 41,96 *** | 1 | 1 | 2 |
змінювалася з плином часу при введенні як фізрозчину, так і розчинів етилового спирту.
На стадії еструса після ін'єкції етанолу в дозі 1 г / кг активність ФМСФ-КП в гіпофізі була вищою, ніж у контрольній групі тварин через 0,5 і 4 години на 61%, а через 18 годин на 133%. Через 0,5 і 18 годин після введення етанолу в дозі 1 г / кг активність ферменту більше, ніж у контролі: у наднирниках на 47% і 78%, а в яєчниках у 5,2 і 5,1 рази відповідно. У гіпоталамусі активність ФМСФ-КП зростає через 4 і 18 годин після ін'єкції алкоголю в дозі 1 г / кг на 35% і 68% відповідно.
У еструс введення етанолу в дозі 4 г / кг не змінювало активність ФМСФ-КП в гіпофізі через 0,5 години після ін'єкції, зменшувало активність ферменту через 4 години на 25% і підвищувало через 18 годин на 124% по відношенню до контрольної групи тварин. У гіпоталамусі під дією тієї ж дози етанолу активність ферменту збільшувалася тільки через 18 годин після наданого впливу на 82%. -образную зависимость от времени после введения этанола (доза 4 г на кг): повышение активности через 0,5 часа на 66% и 25% и через 18 часов на 82% и 58% и снижение активности через 4 часа на 46% и 28% соответственно по отношению к контрольным крысам.
У стріатумі і наднирниках активність ФМСФ-КП мала U-образну залежність від часу після введення етанолу (доза 4 г на кг): підвищення активності через 0,5 години на 66% і 25% і через 18 годин на 82% і 58% і зниження активності через 4 години на 46% і 28% відповідно по відношенню до контрольних щурам. У яєчниках через 0,5 години після ін'єкції етанолу в дозі 4 г / кг активність ФМСФ-КП знижувалася на 36%, через 4 години не було достовірних відмінностей, а через 18 годин - підвищення активності в 5,8 рази в порівнянні з контролем.Таким чином, на стадії еструса при введенні етанолу найбільш суттєві зміни в активності ФМСФ-КП відбувалися в гіпофізі і яєчниках.
Виявлені статистично значущі відмінності у впливі різних доз етанолу. Так у гіпофізі алкоголь у дозі 1 г / кг через 0,5 і 4 години після ін'єкції підвищував активність ФМСФ-КП, а в дозі 4 г / кг, навпаки, знижував в порівнянні з контрольною групою тварин. У гіпоталамусі через 4 години після внутрішньочеревно введення етанолу менша доза викликала активацію ферменту на відміну від більшої, під дією якої активність по відношенню до контролю не змінювалася. У стріатумі і наднирниках дві дози етанолу також надавали різний вплив: при введенні етанолу в дозі 1 г / кг через 4 години не було змін в активності ФМСФ-КП, в той час як його ін'єкція в дозі 4 г / кг викликала зниження активності ферменту.
Таким чином, в еструс, також як і на стадії діеструса, введення етанолу в меншій дозі або не викликало змін в активності ФМСФ-КП, або призводило до її збільшення, в той час як ін'єкція більшої дози могла приводити і до зниження активності ферменту.
Дисперсійний аналіз впливу часу після ін'єкції при введенні фізіологічного розчину і різних доз етанолу на стадії еструса показав, що в гіпофізі і стріатумі залежність від часу виявлялася при ін'єкції фізіологічного розчину і етанолу в дозі 4 г / кг, однак активність ФМСФ-КП не залежала від часу після введення етанолу в дозі 1 г / кг (табл.8).
Таблиця 8. Дисперсійний аналіз вплив часу на активність ФМСФ-КП в еструс (значення відносини Фішера F Ф і бали експериментальних (тимчасових) підгруп).
Відділ | Вплив | ф F ф | Норма | Тимчасові підгрупи | ||
0,5 ч. | 4 ч. | 18 ч. | ||||
Гіпофіз | Физраствор | 3,72 * | 2 | 1,5 | 1,5 | 1 |
Етанол 1г/кг | 1,23 | - | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 6,86 ** | 1,5 | 1 | 1 | 2 | |
Гіпоталамус | Физраствор | 1,49 | - | - | - | - |
Етанол 1г/кг | 3,80 * | 1 | 1,5 | 1,5 | 2 | |
Етанол 4 г / кг | 3,14 | - | - | - | - | |
Стріатум | Физраствор | 4,43 * | 1,5 | 1,5 | 2 | 1 |
Етанол 1г/кг | 0,37 | - | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 4,83 * | 1,5 | 2 | 1 | 1,5 | |
Наднирники | Физраствор | 2,59 | - | - | - | - |
Етанол 1г/кг | 1,89 | - | - | - | - | |
Етанол 4 г / кг | 1,21 | - | - | - | - | |
Яєчники | Физраствор | 21,20 *** | 1 | 1 | 2 | 1 |
Етанол 1г/кг | 44,49 *** | 1 | 3 | 3 | 2 | |
Етанол 4 г / кг |
31,85 ***
1
1
2
2