Основні підходи до первинної обробки біологічної сировини. Методи гомогенізації

Схеми виділення цільового продукту в біотехнологічному виробництві істотно різняться залежно від того, накопичується продукт у клітці або він виділяється в культуральну рідину, або ж продуктом є сама клітинна маса (загальна схема виділення на рис 1). Найбільш складно виділення продукту, що накопичується в клітинах. Для цього клітини необхідно відокремити від культуральної рідини, зруйнувати (дезінтегрувати) і далі цільовий продукт очистити від маси компонентів зруйнованих клітин. Виділення продукту полегшується, якщо він вивільняється (екскретується) продуцентом в культуральну рідину.

Культура клітин

Біомаса

Культуральна рідина

Гомогенат клітин

Цільовий продукт

Активні фракції

Попередня обробка
сепарація
дезінтеграція
екстракція
екстракція, хроматограція, центрифугування
хроматограція, центрифугування,
електрофорез
Малюнок 1. Загальна схема виділення БАС на заключній стадії біотехнологічного виробництва.
Одним з перших етапів на шляху до очищення цільового продукту є поділ культуральної рідини і біомаси - сепарація. Іноді сепарації передує спеціальна обробка культури - зміна рН, нагрівання, додавання коагулянтів білків. Існують різні методи сепарації (флотація, центрафугірованіе, фільтрування), які будуть детально розглянуті у відповідних розділах.
У даному розділі зупинимося на методах гомогенізації (дезінтеграції) клітин або інших зразків тваринного і рослинного походження.

1. Методи гомогенізації

Фізичні методи.
1. Розтирання з твердими матеріалами.
Метод полягає в розтиранні клітин з піском або абразивним порошком у ступці за допомогою маточки. Хороші результати дає продавлювання клітин, змішаних з абразивними частинками, через прес Хьюза. Модифікацією цього методу є продавлювання клітин при темепературе -25.
2. Руйнування клітин у рідких середовищах.
У цьому випадку руйнування відбувається або при обертанні лопатей або поршня (блендери), або при поступальному русі вгору і вниз поршня чи куль (гомогенізатори).
3. Руйнування клітин за допомогою високого тиску.
Застосовується в основному для руйнування мікробних клітин. Для цієї мети користуються спеціальними пресами, наприклад френч-прес. Руйнування клітин відбувається, коли клітинну суспензію під тиском продавлюють через вузький отвір.
4. Руйнування за допомогою ультразвуку.
5. Заморожування - відтавання.
6. Декомпресія.
Клітинну суспензію стискають, а потім різко скидають тиск.
Хімічні методи.
1. Додавання органічних розчинників.
Толуол, хлороформ, бензол
2. Осмотичним шоком.
Хіміко-ферментативні методи.
Додавання антибіотиків, переварювання клітинних стінок ферментами або складними ферментативними препаратами, виділеними з равликів.
Далі перейдемо до стадії отримання цільового продукту. Тут слід згадати три процеси, які часто є необхідними при отриманні цільового БАС: консервація, стабілізація продукту, модифікація продукту.
2. Консервація.
Зневоднення:
Повітряна сушка при підвищеній і нормальній температурі.
Сушіння у киплячому шарі.
Ліофілізація.
Заміна води на неводні розчинники (Гліцерин, зберігання штамів мікроорганізмів на твердих підкладках).
Заморожування, Добавка антибіотиків, Зміна рН, Зміна іонної сили
3. Стабілізація продукту.
Заходи, спрямовані на збереження властивостей продукту в період його зберігання та використання споживачем.
Зневоднення і сушка.
Додавання органічних розчинників.
Додавання неорганічних іонів Со, Mg, Na (для пектиназу)
Формалін (0,2% р-р для глюкоамілази)
Антибіотиків (низин для глюкоамілази)
Використання біотехнологічного процесу для стабілізації. Меланж, одержуваний з яєчних жовтків, - цінний харчовий продукт. Псування меланжу може бути відвернена, якщо з нього видалити вуглеводи. З цією метою на меланжу рекомендується вирощувати пропіонових бактерії, «відають» вуглеводи. Термін зберігання збільшується крім того, пропіонова бактерії підвищують поживну цінність меланжу, збагачуючи його органічними кислотами і вітаміном В12.
4. Модифікація продукту.
Модифікація необхідна, коли отримуємо лише «заготовку» цільового продукту.
Пеніцилін G, утворений Penicillin potatum, модифікують з метою отримання ампіциліну та інших напівсинтетичних пеніцилінів.
Додання продукту відповідної оптичної асиметрії, коли біооб'єкти (скажімо дріжджі) вибірково споживає один з ізомерів (наприклад, L-амінокислоти), і в середовищі залишається його оптичний антипод.
Отримання ряду ферментів, гормонів, коли, наприклад, у бичачого інсуліну «отстрігают» амінокислотні залишки, після чого він ставати ідентичним людському гормону.
Література: 1. Б. Вільямс, К. Уілсон / Методи практичної біохімії / Світ, 1975.
2. Н.С. Єгоров, А.В. Олескін, В.Д. Самуїлом / Біотехнологія. Проблеми і перспективи / книга 1, Вища школа, 1987.
3. Ю.І. Детнерскій / ПАХТ /, Т.2, стр272-274

Сепарація, осадження, екстракція

1. Флотація.
Якщо клітини продуцента в біореакторі через низьку змочуваності накопичуються в поверхневих шарах рідини. Флотатори різних конструкцій зціджують, відкачують або соскребают піну, що складається з бульбашок газу з прилиплими до них клітинами. Підвищення ефективності відбору біомаси у вигляді концентрованої суспензії досягається спінюванням рідини з подальшим відділенням її верхнього шару. Флотація широко використовують як перший етап відділення дріжджової маси для освітлення культуральної рідини.
2. Мембранні процеси.
Плівку можна розглядати як селективно-проникний бар'єр між двома гомогенними фазами. Перенесення через мембрану має місце при накладенні рушійної сили, що діє на компоненти. У більшості мембранних процесів рушійною силою є різниця тисків або концентрацій (активностей) по обидві сторони мембрани. Такі параметри, як тиск, концентрація (активність) або навіть температура, можна об'єднати в одному параметрі - хімічному потенціал . При постійній температурі хімічний потенціал i-го компонента в суміші задається як
m _i = m _i ⁰ + RT lna _i + V _i P
де m _i ⁰     хімічний потенціал 1 моля чистої речовини при тиску  Р  і температурі Т. Для чистих речовин активність дорівнює одиниці, але для рідких сумішей активність визначається виразом:
a _i = Х _i g _i
де Хi - мольна частка і g _{i i-коефіцієнт} активності.
Мембранні процеси можна класифікувати відповідно до рушійними силами процесу.

Таблиця 1. Рушійна сила в різних мембранних процесах.

Перепад тиску	Градієнт концентрації (активності)	Градієнт температури	Градієнт електричного потенціалу
Мікрофільтрація Ультрафільтрація Зворотний осмос Пьезодіаліз	Первапорация Газоразделеніе Діаліз Рідкі мембрани	Термоосмос Мембранна дистиляція	Електродіаліз Електроосмос

Мембранні матеріали:
Гідрофобні полімерні мембрани: політетрафторетилен (тефлон), полівінілденфторид, поліпропілен.
Гідрофільні полімерні мембрани: ефіри целюлози, полікарбонати, полісульфон, полиимид, аліфатичний поліамід.
Керамічні мембрани: оксид алюмінію, оксид цирконію
Таблиця 2. Основні параметри мембранних процесів і застосування.

Назва-ня про-цесу	Мембрани	Товщі-ну (мкм)	Розмір пор	Мембрани нние метаріа-ли	Рушійна сила процесу	Принцип поділу	Застосування
Мікро-фільт- рація	Асіммет-ковий або сіммет-ковий, пористі	10 - 150	0,05 - 10 мкм	Полімерні та керамічні	Тиск (<2 бар)	Ситової механізм	В аналітичних цілях, стерилізація (їжа, лікарські препарати), ультрачистої вода для напівпровідників, освітлення напоїв, концентрування клітин і мембранні біореактори (біотехнологія), плазмофорез (медицина)
Ультрафільтрація	Пористі асиметричні	150	1 - 100 нм	Гідрофільні полімерні і керамічні	Тиск (1 - 10 бар)	Ситової механізм	Молочна промисловість (обробка молока, сироватки, сироваріння), харчова промисловість (витяг крохмалю, білків), металургія (поділ емульсій масла у воді, витяг барвників), текстильна промисловість (витяг індиго), фармацевтична промисловість (витяг ферментів, антибіотиків і жарознижуючих препаратів) .
Зворотний осмос	Асиметричні або композиційні	Підкладка 150 мкм, верхній шар 1 мкм.	<2 нм	Триацетат целюлози, ароматичні поліаміди, поліуретанові ефіри	Тиск (15 - 20 бар) солонувата вода; (40 - 80 бар) морська вода	Розчинення - дифузія	Знесолення солонуватих вод і морської води, виробництво ультрачистої води (електронна промисловість), концентрування харчових соків і цукру (харчова промисловість), концентрування молока (молочна промисловість)
Пьезодіаліз	Мозаїчні мембрани з чергуванням катіонних і аніонообмінних областей	Кілька сотень мкм	непористі	Катіоно-аніонообмен-ні смоли	Тиск (до 100 бар)	Іонний транспорт	Концентрування солей.
Газоразделеніе	Композиційні або асиметричні з верхнім шаром з еластомеру або склоподібного полімеру	Підкладка 150 мкм, верхній шар 0,1 - 5 мкм.	Непористі або з порами <1 мкм	Еластоміри: полідиметилсилоксан, поліметілпентен. Стеклообразующие-ні поліме-ри: полиимид, полі-сульфон	Тиск над мембраною до 100 бар, або вакуум після мембрани	Механізм розчинення дифузії (непористі мембрани); Кнудсеновскій потік (пористі мембрани)	Витяг водню або гелію, СН4/СО2, Н2S

3. Центрифугування

Поділ речовин за допомогою центрифугування засноване на різній поведінці часток у відцентровому полі.
Швидкість седиментації залежить від відцентрового прискорення (G), прямо пропорційно кутовий швидкості ротора (w, радий * с-1) і відстані між часткою і віссю обертання (r, см):
G = w ² r.
При перерахуванні умов поділу часток вказують швидкість обертання і радіус обертання ротора, а також час центрифугування. Відцентрове прискорення звичайно виражають в одиницях g, розрахованих із середнього радіусу обертання (rсред) стовпчика рідини в центріфужний пробірки (тобто відстані від осі обертання до середини стовпчика рідини).
Швидкість седиментації сферіченскіх частинок залежить не тільки від відцентрового прискорення, але і від щільності і радіуса самих частинок і в'язкості середовища суспендированием. Час, необхідний для осадження сферичної частинки в рідкому середовищі від меніска рідини до дна центріфужний пробірки, обернено пропорційно швидкості седиментації і визначається наступним рівнянням:
t = 9 / 2 * h * (2 w ² r ² _год (r _ч-r)) * Ln (r _д / r _м),
де t - час седиментації, h - в'язкість середовища, Rч - радіус частинки, Rч-щільність частинки, r - щільність середовища, rд - відстань від осі обертання до меніска рідини, Rм - відстань від осі обертання до дна пробірки.
Діфферінціальное центрифугування. Цей метод заснований на відмінності в швидкості седиментації частинок, що відрізняються один від одного розмірами і щільністю. Розділяється матеріал центрифугують, осад відокремлюють від надосадової рідини, а надосадову рідину центрифугують при більшому відцентровому прискоренні.
Зонально - швидкісне центрифугування. Досліджуваний зразок нашаровується на поверхню розчину з безперервним градієнтом щільності. Потім центрифугують до тих пір, поки частки не розподіляться уздовж градієнта у вигляді дискретних зон або смуг.
Ізопікніческое центрифугування. Зразок нашаровується на поверхню розчину з безперервним градієнтом щільності, що охоплює діапазон щільності всіх компонентів суміші. Центрифугування проводять до тих пір, поки плавуча щільність часток не зрівняється з щільністю відповідних зон, тобто поки не відбудеться поділ часток по зонах.
Рівноважний центрифугування в градієнті щільності. Розчинена речовина і розчинник спочатку розподіляються по всьому об'єму рівномірно. У ході центрифугування встановлюється рівноважний розподіл концентрації, а отже, і щільності. Під дією відцентрового прискорення молекули речовини перерозподіляються, збираючись у вигляді окремої зони в частині пробірки з відповідною їм щільністю.
Для створення градієнтів щільності застосовуються розчини сахарози, важка вода, солі важких металів, наприклад рубідію або цезію.
Центрифуги.
Центрифуги загального призначення дають максимальну швидкість 6000 об / хв і Оцу до 6000g. У всіх центрифугах цього типу ротори жорстко кріпляться на валу приводу, і центрифужні пробірки разом з їх вмістом повинні бути ретельно врівноважені з точністю до 0,25 гр.
Швидкісні центрифуги дають граничну швидкість 25000 об / хв, Оцу до 89000g. Камера ротора оснащена системою охолодження, що запобігає нагрівання.
Ультрацентрифугу дають граничну швидкість до 75000 об / хв, Оцу до 510000g. Вони забезпечені як холодильником, так і вакуумною установкою. Ротори таких центрифуг виготовляють з високоміцних титанових сплавів. Для зменшення вібрацій ультрацентрифугу мають гнучкий вал. Центрифужні пробірки і їх вміст повинен бути урівноважене з точністю до 0,1 гр.
4. Осадження.
Глава методи осадження винесена для самостійної теоретичної опрацювання, а також детально розглядається в рамках малого практикуму.
5. Екстракція.
Мацерація - тверда речовина екстрагують багаторазово окремими порціями розчинника при кімнатній температурі.
Дігерірованіе - тверда речовина екстрагують окремими порціями розчинника при нагріванні. Подрібнене тверда речовина розмішують з розчинником і потім фільтрують чи декантіруют.д.ля більш повного вилучення операцію повторюють кілька разів, використовуючи невеликі порції свіжого розчинника.
Перколяції - безперервна екстракція. Найбільшу ефективність процесу забезпечує протиточний принцип. Він полягає в тому, що матеріал, що містить найбільше екстрагуються речовини, омивається найбільш концентрованим розчином, а екстрагований матеріал у верхніх шарах омивається чистим розчинником.
Перфорація - безперервна екстракція, якщо речовина добре розчинно у воді.
Розподіл розчиненої речовини між рідкими фазами визначається законом розподілу Нернста. Труднощі поділу визначається величиною b - фактором поділу. Обидві речовини можуть бути розділені задовільно якщо b> 100.
Вибір розчинників.
Взаємна розчинність фаз.
Розчинність даної речовини і селективність розчинника.
Стійкість речовини в розчині.
Чистота і стійкість розчинника.
Достатня відмінність щільності обох фаз (на 0,1 - 0,2).
Схильність до утворення емульсій.
Для руйнування емульсій спирт, ацетон, бензол, насичений розчин кухонної солі.
Безпека.
Легкість видалення розчинника з екстракту.
5.1. Надкритична екстракція (SFE).
SFE використовується для складних сумішей і розглядається як альтернатива Сокслетом.
Для екстракції застосовується вуглекислий газ. Параметри, які можна варіювати: щільність (тиск) СО2, температура, витрата, Передобробка зразків, збір фракцій і час екстракції.
Правила для зміни параметрів.
При збільшенні тиску і щільності збільшується екстрагуються здатність СО2.
Чим менше молекулярна вага речовини, тим менший тиск (щільність) потрібен для розчинення речовини і його екстракції.
Чим полярні речовини, тим вище має бути тиск.
З експериментальної практики відомо, що краще вибирати низьку температуру, високу щільність і низький тиск. Це забезпечить швидку і ефективну екстракцію.