Вивчення тривимірної структури за допомогою рентгенівської дифракції та реконструкції зображення

Кристали типу II утворюють білки фотосинтетичного реакційного центру Rhodopseudomonas . viridis. . Є дані, що близька до завершення робота по встановленню структури матриксних поріна з високою роздільною здатністю з зовнішньої мембрани Є. coli.

Отже, мембранні білки можна кристалізувати, і хоча число Успішних спроб поки невелике, можна зробити кілька висновків, що стосуються методології кристалізації.

1. Білки кристалізуються разом з миючим засобом.

2. Дуже важливий вибір детергенту. Мабуть, найбільш при-придатні цвіттеріонние або неіонні детергенти з високою ККМ і Малим розміром міцел.

Таблиця 1. Мембранні білки, які були закристалізованій

Кристалізація полегшується в присутності малих амфіфіли-них органічних молекул, мабуть впливають на полярні кінцеві групи детергенту. . viridis удалось закристаллизовать в присутствии 1,2,3-гептантриола. Так, білок реакційного центру R. Viridis вдалося закристалізувався у присутності 1,2,3-гептантріола.

Поліетиленгліколь і сульфат амонію, зазвичай використовуються при кристалізації розчинних білків, застосовувалися і для індукції кристалізації мембранних білків.

У роботі зазначалося, що умови кристалізації в деяких випадках близькі до умов, за яких детергент утворює окрему фазу. Роль, яку відіграє агрегація детергенту в процесі кристалізації білково-детергентних коміцелл, невідома, але очевидно, що правильний вибір детергенту дуже важливий.

2. Реконструкція зображення і двовимірні кристали

Тривимірні кристали мембранних білків отримати дуже важко, але багато хто з них утворюють двовимірні впорядковані структури. ,. У деяких випадках білки формують такі структури in vivo,. При підходячи-"щих умовах такі білки, як і багато інших, утворюють" двумер-'кристали "при їх очищення та реконструкції в присутності фос-фоліпідов. Подібні двовимірні впорядковані структури можна, використовувати для отримання тривимірної структурної інформації з, допомогою електронної мікроскопії і методів реконструкції зображення.

2.1 Реконструкція зображення

Ця методика початково призначалася для вивчення вірусних частинок, а до мембранних білків вона була вперше застосована Хендерсоном і Ануіном, що досліджували бактеріородопсин. У принципі цей метод дозволяє отримати структурну інформацію, достатню для того, щоб простежити хід поліпептидного ланцюга, але реалізувати цю можливість поки не вдалося. Розсіювання електронів достатньо великим для того, щоб візуалізувати окремі молекули за допомогою електронного мікроскопа. Проте інтенсивність пучка електронів, необхідна для цього, занадто велика, сам зразок при цьому руйнується, і для отримання високої дозвільної здатності доводиться використовувати набагато менші інтенсивності. У звичайній трансмісійної електронної мікроскопії для посилення контрасту використовується негативний контрастування, але воно непридатне для виявлення структурних деталей тих ділянок білка, які занурені в бішар, оскільки вони недоступні для барвника. Барвники рідко використовуються для реконструкції зображення; виняток становлять лише дослідження з візуалізації водних каналів.

Щоб отримати достатню інформацію за допомогою пучка електронів низької інтенсивності, необхідно підсумувати зображення багатьох молекул. Саме з цією метою використовують двовимірні впорядковані структури. Самі зображення представляють собою двовимірні проекції електронної щільності зразка. Провівши оцифровку цих зображень і застосувавши перетворення Фур'є, можна виявити елементи, що повторюються і усунути шуми. Ще раз застосувавши перетворення Фур'є до цих повторюваним елементам, реконструюють вихідне зображення, але вже без шумів. В основі процедури лежить вдалий прийом, що дозволяє підсумовувати зображення, отримані від сотень і тисяч молекул в полі зору мікроскопа.

Проекції електронної щільності в двох напрямках недостатні для побудови тривимірної структури. Тому, нахиляючи зразок, отримують проекції зразка під різними кутами і використовують їх для реконструкції тривимірного зображення об'єкта. Таким чином будують карту електронної щільності в мембрані на Різних рівнях. Зазвичай наводять дані про профіль електронної густини через кожні 15-25 А.

Таблиця 2. Мембранні білки, структуру яких визначали методом реконструкції зображення

У табл.2 наведено список білків, які були вивчені цим методом. У всіх випадках, крім бактериородопсина, рівень дозволу був достатній лише для окреслення загальних контурів молекул і визначення їх розмірів.

Проте навіть така інформація може бути дуже цінною. Наприклад, з'ясувалося, що багато з цих молекул у двовимірних кристалах існують у вигляді окремих мультімеров, а порін і бактеріородопсин є тримером.

. У разі поріна існує чітко спостерігається канал, в утворенні якого на зовнішній поверхні клітини бере участь кожен із трьох окремих поліпептидів; зливаючись, ці поліпептиди утворюють одиночний канал на періплазматіческой поверхні зовнішньої мембрани Є. coli.

Коннексін виглядає як гексамери, а ацетилхолінових рецепторів - як симетричний пентамер. Ферменти дихального ланцюга мітохондрій, убіхінолцітохром з-оксидоредуктаз і цитохромоксидази, є димерами, хоча неясно, чи існують ці димери in . vivo. Дивно, як сильно білки іноді виступають над поверхнею бішару.

Наприклад, окремі частини цитохром с-оксидази підносяться над поверхнею бішару на 50 А 1314, 466]; така ж картина спостерігається для ацетилхолінового рецептора. Навпаки, порін і бактеріородопсин майже не видаються над поверхнею мембран. На рис.3.3 представлена ​​структура цитохром с-оксидази, отримана з низьким дозволом.

2.2 Три приклади структурних досліджень мембранних білків

Розглянемо три приклади вивчення інтегральних мембранних білків, що ілюструють велика різноманітність використовуваних для цього методів. . viridis и R . sphaeroides , исследование которых с помощью рентгеновской дифракции было весьма успешным. Найбільш відомими структурами є реакційні центри R. Viridis і R. Sphaeroides, дослідження яких за допомогою рентгенівської дифракції був дуже успішним. ; для его исследования применялся метод реконструкции изображения, а также другие подходы. Ще один найбільш повно вивчена структура - бактеріородопсин Н. halobium; для його дослідження застосовувався метод реконструкції зображення, а також інші підходи. Порін і споріднені білки зовнішньої мембрани Є. соч вивчали в основному за допомогою генетичних і молекулярно-біологічних методів, що дозволяють ідентифікувати функціонально важливі ділянки.

3. Структура фотосинтетичних реакційних центрів ft. viridis і ft. sphaeroides

Фотосинтетичні реакційні центри представляють собою комплекси білків з пігментами; в них відбувається первинне розділення зарядів у фотосинтетичних мембранах. . Найкраще охарактеризовано комплекси з пурпурових несерних бактерій; вони зазвичай складаються з трьох білкових субодиниць - Н, М і L. Реакційний центр Rhodopseudomonas имеет также четвертую субъединицу - цитохром с-типа. viridis має також четверту субодиницю - цитохром с-типу. Простетичними групами цього комплексу є чотири гемогруппи, чотири бактериохлорофилла Ь, два бактеріофеофітіна, одне негемове залізо, один менахінон і один . убіхінон. Під дією світла електрон переходить від первинного донора електронів, так званої "спеціальної пари" - молекул бактериохлорофилла, що утворюють димер, до бактеріофеофітіну, а потім до первинного хінонову акцептору Q _A. в ходе реакции, при которой протоны поступают из раствора на восстановленный хинон. Qb Зрештою електрон відновлює вторинний акцептор Qb в ході реакції, при якій протони надходять з розчину на відновлений хинон. Qb знаходиться в рівновазі з хінони пулом в бі-шарі. Окислений первинний донор електронів, "спеціальна пара", відновлюється цитохромом с-типу. Оскільки цитохром і хинон розташовані на протилежних сторонах фотосинтетичної мембрани, світлозалежна електронний транспорт електроге-нен і генерує трансмембранну різницю потенціалів.

Сумарна мовляв. . viridis составляет примерно 150 ООО, а кажущаяся мол. маса реакційного центру з R. viridis становить приблизно 150 ТОВ, а уявна мовляв. маса субодиниць - 38 ТОВ, 35 ТОВ, 28 ТОВ та 24 ТОВ. субъединиц; об этом свидетельствуют данные о числе аминокислотных остатков в каждом полипептиде, полученные при секвенировании ДНК. Зауважимо, що електрофорез в ПААГ-ДСС дає неправильні молекулярні маси для Н, М і L субодиниць; про це свідчать дані про число амінокислотних залишків у кожному поліпептиди, отримані при секвенування ДНК. . N -диме-тилдодециламин-М-оксида и органического амфифильного соединения гептан-1,2,3-триола. Очищений комплекс був закристалізувався з використанням сульфату амонію як осаджуючої агента в присутності детергенту N. N-діметричній-тілдодеціламін-М-оксиду і органічного амфіфільних сполук гептан-1 ,2,3-триола. Кристали були достатньою мірою впорядковані і фотохімічно активні. Структура цього четирехсуб'едінічного білка була встановлена ​​з роздільною здатністю близько 3 А. Детергент в кристалах не впорядковано, тому неможливо точно визначити положення меж занурених у мембрану ділянок. . L - и М-субъединицы содержат по пять трансмембранных а-спиральных участков, а у Н-субъединицы такой участок только один. Розміри комплексу - 30 х 70 х 130 A. L - і М-субодиниці містять по п'ять трансмембранних а-спіральних ділянок, а у Н-субодиниці таку ділянку тільки один.

Отже, всі трансмембранні області цього білкового комплексу мають а-спіральну конфігурацію. Довжина кожного а-спірального сегмента становить приблизно 40 А, цього достатньо для перетину мембрани.

. viridis напоминает сэндвич. L - и М-субъединицы уложены одинаковым образом и расположены в центре сэндвича. Структура білкового комплексу з R. Viridis нагадує сендвіч. L - і М-субодиниці укладені однаковим чином і розташовані в центрі сендвіча. Вони перетинають бішар і пов'язані з усіма простетичними групами, за винятком гемов. и М, которые соединяют трансмембранные сегменты по обе стороны мембраны, участвуют в связывании цитохрома и Н-субъединиц. Сегменти L і М, які з'єднують трансмембранні сегменти по обидві сторони мембрани, беруть участь у зв'язуванні цитохрому і Н-субодиниць. Цитохром утворює "шапочку" на зовнішній поверхні бішару, а гідрофільна частина субодиниці Н - аналогічну структуру на цитоплазматичній поверхні. -конце Н-субъединицы контактирует с цитохромом на противоположной стороне мембраны. Трансмембранний а-спіраль на N-кінці Н-субодиниці контактує з цитохромом на протилежній стороні мембрани.

Ці міжмолекулярні взаємодії в кристалах здійснюються між ділянками Н-субодиниці та цитохромом, які в нормі контактують з водою. Можливо, ці два білки, що утворюють гідрофільні "шапочки", сприяють формуванню високоупорядоченних кристалів.

Відзначимо деякі важливі структурні особливості даного комплексу.

Всі 11 трансмембранних ділянок представляють собою а-спіралі, а амінокислоти в більшості своїй неполярні. -и М-субъединиц имеется последовательность длиной не менее 19 остатков, не содержащая никаких кислых или основных аминокислот. У кожній з трансмембранних спіралей L-та М-субодиниць є послідовність довжиною не менше 19 залишків, не містить жодних кислих чи основних амінокислот.

или М обычно антипараллельны своим соседям, но спирали сие параллельны друг другу. Трансмембранні спіралі в кожній з субодиниць L або М зазвичай антіпараллельни своїм сусідам, але спіралі це паралельні один одному. , которая наклонена к нормали под углом 38°. Нахил спіралей до нормалі до площини мембрани не перевищує 25 °, за винятком спіралі d, яка нахилена до нормалі під кутом 38 °. Довжина спіралей варіює від 24 до 30 залишків.

- и М-субъединиц, которые соединяют трансмембранные сегменты, образуют уплощенные структуры по обе стороны мембраны, которые могут контактировать с двумя гидрофильными субъединицами. Ті ділянки L - і М-субодиниць, які з'єднують трансмембранні сегменти, утворюють сплощені структури по обидві сторони мембрани, які можуть контактувати з двома гідрофільними субодиницями.

и М распределены асимметрично, так что полярные концы трансмембранных спиралей и соединяющие их участки заряжены более отрицательно на периплазматической стороне мембраны, чем на цитоплазматической. Заряджені амінокислоти в субодиниця L і М розподілені асиметрично, так що полярні кінці трансмембранних спіралей і з'єднують їх ділянки заряджені більш негативно на періплазматіческой стороні мембрани, ніж на цитоплазматичній. Це створює певні енергетичні вигоди, оскільки мембранний потенціал негативний на цитоплазматичній стороні.

Всі ці структурні дані цінні також в тому відношенні, що вони допомагають зрозуміти фотохімії цього важливого комплексу.

Хоча редокс-центри, мабуть, створюють два паралельних шляху переносу електронів від "спеціальної пари", ці дві гілки не ідентичні, і при переносі електронів через мембрану, ймовірно, використовується тільки одна з них. Фотосинтетичні пігменти жорстко фіксуються в певному місці за рахунок гідрофобних взаємодій і водневих зв'язків з білком і навряд чи переміщуються під час реакції.

Перенос електрона від "спеціальної пари" до бактеріофеофітіну відбувається дуже швидко; це узгоджується з тим, що беруть участь у процесі простетичні групи знаходяться один від одного на відстані вандерваальсового радіусу. Характерне час перенесення електрона від бактеріофеофітіна до Qa становить 230 пс, і центри цих двох груп розділені відстанню близько 14 А. Проте изопреноидной бічний ланцюг хінону безпосередньо контактує з бактеріофеофітіном.

Перенос електрона від цитохрому, що супроводжується відновленням спеціальної пари, відбувається повільно, за 270 не, відповідно до того, що центр найближчого гема розташований від центру спеціальної пари на відстані 21 А. З-за цього, зокрема, сповільнюється перенесення електрона.

может осуществляться при участии негемового железа, хотя оно, по-видимому, не является необходимым для этого процесса. Перенесення Q _A Qb може здійснюватися за участю негемового заліза, хоча воно, мабуть, не є необхідним для цього процесу. связывается слабо и утрачивается в процессе приготовления образца. Хінон Qb зв'язується слабо і втрачається в процесі приготування зразка. . Можливо, функціональна роль Н-субодиниці полягає у зв'язуванні Q _B.

, также установленная методом рентгеновской дифракции с разрешением 2,8 А, очень похожа на структуру реакционного центра R . viridis . Структура трехсуб'едінічного реакційного центру Rhodobacter sphaeroides, також встановлена ​​методом рентгенівської дифракції з роздільною здатністю 2,8 А, дуже схожа на структуру реакційного центру R. Viridis. Модельні дослідження дозволяють припустити, що негемове залізо і хінони розташовані на рівні полярних кінцевих груп фосфоліпідів всередині бішару, хоча вони повністю оточені білками. Спеціальна пара бактериохлорофилла знаходиться приблизно на 5 А нижче полярних ліпідних головок. Одинадцять трансмембранних спіралей упаковані так само щільно, як амінокислотні залишки всередині водорозчинних білків. Ті амінокислотні залишки в трансмембранному ділянці, які контактують з білком, зазвичай гідрофобні; така ж картина характерна і для відповідних амінокислот водорозчинних білків. Полярні зв'язку між трансмембранним спіралями вельми нечисленні. Трехсуб'едінічная структура стабілізується за рахунок:

1) взаємодії між експонованими назовні ділянками субодиниць;

2) сприятливих діпольдіпольних взаємодій між антипаралельними плотноупакованной а-спіралями;

3) вандерваальсових взаємодій між плотноупакованной спіралями;

- и е-спиралей L - и М-субъединиц. 4) зв'язування одного атома заліза з чотирма гистидинового залишками d - і е-спіралей L - і М-субодиниць. Відсутністю полярних взаємодій між трансмембранним спіралями цей комплекс відрізняється від більшості моделей бактериородопсина, обговорюваних в наступному розділі.

На закінчення відзначимо, що реакційні центри бактерій подібні з реакційними центрами фотосистеми II вищих організмів, які відповідальні за окислення води та виділення кисню. Він містить єдину ковалентно пов'язану простетичної групу ретиналь, яка за допомогою шіффова підстави приєднана до лізину-216. Цей білок виконує функцію фотохімічного протонного насоса, що створює різницю електрохімічного потенціалу протонів, яка потім використовується клітиною для транспорту розчинних речовин і синтезу АТР. При поглинанні ретиналь одного протона індукується ряд перетворень, в тому числі т /? анс-г/нс-ізомерізація по зв'язку С13-С14 ретиналя та депротонування азоту шіффова підстави; це призводить до електрогенному переносу одного або двох протонів з клітини назовні.

этот белок образует высокоупорядоченную двумерную кристаллическую решетку, для установления его трехмерной структуры можно использовать методы реконструкции изображения. Оскільки in situ цей білок утворює високоупорядоченную двовимірну кристалічну решітку, для встановлення його тривимірної структури можна використовувати методи реконструкції зображення. Білок має відносно малі розміри та виконує дуже важливу функцію протонного насоса, а за всіма перетвореннями ретиналя можна стежити оптичними методами. Все це стимулювало детальні дослідження механізму функціонування бактериородопсина. Фотохімічні властивості шіффова підстави ретиналя вивчені досить добре, проте як вони впливають на білок і що викликає переміщення протонів - невідомо. Структурні дані теж не пролили світло на механізм функціонування білка, хоча і були запропоновані моделі протонної "естафети" або ланцюжка трансмембранних водневих зв'язків. З іншого боку, функціонально-механістичні дослідження теж не дали ніяких вказівок, які допомогли б в інтерпретації структурних даних.

Структурний каркас бактериородопсина був побудований методом реконструкції зображення з використанням електронно-мікроскопічних даних; це випадок найбільш успішного застосування даного підходу. Карти електронної щільності дозволяють отримати дозвіл краще, ніж 3,7 А, в площині мембрани і близько 14 А в площині, перпендикулярної Біслі. На рис.3.7 представлені одна з карт електронної щільності і відповідна тривимірна модель. Білок складається з тримерів, при цьому кожен поліпептид постає у вигляді утворення з семи циліндрів, які пронизують мембрану і приблизно перпендикулярних її площині. Зазвичай вважають, що ці циліндри є а-спіральні ділянки білкової молекули. Їх довжина за оцінками дорівнює 45 А, що узгоджується з рентгеноструктуровим даними про те, що товщина пурпурової мембрани складає приблизно 49 А. Якщо поліпептид дійсно знаходиться в а-спіральної конфігурації, то ця величина повинна відповідати 30 залишкам, оскільки відстань між залишками вздовж осі а -спіралі дорівнює 1,5 А. Отже, в семи передбачуваних а-спіралях міститься більше 80% всіх амінокислотних залишків. І дійсно, як показують дані КД, велика частина білкової молекули знаходиться в а-спіральної конфігурації, хоча є також ділянки, що утворюють 3-шар.

Дозволи методу реконструкції зображення недостатньо для того, щоб простежити за ходом поліпептидного ланцюга, і ділянки, що з'єднують сім передбачуваних спіралей, в основному не видно. З 1980 р. було побудовано багато моделей структури бактериородопсина, що узгоджуються з дифракційними даними, а також зроблено численні спроби отримати необхідну інформацію за допомогою інших методів. До теперішнього часу найбільш часто використовувалися:

1) визначення амінокислотної послідовності;

2) протеоліз та імунологічні методи для виявлення тих ділянок білка, які знаходяться за межами бішару, і встановлення їх орієнтації щодо внутрішньої і зовнішньої сторін мембрани.

Всі побудовані моделі схожі в інтерпретації загальної укладання й топології молекули. На рис.3.8 представлена ​​модель, аналогічна запропонованої Енгелманом та ін Встановлено, що для перетину неполярної частини бішару спіраль повинна містити 21 амінокислотний залишок, і в білковій молекулі дійсно є сім ділянок приблизно такої довжини з переважним вмістом неполярних амінокислот. Вважають, що вони і утворюють сім а-спіралей, які спостерігаються на карті електронної щільності.

, E , F , G , начиная с N -конца. Ці а-спіралі зазвичай позначаються буквами А, В, С, D, E, F, G, починаючи з N-кінця. Яке відповідність між ними і сім'ю спіралями, виявленими за допомогою електронно-мікроскопічних досліджень, - невідомо. Це питання неодноразово обговорювалося, і тут існують різні думки. Майже не викликає сумнівів, що загальна топологія, представлена ​​на рис.3.8, адекватна. Різні моделі, описані в літературі, в якихось відносинах можуть істотно різнитися. Це стосується, зокрема, довжини декількох спіралей, розташованих усередині бішару, яка варіює у різних моделях в межах 10 залишків. Незважаючи на ці розбіжності, по головних особливостей досягнуто консенсусу, хоча говорити про одностайність не можна. Ці особливості наступні.

Ділянки білка, що перетинають бішар, мають форму а-спіралей і в цілому неполярні. Спіралі, ймовірно, пронизують всю товщу мембрани, а не тільки неполярних частина бішару. Спіралі перпендикулярні поверхні мембрани і упаковані так, що відстань між їх центрами становить 10 А.

Заряджені і полярні амінокислотні залишки розташовані в основному в ділянках, що з'єднують трансмембранні спіралі. У тій частині білкової молекули, яка занурена в неполярних частина бішару, є до дев'яти іонізіруемих залишків в залежності від того, де розташовані його межі. Мабуть, для стабілізації структури вони повинні бути якимось чином нейтралізовані. Можливо, вони утворюють іонні або водневі зв'язку із залишками, розташованими в іншій частині поліпептидного ланцюга. Цей момент може виявитися корисним при обговоренні питання про характер упаковки різних спіралей в мембрані. Мабуть, іонізіруемие залишки, розташовані усередині мембрани, мають структурний та / або функціональне значення. -216, с которым связывается ретиналь. Приклад тому - залишок Lys -216, з яким пов'язується ретиналь. Більшість заряджених амінокислотних залишків, локалізованих в експонованих в розчин ділянках білка, розташовуються поблизу цитоплазматичної поверхні або безпосередньо на ній.

расположены по три остатка пролина, однако спирали при этом не выглядят сильно изогнутыми. Приблизно в середині спіралей В, С і F розташовані по три залишку проліну, проте спіралі при цьому не виглядають сильно зігнутими.

Спостерігається асиметричний розподіл ароматичних амінокислот: багато залишки тирозину і майже всі залишки триптофану знаходяться поблизу зовнішнього боку мембрани. Значення цього феномена невідомо.

-Конец располагается у наружной стороны мембраны, а С-конец - у внутренней. N-Кінець розташовується біля зовнішньої сторони мембрани, а С-кінець - у внутрішній.

З-Концевой ділянку, мабуть, має форму статистичного клубка і може зазнавати протеолізу без порушення функцій білка.

. Лізин-216 пов'язаний з простетичної групою - ретиналь і розташований приблизно в середині спіралі G.

3.1 вивернутий білок

Щодо структури бактериородопсина можна зробити досить цікавий висновок: його поліпептидний ланцюг укладена так, що полярні або заряджені залишки, що знаходяться у семи трансмембранних ділянках, виявляються зверненими всередину глобули, а неполярні контактують з мембранними ліпідами. Глобула по суті "вивернута", якщо порівнювати її з білками, в яких більшість неполярних залишків заховані усередині структури, а полярні звернені назовні. Цьому є розумне пояснення, і про це ж свідчать деякі експериментальні дані, в першу чергу дані по розсіюванню нейтронів. В основі згаданого методу лежить велика різниця між розсіюванням на атомах водню і дейтерію. Дейтерированного валін і фенілаланін включали шляхом біосинтезу в бактеріородопсин і потім, використовуючи різницевий метод Фур'є, встановлювали розподіл цих амінокислот у проецируемой структурі пурпурової мембрани. Прийнявши загальноприйняті допущення про послідовність передбачуваних спіральних ділянок, при побудові відповідної моделі виявили, що якщо дивитися уздовж осі спіралі, то для кожної спіралі залишки валіну будуть розташовуватися на сторонах, протилежних зарядженим і полярним групам, а залишки фенілаланіну - переважно на протилежній Валину стороні. За даними нейтронного розсіювання, залишки валіну переважно звернені до мембранних ліпідів, тому був зроблений висновок, що заряджені і полярні залишки групуються всередині білка. Зауважте, що цей результат не залежить від конкретного розташування ділянок поліпептиду на електронно-мікроскопічної карті.

Інший підхід заснований на використанні гідрофобного фотореактивних зонда ¹²⁵ 1-ТІД. Цей реагент впроваджується в гідрофобну серцевину мембрани і при фотолізі неспецифічно реагує з найбільш доступними бічними групами амінокислот. Це його властивість може використовуватися для локалізації тих ділянок білкової молекули, які звернені до ліпідів. Принаймні в двох випадках, у тому числі в разі бактериородопсина, зазначалося включення мітки в специфічні, періодично розташовані ділянки поліпептидного ланцюга, при цьому мітка включалася через кожні три або чотири залишку.

Якщо такий характер мічення відображає тільки частку бічних груп, звернених до мембранних ліпідів, то ми зможемо встановити, яка сторона передбачуваного а-спірального ділянки контактує з ліпідами. Оскільки на один виток спіралі доводиться 3,6 залишку, то спостерігається періодичність може мати місце тільки в тому випадку, якщо зонд контактує лише з однією стороною спіралі. Дані по спіралі С в бактеріородопсин узгоджуються з поданням про вивернутою структурі цього білка і теж свідчать про те, що відповідна частина поліпептиду має спіральну конфігурацію. У цілому можна сказати, що концепція вивернутих інтегральних мембранних білків дуже розумна, проте експериментальне її обгрунтування поки недостатньо. Нагадаємо, що, згідно з моделями фотосинтетичного реакційного центру, в серцевині бішару знаходиться дуже мало іонізіруемих залишків або вони відсутні там взагалі.

3.2 Розташування спіралей в бішарі і їх з'єднання

Ситуація, яка склалася при вивченні бактериородопсина, вельми незвичайна в тому сенсі, що при проміжному рівні дозволу вдається встановити деякі структурні деталі, але цього дозволу недостатньо для однозначного визначення конфігурації білка в бішарі. Всі спроби, які робилися тут до сих пір, швидше змогли виявити обмеження використовувалися методів, ніж з'ясувати принципи структурної організації мембранних білків. Застосовувалися такі методи.

Теоретичний аналіз, спрямований на пошук такої конфігурації спіральних ділянок, при якій відбувається оптимальна нейтралізація зарядів завдяки освіті іонних зв'язків усередині бішару, а також на оцінку довжини поліпептидних ділянок, що з'єднують спіралі.

Нейтронне розсіювання з використанням дейтерированного амінокислот і даних про амінокислотним складом кожного спірального ділянки.

Поліпшення дозволу в площині мембрани з використанням методу. реконструкції зображення та електронної дифракції.

-концевого пептида с целью идентификации на карте электронной плотности остатков, расположенных на N - кон це. Визначення рентгенівського розсіювання до і після протеолітичного розщеплення N-кінцевого пептиду з метою ідентифікації на карті електронної щільності залишків, розташованих на N - кон це.

Дослідження за допомогою нейтронного розсіювання бактериородопсина, реконструйованого з протеолітичних фрагментів, один з яких був дейтерированного.

Нейтронне розсіювання з використанням дейтерированного ретиналя, включеного або шляхом заміщення, або біосинтетичних. -216 в спирали G . Ретиналь був приєднаний до Lys -216 в спіралі G. Вважається, що він розташований всередині бішару під кутом 75 ° по відношенню до нормалі, тобто майже паралельно поверхні мембрани.

Фотохімічне зшивання з використанням фотореактивних похідного ретиналя. Цей метод дозволяє виявити ближні взаємодії.

Кожен з цих підходів має свої обмеження, і в цьому сенсі вони не узгоджуються між собою. Існує 5040 можливих способів розміщення семи спіралей в семи борозенках, і до теперішнього часу ці методи давали суперечливі відповіді на питання навіть про найбільш ймовірне їх розташуванні.

4. Структура порінов

Поріни - це основний клас білків, виявлених в зовнішній мембрані кишкових бактерій. и Salmonella typhimurium выявлены три порина: OmpF , OmpC и PhoE . У Е. coli і Salmonella typhimurium виявлено три поріна: OmpF, OmpC і PhoE. Ці білки мають мовляв. масу приблизно 35 ТОВ та гомологічні амінокислотні послідовності. Поріни екстрагуються із зовнішньої мембрани за допомогою ДСН у вигляді стабільних тримерів; їх можна вбудувати в фосфоліпідних бішару з утворенням неспецифічних пір, здатних пропускати малі гідрофільні молекули. Мабуть, саме вони надають зовнішній мембрані бактерій властивість молекулярного сита, Дозволяючи поживним речовинам проникати всередину клітини, а відходів - виводитися назовні через неспецифічні канали.

, известного также под названием "матриксный порин"; в настоящее время осуществляется кристаллографический анализ, который позволит получить его структуру с высоким разрешением. Були проведені великі структурні дослідження білка OmpF, відомого також під назвою "матриксних порін"; в даний час здійснюється кристалографічних аналіз, який дозволить отримати його структуру з високою роздільною здатністю. сильно отличается от структуры как бактериородопсина, так и полипептидов, образующих фотосинтетический реакционный центр. Проте вже зараз можна зробити висновок, що структура OmpF сильно відрізняється від структури як бактериородопсина, так і поліпептидів, що утворюють фотосинтетичний реакційний центр. Судячи за даними про первинну послідовності, в молекулі немає ніяких довгих гідрофобних ділянок, які можна було б ідентифікувати як трансмембранні, і в середньому в ній міститься більше полярних амінокислот, ніж неполярних. Проте тривимірна електронно-мікроскопічна реконструкція зображення з використанням кристалічних пластинок реконструйованого поріна показала, що білок пронизує бішар, причому за межі мембрани виходять лише невеликі ділянки молекули. Методом негативного контрастування були виявлені канали, утворені тримером. Окремі молекули поріна утворюють біля внутрішньої поверхні канали, які в середині бішару зливаються в одиночний канал, що відкривається назовні. Є й інші дані, що свідчать про те, що порін, незважаючи на відсутність у його молекулі гідрофобних ділянок, є трансмембранним білком. Іноді цей білок виконує роль рецептора для бактеріофага, а також проявляє спорідненість до компонентів клітинної стінки на періплазматіческой стороні. Очищений порін можна вбудовувати в фосфоліпідних бішару з утворенням потенціалчувствітельних каналів.

Дані інфрачервоної спектроскопії, кругового дихроїзму та ширококутного дифузійної рентгенівської дифракції свідчать про те, що дві третини довжини молекули утворює / 3-шар, а на частку а-спіралей припадає невелика частина довжини молекули. Крім того, ці дослідження показують, що / 3-ланцюга антіпараллельни, орієнтовані перпендикулярно площині мембрани н мають середню довжину 10-12 залишків, яких достатньо для перетину неполярної області мембрани. Спосіб укладання / 3-ланцюгів можна встановити лише за допомогою рентгенівської дифракції. Як показують модельні дослідження, / 3-кола можуть бути укладені так, що утворюється / 3-циліндр, при цьому полярні і заряджені амінокислотні залишки вистилають стінки наповнених водою каналів.

Всі відомі про структуру поріна дані показують, що гідрофобна а-спіраль не є його необхідним трансмембранним елементом. Це означає, що найбільш поширені способи пророкування структури трансмембранних білків мають свої обмеження, оскільки вони грунтуються на припущенні, що перетнути бішар можуть тільки гідрофобні сегменти. Точна структура поріна до цих пір невідома; неясно також, подібна вона зі структурою інших мембранних білків. Втім, є й інші білки зовнішньої мембрани бактерій, які характеризуються високим вмістом ^-структур. Один з них - білок отрут, який теж є рецептором для фагів, але, ймовірно, не існує у вигляді окремих тримерів і не утворює пори. , являющийся рецептором бактериофага лямбда; он функционирует как специфичный канал, через который осуществляется диффузия мальтодекстринов. Інший білок такого роду - LamB, що є рецептором бактеріофага лямбда; він функціонує як специфічний канал, через який здійснюється дифузія мальтодекстрину.

Припущення про те, що незвичайна структура порінов пов'язана з унікальною структурою і складом зовнішньої мембрани бактерій, виглядає правдоподібно. Можливо, однак, що вона обумовлена ​​унікальністю способу утворення великих водних каналів через бішар.