РЕФЕРАТ
Імунологічні методи
2009
ВСТУП
У імунології застосовується цілий ряд експериментальних методів з інших областей біології. Так, виділення антигенів і антитіл проводять за допомогою біохімічних методів фракціонування білків, гени імунологічно важливих молекул секвеніруют звичайними молекулярно-генетичними методами. Разом з тим в імунології розроблені і свої спеціальні методи дослідження, засновані на взаємодії антиген-антитіло. Ці імунологічні методи в свою чергу знайшли застосування в різних галузях біології. Зокрема, будь-які молекули, що володіють антигенними властивостями, можна виявляти в тканинах імуногістохімічними методами. Для кількісного визначення таких молекул, присутніх в надзвичайно низьких концентраціях, застосовують радіоіммуноаналіз і ферментний іммуносорбентний аналіз. В даний час існують сотні різноманітних імунологічних методів: найбільш широко вживані з них описані в цій роботі.
Взаємодія антиген-антитіло
Реакція преципітації. Одним з перших описаних проявів взаємодії антиген-антитіло було утворення преципітату при змішуванні обох реагентів в еквівалентних або близьких до еквівалентних кількостях. Воно спостерігається при постановці класичної реакції преципітації з розчинними антигенами і антитілами. Якщо проводити цю реакцію в агаровому гелі, можна диференціювати окремі реакції антиген-антитіло, зумовлені різними популяціями антитіл, присутніми в сироватці. Такий метод, названий методом подвійного иммунодиффузии, застосовується також для перевірки подібності між різними антигенами.
Однак деякі суміші антигенів занадто складні для поділу просто шляхом дифузії і преципітації, і для аналізу таких сумішей був розроблений метод імуноелектрофорез - перш ніж виявляти антигени візуально в реакції преципітації, їх поділяють по заряду за допомогою цього методу.
Методи, засновані на дифузії в гелі, дозволяють визначати антигени і антитіла лише якісно, кількісну ж оцінку реагуючих компонентів проводять розробленим пізніше методом простої радіальної иммунодиффузии.
Иммунодиффузии в електричному полі можна виробляти з одночасним зустрічним рухом антигенів і антитіл; цей спосіб названий зустрічним електрофорезом. Аналогічна модифікація простий радіальної иммунодиффузии отримала назву ракетний електрофорез.
Описані методи використовуються для визначення антигенів і антитіл у концентрації від 20 м кг / мл до 2 мг / мл.
Реакції гемаглютинації та зв'язування комплементу
Якщо антитіла присутні в таких низьких концентраціях, що їх не вдається виявити і кількісно визначити за допомогою зустрічного і ракетного електрофорезу, застосовують реакцію гемаглютинації. Вона заснована на здатності антитіл перехресно зв'язуватися з еритроцитами, взаємодіючи з їх поверхневими антигенами.
Реакція антиген-антитіло веде до утворення імунних комплексів, які пов'язують комплемент при його активації класичним шляхом, і на цьому заснований один з кількісних методів визначення антигенів і антитіл. За допомогою реакцій гемаглютинації та зв'язування комплементу вдається виявляти антитіла, присутні в концентрації <1 мкг / мл.
Пряма і непряма імунофлуоресценція
Імунофлуоресцентний методи широко використовуються для виявлення аутоантитіл і антитіл до тканинних і клітинних антигенів. Хоча ці методи технічно більш складні, ніж описані вище, вони мають явну перевагу в тих випадках, коли потрібно визначити число видів антитіл. Використовуючи зрізи тканин, на одному предметному склі можна виявити антитіла до кількох різних антигенів, встановивши при цьому їх внутрітканинне або внутрішньоклітинний розподіл.
Крім того, за допомогою імунофлуоресцентний тестів можна ідентифікувати окремі клітини в клітинній суспензії, тобто виявляти антигени на поверхні живих клітин. Для цієї мети суспензію живих клітин, флуоресцентно забарвлених специфічними реагентами, пропускають через проточний флуоресцентний клітинний сортер - прилад, що вимірює інтенсивність світіння кожної клітини в різних областях спектру і потім розділяє клітини за параметрами світіння. Даний метод дозволяє виділяти різні клітинні популяції, тобто розділяти клітини, які несуть специфічні поверхневі антигени і відповідно до цього забарвлені різними флуоресцентно міченими антитілами.
Імунологічний аналіз антигенів і антитіл за допомогою мічених реагентів
Методи цієї категорії відрізняються дуже високою чутливістю і економічністю у витрачанні реагентів. Найбільш поширений з усіх імунологічних методів - це, ймовірно, іммуносорбентний аналіз антитіл із застосуванням лігандів, мічених радіоізотопами чи ферментами; він дозволяє досліджувати велику кількість зразків у відносно короткий час. Кількість антигену можна вимірювати за допомогою методу «подвійний антигенної пастки» або конкурентного іммуноаналі через із застосуванням будь-якого маркера для визначення.
Імуноблотинг і іммунопреціпітація
Описані вище методи зазвичай застосовують для визначення рівня конкретних відомих антигенів і антитіл, однак часто необхідно ідентифікувати та охарактеризувати не відомі заздалегідь антигени, що містяться в багатокомпонентної суміші. Для цієї мети особливо підходить імуноблотинг.
При проведенні иммуноблоттинга складну суміш антигенів спочатку піддають гель-електрофорез, а потім фракціоновані пептиди переносять на лист нітроцелюлози для ідентифікації індивідуальних антигенів за допомогою специфічних антисироваток. Виробляючи попереднє розділення в гелі з додецилсульфату натрію або в гелі для ізо-електричного фокусування можна отримати дані про розміри і ізоелектричної точці досліджуваних антигенів, а також про подібність між ними.
У деяких випадках в результаті електрофорезу в гелі та процедури блотів антиген денатурує так, що деякі з його епітопів руйнуються і втрачають здатність зв'язуватися зі специфічними антитілами. У такій ситуації замість блотів слід використовувати іммунопреціпітація, щоб встановити, який антиген пов'язують антитіла. Даний метод може бути застосований для визначення як розчинних, так і мембранних антигенів.
ОТРИМАННЯ ЧИСТИХ АНТИТІЛ
У імунологічних дослідженнях часто виникає необхідність в отриманні очищених препаратів антитіл, тобто Антигенспецифічність або неспецифічних імуноглобулінів. Виділення неспецифічних імуноглобулінів із сироватки зазвичай проводять шляхом послідовного фракціонування білків, яке включає наступні етапи.
• Осадження гамма-глобулінів в 30-50% розчині сульфату амонію.
• Гель-фільтрація для отримання молекул відповідних розмірів.
• Іонообмінна хроматографія з метою виділення молекул, що несуть сумарний позитивний заряд при нейтральному рН.
• Афінна хроматографія з використанням природних лігандів імуноглобулінів, наприклад стафілококового білка А.
Виділення Антигенспецифічність імуноглобулінів здійснюють методом афінної хроматографії. Антиген «пришивають» до частинок сефарози і пов'язані з ним «чисті» антитіла елюіруют з імуносорбент хаотропні агентами або буферним розчином. Метод афінної хроматографії застосовують і для отримання очищених препаратів антигенів.
Отримання моноклональних антитіл
Іншим способом отримання індивідуальних антитіл певної специфічності служить гібридомної технологія - створення Іммортал-зовано лінії клітин, що продукують антитіла тільки однієї специфічності, тобто моноклональні. У такій культурі можна підтримувати антитілоутворення невизначено довгий час. Моноклональні антитіла незрівнянно краще відповідають цілям імуноаналізу, ніж гетерогенні сироватки, одержувані від імунних тварин, і тому знайшли широке застосування в різних галузях біології в якості високоспецифічних зондів.
Ефективно продукувати моноклональні антитіла можуть будь-які В-клітини, необхідно лише зробити їх для цього безсмертними і проліферуючими. Найчастіше для цієї мети отримують гібридні клітини - шляхом злиття мишачих спленоцітов з мієломною В-клітинами від мишей тієї ж лінії, не секретуючими власних антитіл. Можливо також отримати міжлінійні або міжвидові гібриди, проте вони часто нестабільні. Інший метод імморталізаціі - це трансформація клітин, наприклад у випадку В-клітин людини шляхом інфікування вірусом Епштейна-Барр.
Розроблено також новий метод отримання антитіл, заснований на використанні бактеріофагів. За допомогою цього цікавого методу вдається отримати експресію на поверхні ниткоподібного бактеріофага М13 варіабельних областей у вигляді фрагментів антитіл, що зв'язують антиген з певною специфічністю і авідності. Маючи в своєму розпорядженні бібліотекою таких експресуються бактеріофагом фрагментів, можна проводити відбір фагових частинок, які продукують той чи інший Fv-фрагмент. Крім того, якщо даними бактеріофагом інфікувати відповідні бактерії, вони починають виділяти Fv-білок у великій кількості у культуральне середовище. Такий підхід не вимагає обов'язкової імунізації тварин або людини.
Моноклональні антитіла представляють собою чітко визначений реагент, але вони не мають більш високу специфічність у порівнянні з поликлональной антисироватки, яка розпізнає антиген в результаті взаємодії імуноглобулінів з його різними епітопи.
ВИЗНАЧЕННЯ Комплемент
Найбільш простий спосіб вимірювання активності комплементу полягає у визначенні концентрації сироватки, викликає гемоліз 50% клітин у стандартному препараті еритроцитів, сенсибілізованих антигеном. Реакцію проводять у пробірках або на мікропланшетах. Для приблизної оцінки активності комплементу більш зручний простий радіальний гемоліз. Цей метод схожий з простій радіальної им-мунодіффузіей, за винятком того що в лунки вносять досліджувану сироватку, а гель містить ЕСА. Навколо лунки, що містить активний комплемент, утворюється зона гемолізу, величина якої пропорційна кількості комплементу в досліджуваній сироватці. Даний метод дозволяє визначати загальну активність компонентів класичного і литического шляхів активації, проте якщо в сироватці виявлено дефіцит комплементу, цим методом неможливо встановити, відсутністю якогось компонента дефіцит зумовлений.
Існують також методи для визначення різних окремих компонентів комплементу за їх утримання чи функціональної активності. Це важлива відмінність, так як компонент може бути присутнім в нормальній кількості, але бути функціонально неактивним. Зміст індивідуальних білків комплементу зазвичай визначають за допомогою радіоіммуноаналіза або ферментного іммуносорбентного аналізу, використовуючи антитіла, специфічні до даного білку. Для вимірювання функціональної активності в суспензію сенсибілізованих еритроцитів вносять всі компоненти комплементу, необхідні для лізису, за винятком досліджуваного білка.
ВИДІЛЕННЯ популяції лімфоцитів
Для проведення багатьох імунологічних досліджень in vivo і in vitro потрібні ті чи інші популяції лімфоцитів. Їх отримують від експериментальних тварин, в основному з тимусу, селезінки і периферичних лімфовузлів. Деякі спеціальні дослідження вимагають виділення клітин з інших ділянок організму, наприклад з пеєрових бляшок. Рециркулирующим клітини можна отримати шляхом канюлірованія грудного лімфатичного протоку і збору клітин протягом кількох годин. У людини найбільш легко виділити лімфоцити периферичної крові, а хірургічним шляхом можна отримати також клітини селезінки, мигдаликів і лімфовузлів. Однак хірургічно відібраний матеріал часто містить інфекційні агенти або пухлинні клітини, залежно від захворювання, яке викликало необхідність хірургічного втручання. Слід мати на увазі, що клітинні популяції, що містяться в перерахованих тканинах, абсолютно різні як за ступенем зрілості лімфоцитів, так і за чисельним співвідношенням в них клітин різних типів.
Тимус є джерелом досить чистою Т-клітинної популяції, проте складові її лімфоцити розрізняються за ступенем зрілості. При роботі з лімфоцитами з інших органів і тканин часто виникає необхідність у виділенні окремих субпопуляцій для аналізу їх особливих функцій. Застосування з цією метою описаного вище проточного флуоресцентного клітинного сортер, що дозволяє розділяти лімфоцити по їх поверхневим маркерами, дозволяє отримувати лише обмежену кількість клітин, оскільки швидкість цитометрії з сортуванням дуже низька. Існує, однак, і ряд методів, що дозволяють виділяти лімфоцити і їх окремі субпопуляції відразу з усього обсягу досліджуваного зразка, - центрифугування в градієнті щільності, розеткоутворення, пеннінг і магнітне розділення.
Виділення в градієнті щільності засноване на тому, що лімфоцити мають меншу щільність, ніж еритроцити і гранулоцити. Цей спосіб дозволяє виділяти більшу частину лімфоцитів крові. Розеткоутворення і пеннінг використовують для виділення субпопуляцій. Пеннінг представляє собою різновид афінної хроматографії стосовно до лімфоцитів. На подібному принципі заснований і спосіб поділу за допомогою магнітних гранул, покритих специфічними антитілами. При змішуванні з клітинами гранули пов'язують ті з них, які розпізнаються фіксованими антитілами. Ці клітини можна потім змити з гранул або виділити шляхом накладення магнітного поля.
Інший спосіб - він застосовується для видалення непотрібної клітинної популяції, - заснований на використанні антитіл і комплементу. Якщо до суміші клітин додати специфічні антитіла, а потім комплемент, клітини відповідної субпопуляції будуть ціалізуватися. Звичайно, для цього методу придатні лише такі антитіла, які пов'язують комплемент; крім того, клітини-мішені повинні нести на поверхні достатню кількість молекул антигену, щоб фіксувати літичну дозу комплементу.
Джерелом певних популяцій лімфоцитів можуть служити Антигенспецифічність Т-клітинні лінії, культивовані протягом тривалого періоду. Отримання таких ліній дозволяє обійтися без частого виділення первинних культур з органів і тканин тварин.
МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ ефекторних клітин
Розроблено різні методи для визначення ефекторних функцій лімфоцитів, зокрема продукції антитіл, цитотоксичності та опосередкованої Т-клітинами допомоги та супресії.
В-клітини, що продукують IgM-або IgG-антитіла, можна визначити за допомогою методу локального гемолізу, або реакції бляшкообразованія. Іншим способом виявлення антітелообразующіх клітин служить імуноферментний тест ELISPOT. Він дозволяє визначати функціонально активні Т-клітини, секретіруюшіе ті чи інші розчинні медіатори, тобто цитокіни. Визначення проводять на підкладці з іммобілізованими антитілами до специфічного цитокіну. Ці антитіла пов'язують даний цитокін, що виділяється Т-клітиною в навколишнє зону, і ефект зв'язування можна виявити шляхом відповідної обробки підкладки: навколо цітокінвиделяющіх Т-клітин будуть видні пофарбовані цятки.
Для визначення Антигенспецифічність Т-клітин часто використовують тест стимуляції лімфоцитів - проліферативний відповідь Т-клітин на антиген, що виявляються по включенню ними 3Н-тимідину. Цитотоксичну активність клітинних популяцій зазвичай визначають за їх здатністю лизировать клітини-мішені. Кількісно лізис клітин-мішеней визначають за допомогою тесту з вивільненням міченого хрому.
Міграція лімфоцитів
В експериментах з вивчення міграції лімфоцитів in vivo зазвичай досліджують розподіл в тих чи інших тканинах введених внутрішньовенно мелекул адгезії, мітять лімфоцити або ендотеліальні клітини і використовують блокуючі адгезію антитіла для иммунопреципитации специфічних молекул адгезії.
Трансгенних тварин і СПРЯМОВАНА ДОСТАВКА ГЕНІВ
Трансгенні тварини
Один зі шляхів для вивчення функцій тієї чи іншої молекули - це створення трансгенних тварин, у яких ген даної молекули або делетірован, або експресується, але на надвисокому рівні або з утворенням зміненого продукту. Оригінальний спосіб отримання трансгенних тварин полягає в ін'єкції приблизно ста копій даного гена безпосередньо в пронуклеус заплідненої яйцеклітини. Яйцеклітину переносять потім у яйцепровід ложнобеременной миші-самки, у матці якої і розвивається ембріон. Потомство таких мишей відрізняється варіабельністю. У невеликої кількості ембріонів одна або більше копій гена вбудовується в одну з хромосом до першого клітинного ділення. Ці тварини є гетерозиготами за трансгенів. В іншої частини тварин включення трансгена відбувається після першого поділу, і миші виявляються химерами, у яких поряд з нормальними клітинами є клітини, що містять трансгени. У більшості мишей Трансген не вбудовується в хромосому. Статус кожної миші визначають шляхом дослідження зразків клітин на присутність гена, для чого застосовують саузернблоттінг. На підставі даних аналізу відбирають трансгенних гетерозиготних тварин, яких потім використовують для схрещування і отримання гомозиготною трансгенної лінії.
Зазвичай включення трансгенів у хромосому відбувається випадковим чином і у вигляді блоку з кількох копій. Важливо, що при включенні трансгенного блоку не утворюється розривів в інших, функціонально важливих генах. Характер експресії трансгенів залежить від ряду факторів. Іноді ці гени виявляються під контролем промоторів загального типу і експресуються в більшості тканин. В інших випадках вони пов'язані з тканиноспецифічною промоторами та їх експресія обмежена лише деякими тканинами і клітинами або певними стадіями розвитку. До інтерпретації фенотипу трансгенних тварин необхідно підходити з обережністю, оскільки високу експресію трансгенів у невідповідних тканинах не можна вважати фізіологічною.
Спрямована доставка гена
Цей більш тонкий метод на першому етапі полягає в перенесенні гена, який взаємодіє або рекомбінує з досліджуваним ендогенним геном і викликає в результаті його зміна. Наприклад, в цьому ендогенному гені може відбутися делеція, в ньому можуть виникнути точкові мутації або випасти екзон. Такий змінений ген вводять в ембріональну поліпотентної стволову клітку, де він рекомбінує з аналогічним ендогенним геном. Цю стволову клітку переносять потім у бластоцисту або імплантують описаним вище способом.
Імунологічні методи
2009
ВСТУП
У імунології застосовується цілий ряд експериментальних методів з інших областей біології. Так, виділення антигенів і антитіл проводять за допомогою біохімічних методів фракціонування білків, гени імунологічно важливих молекул секвеніруют звичайними молекулярно-генетичними методами. Разом з тим в імунології розроблені і свої спеціальні методи дослідження, засновані на взаємодії антиген-антитіло. Ці імунологічні методи в свою чергу знайшли застосування в різних галузях біології. Зокрема, будь-які молекули, що володіють антигенними властивостями, можна виявляти в тканинах імуногістохімічними методами. Для кількісного визначення таких молекул, присутніх в надзвичайно низьких концентраціях, застосовують радіоіммуноаналіз і ферментний іммуносорбентний аналіз. В даний час існують сотні різноманітних імунологічних методів: найбільш широко вживані з них описані в цій роботі.
Взаємодія антиген-антитіло
Реакція преципітації. Одним з перших описаних проявів взаємодії антиген-антитіло було утворення преципітату при змішуванні обох реагентів в еквівалентних або близьких до еквівалентних кількостях. Воно спостерігається при постановці класичної реакції преципітації з розчинними антигенами і антитілами. Якщо проводити цю реакцію в агаровому гелі, можна диференціювати окремі реакції антиген-антитіло, зумовлені різними популяціями антитіл, присутніми в сироватці. Такий метод, названий методом подвійного иммунодиффузии, застосовується також для перевірки подібності між різними антигенами.
Однак деякі суміші антигенів занадто складні для поділу просто шляхом дифузії і преципітації, і для аналізу таких сумішей був розроблений метод імуноелектрофорез - перш ніж виявляти антигени візуально в реакції преципітації, їх поділяють по заряду за допомогою цього методу.
Методи, засновані на дифузії в гелі, дозволяють визначати антигени і антитіла лише якісно, кількісну ж оцінку реагуючих компонентів проводять розробленим пізніше методом простої радіальної иммунодиффузии.
Иммунодиффузии в електричному полі можна виробляти з одночасним зустрічним рухом антигенів і антитіл; цей спосіб названий зустрічним електрофорезом. Аналогічна модифікація простий радіальної иммунодиффузии отримала назву ракетний електрофорез.
Описані методи використовуються для визначення антигенів і антитіл у концентрації від 20 м кг / мл до 2 мг / мл.
Реакції гемаглютинації та зв'язування комплементу
Якщо антитіла присутні в таких низьких концентраціях, що їх не вдається виявити і кількісно визначити за допомогою зустрічного і ракетного електрофорезу, застосовують реакцію гемаглютинації. Вона заснована на здатності антитіл перехресно зв'язуватися з еритроцитами, взаємодіючи з їх поверхневими антигенами.
Реакція антиген-антитіло веде до утворення імунних комплексів, які пов'язують комплемент при його активації класичним шляхом, і на цьому заснований один з кількісних методів визначення антигенів і антитіл. За допомогою реакцій гемаглютинації та зв'язування комплементу вдається виявляти антитіла, присутні в концентрації <1 мкг / мл.
Пряма і непряма імунофлуоресценція
Імунофлуоресцентний методи широко використовуються для виявлення аутоантитіл і антитіл до тканинних і клітинних антигенів. Хоча ці методи технічно більш складні, ніж описані вище, вони мають явну перевагу в тих випадках, коли потрібно визначити число видів антитіл. Використовуючи зрізи тканин, на одному предметному склі можна виявити антитіла до кількох різних антигенів, встановивши при цьому їх внутрітканинне або внутрішньоклітинний розподіл.
Крім того, за допомогою імунофлуоресцентний тестів можна ідентифікувати окремі клітини в клітинній суспензії, тобто виявляти антигени на поверхні живих клітин. Для цієї мети суспензію живих клітин, флуоресцентно забарвлених специфічними реагентами, пропускають через проточний флуоресцентний клітинний сортер - прилад, що вимірює інтенсивність світіння кожної клітини в різних областях спектру і потім розділяє клітини за параметрами світіння. Даний метод дозволяє виділяти різні клітинні популяції, тобто розділяти клітини, які несуть специфічні поверхневі антигени і відповідно до цього забарвлені різними флуоресцентно міченими антитілами.
Імунологічний аналіз антигенів і антитіл за допомогою мічених реагентів
Методи цієї категорії відрізняються дуже високою чутливістю і економічністю у витрачанні реагентів. Найбільш поширений з усіх імунологічних методів - це, ймовірно, іммуносорбентний аналіз антитіл із застосуванням лігандів, мічених радіоізотопами чи ферментами; він дозволяє досліджувати велику кількість зразків у відносно короткий час. Кількість антигену можна вимірювати за допомогою методу «подвійний антигенної пастки» або конкурентного іммуноаналі через із застосуванням будь-якого маркера для визначення.
Імуноблотинг і іммунопреціпітація
Описані вище методи зазвичай застосовують для визначення рівня конкретних відомих антигенів і антитіл, однак часто необхідно ідентифікувати та охарактеризувати не відомі заздалегідь антигени, що містяться в багатокомпонентної суміші. Для цієї мети особливо підходить імуноблотинг.
При проведенні иммуноблоттинга складну суміш антигенів спочатку піддають гель-електрофорез, а потім фракціоновані пептиди переносять на лист нітроцелюлози для ідентифікації індивідуальних антигенів за допомогою специфічних антисироваток. Виробляючи попереднє розділення в гелі з додецилсульфату натрію або в гелі для ізо-електричного фокусування можна отримати дані про розміри і ізоелектричної точці досліджуваних антигенів, а також про подібність між ними.
У деяких випадках в результаті електрофорезу в гелі та процедури блотів антиген денатурує так, що деякі з його епітопів руйнуються і втрачають здатність зв'язуватися зі специфічними антитілами. У такій ситуації замість блотів слід використовувати іммунопреціпітація, щоб встановити, який антиген пов'язують антитіла. Даний метод може бути застосований для визначення як розчинних, так і мембранних антигенів.
ОТРИМАННЯ ЧИСТИХ АНТИТІЛ
У імунологічних дослідженнях часто виникає необхідність в отриманні очищених препаратів антитіл, тобто Антигенспецифічність або неспецифічних імуноглобулінів. Виділення неспецифічних імуноглобулінів із сироватки зазвичай проводять шляхом послідовного фракціонування білків, яке включає наступні етапи.
• Осадження гамма-глобулінів в 30-50% розчині сульфату амонію.
• Гель-фільтрація для отримання молекул відповідних розмірів.
• Іонообмінна хроматографія з метою виділення молекул, що несуть сумарний позитивний заряд при нейтральному рН.
• Афінна хроматографія з використанням природних лігандів імуноглобулінів, наприклад стафілококового білка А.
Виділення Антигенспецифічність імуноглобулінів здійснюють методом афінної хроматографії. Антиген «пришивають» до частинок сефарози і пов'язані з ним «чисті» антитіла елюіруют з імуносорбент хаотропні агентами або буферним розчином. Метод афінної хроматографії застосовують і для отримання очищених препаратів антигенів.
Отримання моноклональних антитіл
Іншим способом отримання індивідуальних антитіл певної специфічності служить гібридомної технологія - створення Іммортал-зовано лінії клітин, що продукують антитіла тільки однієї специфічності, тобто моноклональні. У такій культурі можна підтримувати антитілоутворення невизначено довгий час. Моноклональні антитіла незрівнянно краще відповідають цілям імуноаналізу, ніж гетерогенні сироватки, одержувані від імунних тварин, і тому знайшли широке застосування в різних галузях біології в якості високоспецифічних зондів.
Ефективно продукувати моноклональні антитіла можуть будь-які В-клітини, необхідно лише зробити їх для цього безсмертними і проліферуючими. Найчастіше для цієї мети отримують гібридні клітини - шляхом злиття мишачих спленоцітов з мієломною В-клітинами від мишей тієї ж лінії, не секретуючими власних антитіл. Можливо також отримати міжлінійні або міжвидові гібриди, проте вони часто нестабільні. Інший метод імморталізаціі - це трансформація клітин, наприклад у випадку В-клітин людини шляхом інфікування вірусом Епштейна-Барр.
Розроблено також новий метод отримання антитіл, заснований на використанні бактеріофагів. За допомогою цього цікавого методу вдається отримати експресію на поверхні ниткоподібного бактеріофага М13 варіабельних областей у вигляді фрагментів антитіл, що зв'язують антиген з певною специфічністю і авідності. Маючи в своєму розпорядженні бібліотекою таких експресуються бактеріофагом фрагментів, можна проводити відбір фагових частинок, які продукують той чи інший Fv-фрагмент. Крім того, якщо даними бактеріофагом інфікувати відповідні бактерії, вони починають виділяти Fv-білок у великій кількості у культуральне середовище. Такий підхід не вимагає обов'язкової імунізації тварин або людини.
Моноклональні антитіла представляють собою чітко визначений реагент, але вони не мають більш високу специфічність у порівнянні з поликлональной антисироватки, яка розпізнає антиген в результаті взаємодії імуноглобулінів з його різними епітопи.
ВИЗНАЧЕННЯ Комплемент
Найбільш простий спосіб вимірювання активності комплементу полягає у визначенні концентрації сироватки, викликає гемоліз 50% клітин у стандартному препараті еритроцитів, сенсибілізованих антигеном. Реакцію проводять у пробірках або на мікропланшетах. Для приблизної оцінки активності комплементу більш зручний простий радіальний гемоліз. Цей метод схожий з простій радіальної им-мунодіффузіей, за винятком того що в лунки вносять досліджувану сироватку, а гель містить ЕСА. Навколо лунки, що містить активний комплемент, утворюється зона гемолізу, величина якої пропорційна кількості комплементу в досліджуваній сироватці. Даний метод дозволяє визначати загальну активність компонентів класичного і литического шляхів активації, проте якщо в сироватці виявлено дефіцит комплементу, цим методом неможливо встановити, відсутністю якогось компонента дефіцит зумовлений.
Існують також методи для визначення різних окремих компонентів комплементу за їх утримання чи функціональної активності. Це важлива відмінність, так як компонент може бути присутнім в нормальній кількості, але бути функціонально неактивним. Зміст індивідуальних білків комплементу зазвичай визначають за допомогою радіоіммуноаналіза або ферментного іммуносорбентного аналізу, використовуючи антитіла, специфічні до даного білку. Для вимірювання функціональної активності в суспензію сенсибілізованих еритроцитів вносять всі компоненти комплементу, необхідні для лізису, за винятком досліджуваного білка.
ВИДІЛЕННЯ популяції лімфоцитів
Для проведення багатьох імунологічних досліджень in vivo і in vitro потрібні ті чи інші популяції лімфоцитів. Їх отримують від експериментальних тварин, в основному з тимусу, селезінки і периферичних лімфовузлів. Деякі спеціальні дослідження вимагають виділення клітин з інших ділянок організму, наприклад з пеєрових бляшок. Рециркулирующим клітини можна отримати шляхом канюлірованія грудного лімфатичного протоку і збору клітин протягом кількох годин. У людини найбільш легко виділити лімфоцити периферичної крові, а хірургічним шляхом можна отримати також клітини селезінки, мигдаликів і лімфовузлів. Однак хірургічно відібраний матеріал часто містить інфекційні агенти або пухлинні клітини, залежно від захворювання, яке викликало необхідність хірургічного втручання. Слід мати на увазі, що клітинні популяції, що містяться в перерахованих тканинах, абсолютно різні як за ступенем зрілості лімфоцитів, так і за чисельним співвідношенням в них клітин різних типів.
Тимус є джерелом досить чистою Т-клітинної популяції, проте складові її лімфоцити розрізняються за ступенем зрілості. При роботі з лімфоцитами з інших органів і тканин часто виникає необхідність у виділенні окремих субпопуляцій для аналізу їх особливих функцій. Застосування з цією метою описаного вище проточного флуоресцентного клітинного сортер, що дозволяє розділяти лімфоцити по їх поверхневим маркерами, дозволяє отримувати лише обмежену кількість клітин, оскільки швидкість цитометрії з сортуванням дуже низька. Існує, однак, і ряд методів, що дозволяють виділяти лімфоцити і їх окремі субпопуляції відразу з усього обсягу досліджуваного зразка, - центрифугування в градієнті щільності, розеткоутворення, пеннінг і магнітне розділення.
Виділення в градієнті щільності засноване на тому, що лімфоцити мають меншу щільність, ніж еритроцити і гранулоцити. Цей спосіб дозволяє виділяти більшу частину лімфоцитів крові. Розеткоутворення і пеннінг використовують для виділення субпопуляцій. Пеннінг представляє собою різновид афінної хроматографії стосовно до лімфоцитів. На подібному принципі заснований і спосіб поділу за допомогою магнітних гранул, покритих специфічними антитілами. При змішуванні з клітинами гранули пов'язують ті з них, які розпізнаються фіксованими антитілами. Ці клітини можна потім змити з гранул або виділити шляхом накладення магнітного поля.
Інший спосіб - він застосовується для видалення непотрібної клітинної популяції, - заснований на використанні антитіл і комплементу. Якщо до суміші клітин додати специфічні антитіла, а потім комплемент, клітини відповідної субпопуляції будуть ціалізуватися. Звичайно, для цього методу придатні лише такі антитіла, які пов'язують комплемент; крім того, клітини-мішені повинні нести на поверхні достатню кількість молекул антигену, щоб фіксувати літичну дозу комплементу.
Джерелом певних популяцій лімфоцитів можуть служити Антигенспецифічність Т-клітинні лінії, культивовані протягом тривалого періоду. Отримання таких ліній дозволяє обійтися без частого виділення первинних культур з органів і тканин тварин.
МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ ефекторних клітин
Розроблено різні методи для визначення ефекторних функцій лімфоцитів, зокрема продукції антитіл, цитотоксичності та опосередкованої Т-клітинами допомоги та супресії.
В-клітини, що продукують IgM-або IgG-антитіла, можна визначити за допомогою методу локального гемолізу, або реакції бляшкообразованія. Іншим способом виявлення антітелообразующіх клітин служить імуноферментний тест ELISPOT. Він дозволяє визначати функціонально активні Т-клітини, секретіруюшіе ті чи інші розчинні медіатори, тобто цитокіни. Визначення проводять на підкладці з іммобілізованими антитілами до специфічного цитокіну. Ці антитіла пов'язують даний цитокін, що виділяється Т-клітиною в навколишнє зону, і ефект зв'язування можна виявити шляхом відповідної обробки підкладки: навколо цітокінвиделяющіх Т-клітин будуть видні пофарбовані цятки.
Для визначення Антигенспецифічність Т-клітин часто використовують тест стимуляції лімфоцитів - проліферативний відповідь Т-клітин на антиген, що виявляються по включенню ними 3Н-тимідину. Цитотоксичну активність клітинних популяцій зазвичай визначають за їх здатністю лизировать клітини-мішені. Кількісно лізис клітин-мішеней визначають за допомогою тесту з вивільненням міченого хрому.
Міграція лімфоцитів
В експериментах з вивчення міграції лімфоцитів in vivo зазвичай досліджують розподіл в тих чи інших тканинах введених внутрішньовенно мелекул адгезії, мітять лімфоцити або ендотеліальні клітини і використовують блокуючі адгезію антитіла для иммунопреципитации специфічних молекул адгезії.
Трансгенних тварин і СПРЯМОВАНА ДОСТАВКА ГЕНІВ
Трансгенні тварини
Один зі шляхів для вивчення функцій тієї чи іншої молекули - це створення трансгенних тварин, у яких ген даної молекули або делетірован, або експресується, але на надвисокому рівні або з утворенням зміненого продукту. Оригінальний спосіб отримання трансгенних тварин полягає в ін'єкції приблизно ста копій даного гена безпосередньо в пронуклеус заплідненої яйцеклітини. Яйцеклітину переносять потім у яйцепровід ложнобеременной миші-самки, у матці якої і розвивається ембріон. Потомство таких мишей відрізняється варіабельністю. У невеликої кількості ембріонів одна або більше копій гена вбудовується в одну з хромосом до першого клітинного ділення. Ці тварини є гетерозиготами за трансгенів. В іншої частини тварин включення трансгена відбувається після першого поділу, і миші виявляються химерами, у яких поряд з нормальними клітинами є клітини, що містять трансгени. У більшості мишей Трансген не вбудовується в хромосому. Статус кожної миші визначають шляхом дослідження зразків клітин на присутність гена, для чого застосовують саузернблоттінг. На підставі даних аналізу відбирають трансгенних гетерозиготних тварин, яких потім використовують для схрещування і отримання гомозиготною трансгенної лінії.
Зазвичай включення трансгенів у хромосому відбувається випадковим чином і у вигляді блоку з кількох копій. Важливо, що при включенні трансгенного блоку не утворюється розривів в інших, функціонально важливих генах. Характер експресії трансгенів залежить від ряду факторів. Іноді ці гени виявляються під контролем промоторів загального типу і експресуються в більшості тканин. В інших випадках вони пов'язані з тканиноспецифічною промоторами та їх експресія обмежена лише деякими тканинами і клітинами або певними стадіями розвитку. До інтерпретації фенотипу трансгенних тварин необхідно підходити з обережністю, оскільки високу експресію трансгенів у невідповідних тканинах не можна вважати фізіологічною.
Спрямована доставка гена
Цей більш тонкий метод на першому етапі полягає в перенесенні гена, який взаємодіє або рекомбінує з досліджуваним ендогенним геном і викликає в результаті його зміна. Наприклад, в цьому ендогенному гені може відбутися делеція, в ньому можуть виникнути точкові мутації або випасти екзон. Такий змінений ген вводять в ембріональну поліпотентної стволову клітку, де він рекомбінує з аналогічним ендогенним геном. Цю стволову клітку переносять потім у бластоцисту або імплантують описаним вище способом.