Курсова робота «Культивування Penicillium griseofulvum з метою одержання гризеофульвіну» зміст вступ розділ І загальні аспекти культивування мікроорганізмів для отримання антибіотиків

Ім'я файлу: текст.docx
Розширення: docx
Розмір: 1092кб.
Дата: 09.09.2023
скачати
Пов'язані файли:
Тести В1.docx
Екзотичні фрукти.pptx
Зразок оформлення 2 емпіричної частини КР-1.docx
Вирішення задач сімплекс-методом..docx

КУРСОВА РОБОТА

«Культивування Penicillium griseofulvum з метою одержання гризеофульвіну»
ЗМІСТ
ВСТУП

РОЗДІЛ І ЗАГАЛЬНІ АСПЕКТИ КУЛЬТИВУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ ДЛЯ ОТРИМАННЯ АНТИБІОТИКІВ

Особливості біосинтезу антибіотиків у мікроорганізмів
Вплив умов середовища на антибіотичну продуктивність
Спеціальні умови культивування для отримання антибіотиків
Спрямований біосинтез антибіотиків

РОЗДІЛ ІІ ХАРАКТЕРИТИКА МІКРООРГАНІЗМІВ ПРОЦУДЕНТІВ АНТИБІОТИЧНИХ РЕЧОВИН

2.1. Антибіотики мікробного походження

2.2. Загальні відомості про механізм дії антибіотиків. Резистентність до антибіотиків

2.3. Оцінка чутливості мікробів до антибіотиків

ВИСНОВКИ

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ
ВСТУП
Актуальність теми дослідження. Всі середовища біосфери населені мікроорганізмами: вони існують у ґрунті, воді, повітрі, на дні океанів, пісках пустель, антарктичних льодовиках, викидах підприємств хімічної промисловості, системах ядерних реакторів тощо. Мікроорганізми є обов’язковим компонентом будь-якої екосистеми. Інтенсивна життєдіяльність великої кількості мікроорганізмів є важливим фактором забезпечення динамічної рівноваги у біосфері. Кругообіг біогенних елементів можливий лише за участю мікроорганізмів. Широке розповсюдження мікроорганізмів зумовлене їхніми малими розмірами, швидкістю розмноження, різноманітністю, гнучкістю метаболізму, стійкістю до несприятливих факторів середовища. Мікроорганізми володіють високим адаптаційним потенціалом, що обумовлює здатність пристосування у середовищах і умовах, згубних для інших живих істот. В умовах, які визначаються як екстремальні, нерідко мешкають тільки мікроорганізми, наприклад, при екстремальних значеннях солоності, температури, рН тощо.

На сьогоднішній день грибкові інфекції є одними з найскладніших для лікування захворювань у людей. До інфекцій, які спричиняють гриби відносять такі хвороби як аспергільоз, кандидоз, кокцидіоїдомікоз, криптококоз, гістоплазмоз, міцетоми, мукормікоз і паракокцидіоїдомікоз. Так звані дерматофітні та кератинофільні грибки можуть вражати очі, нігті, волосся і особливо шкіру і викликати місцеві інфекції, такі як стригучий лишай і мікоз [2].

Незважаючи на масштабні дослідження, присвячені розробці нових терапевтичних засобів, існує лише обмежена кількість доступних препаратів для боротьби з інвазивними грибковими інфекціями. Наразі для лікування системних грибкових інфекцій використовуються в клінічній практиці лише чотири молекулярні класи: аналоги фторпіримідину, полієни, азоли та ехінокандини. Деякі інші класи, такі як морфоліни та аліламіни, використовуються лише як місцеві засоби через низьку ефективність або серйозні побічні ефекти при системному введенні [2].

Сучасні протигрибкові лікарські засоби обмежені у своїх можливостях для лікування інфекцій. Окрім цього, боротьба із мікопатогенами характеризується ефемерністю через швидкий розвиток стійкості грибків до хімічних сполук, оскільки грибки мають дуже пластичний геном і швидко розмножуються. Поєднання цих властивостей дає змогу біологічним агентам швидко генерувати варіанти для опору, що і призводить до резистентності. Тому актуальним є пошук нових методів боротьби із патогенними грибами.

Одним із підходів для виявлення чи створення нових протигрибкових препаратів є тестування сполук із природних джерел, таких як рослини, гриби, мікроорганізми. Отримані сполуки можуть відкрити нові ефективні шляхи у лікуванні грибкових інфекцій. Протигрибкові сполуки з більш-менш значною активністю можуть бути виділені з багатьох видів грибів і можуть бути корисними для людини, адже на основі грибних компонентів можна створювати, наприклад, протигрибкові мазі або креми у комбінації синтетичних протигрибкових сполук із грибними.

Грізеофульвін утворюється пліснявим грибом Penicillium griseofulvum. Грізеофульвін вперше був описаний як протифунгіцидний препарат, для застосування у сільському господарстві. Згодом був досліджений для лікування дерматомікозов у тварин. Показав ефективність при лікуванні трихофітії. Частина введеного грізеофульвіна депонується на поверхні волосся та епідермісі шкіри і тим самим попереджує проникнення патогенних грибів. Оскільки антибіотик діє на гриби статично, а не цидно, то після його застосування часто спостерігаються рецидиви хвороби.

Мета дослідження. Проаналізувати процес культивування Penicillium griseofulvum з метою одержання гризеофульвіну.

Предемет дослідження. Розкрити загальні аспекти культивування Penicillium griseofulvum з метою одержання гризеофульвіну

Об’єктом дослідження виступає культивування Penicillium griseofulvum з метою одержання гризеофульвіну

Завдання:

Розкрити особливості біосинтезу антибіотиків у мікроорганізмів.
Дослідити вплив умов середовища на антибіотичну продуктивність.
Описати спеціальні умови культивування для отримання антибіотиків.
Охарактеризувати спрямований біосинтез антибіотиків.
Дослідити антибіотики мікробного походження.
Розкрити загальні відомості про механізм дії антибіотиків та резистентність до антибіотиків.
Визначити оцінку чутливості мікробів до антибіотиків.

Методи дослідження. В ході написання нами курсової роботи використоֺвувалось ряд методів: методи аналізу і синтезу, індукції і дедукції, моделюванֺня, абстрагувֺання тощо, а в процесі розробленֺня проблеми використоֺвувалися порівняльֺно – ретроспекֺтивний, формально – логічний, системногֺо підходу, порівняльֺно та інші методи дослідженֺня.

Структура курсової роботи. Курсова робота складаєтьֺся зі вступу та всіх його основних елементів, двох розділів та підрозділֺів до них, загальних висновків та списку використаֺної літературֺи.
РОЗДІЛ І ЗАГАЛЬНІ АСПЕКТИ КУЛЬТИВУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ ДЛЯ ОТРИМАННЯ АНТИБІОТИКІВ

Особливості біосинтезу антибіотиків у мікроорганізмів

Утворення антибіотиків мікроорганізмами – спадкова властивість. Кожний вид мікроорганізмів здатний утворювати одну або декілька певних специфічних для цього виду антибіотичних речовин.

Особливість біосинтезу антибіотиків мікроорганізмами полягає в тому, що цей процес відбувається за двохфазним принципом (рис. 1.1). Ця закономірність характерна для більшості стрептоміцетів і міцеліальних грибів.

В 1-й фазі (фаза збалансованого росту, тропофаза) відбувається процес накопичення біомаси продуцента (утворюються ферменти, білки, нуклеїнові кислоти, вуглеводи, тобто речовини, які приймають участь в рості мікроорганізму). Швидкість засвоєння основних компонентів субстрату та кисню висока. Утворюються деякі органічні кислоти, що призводить до зниження значення рН середовища. В цій фазі антибіотик, як правило, ще не утворюється, а якщо антибіотична речовина присутня, то у незначних кількостях. Це пов’язують з пригніченням генів та ферментів, що відповідають за синтез антибіотика.

В 2-й фазі (ідіофазі, фазі незбалансованого росту) спостерігається уповільнення накопичення біомаси, навіть її зменшення. Це пов’язано з тим, що основні компоненти середовища вже використані продуцентом, середовище збагачене продуктами життєдіяльності, в культурі переважають літичні процеси, відбувається автоліз клітин, що призводить до залуження. В період ідіофази відбувається дерепресія ферментів, що приймають участь у біосинтезі антибіотиків.

Починається антибіотикоутворення.

В більшості випадків максимальне накопичення антибіотиків відбувається після максимального накопичення біомаси. Антибіотики ще називають метаболітами-ідіолітами.

Звичайно максимум продукування антибіотика в середовищі наступає після максимуму накопичення біомаси. Цей максимум неоднаковий у різних організмів і в різних умовах культивування.

Двофазність утворення антибіотиків чітко прослідковується за періодичного культивування продуценту на середовищі, що в процесі культивування змінюється самим продуцентом, при засіві середовища молодою культурою продуцента. У разі засіву середовища великою кількістю старого засівного матеріалу (40 год і більше) двофазність порушується, оскільки в таких випадках перша фаза закінчується вже під час приготування засівного матеріалу.

Рис. 1.1. Схема двофазного процесу культивування Streptomycesgriseus
Основні біосинтетичні шляхи утворення антибіотиків. Ферментативні реакції біосинтезу антибіотиків, за деяким виключенням, не відрізняються від реакцій під час яких утворюються інші метаболіти. Механізми біосинтезу антибіотиків можна розділити на три основні категорії.

1. Антибіотики, що походять від одного первинного метаболіту. Шлях їх біосинтезу складається з послідовності реакцій, які модифікують вихідний метаболіт, як це має місце за синтезу амінокислот та нуклеотидів.

2. Антибіотики, що походять від двох чи трьох різних первинних метаболітів, які модифікуються та конденсуються з утворенням складної молекули.

3. Антибіотики, що є продуктами полімеризації декількох схожих метаболітів з утворенням основної структури, що згодом може модифікуватися.

В результаті полімеризації утворюються антибіотики чотирьох типів: 1) поліпептидні антибіотики, які утворюються шляхом конденсації амінокислот;

2) антибіотики, утворені з ацетат-пропіонатних одиниць в реакціях полімеризації, схожих на реакції біосинтезу жирних кислот;

3) терпеноїдні антибіотики, що утворюються з ацетатних субодиниць в шляху синтезу ізопреноїдних сполук;

4) аміноглікозидні антибіотики, що утворюються в реакціях конденсації, сходних з реакціями біосинтезу полісахаридів.

Необхідно зазначити, що основна структура, отримана шляхом полімеризації, далі модифікується, до неї можуть приєднуватися різні радикали.

Вплив умов середовища на антибіотичну продуктивність

Для кожного продуценту антибіотика розробляється оптимальне поживне середовище, яке повинне забезпечувати максимальне накопичення продуцентом антибіотика. Поживне середовище повинно відповідати наступним вимогам: повноцінність; вміст доступних і дешевих компонентів; забезпечувати можливість ефективної фільтрації та використання найекономічніших методів виділення і очистки антибіотика.

Джерела азоту при культивуванні продуцентів антибіотиків

Джерела азоту мають дуже важливе значення для отримання антибіотиків. Продуценти засвоюють азот в окисленій (NO₂^-, NO₃^-) або у відновленій (NH₄⁺, -NH₂) формах. Найбільш важливі джерела азоту – солі азотної або азотистої кислот, а також амонійні солі органічних або неорганічних кислот, амінокислоти, продукти гідролізу білків, білки.

В натуральних середовищах невизначеного складу (кукурудзяний екстракт, меляса, соєве борошно) азот міститься у формі білків. Утилізація такого азоту залежить від наявності у продуцента відповідного протеїназного комплексу для перетворення білків до амінокислот.

У більшості продуцентів антибіотиків найефективніше засвоюється азот амонійних солей та амінокислот, в яких він знаходиться у відновленій формі.

Ефективність засвоєння азоту залежить від: хімічної природи джерела вуглецю; наявності в середовищі органічних кислот, катіонів та аніонів солей. На середовищах з єдиним джерелом азоту продуценти можуть розвиватися дуже добре, але не утворювати необхідну кількість антибіотика. Потреба в азоті різних продуцентів специфічна, наприклад, продуцент стрептоміцину не утворює антибіотик на середовищах з нітратами або нітритами тоді, коли вони є єдиними джерелами азоту. Утворення стрептоміцину відбувається на середовищах з амонійними джерелами азоту. Біосинтез пеніциліну відбувається більш енергійно в середовищі, яке поряд з амонійним джерелом азоту містить і нітратне.

Джерела вуглецю при культивуванні продуцентів антибіотиків.

Значення джерела вуглецю для антибіотикоутворення полягає насамперед у впливі на використання джерела азоту. Можуть бути використані: глюкоза, галактоза, мальтоза, сахароза, лактоза, крохмаль, гліцерин, етанол, янтарна, пировиноградна, оцтова, молочна кислоти. Наприклад, при отриманні пеніциліну доцільно використовувати одночасно глюкозу та лактозу, що забезпечує розвиток мікроміцета та високий рівень накопичення пеніциліну.

Не всі продуценти антибіотиків мають досить активні амілази, здатні здійснювати гідроліз крохмалвмісних природних субстратів. Тому доцільно обробляти таку сировину перед використанням ферментами.

Важливе значення має також співвідношення вуглецю та азоту в середовищі. Для росту багатьох продуцентів зазвичай оптимальним є співвідношення 20:1 (С:N). Не завжди таке співвідношення призводить до максимального накопичення антибіотика. Для кожного конкретного продуцента воно встановлюється окремо експериментальним шляхом.

Джерела мінерального живлення.

Важливими є фосфор, калій, кальцій, магній, сірка, залізо, цинк, мідь, молібден та інші елементи. Вони входять до складу протоплазми клітини як складові деяких ферментів, виступають як компоненти для регулювання осмотичного тиску. Фізіологічна роль макро- та мікроелементів в тому, що вони є структурними елементами ферментних систем, регулюють проникність мембран клітини, приймають участь у переносі енергії, активують ферментні системи.

Важливе значення для утворення антибіотиків, що містять хлор (хлортетрациклін, хлорамфенікол), має наявність в середовищі цього галогену. При цьому наявність інших галогенів (наприклад, брому) призводить до інгібування процесу хлорування і утворення антибіотика, що позбавлений хлору.

Культивування мікроорганізмів-продуцентів антибіотиків відбувається в асептичних умовах. Для стерилізації поживних середовищ використовуються:

а) безперервна стерилізація – для великих обсягів поживного середовища;

б) періодична стерилізація – для невеликих обсягів;

в) роздільна стерилізація за групами компонентів, зважаючи на стан та характеристику компонентів. Наприклад, щоб запобігти реакції карамелізації С- та N-вмісні компоненти (глюкоза та амінокислоти) стерилізуються окремо.

Спеціальні умови культивування для отримання антибіотиків

Інтенсифікувати утворення антибіотика окрім відомих підходів (отримання мутантних штамів з підвищеною здатністю до синтезу антибіотика, підбір відповідних середовищ для культивування, покращення технологічних умов розвитку продуцента) можна шляхом сумісного культивування продуцента антибіотика з іншими спеціально підібраними видами мікроорганізмів. Змішана культура термофільних Lactococcus та Lactobacillus, що складають мікрофлору йогуртів (кислого молока), має більшу антибіотичну активність, порівняно з активністю цих мікроорганізмів поодинці.

Вперше метод сумісного культивування мікроорганізмів для отримання антибіотиків було запропоновано у 1959 році угорськими вченими для отримання трихотецину. Було помічено, що продуцент трихотецину Trichothecium roseum найбільшу біологічну активність проявляє при сумісному культивуванні з міцеліальними грибами роду Penicillium. Якщо до 24-годинної культури T. roseum додавати 2-10% однодобового міцелію пеніцилового гриба, вихід трихотецину підвищується в декілька разів.

Неживий міцелій або культуральна рідина пеніцила не стимулюють утворення трихотецину. Продукція трихотецину в змішаній культурі збільшується в результаті антагоністичних взаємовідносин між продуцентом антибіотика та грибами роду Penicillium.

Збільшення утворення бацитрацину спостерігається у разі сумісного культивування його продуцента B. subtilis та бактерій роду Pseudomonas.

Вплив мікроорганізмів в змішаних культурах один на одного може відбуватися по різному:

1 – продукти обміну одного організму можуть бути використані іншим в якості джерела азоту, вуглецю або іншого компонента чи в якості попередника біосинтезу якої-небудь сполуки.

2 – в змішаній культурі один з мікроорганізмів може утворювати стимулятори росту для іншого.

3 – продукти життєдіяльності одного з мікроорганізмів (того, що не утворює антибіотик) дещо притримують розвиток продуцента, який у відповідь починає активніше синтезувати антибіотики.

Необхідно враховувати, що не існує універсальних комбінацій для сумісного культивування. В кожному конкретному випадку необхідно підбирати відповідні організми і їхнє оптимальне співвідношення.

В останні десятиріччя ХХ століття успішно розвинувся новий напрям у біосинтезі антибіотиків – це використання імобілізованих клітин продуценту. Виявилося, що живі клітини мікроорганізмів в імобілізованому стані здатні досить довго існувати і здійснювати характерні для них біохімічні процеси. Існування мікроорганізмів в імобілізованому стані є більш екологічним, тобто в природних умовах більшість мікроорганізмів існують саме в такому стані. Наприклад в ґрунті майже не зустрічається вільноживучих мікроорганізмів, всі вони адсорбовані на поверхні твердих часток ґрунту.

На сьогодні дослідження з імобілізації клітин мають пошуковий характер і в промислових умовах не використовуються.

Встановлено, що імобілізовані клітини Bacillus sp. здатні продукувати бацитрацин, S. griseus – кандицидин, P. chrysogenum – пеніцилін, L. lactis – нізин.

1.4. Спрямований біосинтез антибіотиків
Під спрямованим біосинтезом антибіотиків необхідно розуміти втручання експериментатора в метаболізм мікроорганізму-продуценту для отримання одного (з декількох) або нових порівняно з тими, що звичайно синтезуються.

Для спрямованого утворення переважно одного антибіотика з тих, що продукує обраний продуцент (або їхньої модифікації) використовують наступні методи втручання в метаболізм мікроорганізмів:

1 – зміна умов культивування і передусім зміна складу поживного середовища.

2 – введення в середовище для культивування специфічних інгібіторів.

3 – отримання мутантів вихідного продуцента, що утворюють модифіковані антибіотики.

4 – Оброблення отриманого антибіотика певними ферментами або мікроорганізмами.

Отримання деяких антибіотиків шляхом спрямованого синтезу:

введення до складу поживного середовища речовин, що вбудовуються в молекулу антибіотика, забезпечуючи отримання препаратів з новими властивостями. Тобто, введення попередників біосинтезу. Попередники – це органічні речовини, які в процесі біосинтезу антибіотика включаються в його молекулу без попереднього розщеплення на окремі фрагменти і їх наступного ресинтезу. Так, введення в середовище для культивування Penicillium chrysogenum фенілоцтової кислоти забезпечує утворення бензилпеніциліну, а введення феноксиоцтової кислоти – феноксиметилпеніциліну.
зміна співвідношення концентрацій джерел вуглецю та азоту (або ступеню аерації культури). Наприклад, в залежності від співвідношення вуглецю та азоту в середовищі культура Bacillus licheniformis продукує ліхеніформіни або бацитрацини. Якщо в середовищі міститься лактат амонію, і співвідношення С:N є невисоким утворюються ліхеніформіни. Якщо створені умови підвищеного співвідношенні С:N, утворюються бацитрацини.
введення специфічного інгібітору. На середовищі з хлоридами S.aureofaciens продукує хлортетрациклін (90-95%) і тетрациклін (5-10%). Якщо цей організм культивувати на середовищі, вільному від хлоридів, збільшується вихід тетрацикліну за рахунок зменшення хлортетрацикліну. Тетрациклін можна отримати і на середовищі, що містить хлориди, у разі додавання речовин, що інгібують процес хлорування (броміди, тіосечовина, меркаптобензотіазол).

РОЗДІЛ ІІ ХАРАКТЕРИТИКА МІКРООРГАНІЗМІВ ПРОЦУДЕНТІВ АНТИБІОТИЧНИХ РЕЧОВИН

2.1. Антибіотики мікробного походження
Антибіотики, що синтезуються грибами.

Продуцентами антибіотиків також є мікроскопічні гриби, головним чином дейтероміцети (Deuteromycetes). Широкого застосування набули антибіотики із грибів пеніцилін, цефалоспорини, трихотецин та ін.

Пеніцилін − продукт життєдіяльності пеніцилових грибів (P. notatum, P. crustosum, P. chrysogenum та ін.). Назва антибіотика була запропонована А. Флемінгом. Це складна речовина, що включає декілька біологічно активних сполук. Найбільш важливий з них бензилпеніцилін. Кристалічний препарат був отриманий у 1940 Х.У. Флорі та Е.Б. Рейном. У нашій країні подібний антибіотик був отриманий З.В. Єрмольєвою. Пеніцилін застосовується у вигляді калієвої, натрієвої, кальцієвої та інших солей. Природні пеніциліни діють на грампозитивні мікроорганізми, вони гальмують утворення пептидоглікану, який входить до складу клітинної стінки бактерій під час їх розмноження. На сьогодні існують напівсинтетичні пеніциліни широкого спектру дії: ампіцилін, оксацилін, ампіокс, метицилін та ін. Крім того, є напівсинтетичні пеніциліни, які доповнюють антимікробний спектр дії препаратів даної групи і використовуються для лікування хвороб, збудники яких не чутливі до пеніциліну.

Пліснявий гриб Cephalosporium acremonium є продуцентом декількох антибіотиків, із яких найбільш активним виявився цефалоспорин С. Цей антибіотик пригнічує ріст як грампозитивних, так і грамнегативних мікробів. Цефалоспорин С не інактивується пеніциліназою, тому є активним проти бактерій, стійких до пеніциліну. Як і пеніцилін, цефалоспорин, інгібує синтез клітинної стінки у бактерій.

Цефалоспорини мають ряд переваг над пеніцилінами: для них характерна більша кислотостійкість, вони менш чутливі до -лактамаз, у багатьох випадках відсутні перехресні алергічні реакції з пеніцилінами. На основі природного цефалоспорину отримані сотні напівсинтетичних цифалоспоринів (цефалексін, цефалотин, цефазоліл, цефтріаксон та ін.).

Грізеофульвін утворюється пліснявим грибом Penicillium griseofulvum. Грізеофульвін вперше був описаний як протифунгіцидний препарат, для застосування у сільському господарстві. Згодом був досліджений для лікування дерматомікозов у тварин. Показав ефективність при лікуванні трихофітії. Частина введеного грізеофульвіна депонується на поверхні волосся та епідермісі шкіри і тим самим попереджує проникнення патогенних грибів. Оскільки антибіотик діє на гриби статично, а не цидно, то після його застосування часто спостерігаються рецидиви хвороби.

Трихоцетин (продуцент гриб Trichothecium roseum)  препарат, що характеризується високою антифунгіцидною активністю, спочатку був випробуваний у рослинництві, а згодом була показана його ефективність стосовно дерматофітів (використовується для лікування тріхофітії у тваринництві).

Антибіотики, що синтезуються актиноміцетами.

Антибіотики синтезуються багатьма мікроорганізмами, однак, найбільше ця властивість виражена у актиноміцетів. Більшість антибіотиків, що використовується у медичній практиці (70 %) виділено із актиноміцетів: еритроміцин, мономіцин, канаміцин, ністатин, гентаміцин та ін.

У 1943 р. виділений, а у 1944 описаний А. Штац, Е. Б’юджи та З.А. Ваксманом антибіотик із Act. streptomycini стрептоміцин. Антибіотик пригнічує ріст грампозитивних та грамнегативних мікробів, таких, як стафілококи, стрептококи, збудники сальмонельозів, дизентерії. Антибіотик діє на мікроби цидно. Антимікробна активність ґрунтується на пригніченні синтезу білка. Однак ще у 1946 році було встановлено, що стрептоміцин володіє загальною нейротоксичною дією, спричинює ураження центральних і периферійних відділів органів слуху та рівноваги, пригнічує дихання, порушує видільну функцію нирок. У практиці знайшли застосування інші антибіотики групи стрептоміцинів.

Канаміцин виділений у 1957 р. із культуральної рідини Act. kanamyceticus. Відомо три різновиди антибіотику: А, В, С. У практиці застосовують сульфат канаміцину, який добре розчинний у воді. За біологічними властивостями він схожий на стрептоміцин і неоміцин. Активний щодо збуднику туберкульозу. Цидна активність щодо мікробів більш виразна у стадії їх розмноження та в аеробних умовах. Препарат пригнічує ріст мікробів, стійких до пеніциліну, стрептоміцину, левоміцетину, тетрацикліну та інших антибіотиків. Токсичність на тваринний організм така ж, як у стрептоміцину, але нижча, ніж у неоміцину.

Неоміцин − комплекс антибіотиків, що утворюється при біосинтезі Act. fradiae. Неоміцин − антибіотик широкого спектру дії, однак, до нього стійкі клостридії, гриби, деякі штами синьогнійної палички. Антибіотична активність на мікроби вище, ніж у стрептоміцину, проте він ще більш токсичний, викликає втрату слуху та запальні процеси у нирках, саме тому застосовується місцево у вигляді мазей, розчинів, аерозолів.

Тетрацикліни. В цю групу входять антибіотики, близькі за хімічним складом і дією. Їх активно застосовують у медицині та ветеринарії, що обумовлено їх широким спектром дії.

Хлортетрациклін (біоміцин) виділений у 1948 р. із актиноміцета Act. aureofaciens. З лікувальною метою антибіотик призначають при сальмонельозах, бруцельозі та ін. інфекціях. На мікроби діє, в основному статично, пригнічуючи синтез білка.

Дібіоміцин діє на тих самих збудників, що і хлортетрациклін, але менш токсичний.

Окситетрациклін (терраміцин) − отриманий у 1949 році і синтезується Act. rimosus. За своїми властивостями близький до хлортетрацикліну. На відміну від хлортетрацикліну у його формулі атом хлору замінений на гідроксильну групу (ОН), звідки і назва «хлортетрациклін». Препарат володіє незначною токсичністю, спричинює меншу подразнюючу дію на слизову оболонку шлунково-кишкового тракту.

Тетрациклін. Отриманий у 1953 р. із хлортетрацикліну хімічним шляхом при видаленні із його молекули атому хлору. Пізніше, у 1966 р. в результаті тривалого пошуку продуцента, цей антибіотик був отриманий шляхом біосинтезу із актиноміцету. Препарат викликає менше побічних ефектів, ніж попередники.

Морфоциклін − синтетичний препарат, отриманий із тетрацикліну, в якому один атом водню у карбоксильній групі заміщений групою метилморфіну. Діє на ті ж мікроби, що й тетрациклін, проте більш активний щодо мікоплазм.

Загалом, тетрацикліни спричинюють подразнення слизової шлунково-кишкового тракту, токсично діють на печінку, викликають дисбактеріоз кишечнику.

Хлорамфенікол (лєвоміцетин) − виділений 1947 р. Ерліхом із актиноміцета ізольованого з ґрунту Act. venezuelae. Антибіотик пригнічує дію багатьох мікробів, в тому числі рикетсій та спірохет. Не активний по відношенню до кислотостійких бактерій. Механізм дії полягає у інгібуванні білкового обміну. Хлорамфенікол і його препарати ефективні при шлунково-кишкових хворобах, таких як сальмонельоз, дизентерія та ін.

Еритроміцин. Антибіотик отримують із культуральної рідини Act. erythreus. За спектром дії він близький до пеніциліну, однак, пригнічує ріст пеніцилін стійких мікробів. Діє як на грампозитивні, так і на деякі грамнегативні мікроби, а також рикетсії і клостридії.

Крім того, є і інші антибіотики, отримані із актиноміцетів: олеандоміцин, лінкоміцин, ністатин, леворин та ін.

Антибіотики, що синтезуються бацилами.

Продуценти антибіотиків зустрічаються і серед спороутворюючих бактерій роду Bacillus. Медичне значення мають антибіотики − граміцидин із B. brevis, поліміксин − із B.polymyxa, бацитрацин − із B.licheniformis.

Граміцидин. Виділений у 1939 р. Р.Ж. Дюбо із B. brevis. У нашій країні граміцидин С був отриманий у 1942 р. Г.Ф. Гаузе та М.Г. Бражніковою. За хімічним складом − це циклічний пептид, в який входить п’ять амінокислот. У 1956 р. здійснений синтез антибіотику. Граміцидин активний стосовно стафілококу, стрептококу, збудників сальмонельозу, правцю, сибірської виразки, ешерихіозу та інших хвороб. Однак антибіотик володіє токсичними властивостями, зокрема викликає лізис еритроцитів, але не подразнює слизові оболонки та шкіру, тому призначається зовнішньо.

Поліміксин В синтезується B.polymyxa. Був відкритий у 1947 р. У всіх поліміксинів виразна активність щодо збудників захворювань шлунково-кишкового тракту та патогенних грибів. Цидна дія антибіотику пояснюється здатністю збільшувати проникність клітинної стінки мікробної клітини.

Поліміксин Е (колістин) синтезується B.colistinus, виділений у 1950 р. Дія антибіотику аналогічна іншим поліміксинам.

Субтілін − продукт B. subtilis. Всього із різних штамів цього продуцента виділено більше 70 антибіотиків. Володіє цидною дією по відношенню до збудника сибірської виразки, стафілококів, мікобактерій та інших мікробів, малотоксичний. Застосовується у харчовій промисловості у якості консерванту. У сільському господарстві використовується штам B. subtilis № 3 для профілактики цвільового ураження кормів.

Антибіотики, що синтезуються бактеріями.

Із Streptococcus lаctis отриманий антибіотик нізін. Він крім звичайних амінокислот містить лізин, гістидин, пролін, метіонін, ізолейцин, а також лактіонін та -метиллатіонін. Нізін пригнічує ріст стафілококів, стрептококів, сарцин, бацил. Антибіотик застосовується у харчовій промисловості. Отримано ряд антибіотиків із бактерій роду Pseudomonas.

Таким чином, мікроорганізми залишаються перспективним джерелом одержання антибіотиків. Крім того, у медичній практиці широкого впровадження набули напівсинтетичні антибіотики, які представляють собою хімічні модифікації природних антибіотиків. Так, на основі пеніцилінового ядра 6-амінопеніциланової кислоти (6-АПК) отримано за допомогою реакції ацилювання різноманітні синтетичні пеніциліни. 6-АПК отримують із пеніциліна ферментативним гідролізом під дією дезацилаз, які, в свою чергу, отримують із E.coli, B.subtilis, Nocardia.
2.2. Загальні відомості про механізм дії антибіотиків. Резистентність до антибіотиків
Характер і механізм біологічної дії антибіотиків обумовлені специфікою хімічної будови препарату та особливостями структури і хімічного складу бактеріальної клітини. Наприклад, мішенню для пеніциліну є клітинна стінка. У склад клітинної стінки бактерій входить гетерополімер пептидоглікан (муреїновий комплекс), який утворює жорсткий каркас клітинної стінки. Пеніцилін порушує процес утворення нормального гетерополімеру, клітини позбавлені жорсткого каркасу клітинної стінки, в результаті незбалансованого росту сильно збільшуються у розмірах, набувають форми сферопластів. Різниця грампозитивних та грамнегативних бактерій у чутливості до пеніциліну обумовлені різницею у будові клітинної стінки: у грампозитивних бактерій у клітинній стінці до 90 % глікопептида, у грамнегативних − не перевищує 5-10 %. Муреїновий шар клітинної стінки грамнегативних бактерій вкритий білковим шаром, а також ліпополісахаридом і ліпопротеїдом, що утруднює доступ до нього пеніциліну. До числа антибіотиків, що пригнічують синтез клітинної стінки чутливих бактерій, відносяться Д-циклосерин, цефалоспорин.

Стрептоміцин відноситься до аміноглікозидних антибіотиків. Цей антибіотик інгібує синтез білка, завдяки вибірковій дії на 30S-субодиницю рибосом. Тобто мішенню є один із білків рибосом прокаріот.

Інгібуючий ефект тетрациклінів обумовлений порушенням зв’язування аміноацил-т-РНК з рибосомально-матричним комплексом завдяки взаємодії з 30S-субодиницю рибосом у якості мішені. Механізм антибактеріальної дії левоміцетину полягає у пригніченні пептидилтрансферазної реакції, завдяки зв’язуванню з 50S-субодиницю рибосом, в результаті чого припиняється синтез білка в бактеріальній клітині.

Леворин та ністатин − полєнові антибіотики складної хімічної будови. Механізм їх дії обумовлений вибірковим зв’язуванням з цитоплазматичною мембраною, яке здійснюється завдяки взаємодії з її стериновими компонентами. Це призводить до порушення проникності цитоплазматичної мембрани, втрати клітиною життєво важливих низькомолекулярних речовин і, врешті решт, до її загибелі.

Резистентність до антибіотиків.

Багато антибіотиків поступово втратили свою ефективність у зв’язку з формуванням мікроорганізмами резистентності до них. Наприклад, багато штамів стафілококів, що виділяють на даний час, за рідкими виключеннями, резистентні до пеніциліну та ін. антибіотиків. З’явились штами бактерій, які володіють множинною резистентністю до антибіотиків. Резистентність мікроорганізмів до лікарських препаратів може бути природною або набутою. Природна стійкість обумовлена відсутністю у мікроорганізмів «мішені» для дії антибіотику, т.б. такої ланки у ланцюгу метаболічних реакцій, яка б блокувалась під дією препарату. Набута стійкість може бути обумовлена мутаціями в хромосомних генах, що контролюють синтез компонентів клітинної стінки, цитоплазматичної мембрани, рибосомних та транспортних білків. Такого роду мутації змінюють «мішень» і роблять клітину стійкою для антибіотику. Хромосомні мутанти звичайно стійкі до одного або декількох антибіотиків близької хімічної структури. Частіше всього набута резистентність виникає в результаті переносу плазмід (R-фактор), що контролюють множинну резистентність до антибіотиків. Плазміди включають комплекс генів, що кодують синтез ферментів, які руйнують або модифікують структуру антибіотику, з чим і пов’язана втрата його активності. Так, стійкість S. aureus до пеніциліну обумовлена наявністю локалізованих у плазмідах генів -лактамази, що розщеплює пеніцилін до неактивної пеніцилінової кислоти. Плазміди E.coli детермінують синтез ферментів, які мають здатність до аденілування, форфорилювання або ацелювання аміноглікозидних антибіотиків і таким чином попереджують згубну дії цих антибіотиків на чутливі до них мікроорганізми.

Для подолання лікарської резистентності бактерій необхідно постійне поповнення арсеналу хіміотерапевтичних препаратів новими, які б відрізнялись від існуючих механізмом дії. Перспективним напрямком є хімічна модифікація вже існуючих антибіотиків, пошук інгібіторів бактеріальних ферментів, що інактивують антибіотики.
2.3. Оцінка чутливості мікробів до антибіотиків
Оцінка чутливості мікробів до антибіотиків та вивчення їх фармакокінетики в організмі хворого є основними лабораторними показниками, які при їх співставленні дозволяють прогнозувати ефективність антибактеріальної терапії. Крім того, результати визначення антибіотикочутливості використовують як маркер, що дозволяє виявляти та контролювати зміни антибіотикограми збудників у динаміці; використовувати детермінанти резистентності, які найчастіше зустрічаються, або їх сполучення як додаткові маркери при діагностиці внутрішньо лікарняних інфекцій; для виявлення джерел інфікування та шляхів розповсюдження полірезистентних штамів. Такі дані, одержані та узагальнені у різних регіонах країни протягом фіксованих проміжків часу, використовуються при формуванні політики антибактеріальної терапії та визначенні номенклатури антибіотиків, які випускаються в країні.

Найбільш розповсюдженими методами визначення антибіотикочутливості збудників інфекцій є диско-дифузійний (метод дисків) та серійних розведень.

Поживні середовища для визначення чутливості бактерій до антибіотиків повинні відповідати таким вимогам:

бути стандартними та забезпечувати оптимальні умови росту мікроорганізмів;
не містити інгібіторів бактеріального росту і великої кількості стимуляторів;
не містити речовин, що пригнічують активність препаратів.

На результати дослідження може суттєво впливати значення рН середовища. Найдоцільніше вибирати нейтральне або дещо лужне середовище (рН 7,0-7,4), оскільки ці значення придатні для більшості антибіотиків. При визначенні чутливості бактерій використовують бульйон і 1,5-2 % агар на переварі Хоттінгера, звичайний м’ясо-пептонний бульйон і 1,5-2 % агар на ньому, середовище АГВ (агар Гівенталя-Вєдьміної). Вони придатні при визначенні антибіотикочутливості стафілококів, ентеробактерій, псевдомонад. Однак стрептококи та гемофільні бактерії вимагають добавки ростових факторів; дріжджі та анаеробні бактерії − спеціальних середовищ і певних умов культивування. На результати визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків-аміноглікозидів, поліміксинів, тетрациклінів впливає вміст у поживних середовищах катіонів кальцію, магнію, що особливо важливо при дослідженні Рs. aeruginosa. Оптимальний вміст - 50 мг/л Са²⁺і 25 мг/л Мg²⁺.
Метою розрахунку є вибір робочого об’єму, визначення геометричних розмірів апарату.

1 м³ культура Penicillium griseofulvum продукує 0,005 кг гризеофульвіну.

Для досягнення добового виробництва 250 л/добу гризеофульвіну потрібно розрахувати необхідну біомасу Penicillium griseofulvum:

m_сум=250/0,3/0,005=166666 л/добу=166,666 м³/добу.

Для культивування культури використовуємо ферментер об’ємом 10 м³

З коефіцієнтом заповнення 0,5. У процесі ферментації 5 % - втрати, тому робочий об’єм становить:

𝑉_р = 𝑉_ф ∙ 0,95 ∙ 0,5 = 10 ∙ 0,95 ∙ 0,7 = 4,75 м³

Кількість виробничих процесів:

n= m_сум/ 𝑉_р=166,666/4,75=35

Необхідна кількість поживного середовища на добу:

m_c_.с=250 л/добу/0,005=50 м³

Максимальна кількість робочих годин на рік:

𝜏 = 365 ∙ 24 = 8760 год

Для виробництва 182 тис л/рік гризеофульвіну необхідна кількість ферментерів:

N=182/4,75=38,3=38 шт

Основні параметри ферментера об’ємом 10 м³ показані на рис.1.2

Рисунок 1.2 – Розміри ферментера.

Б – вхід повітря; Г – Вхід теплоносія; Д – вихід теплоносія; Е – подача живлячого середовища; Ж – датчик рівня піни; Л – люк-паз; М – термометр; Р – рН-метр;

Технічні характеристика ферментера:

Об’єм – 10 м²;

Робочий тиск – 0,03 – 0,05 МПа;

Надлишковий тиск у процесі стерлізації – 0,3 МПа;

Тиск у сорочці – 0,3 МПа;

Температура робочого середовища – 25-31 ºС;

Температура стерилізації – 133-146 ºС;

Температура теплоносія – 10-12 ºС.

Витрата повітря – 432 м³/год.

Площа поверхні теплообміну - 14,8 м².

Потужність приводу – 15 кВт

Частота обертання вала – 254 об/хв.

Габарити 2360 х 2100 х 7112 мм.

Маса – 5702 кг.

Ферментер виготовлений зі сталі 08Х22Н6Т, вал перемішуючого пристрою - з сталі 14X17Н2, деталі зовнішніх пристроїв – зі сталі ВСтЗсп5.

ВИСНОВКИ
Отже антибіотикорезистентність актуальна проблема сьогодення. Стійкість до антибіотиків та поява мультирезистентних бактеріальних штамів є проблемою глобального значення, яка спричиняє серйозні загрози людству.

Найбільшим класом лікарських засобів, що одержують шляхом мікробного синтезу, є антибіотики. За різноманіттям і показаннями до застосування вони займають перше місце серед продукції світової фармацевтичної промисловості. Обсяг світового ринку антибіотиків збільшується в середньому на 10 - 12 % щорічно і становить більше 23 млрд. доларів. Виробництво антибіотиків виявилося надзвичайно наукоємною галуззю, яка потребувала нових знань від мікробіологів, біохіміків, генетиків і стимулювала розроблення сучасних біотехнологій, створення нового обладнання, врешті сам розвиток мікробіологічної промисловості.

Антибіотики – це специфічні продукти життєдіяльності або їхні модифікації, що характеризуються високою фізіологічною активністю щодо певних груп мікроорганізмів (вірусів, бактерій, грибів, водоростей, протозоїв) або злоякісних пухлин, вибірково затримуючи їхній ріст або повністю пригнічуючи розвиток.

Вибірковість дії антибіотиків забезпечується їхньою здатністю впливати на певні мішені в чутливих клітинах. По-перше, антибіотики можуть впливати на утворення структурних компонентів мікробної клітини, які відсутні у клітинах ссавців. Наприклад, більшість клітинних оболонок бактерій складається із пептидоглікану – макромолекули, що забезпечує еластичність оболонки бактеріальної клітини. Антибіотики пеніцилін та цефалоспорин пригнічують процес трансамінування на заключному етапі синтезу пептидоглікану. Наслідком цього є неможливість забезпечення міцності клітинної стінки бактерій і врешті їхня загибель. Клітини ссавців не потерпають, оскільки не містять пептидоглікану. По-друге, антибіотики можуть впливати на метаболічні процеси, властиві лише бактеріальним клітинам.

Здавен людство несвідомо користувалося антибіотичними властивостями деяких продуктів життєдіяльності мікроорганізмів та рослин. З розвитком мікробіології поступово вивчалися взаємодії між різними організмами, була доведена здатність мікроорганізмів виділяти в довкілля антимікробні речовини, вивчалося явище антагонізму в світі мікробів. Ще наприкінці XIX ст. Л. Пастер та І.І. Мечников відмічали, що деякі мікроби можуть бути дійовими для боротьби з патогенними та іншими бактеріями, а у 1872 р. російські дослідники О.Г.Полотебнов і В.А.Манасеїн вперше використали лікувальні властивості зеленої цвілі (Penicillium). У 1887 р. Павловський з успіхом використав живі культури Bacterium prodigiosum для лікування шкіряних форм сибірки кролів. У 1885 р. румунський вчений Бабеш встановив, що антагонізм між бактеріями пов’язаний з виділенням у довкілля речовин, які завдають шкоди бактеріям іншого виду. У 1910 – 1913 рр. О.Блек і У.Альсберг виділили з грибів роду Penicillium у чистому вигляді пеніцилову кислоту, але не змогли визначити її будову.

1928 рік справедливо вважають початком ери антибіотиків – саме цього року Олександр Флемінг відкрив пеніцилін.

Спочатку пеніцилін отримували за культивування гриба-продуцента поверхневим способом на рідких поживних середовищах. Собівартість пеніциліну була надзвичайно високою: 227270 доларів за 1 кг. У 80 роках минулого сторіччя собівартість пеніциліну становила 16 доларів.

Загальна кількість відомих антибіотиків до 2000 року становила приблизно 15,8 тис. найменувань. З них лише 200 природних сполук використовується в медичній практиці. Більшість антибіотиків не знаходить використання в медицині через їхню токсичність, інактивацію в організмі хворого та з ряду інших причин.

Кожного року в світі виробляється 100 тис. тон антибіотиків. Серед інших лікарських засобів, що використовуються в медичній практиці, антибіотики становлять 30%. Щорічно вчені відкривають 100 – 200 нових антибіотиків. За оцінками експертів на сьогодня розроблення нового антибіотика, від пошуку продуценту до впровадження готового продукту в практику, потребує затрат від 300 до 500 млн. американських доларів.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

Алмагамбетов К. Х. Биотехнология микроорганизмов / К. Х. Алмагамбетов. – Астана, 2008. – 244 с.
Билай В.И., Билай Т.И., Мусич Е.Г. Трансформация целлюлозы грибами. – Киев: Наук. думка, 1982. – 296 с.
Жданова Н.Н., Захарченко В.А., Василевская А.И. и др. Микобиота Украинского Полесья: последствия Чернобыльской катастрофы. – Киев: Наук. думка, 2013. – 383 с.
Загальна (промислова) біотехнологія: навчальний посібник/ М.Д. Мельничук, О.Л.Кляченко, В.В.Бородай, Ю.В.Коломієць. – Київ: ФОП Корзун Д.Ю., 2014. - 252 с.
Кривцова М.В., Ніколайчук М.В.: «Екологія мікроорганізмів». Навчальний посібник. − 2011. − 184 с
Карлаш Ю.В., Красінько В.О. Основи проєктування біотехнологічних виробництв Електронний ресурс : Навч. посібник. –К.:НУХТ, 2022. –373 с.
Курченко І.М. Біорізноманітність та еколого-фізіологічні особливості ендофітних мікроміцетів рослин сфагнових боліт Полісся України: автореф. дис. на здобуття наук. ступеня докт. біол. наук : спец. 03.00.07 «Мікробіологія». – Київ, 2014. – 40 с.
Курченко І.М., Жданова Н.М., Соколова О.В. Вивчення наявності деяких гідролітичних та окисно-відновних ферментів у штамів Fusarium oxysporum (Schlecht.) Snyd. et Hans., ізольованих з різних місцеперебувань // Мікробіологічний журнал. – 2001. – 63, № 5. – С. 34–44
Методы экспериментальной микологии: Справочник / Под ред. В.И. Билай. – Киев: Наук. думка, 1982. – 550 с.
Пирог Т.П. Загальна мікробіологія. – К.: НУХТ, 2004. – 471 с.
Пирог, Т.П. Загальна біотехнологія / Т.П.Пирог, О.А. Ігнатова– К.: НУХТ, 2009. – 336 с.
Сидоров, Ю.І. Процеси і апарати мікробіологічної та фармацевтичної промисловості. Технологічні розрахунки. Приклади і задачі. Основи проєктування: Навч. посібник. /Ю.І. Сидоров, Р.Й. Влязло, В.П. Новіков.- Львів: «Інтелект-Захід», 2008.- 736 с.
Сергійчук М.Г., Позур В.К., Вінніков А.І. та ін. Мікробіологія. – К.: ВПЦ «Київський університет», 2005 . – 375 с.
Adejuwon A.O., Oni A.O., Ajayi A.A. et al. Cellulase activity in tomato fruits infected with Penicillium funiculosum Thom // African Journal of Plant Science. – 2009. – 3, N 5. – P. 113–116.
de Castro A.M., Ferreira L.S.G., Pereira N. Cellulases from Penicillium funiculosum: production, properties and application to cellulose hydrolysis // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. – 2010. – 37, N 2. – P. 151–158.
Соlonia B.S.O., Chagas A.F.J. Screening and detection of extracellular cellulases (endo- and exo-glucanases) secreted by filamentous fungi isolated from soil using rapid tests with chromogenic dyes // African Journal of Biotechnology. – 2014. – 13, N 52. – P. 4694–4701.
Domsch K.H., Gams W., Anderson T.-H. Compendium of soil fungi / Second edition. – Eching: IHW-Verlag, 2007. – 672 p.
Florencio C., Couri S., Farinas C.S. Correlation between agar plate screening and solid-state fermentation for the production by Trichoderma strains // Enzyme Research. – 2012. DOI:10.1155/2012/793708.
Kurtzman C.P. , Fell J.W. The Yeastes: a taxonomic study. – 4th ed. – Amsterdam etc.: Elsevier, 1998. – 1055 p.
Arima J. Study on peptide hydrolysis by aminopeptidases from Streptomyces griseus, Streptomyces septatus, and Aeromonas proteolytica / J. Arima, Y. Uesugi, M. Iwabuchi [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2006. – № 4. – P. 541–547.
Jonathan M. Oligomeric structure of proclavaminic acid amidinohydrolase: evolution of a hydrolytic enzyme in clavulanic acid biosynthesis / M. Jonathan, I. Clifton, H. Hernández [et al.] // Biochem J. – 2002. – № 2. – Р. 423-434.
Pokorny M. Streptomyces rimosus extracellular proteases / M. Pokorny, L. Vitale, V. Turk [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2004. – V. 8, № 1-2. – P. 81-90.
Salazar O. Enzymatic lysis of microbial cells / O. Salazar, J. Asenjo // Biotechnology letters. – 2007. – V. 29, № 7. – P. 985-994.

скачати