Стан глутатіонової ланки антиоксидантної системи крові практично здорових людей з лор-патологія

1.1. Рівень антропогенного навантаження на здоров'я населення в умовах промислового міста

1.2. Активні форми кисню: властивості та механізми утворення

1.3. Характеристика антиоксидантної системи

Глава 2. Матеріали і методи

2.1. Об'єкт дослідження

2.2. Приготування еритроцитів

2.3. Визначення вміст гемоглобіну

2.4. Визначення кількості відновленого глутатіону ... ... ... ... ... ... ... 26

2.5. Визначення активності глутатіонпероксидази

2.6. Визначення активності глутатіон-S-трансферази

2.7. Визначення активності глутатіонпероксидази

2.8. Статистична обробка результатів

Глава 3. Результати досліджень та їх обговорення

3.1. Аналіз змісту GSH і активності глутатіонзалежної ферментів в еритроцитах крові практично здорових людей і людей з ЛОР-захворюваннями

3.2. Аналіз зміст GSH і активність глутатіонзалежної ферментів в еритроцитах крові практично здорових людей, які проживають в різних за рівнем забруднення районах г.Красноярска

3.3. Аналіз зміст GSH і активність глутатіонзалежної ферментів в еритроцитах крові здорових чоловіків і жінок

3.4. Зміст GSH і активність глутатіонзалежної ферментів в еритроцитах крові практично здорових людей різного віку

Висновки

Список літератури

Summary

СПИСОК СКОРОЧЕНЬ

АФК - активні форми кисню

АОС - антиоксидантна система

ДНК - дезоксінуклеіновая кислота

КрАЗ - Красноярський Алюмінієвий Завод

ПОЛ - перекисне окислення ліпідів

ГДК - гранично допустима концентрація

РНК - рибонуклеїнова кислота

ТЕЦ - паливо-енергетичний центр

цАМФ - цикло-аденозинмонофосфат

– восстановленный глутатион GSH - відновлений глутатіон

– глутатионпероксидаза GPO - глутатіонпероксидаза

– глутатионредуктаза GR - глутатіонредуктаза

– глутатион- S -трансфераза GST - глутатіон-S-трансфераза

– никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный NADP - никотинамидадениндинуклеотидфосфат окислений

– никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный NADFH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат відновлений

СРО - вільнорадикальне окислення

ядерный респираторный фактор NRF - ядерний респіраторний фактор

ВЕДЕННЯ

В останні десятиліття у зв'язку з величезним розвитком промисловості екологія індустріальних міст значно погіршилася, це результат великих техногенних викидів підприємств стоять на території міст або поблизу них [Іванова з співавт., 2001].

За ступенем забруднення атмосфери місто Красноярськ входить до числа найбільш забруднених міст Російської Федерації. На території міста розташовуються великі підприємства, які є основними постачальниками забруднюючих речовин в атмосферу міста, до таких підприємств належать дві ТЕЦ, алюмінієвий, цементний, целюлозно-паперовий, фармацевтичний заводи [Симонова, 2002]. Тільки ВАТ «Красноярський Алюмінієвий завод» має обсяги викидів в атмосферу в розмірі 58,6 тис. в рік. Основними компонентами хімічного забруднення навколишнього середовища від КрАЗу є: фтористий водень, плохорастворімие неорганічні фториди, оксиди алюмінію, оксид вуглецю бенз (а) пірен, сірчистий ангідрид [Ігамбердіев, 2004]. Перевищення ГДК спостерігається по фторидам газоподібним - до 2,79 разів; по бенз (а) пірен - до 4,42 разів; по погано розчинним фторидам - до 3,16 разів. При цьому рівень забруднення атмосфери житлової зони міста з фторидам газоподібним склав 1,19-1,57 ГДК на 2003 рік [Реброва, 2003]

За даними ряду авторів фтор та його похідні в помірних дозах є необхідним елементом живих організмів, найбільша його зміст відзначено в зубах і кістках, низькі концентрації - підвищують стійкість зубів до карієсу, стимулюють кровотворення, репаративні процеси при переломах кісток і реакції імунітету, беруть участь у зростанні скелета, надлишкове надходження фтору в організм викликає флюороз. При інгаляційному надходженні в організм газоподібних сполук фтору і містять фтор аерозолів виникають атрофічні зміни слизової оболонки верхніх дихальних шляхів і бронхів, можливий розвиток риніту, фарингіту, ларингіту [Богданов, Гембицький, 1975].

Дихальна система є вхідними воротами для потрапляння в організм полютантів техногенного походження. Дії пилових частинок на респіраторні органи викликає утворення великої кількості активних форм кисню (АФК), і призводять до розвитку окислювального стресу. Антиоксидантна система здійснює захист організму від шкідливої ​​дії прооксидантів і обмежує розвиток окисного стресу [Ковальчук, 2004].

МЕТА: оцінити стан глутатіонової ланки антиоксидантної системи в еритроцитах крові практично здорових людей і людей з ЛОР-захворюваннями, які проживають в різних за рівнем забрудненості районах міста Красноярська.

ЗАВДАННЯ РОБОТИ:

1. и активность GPO , GST и GR в эритроцитах крови практически здоровых людей и людей с хроническим ЛОР-заболеваниями. Вивчити зміст GSH і активність GPO, GST та GR в еритроцитах крові практично здорових людей і людей з хронічним ЛОР-захворюваннями.

2. и активность GPO , GST и GR в эритроцитах крови практически здоровых людей проживающих в различных по уровню загрязнения районах г. Красноярска. Визначити зміст GSH і активність GPO, GST та GR в еритроцитах крові практично здорових людей проживають у різних за рівнем забруднення районах м. Красноярська.

3. и активности GPO , GST и GR в эритроцитах крови практически здоровых мужчин и женщин. Провести порівняльний аналіз змісту GSH і активності GPO, GST та GR в еритроцитах крові практично здорових чоловіків і жінок.

4. и активность глутатионзависимых ферментов в эритроцитах крови практически здоровых людей различного возраста, проживающих в районах с разной техногенной нагрузкой г. Красноярска. З'ясувати зміст GSH і активність глутатіонзалежної ферментів в еритроцитах крові практично здорових людей різного віку, що проживають в районах з різною техногенним навантаженням м. Красноярська.

Робота виконана на базі кафедри біохімії та фізіології людини і тварин Інституту фундаментальної біології та біотехнології Сибірського федерального університету.

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

1.1. Рівень антропогенного навантаження на здоров'я населення в умовах промислового міста

Аналіз досліджень за останнє десятиліття показав, що атмосферне повітря забруднюється внаслідок утворення забруднюючих речовин у концентраціях, що перевищують нормативи якості або рівня природного вмісту. Потужність антропогенного впливу на атмосферу збільшується з кожним роком. За останні 25 років її техногенна запиленість зросла на 70%. Щорічно, в результаті діяльності людини, в атмосферу викидаються мільйони тонн забруднюючих речовин: діоксиди сірки, оксидів азоту, вуглецю, хлорфторвуглеці (фреони), які негативно діють на фізико-хімічні властивості атмосфери і на здоров'я людей [Пінігін, 1991; Новиков, 1999] .

Найбільш активними постачальниками полютантів - речовин, що забруднюють атмосферу, є автомобілі, коксохімічні, цементні, нафтопереробні, сталеплавітельние, целюлозопаперової, металургійні заводи, ТЕЦ, тобто галузі, без процвітання яких сучасна людина не мислить свого існування [Онищенко, 2003].

Практично кожен поллютантами є високотоксичною речовиною, поступово руйнує здоров'я людини. Так, наприклад, при згорянні вугілля і мазуту виділяється двоокис сірки, вона викликає легеневі та алергічні захворювання, окис вуглецю, що утворюється при згоранні всіх видів палива, вражає серцево-судинну систему, вуглеводні, що містяться у вихлопних газах автомобілів, канцерогени, пилоподібні відходи (цементний завод викидає близько 15 тонн пилу на добу) провокує розвиток бронхіальної астми, захворювань легень [Савін, 2001].

Як відомо, людина потерпає від екологічного впливу не тільки в широкому сенсі розуміння цього терміна як навколишнього середовища людини, але і безпосередньо під час його виробничо - професійної діяльності. , 2003]. Трудова діяльність людини не тільки погіршує якість середовища, а й забезпечує умови праці, які, будучи істотним чинником частини навколишнього середовища (виробничого середовища), часто чинять негативний вплив на працюючу людину [Haglof, 2003]. Абсолютні величини гранично допустимих концентрацій (ГДК) одних і тих же речовин в повітрі робочої зони від декількох десятків до декількох тисяч разів вище середньодобових ГДК для атмосфери [Кучма, 2002]. Тому сумарне навантаження шкідливими речовинами на робітника в стільки ж вище в порівнянні з навантаженням на населення в цілому. Найбільш поширеним професійним захворюванням робочих алюмінієвого виробництва є хронічна фториста інтоксикація - професійний флюороз, що складає 70% всіх професійних захворювань в даній області [Коцнельсон з співавт., 2000]. Обов'язковою проявом професійного флюороза є не тільки остеосклероз, але і дегенеративно-дистрофічні зміни опорно-рухового апарату по суті вікового характеру, що розвиваються вони набагато раніше і носять не тільки двосторонній, але і симетричний характер. Явно випереджаючої хронологічні терміни наступ кардинального ознаки старіння (імовірності смерті у міру дорослішання) є і демографічна ситуація. Так тривалість життя робітників алюмінієвого заводу складає близько 44 років. Строки розвитку професійно флюороза залежать більшою мірою від віку початку роботи в контакті з фтористими сполуками і м'язових навантажень [Гічев, 2002].

Вивчення закономірностей формування здоров'я населення, що проживає в зоні впливу викидів алюмінієвих виробництв, залишається актуальною гігієнічної завданням. Як відомо, основними шкідливими факторами алюмінієвого виробництва є фтор, його солі і фтористий водень. За даними ряду авторів рівень забруднення атмосферного повітря фтористими сполуками в зоні впливу викидів алюмінієвого заводу перевищує ГДК в 1,6-2,1 рази. Фтористі з'єднання так само виявляються у воді та грунті і перевищують контрольні в 5 разів [Іванова з співавт., 2001]. Токсичні сполуки фтору в значній кількості надходять через дихальні шляхи, з продуктами харчування, питною водою. , et al ., 2001]. Є ряд досліджень про вплив фтористих з'єднань на стан перекисного окислення ліпідів мембран клітин і антиоксидантного захисту [Cavalca, et al., 2001]. Тривала дія на організм токсичних сполук фтору, фтористоводородной кислоти призводить до формування виражених функціонально-структурних порушень, до пригнічення біоенергетичного обміну в еритроцитах, білково-освітньої функції печінки, посилення пролиферативно-клітинної реакції. Висока реакційність фтору робить можливим його проникнення через захисні бар'єри організму, порушуючи цілісність мембран, посилюючи процеси ліпопероксидації. Результати ряду досліджень свідчать про те, що фтор та його сполуки викликають системне ураження організму, яке проявляється низкою специфічних захворювань [Кацнельсон з співавт., 2000].

У літературі наводяться дані, що для інтоксикації фтором характерно різноманітний вплив на обмінні процеси. Цей елемент має високу спорідненість до деяких елементів, наприклад, кальцію та магнію, з якими він комплексу в клітинах [Мамирев, Богатова, 2002]. Фтор здатний виступати в якості регулятора ферментативної активності в клітині. Він має дію на металопротеїни. Це, мабуть, зумовлено тим, що він представляє собою один з найбільш "жорстких" лігандів, тобто, здатний утворювати міцні комплекси з іонами "жорстких" металів, до яких відносяться майже всі метали в біологічних системах [Генкін, Глотов, Ждахіна , 1983]. У силу цієї обставини при збільшенні концентрації фтор здатний "вклинюватися" в структуру біокоордінаціонних з'єднань і замішати деякі іони-ліганди (наприклад, гідроксил-іони), в результаті чого змінюється конформація з'єднання, що і призводить до "погіршення" взаємодії ферменту з субстратом, то є до інгібування ферментативної активності [Ройт, 1991]. ²⁺ -зависимых ферментных систем по своей чувствительности к ингибирующему воздействию фтора в несколько раз превосходят ферменты, активируемые другими ионами, например М n ²⁺ .Существуют данные о влиянии фтора на активность некоторых энзимов, например липаз, через их лабильный компонент – кофермент [Разумов, 1997]. Найбільшою міцністю відрізняється з'єднання фтору з іонами магнію, в силу чого більшість М g ^{2 +-залежних} ферментних систем за своєї чутливості до інгібуючого впливу фтору в кілька разів перевершують ферменти, що активуються іншими іонами, наприклад М n ^{2 +.} Існують дані про вплив фтору на активність деяких ензимів, наприклад ліпаз, через їх лабільний компонент - кофермент [Разумов, 1997]. З літературних джерел відомо, що фтор здатний надавати інгібуючий вплив на ферменти циклу трикарбонових кислот і ланцюга перенесення електронів: НАДН-залежні дегідрогенази, цитохромоксидазу, сукцинатдегідрогеназу, a-кетоглутаратдегі-дрогеназу. , 2000]. Найбільшою чутливістю з них до фтору володіє сукцинатдегідрогеназа [Abiaka, 2000].

1.2. Активні форми кисню: властивості та механізми утворення

Обов'язковим атрибутом нормальної аеробної життя є генерація АФК - прооксидантів. соавт, 2006]. Функціонування і розвиток клітин не могло бути можливим без існування захисних систем, до яких відноситися спеціалізовані ферментативного і неферментативного актіоксіданти [Меньщикова c співавт, 2006]. Постійна освіта прооксидантів врівноважено їх дезактивацією антиоксидантами, тому для підтримання гомеостазу необхідно безперервна генерація антиоксидантної здатності. Відсутність або збій цієї безперервності призводять до розвитку окислювального стресу, до виникнення і накопиченні окисних ушкоджень, що супроводжує ряд фізіологічних процесів - таких як запалення, реперфузійному ураження тканин, бронхо-легеневе захворювання, старіння та ін

У живих організмах існує два різних джерела АФК: радикальні окислювальні реакції і металопротеіновие ферментативні системи. В обох випадках молекулярний кисень виступає акцептором електронів. Наявність у молекулярного кисню двох неспарених електронів суттєво обмежує його реакційну здатність. У процесі еволюції у живих організмів виробилися спеціальні ферментативні системи, які відновлюють молекулярний кисень, переносячи на нього один, два або чотири електрона. Головні ферменти, які здійснюють метаболізм кисню в організмі ссавців - оксидази і оксигенази. соавт, 2006]. В активних центрах цих ферментів кисень перетворюється в цих продуктах і не виходить в навколишнє середовище, але при цьому вони не піддають небезпеки органічні молекули, а небезпечними є активні форми кисню, які утворюються як побічні речовини в ході цих перетворень [Меньщикова c співавт, 2006] .

Головні АФК: супероксидний радикал , Перекис водню , Гідроксильний радикал , Синглетний кисень , Гіпогалоіди алкоксильні радикал і перекисний радикал ^.

Характеристика основних форм АФК

Супероксидний радикал. Приєднання одного електрона до молекули кисню в основному стані призводить до утворення супероксидного аніон радикала ( ), Який при взаємодії з протоном переходить в гідроперекісний радикал ( ) [Бурлакова з співавт., 1992]. У живих системах супероксидний аніон є проміжним продуктом багатьох біохімічних реакцій - окислення тіолів, флавінів, хінонів, катехоламінів, птерина, ксонобіотіков. -оксидаза фагоцитирующих клеток, ксантиноксидаза, митохондриальная цитохром-с-оксидаза и микросомальные монооксигеназы. Але основні джерела його утворення - ферментативні системи: NADFH-оксидаза фагоцитуючих клітин, ксантиноксидаза, мітохондріальна цитохром-с-оксидаза і мікросомальні монооксигенази. При активації фагоцитів у вогнищі запалення генерація служить пусковим ланкою цілого каскаду реакцій, що призводять до утворення інших форм АФК. Для регуляції рівня в клітинах служить високоспецифічний фермент - антиоксидант супероксиддисмутаза, яка істотно прискорює реакції дисмутації до перекису водню [Зенков, Меньщикова, 2004].

Перекис водню. Приєднання двох електронів до молекули кисню або одного електрона до аніоном супроводжується утворенням двозарядних аніону , Який у вільному стані не існує, приєднуючи протони він переходить в гідроперекісний аніон , Messmer , 1995]. [Brune, Messmer, 1995]. Перекис водню - слабкий окислювач, у відсутності каталази та іонів металів змінної валетності вона відносно стабільна і може мігрувати в клітці і тканини. У живих організмах джерелами [Зенков, Меньщикова, 2004]. служать ферментативні реакції з оксидаза, реакція дисмутації, каталізується SOD [Зенков, Меньщикова, 2004].

Клітини ссавців досить стійкі до впливу , Завдяки наявності Глутатіонпероксидазну і каталазної ферментативних систем, перша з яких ефективно працює при малих концентраціях перекису, друга - при високих.

Гіпогалоіди. Утворюються головним чином в результаті ферментативної реакції перекису водню з галідамі, що каталізується мієлопероксидази, пероксидазою еозинофілів, які розрізняються за структурою і субстратної специфічності. Основним продуктом мієлопероксидази є , Пероксидаза еозинофілів каталізує утворення і . Гіпогалоіди інактивують -Антитрипсин, переводять коллагеназу в активну форму Б, окислюють лейкотрієни, імуноглобуліни, альбумін, церулоплазмін, трансферин. Викликають структурну модифікацію і інактивацію , -SOD можуть як індукувати, так і пригнічувати процеси ПОЛ.

Гідроксильний радикал є найбільш реакційноздатними АФК, що утворюється в біологічних системах, він може розривати будь-яку вуглецеву зв'язок [Андрєєв, 1999]. -радикалов в биологических системах служит реакция Фентона с участием металлов переменной валентности, главным образом Освіта ОН-радикала показано в реакціях окислення арахідонової кислоти, в реакції Габера-Вейса, при мікросамальном окисленні, в реакціях з флавінових ферментами і убіхінон, але основним джерелом OH-радикалів у біологічних системах служить реакція Фентона за участю металів змінної валентності, головним чином :

Зворотне відновлення можливо в реакції з :

а також при взаємодії з аскорбіновою кислотою, глутатіоном, цистеїном та іншими окиснюються сполуками [Зенков, Меньщикова, 2004].

Синглетний кисень. У кисні внутрішньомолекулярної відбувається перебудова електронів і виникає більш високий енергетичний рівень [Владимиров, 1998]. Джерелом синглетного кисню є реакції фотосенсібілізірованного окислення біологічних субстратів, при не фотохімічних реакції не ферментативна дисмутації супероксидних радикалів, що протікають з утворенням перекису водню. має високу хімічну активність, особливо по відношенню до молекул, що містить ділянки підвищеної електронної щільності.

Алкоксильні і перекисні радикали. При розвитку радикальних окислювальних процесів взаємодія органічних радикалів молекулярним киснем призводять до утворення перекисних радикалів , Які з алкоксильні радикалами можуть утворюватися в реакціях розкладання перекису у присутності іонів металів змінної валентності. -радикал и мало активные радикалы фенольных антиоксидантов. За фізико-хімічними властивостями алкоксильні і перекисні радикали це дуже гетерогенний клас сполук, що включає високореакційні OH-радикал і мало активні радикали фенольних антиоксидантів. Взаємодія і з вуглеводнями, що призводять до утворення і - Це найбільш повільна стадія розвитку радикальних окислювальних процесів [Владимиров, 1998].

Біологічний ефект _і реалізується через шкідливу дію на білки, ферменти, нуклеїнові кислоти, через продукти ПОЛ - органічні перекиси, альдегіди, кетони, епоксиди, які високотоксични для клітин. Інгібітори - аскорбінова кислота, сечова кислота, убіхінон, селен, -Токоферол [Андрєєв, 1999].

Всі форми АФК мають високу цитотоксичність для клітин і клітинних утворень. Можна виділити чотири мішені окисли тельной цитотоксичної атаки АФК: індукція процесів ПОЛ у біологічних мембранах, пошкодження мембраною білків, інактивація ферментів тов і пошкодження ДНК клітин.

Амінокислоти, з яких складаються білки, схильні окислювальному дії АФК, що призводить до трьох варіантів зміни фізико-хімічних властивостей білків: фрагментації, агрегації та підвищенню чутливості до протеолізу. У першу чергу впливу кисневих радикалів заради піддаються залишки проліну гістидину та аргініну. Окислювальне пошкодження призводить до денатурації і агрегації бел ков (кришталика ока). Агрегація білків пов'язана зі здатністю АФК обра зовивать міжмолекулярні зшивання. У результаті денатурації білків порушується їх конформація, і вони стають більш уразливими до дії протеолітичних ферментів [Зенков, Меньщикова, 2004].

Н-содержащие группы белков; их окисление приводит к снижению содержания восстановленных и повышению уровня окисленных S Н-групп, поэтому соотношение окис ленных и восстановленных S Н-групп белков может быть использовано в качестве показателя развития окислительного стресса. Окисленню АФК в першу чергу піддаються S Н-містять групи білків; їх окислення призводить до зниження вмісту відновлених і підвищенню рівня окислених S Н-груп, тому співвідношення окис лених і відновлених S Н-груп білків може бути використано в якості показника розвитку окисного стресу. Найбільш схильні до окислювальному стресу Са ^{2 +-АТФаза,} її пошкодження призводить до порушення тран спорту кальцію через мембрану [Владимиров, 1999].

Карбонільні групи і гідропероксиду, які утворюються при окисленні білків, також є показником вільнорадикального окислення.

Окислення ліпідних молекул призводить до необоротної зміни мембранних структур, порушення їх проникність для іонів. Найбільш схильні до перекисного окислення входять до складу мембран ненасичені жирні кислоти: лінолева, арахідонова, докозагексаєнова [Козлов, 2006]. Одним з найважливіших наслідків надмірної освіти АФК є надлишкова і неконтрольована в цих умовах активація процесів ПОЛ. Процеси ПОЛ можна умовно поділити на три послідовні етапи , або фази розвитку: процеси зародження ланцюгів, процеси розвитку ланцюгових реакцій і обрив ланцюгів. ). На стадії зародження ланцюгів під дією вільних радикалів кисню, іонізуючої радіації, ультрафіолетового опромінення та низки хімічних речовин, що відносяться до прооксидантів, відбувається утворення органічних радикалів (R).

На наступній стадії радикал швидко взаємодіє з киснем, який виступає в якості акцептора електронів. О ₂ ), который атакует ненасыщенные липиды. У результаті відбувається утворення пероксирадикал (R О _2), який атакує ненасичені ліпіди. ) способствует продолжению окислительных реакций, приобретающих цепной характер: Виникнення в результаті цієї реакції органічних перекисів і нового радикала (R) сприяє продовженню окислювальних реакцій, які купують ланцюговий характер:

+ О ₂ R + О ₂ О ₂ R О ₂

ООН ) включаются в процесс генерации радикалов, в присутствии металлов переменной валентности (меди, кобальта, марганца, железа) происходит образование реакционного алкоксильного радикала: Органічні перекису (R ООН) включаються в процес генерації радикалів, у присутності металів змінної валентності (міді, кобальту, марганцю, заліза) відбувається утворення реакційного алкоксильні радикала:

Частина утворюються органічних радикалів взаємодіє один з одним, при цьому відбувається утворення неактивних молекул, що обриває хід реакцій вільнорадикального окислення. Гідропероксиду ліпідів здатні піддаватися нерадикальних окислювальним перетворенням, що призводить до утворення первинних (дієнові кон'югати, діальдегіду), проміжних (основи Шиффа) і кінцевих продуктів ПОЛ, а також спиртів, кетонів та альдегідів. Обрив ланцюгових реакцій перекисного окислення можливий при взаємодії радикалів із спеціалізованими ферментними системами, а також з низкою низькомолекулярних речовин, сукупно формують біохімічний компонент антиоксидантної системи організму [Меньщикова з співавт., 2006].

Одним з кінцевих продуктів ПОЛ є насичені низькомолекулярні вуглеводні (етан, гексан, пентан), які в нормальних умовах переходять в газоподібний стан.

Ідентифіковано понад 20 типів окисних пошкоджень молекул нуклеїнових кислот: різні пошкодження підстав, виникнення одно-та двох цепочечних розривів, зшивок і хромосомних аберацій. Пряма дія і на ДНК не викликає ушкодження підстав чи освіти зшивок між основами. -радикал, который эффективно взаимодействует с дезоксирибозой, пуриновыми и пиримидиновыми основаниями. Основним пошкоджуючим агентом виступає OH-радикал, який ефективно взаємодіє з дезоксирибози, пуринових і піримідинових основ. Синглетний кисень більш специфічно, ніж , Взаємодіє з гуаніном. Перексінітріт викликає нітрозілірованіе і дезамінування аміногруп в підставах ДНК, при цьому 8-нітрогуанін є індикатором ушкоджуючої дії пероксинітриту. В умовах окисного стресу в найбільшою мірою пошкоджується ДНК мітохондрій, що пов'язано з низькою активністю систем репарації і низьким зміст гістонових білків, які надають захисну дію [Зенков, Меншикова, Шергін, 1993].

1.3. Характеристика антиоксидантної системи

У процесі еволюції в клітинах для захисту від АФК виробилися спеціалізовані системи: ферментативна антиоксидантна система (АОС) і неферментативного АОС. Як неферментативної АОС можуть виступати: жиророзчинні антиоксиданти (вітамін Е, β-каротин, убіхінон) [Абрамова, 2004], водорозчинні (аскорбат, рутин, глутатіон). Гідрофобні антиоксиданти локалізовані в біомембранах, гідрофільні - в цитозолі клітини.

О D ), катализирующую реакцию дисмутации О ₂ ˉ в Н ₂ О ₂ , каталазу ( C АТ), разлагающей Н ₂ О ₂ , глутатионпероксидазу ( GPO ), глутатион- S - трансферазу ( GS Т), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу ( G 6 FD ), глутатионредуктазу ( GR ), глутатионзависимые ферменты удаляют органические перекиси [Брискин, Рыбаков 2000]. Ферментативна АОС включає: супероксиддисмутазу (S О D), каталізують реакцію дисмутації О ₂ ˉ в Н ₂ О _2, каталазу (C АТ), що розкладає Н ₂ О _2, глутатіонпероксидази (GPO), глутатіон-S - трансферазу (GS Т), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (G 6 FD), глутатіонредуктази (GR), глутатіонзалежної ферменти видаляють органічні перекиси [Бріскін, Рибаков 2000].

Супероксиддисмутаза має кілька ізоферментних форм, що розрізняються будовою активного центру. Мідь-цинкова форма чутлива до ціаніди і міститься в цитозолі та межмембранное просторі мітохондрій клітин еукаріотів, марганецьвмісних форма локалізована в мітохондріях клітин еукаріот, а так само бактерій, екстрацелюлярний високомолекулярна форма SOD (Е-SOD) [Біленко, 1999]. Е-SOD володіє високою спорідненістю до гепарину і добре зв'язується з гепарінсульфатом глікокаліксу ендотеліоцитів. Н в широком диапазоне. Нативна форма SOD витримує нагрівання при 100 ^º С протягом однієї хвилини, стійкий до коливань значень p Н в широкому діапазоні. SOD істотно прискорює реакцію дисмутації О ₂ ˉ, обриваючи тим самим небезпечну ланцюг вільнорадикальних перетворень кисню:

₂ O ₂ + O ₂ О ₂ ˉ + О ₂ ˉ → H ₂ O ₂ + O ₂

HO ^. → H ₂ O ₂ + O ₂ + ^HO. → H ₂ O ₂ + O ₂

^. ₂ + Н ⁺ → H ₂ O ₂ + O ₂ ^HO. ₂ + Н ⁺ → H ₂ O ₂ + O ₂

У певних умовах медьсодержащих форма SOD може взаємодіяти з перекисом водню і виступати в якості прооксидантів, ініціюючи освіта радикалів - супероксиду і гідроксилу:

²⁺ -СОД + H ₂ O ₂ ←→ Cu ⁺ -СОД + 2Н ⁺ + О ₂ ˉ Cu ^{2 +-СОД} + H ₂ O ₂ ← → Cu ^+-СОД + 2Н ^{+ +} О ₂ ˉ

⁺ -СОД + H ₂ O ₂ ←→ Cu ²⁺ -СОД + ОН ^. + ОН ⁺ Cu ^+-СОД + H ₂ O ₂ ← → Cu ^{2 +-СОД} + ^ОН. + ОН ⁺

[Александров,2007]. СОД грає важливу роль у захисті клітин від дії супероксид-аніон радикала, стабілізує клітинні мембрани, запобігаючи процеси ПОЛ, знижуючи рівень О ₂ ˉ, вона захищає від його дезактивуючих дії CAT і GPO [Александров, 2007].

-содержащие соединения, а также опосредованно ферменты глутатионового обмена [Зенков, Меньщикова, 2004]. Регулюючий вплив на активність SOD надають глутатіон, цистеїн, інші SH-містять сполуки, а також опосередковано ферменти глутатіонової обміну [Зенков, Меньщикова, 2004].

Каталаза - фермент, що бере участь у детоксикації нерадикальної активної форми кисню - Н ₂ О _2. Ця гемвмісного фермент, локалізований переважно в пероксисомах клітин. Велика молекулярна маса ферменту перешкоджає його проникненню через клітинну мембрану [Біленко, 1999]. Розкладання Н ₂ О ₂ каталазою здійснюється у два етапи.

CAT + Н ₂ О ₂ → CAT - Н ₂ О ₂

CAT - Н ₂ О ₂ + Н ₂ О ₂ → CAT + 2Н ₂ О + О ₂

При цьому в окисленому стані каталаза працює і як пероксидаза, каталізує окислення спиртів або альдегідів:

→ CАТ + 2Н ₂ О + > C = O CАТ - Н ₂ О ₂ +> CHOH → CАТ + 2Н ₂ О +> C = O

Каталаза інгібується азидом, ціанідом, пероксидом водню у високих концентраціях і деякими органічними гідроперекисів. Каталаза може виступати джерелом утворення АФК. 0,5% кисню, що утворюється в результаті розкладів перекису водню, виникає у збудженому синглетному стані.

– гликопротеин, имеющий в активном центре четыре атома селена. Глутатіонпероксидаза - фермент, службовець для інактивації перекису водню в клітинах вищих тварин. GPO - глікопротеїн, що має в активному центрі чотири атома селену. имеет селеновые изоферменты: внеклеточное GPO , обнаруженная в плазме и молоке, GPO – G 1, выделенная из цитозоля клеток печени и кишечника, а также неселеновый изофермент, идентичный GS Т. Він є гідрофільним з'єднанням, що утрудняє його проникнення в ліпідний шар мембран, основна частина ферменту локалізована в цитозолі, а інша - в мітохондріях. GPO має селенові ізоферменти: позаклітинне GPO, виявлена ​​в плазмі і молоці, GPO - G 1, виділена з цитозолю клітин печінки і кишечника, а також неселеновий ізофермент, ідентичний GS Т.

представляет собой тетрамер, состоящий из четырех идентичных сферических субъединиц. «Класична» GPO представляє собою тетрамер, що складається з чотирьох ідентичних сферичних субодиниць. -связывающих центра. Кожна субодиниця містить по одному атому селену, на тетрамер є два активних GSH-зв'язуючих центру. снижается устойчивость организма к окислительному поражению, что может приводить к развитию свободнорадикальной патологии [Белоусов, Суслова, Трунова, 1998]. При зменшенні рівня GPO знижується стійкість організму до окислювальному ураження, що може призводити до розвитку вільнорадикальної патології [Бєлоусов, Суслова, Трунова, 1998].

катализирует реакцию восстановления глутатионом нестойких органических гидропероксидов, включая гидропероксиды полиненасыщенных жирных кислот, стабильные соединения – оксикислоты: GPO каталізує реакцію відновлення глутатионом нестійких органічних гідропероксидів, включаючи гідропероксид поліненасичених жирних кислот, стабільні сполуки - оксикислоти:

+ ROOH → GSSG + ROH + H ₂ O 2 GSH + ROOH → GSSG + ROH + H ₂ O

, подобно каталазе, способны также утилизировать перекись водорода: Всі GPO, подібно каталази, здатні також утилізувати перекис водню:

+ H ₂ O ₂ → GSSG + 2 H ₂ O 2 GSH + H ₂ O ₂ → GSSG + 2 H ₂ O

участвует в обезвреживании пероксинитрита: Також селеновмісних GPO бере участь у знешкодженні пероксинітриту:

+ ONOO ^- → GSSG + NO + H ₂ O 2 GSH + ONOO ^- → GSSG + NO + H ₂ O

к Н ₂ О ₂ выше, чем у каталазы, поэтому первая более эффективно работает при низких концентрациях перекиси водорода, в то же время в защите клеток окислительного стресса, вызванного высокими концентрациями Н ₂ О ₂ , ключевая роль принадлежит каталазе. Спорідненість GPO до Н ₂ О ₂ вище, ніж у каталази, тому перша більш ефективно працює при низьких концентраціях перекису водню, в той же час у захисті клітин окисного стресу, викликаного високими концентраціями Н ₂ О _2, ключова роль належить каталази. значительно важнее, чем каталаза, так как каталаза сосредоточена в микросомах, а GPO – в цитозоле и митохондриях, сродство GPO к пероксиду водорода значительно выше, поэтому Н ₂ О ₂ элиминируется GPO , в некоторых тканях каталаза почти ответствует и GPO играет главную роль в валовом метаболизме Н ₂ О ₂ [Зубакова, Варакина, Николенко, 1999]. У цілому ж, GPO значно важливіше, ніж каталаза, так як каталаза зосереджена в мікросомах, а GPO - у цитозолі і мітохондріях, спорідненість GPO до пероксиду водню значно вище, тому Н ₂ О ₂ елімінується GPO, в деяких тканинах каталаза майже відповідає і GPO відіграє головну роль у валовому метаболізмі Н ₂ О ₂ [Зубакова, Варакіна, Ніколенко, 1999]. , названный « GPO гидроперекисей фосфолипидов». У клітинах ссавців також виявлений ізофермент GPO, названий «GPO гідроперекисів фосфоліпідів». Ізофермент крім Н ₂ О ₂ і ліпідних гідроперекисів здатний відновлювати гіроперекісі фосфоліпідів, він ефективно взаємодіє з гідроперекисів фосфотіділхоліна, холестерину і ефіру холестерину в мембранах і ліпопротеїнів низької щільності. гидроперекисей фосфолипидов практически полностью подавляет ПОЛ в биомембранах. Спільно з токоферолом GPO гідроперекисів фосфоліпідів практично повністю пригнічує ПОЛ в біомембранах.

в живых клетках увеличивается при действии ионизирующей радиации, интоксикации этанолом, акрилонитрилом, при Е-авитаминозе. Активність GPO в живих клітинах збільшується при дії іонізуючої радіації, інтоксикації етанолом, акрилонітрилом, при Е-авітамінозі. в условиях окислительного стресса, так как он предупреждает возникновение и развитие пероксидации, устраняет ее источники и продукты, GPO – является одним из важнейших компонентов ферментативной АОС [Брискин, Рыбакова, 2000]. Особливо важлива роль GPO в умовах окислювального стресу, так як він попереджає виникнення і розвиток пероксидації, усуває її джерела і продукти, GPO - є одним з найважливіших компонентів ферментативної АОС [Бріскін, Рибакова, 2000].

-трансфераза входит в семейство ферментов, нейтрализующих токсическое влияние различных гидрофобных и электрофильных соединений путем их коньюгации с восстановленным глутатионом, GST локализованы преимущественно в цитозоле клеток. Глутатіон-S-трансфераза входить у сімейство ферментів, що нейтралізують токсичний вплив різних гідрофобних і електрофільних сполук шляхом їх коньюгации з відновленим глутатіоном, GST локалізовані переважно в цитозолі клітин. -защита клеток от ксенобиотиков и продуктов ПОЛ посредством их восстановления, присоединения к субстрату молекулы глутатиона или нуклеофильного замещения гидрофобных групп: Основна функція GST-захист клітин від ксенобіотиків та продуктів ПОЛ за допомогою їх відновлення, приєднання до субстрату молекули глутатіону або нуклеофільного заміщення гідрофобних груп:

+ 2 GSH → ROH + GSSG + H ₂ O ROOH + 2 GSH → ROH + GSSG + H ₂ O

+ GSH → HRSG R + GSH → HRSG

+ GSH → RSG + HX RX + GSH → RSG + HX

способны восстанавливать гидроперокси-группы окисленных фосфолипидов непосредственно в мембранах без их предварительного фосфолипидного гидролиза свободными жирными кислотами. GST здатні відновлювати гідропероксі-групи окислених фосфоліпідів безпосередньо в мембранах без їх попереднього фосфоліпідного гідролізу вільними жирними кислотами. Н токсичные продукты ПОЛ (ноненали, децинали, холестерин- α- оксид) и тем способствуют их выведению из организма. Цей фермент кон'югуються з GS Н токсичні продукти ПОЛ (нонена, деціналі, холестерин-α-оксид) і тим сприяють їх виведенню з організму. является важным компонентом антиоксидантной защиты, особенно от эндогенных метаболитов, образующих при окислительном стрессе [Владимиров, 1998]. Таким чином, GST є важливим компонентом антиоксидантного захисту, особливо від ендогенних метаболітів, що утворюють при окислювальному стресі [Владимиров, 1998].

Глутатіонредуктаза. и GST , две молекулы GST соединяются дисульфидной связью и образуют окисленный глутатион. У багатьох реакціях, що каталізуються GPO і GST, дві молекули GST з'єднуються дисульфідній зв'язком і утворюють окислений глутатіон. в клетках существует специальный фермент – глутатионредуктаза [Зенков, Меньщикова, 2004]. Для відновлення GSSG в клітинах існує спеціальний фермент - глутатіонредуктаза [Зенков, Меньщикова, 2004].

, катализируя обратимое NFDFH – зависимое восстановление GSSG с образованием двух молекул GSH . ГР широко поширений флавінових фермент, що підтримує високу внутрішньоклітинну концентрацію GSH, каталізує оборотне NFDFH - залежне відновлення GSSG з утворенням двох молекул GSH.

+ NADFH + H ⁺ → 2 GSH + NADF ⁺ GSSG + NADFH + H ⁺ → 2 GSH + NADF ⁺

ГР міститься в основному в розчинній частині клітини.

, который образуется в пентозофосфатном пути в ходе глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной реакции [Андреев, 1999] Глюкоза-6-фосфатдегідрогеназа. Для відновлення окисленого глутатіону ГР в якості Донара водню використовується NADFH, який утворюється в пентозофосфатному шляху в ході глюкозо-6-фосфатдегідрогеназной реакції [Андрєєв, 1999]

6 FD – фермент, катализирующий начальную реакцию пентозофосфатного пути: восстановление глюкозо-6-фосфата в 6-фосфоглюконат. G 6 FD - фермент, що каталізує початкову реакцію пентозофосфатного шляху: відновлення глюкозо-6-фосфату в 6-фосфоглюконат. ₂ -концы, Эти субъединицы различаются по длине и последовательности аминокислот. Вона складається з двох типів субодиниць, які складаються з 479 амінокислотних залишків, мають один і той же СООН - кінцевий ділянку, але різні NH _{2-кінці,} Ці субодиниці розрізняються по довжині і послідовності амінокислот. 6 FD , с кинетической точки зрения можно рассматривать как двухсубстратную реакцию, протекающую с участием субстрата и кофермента, выполняющего роль второго субстрата. Реакції, що каталізується G 6 FD, з кінетичної точки зору можна розглядати як двухсубстратную реакцію, що протікає з участю субстрату і коферменту, що виконує роль другого субстрату. и ATF , по типу конкурентного ингиирования. Фермент дуже сильно пригнічується NADFH і ATF, за типом конкурентного інгіірованія.

-γ- глутамил- L -цистеинилглицин), который при физиологических значениях рН имеет две отрицательно заряженные карбоксильные группы и положительно заряженную аминогруппу. Глутатіон - трипептид (L-γ-глутаміл-L-цістеінілгліцін), який при фізіологічних значеннях рН має дві негативно заряджені карбоксильні групи і позитивно заряджену аміногрупу.

Наявність γ-глутамільной зв'язку захищає трипептид від деградації внутрішньоклітинними пептідаза, а сульфгідрильних груп цистеїну може служити донором електронів, надаючи глутатіону властивості відновника і здатність видаляти вільні радикали. со свободными радикалами приводит к образованию тиильного радикала GS ^. , который при димеризации с другим GS ^. радикалом дает дисульфид глутатиона ( GSSG ). Одноелектронні реакція GSH з вільними радикалами призводить до утворення тіільного радикала ^GS., Який при димеризації з іншим ^GS. Радикалом дає дисульфід глутатіону (GSSG). ,1995]. Другий тип окисно-відновних реакцій, в яких бере участь глутатіон - це реакції тіол-дисульфідного обміну [Brune, 1995]. При окисно-відновних реакціях третього типу відбувається двухелектронное окислення з утворенням інтермедіату, який потім реагує з другої молекулою, ідентичною першою або відмінною від неї. , а во втором-смешанный дисульфид. При цьому в першому випадку утворюється GSSG, а в другому-змішаний дисульфід.

синтезируется в ходе двух последовательных реакций, катализируемых γ- глутамилцистеинсинтетазой ( γ- GCS ) и GS Н-синтетазой ( GS ). У клітинах всіх типів GSH синтезується в ході двох послідовних реакцій, що каталізуються γ-глутамілцістеінсінтетазой (γ-GCS) і GS Н-синтетазою (GS). катализирует образование пептидной связи между γ- карбоксильной группой глутамата и α- аминогруппой цистеина. γ-GCS каталізує утворення пептидного зв'язку між γ-карбоксильною групою глутамату і α-аміногрупи цистеїну. Глутатіонсінтетаза утворює пептидний зв'язок між α-карбоксильною групою цистеїну в складі γ-глутамілцістеіна і α-аміногрупи гліцину. -зависимыми, имеют сходный каталитический механизм и протекают через образование ацилфосфатного интетрмедиата [ Davies ,1995]. Обидві реакції є ATF-залежними, мають подібний каталітичний механізм і протікають через освіту ацілфосфатного інтетрмедіата [Davies, 1995].

Статус глутатіону визначається як загальна концентрація глутатіону і кількісне співвідношення між різними формами, в яких він існує в клітці. Статус глутатіону обумовлений динамічною рівновагою між реакціями синтезу, деградації, транспорту, окислення та відновлення і тому може змінюватися в залежності від переважання тих чи інших реакцій, що визначається станом клітини і навколишнього середовища. может наблюдаться как при нормальных физиологических ситуациях, так и при стрессах. Зміна статусу GSH може спостерігатися як при нормальних фізіологічних ситуаціях, так і при стресах. у эукариот широко используется ингибитор γ- глутамилцистиинсинтетазы [ Gebhardt ,1984]. Для інгібування синтезу GSH у еукаріотів широко використовується інгібітор γ-глутамілцістіінсінтетази [Gebhardt, 1984].

важнейшим внутриклеточным редокс-буфером. Редокс-активність глутатіону при одночасній його стійкості до окислення киснем, висока концентрація і можливість підтримання у відновленому стані роблять GSH найважливішим внутрішньоклітинним редокс-буфером. и Г S Т [ Davies ,1995]. Редокс система глутатіону включає в себе сам глутатіон, GPO і Г S Т [Davies, 1995].

S H реагирует с очень большим числом электрофильных компонентов с образованием G S H -конъюгатов. G S H реагує з дуже великим числом електрофільних компонентів з утворенням G S H-кон'югатів. SТ, затем коньюгаты деградируют до относительно безвредных меркаптуровых кислот. Ця реакція може відбуватися спонтанно або каталізувати ферментами G SТ, потім кон'югати деградують до відносно нешкідливих меркаптурових кислот. Глутатіон також бере участь у детоксикації деяких реактивних альдегідів, які можуть утворюватися при окисних процесах в клітинах. (Рис. 2). У еукаріотів глутатіон відіграє ключову роль в захисті від окислювального стресу як кофактор селенозавісімих і незалежних GPO (Мал. 2). , и снижение соотношения GSH / GSSG является одним из основных признаков окислительного стресса в клетках [ Brune ,1995]. При окислювальному стресі йде інтенсивне окислення GSH, і зниження співвідношення GSH / GSSG є одним з основних ознак окисного стресу в клітинах [Brune, 1995].

Захист живих організмів від окисних пошкоджень не обмежується розглянутими вище антиоксидантними системами, а здійснюється так само великою кількістю репараційних систем, специфічними протеолітичними ферментами; макрофагами і гепатоцитами, ефективно захоплюючими окислені ліпопротеїни через спеціальні «скевенджнр-рецептори». Ця ще раз свідчить про важливість і складності окислювальних процесів за участю АФК, що протікають в живому організмі.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

2.1. Об'єкт дослідження

Об'єктом дослідження стали еритроцити крові практично здорових людей, що проживають в Радянському та Жовтневому районах м. Красноярська, а так само еритроцити крові людей з ЛОР-патологіями.

Всього обстежено 131 осіб у віці від 18 до 54 років, забір матеріалу дослідження проводився на клінічно-діагностичної лабораторії ГУ НДІ медичних проблем Півночі СО РАМН. Групу контролю склали 102 практично здорові людини, неболевших гострими респіраторними захворюваннями в протягом останнього місяця і не мають хронічних ЛОР-захворювань. Здорові люди були відібрані в 2-х районах міста Красноярська ЛОР-лікарем за даними клінічного огляду. Група людей з ЛОР-захворюваннями склала 29 осіб, які проживають в різних районах м. Красноярська.

Таблиця 1

Характеристика матеріалу дослідження та обсягу проведених робіт

, GST и GR , а так же содержание GSH проводили в упакованных эритроцитах крови (табл. 1). Визначення активності глутатіонзалежної ферментів - GPO, GST та GR, а так само зміст GSH проводили в упакованих еритроцитах крові (табл. 1).

2.2. Приготування еритроцитів

Гепаринизированную кров центрифугують 20 хвилин при 3000 об / хв. ). (1700 g). Після центрифугування прибирають шар плазми і тонку білу лейкоцитарну плівку. Плазму відбирають окремо і зберігають. ) и центрифугируют по 15 минут при 3000 об/мин. Частину, що залишилася після відбору плазми еритроцитарну масу тричі відмивають фізіологічним розчином (0,9%-ним NaCl) і центрифугують по 15 хвилин при 3000 об / хв. ). (1700 g). Супернатант відкидають. Остання центрифугування проводять протягом 20 хвилин для більш щільної упаковки клітин [Авраамового, Титова, 1978].

2.3. Визначення вміст гемоглобіну

определяют унифицированным гемиглобинцианидным методом с использованием набора реактивов фирмы “Агат-Мед”. Зміст Hb визначають уніфікованим геміглобінціанідним методом з використанням набору реактивів фірми "Агат-Мед".

крови при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в Met - Hb , образующий с ацетонциангидрином гемиглобинцианид (цианметгемоглобин), оптическая плотность которого при 540 нм пропорциональна концентрации Hb в образце крови [Меньшиков, 1987]. Принцип методу полягає в наступному: Hb крові при взаємодії з залізосиньородистим калієм (червона кров'яна сіль) окислюється в Met - Hb, утворює з ацетонціангідрін геміглобінціанід (ціанметгемоглобін), оптична щільність якого при 540 нм пропорційна концентрації Hb в зразку крові [Меньшиков, 1987]. в опытных образцах выражали в граммах на литр упакованных эритроцитов. Зміст Hb у дослідних зразках виражали в грамах на літр упакованих еритроцитів.

Реактиви:

1. Трансформуючий реагент - суха суміш натрій вуглекислий кислий, 1,0 г, калій залізосиньородистим, 200 мг.

2. Ацетонціангідрін.

3. Калібрувальний розчин гемоглобін з концентрацією 120 г / л.

Хід визначення

До 5 мл трансформуючого розчину додають 0,02 мл крові (розведення в 251 разів) або гемолізаті, добре перемішують. Визначення проводять через 10 хвилин проти холостої проби (трансфор мірующего розчину), забарвлення стійка протягом не менше 1 години.

При використанні фотоколориметр визначення проводять в діапазоні довжин хвиль 500-560 нм (зелений світлофільтр). Калібрувальний розчин гемоглобіну обробляють також, як і пробу цільної крові. Розрахунок вмісту гемоглобіну проводять за формулою:

,

де:

– содержание гемоглобина в опытной пробе, г/л; Hb - вміст гемоглобіну в дослідній пробі, г / л;

о – оптическая плотность опытной пробы; D о - оптична щільність дослідної проби;

– оптическая плотность калибровочной пробы; Dx - оптична щільність калібрувальної проби;

120 - вміст гемоглобіну в калібрувальному розчині, г / л.

2.4. Визначення кількості відновленого глутатіону

Принцип методу SH с ДТНБК (5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой) с образованием окрашенного в желтый цвет аниона 2-нитро-5-тиобензоата. заснований на взаємодії G SH з ДТНБК (5,5 '-дітіо-біс-2-нітробензойною кислотою) з утворенням забарвленого в жовтий колір аніону 2-нітро-5-тіобензоата. Збільшення концентрації жовтого аніону в ході даної реакції реєстрували спектрофотометрично при довжині хвилі 412 нм [Beutler, 1990].

Хід визначення

Готуємо гемолізат додаванням 0,2 мл відмитих від плазми і упакованих еритроцитів до 1,8 мл дист. Н ₂ О, охолодженої до 0 º С. Для осадження білків до гемолізаті додавали 3 мл осаджуючої розчину. Проби ретельно перемішували і після 20 хвилинного стояння при кімнатній температурі фільтрували через великопористий фільтр. Фільтрат повинен бути прозорим і безбарвним. 1 мл фільтрату поміщали в спектрофотометричних кювету об'ємом 3 мл, додавали 4 мл фосфатного буфера. Потім в пробу вносили 500 мкл розчину ДТНБК. Відразу ж після перемішування повинна з'явитися жовте забарвлення через утворення дисульфіду глутатіону з ДТНБК. Пробу фотометріровалі при довжині хвилі 412 нм у кюветі з товщиною шару 1,0 см. Оскільки розчин ДТНБК має слабожелтую забарвлення, паралельно з досвідченою пробою готували контрольну, що містить замість фільтрату облягати розчин, розведений дист. Н ₂ О в відношенні 2:5.

Реактиви:

1. Облягати розчин: 1,67 г крижаної ортофосфорної кислоти, 0,2 г ЕДТА і 30 г хлористого натрію розчиняли в дист. Н ₂ О і доводили до мітки 100 мл.

2. ₂ HPO ₄ Фосфатний буфер: 0,3 М Na ₂ HPO ₄

3. ДТНБК: 0,02%-ний розчин, приготовлений на 1%-ном розчині цитрату натрію

SH с ДТНБК и выражали в мкмоль на грамм Hb . Зміст відновленого глутатіону розраховували з урахуванням коефіцієнта молярної екстинкції (13600 М ^-1 'см ^-1) пофарбованого аніону, що утворюється при взаємодії G SH з ДТНБК і виражали в мкмоль на грам Hb.

Зміст глутатіону розраховують за формулою:

,

де:

; С - концентрація відновленого глутатіону, мкмоль / г Hb;

Е ₁ - оптична щільність дослідної проби до додавання ДТНБК;

Е ₂ - оптична щільність дослідної проби після додавання ДТНБК;

138 - розведення еритроцитів в реакційній пробі;

– гемоглобин, г/л; Hb - гемоглобін, г / л;

1000 - коефіцієнт для перерахунку концентрації глутатіону від молярної до міллімолярной;

– отношение оптической плотности контрольной пробы до добавления ДТНБК (Е ₁ F - відношення оптичної щільності контрольної проби до додавання ДТНБК (Е ₁ ) І після додавання (Е ₂ );

13600 - коефіцієнт молярної екстінціі пофарбованого катіона, що утворюється при взаємодії GSH з ДТНБК;

2.5. Визначення активності глутатіонпероксидази

Принцип методу: SH с гидроперекисью трет-бутила (ГПТБ). глутатіонпероксидаза каталізує реакцію взаємодії G SH з гідроперекисів трет-бутилу (ДПТБ). SH в пробах до, и после инкубации с модельным субстратом в ходе цветной реакции с ДТНБК [Paglia, Valentine , 1967]. Активність ферменту при цьому може бути оцінена по зміні змісту G SH в пробах до, і після інкубації з модельним субстратом в ході кольоровій реакції з ДТНБК [Paglia, Valentine, 1967].

Хід визначення

Відмиті та упаковані еритроцити гемолізованих охолодженої до 0 º С водою у співвідношенні 1:200. 0,2 мл гемолізаті змішували з 0,73 мл складного буфера і термостатіровалі 10 хв при 37 ° С. Реакцію ініціювали внесенням у реакційну суміш 0,07 мл 0,14%-ного розчину ДПТБ (комерційний препарат). Строго за секундоміром через 5 хв інкубації при 37 ° С реакцію зупиняли додаванням 0,2 мл 20%-ного розчину Тху. У контрольні проби 0,14%-ний розчин ДПТБ вносили після осадження білка Тху. Отримані проби центрифугували при 1700g протягом 10 хв. Супернатант використовували для визначення кількості відновленого глутатіону: до 0,1 мл супернатанту додавали 2,65 мл 0,1 М трис-HCl буфера. Після перемішування проби фотометріровалі на СФ-26 при довжині хвилі 412 нм у кюветі з довжиною оптичного шляху 1,0 см проти дист. Н ₂ О. , окисленного за 1 минуту на грамм Hb , используя коэффициент молярной экстинкции (13600 М ^-1 ´ см ^-1 ) окрашенного аниона, образующегося при взаимодействии G SH с ДТНБК. Активність ферменту в еритроцитах виражали в мкмоль GSH, окисленого за 1 хвилину на грам Hb, використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції (13600 М ^-1 'см ^-1) пофарбованого аніону, що утворюється при взаємодії G SH з ДТНБК.

Реактиви:

1. -буфер, pH 8,5, содержащий 6мМ ЭДТА и 12мМ азид натрия. Складний буфер: 0,1 М Трис-HCl-буфер, pH 8,5, що містить 6мм ЕДТА і 12мм азид натрію. Безпосередньо на цьому буфері готують 4,8 мМ розчин GSH

2. 0,14%-ний розчин трет-бутил гідропероксиду

3. 20%-ний розчин Тху

4. 8,5 0,1 М трис-HCl буфер, pH 8,5

5. ДТНБК на абсолютному метанолі, 0,01 М

Активність розраховують за формулою:

,

де:

А - активність ферменту, мкмоль / хв × л;

в опытной и контрольной пробах; Δ С - різниця концентрацій GSH у дослідній і контрольній пробах;

_{пр .} – объем пробы, используемый для определения концентрации GPO V _пр. - Об'єм проби, використовуваний для визначення концентрації GPO

– время инкубации; t - час інкубації;

_{р.с .} .- объем реакционной смеси; V _р.с.. - Обсяг реакційної суміші;

201 - ступінь розведення еритроцитів у гемолізаті;

от молярной к миллимолярной; 1000 - коефіцієнт для перерахунку активності GPO від молярної до міллімолярной;

– гемоглобин г/л; Hb - гемоглобін г / л;

можно также выразить в мкмоль\мин на 1 г Hb Активність GPO можна також висловити в мкмоль / хв на 1 г Hb

2.6. Визначення активності глутатіон-S-трансферази

SH и 1-хлор-2,4-динитробензолом (ХДНБ). Принцип методу: активність глутатіон-S-трансферази визначали за швидкістю утворення глутатіон-S-кон'югатів між G SH і 1-хлор-2 ,4-динітробензолів (ХДНБ).

., 1974]. Збільшення концентрації кон'югатів в ході реакції реєстрували спектрофотометрично при довжині хвилі 340 нм (максимум поглинання глутатіон-S-ХДНБ) [Habig et al., 1974].

Хід визначення

Джерелом ферменту служив осмотичний гемолізат, який готували додаванням до одного обсягу упакованих еритроцитів двадцяти обсягів дист. Н ₂ О, охолодженої до 0 ° С. У кювету з довжиною оптичного шляху 1,0 см, що містить 2,5 мл 0,1 М калій-фосфатного буфера рН = 6,5, додавали 0,2 мл 0,015 М розчину відновленого глутатіону і 0,1 мл гемолізаті. Реакцію ініціювали внесенням до кювету 0,2 мл 0,015 М ХДНБ (готували на абсолютному метанолі). Паралельно дослідної готували контрольну пробу, в яку замість гемолізаті вносили дист. Н ₂ О. Реєстрацію оптичної щільності проводили при t = 25 ° C і довжині хвилі 340 нм проти води відразу після перемішування протягом трьох хвилин. . Активність ферменту розраховували, використовуючи коефіцієнт екстинкції для ГS-ХДНБ при довжині хвилі 340 нм, рівний 9,6 мМ ^-1 * см ^-1, і висловлювали в ммоль утворюються глутатіон S-кон'югатів у хвилину на грам Hb.

Реактиви:

1. 0.1м калій - фосфатний буфер РН6, 5;

2. Н; 0.015М розчин GS Н;

3. 0.015М розчин ХДНБ.

рассчитывают по следующей формуле: Активність GPO розраховують за такою формулою:

де:

А - активність ферменту, моль \ хв × Hb

– изменение оптической плотности в мин. Δ E - зміна оптичної щільності в хв.

– толщена кюветы (1см) d - товща кювети (1см)

– коэффициент разведения эритроцитов в пробе f - коефіцієнт розведення еритроцитів у пробі

ε - коефіцієнт молярної екстинкції при χ = 340 нм (9600М ^-1 × см ^-1)

– гемоглобин г/л Hb - гемоглобін г / л

от молярной к миллимолярной; 1000 - коефіцієнт для перерахунку активності GST від молярної до міллімолярной;

_пр. – объем пробы, используемый для определения активности GST V _пр. - об'єм проби, використовуваний для визначення активності GST

_{р.с .} .- объем реакционной смеси; V _р.с.. - Обсяг реакційної суміші;

2.7. Визначення активності глутатіонпероксидази

, которая регистрируется спектрофотометрически по уменьшению оптической плотности при длине волны 340 нм . Принцип методу: визначення активності глутатіонредуктази засноване на вимірюванні швидкості окислення NADPH, яка реєструється спектрофотометрично щодо зменшення оптичної щільності при довжині хвилі 340 нм.

Для визначення активності глутатіонредуктази використовували осмотичний гемолізат, приготований таким чином. До одного обсягу упакованих та відмитих від плазми еритроцитів додавали дев'яти кратний обсяг холодної дистильованої води.

Хід визначення:

, 0,1 мл гемолизата и 0,1 мл раствора GSSG . У спектрофотометричних кювету з відстанню між робочими гранями 10 мм послідовно вносять 2,7 мл калій-фосфатного буфера, 0,1 мл розчину NADPH, 0,1 мл гемолізаті і 0,1 мл розчину GSSG. Реакція запускається додаванням до проби окисленого глутатіону. Суміш перемішують. . Изменеие оптичної щільності реєструють через 1 хвилину протягом 3 хвилин проти проби, що містить всі компоненти, крім GSSG.

Реактиви:

1. ; 50 мМ калій-фосфатний буфер, рН 7,0, що містить 1мМ EDTA;

2. ; 0,1 мМ розчин NADPH;

3, 0,5 мМ розчин окисленого глутатіону (зберігають у замороженому вигляді).

в минуту. Активність ферменту виражають в мкмоль ¤ р Hb в хвилину. Розрахунок роблять за формулою:

,

де:

А - активність глутатіонредуктази;

D Е - зміна оптичної щільності;

К - коефіцієнт, що враховує розведення еритроцитів в реакційній пробі, рівний 300;

в см ^-1 / мМ ^-1 , при длине волны 340 нм; 6,22 - коефіцієнт екстинкції для NADPH в см ^-1 / мМ ^-1, при довжині хвилі 340 нм;

– время наблюдения, мин; t - час спостереження, хв;

– расстояние между рабочими гранями кюветы (10 мм); d - відстань між робочими гранями кювети (10 мм);

– гемоглобин в г / л. Hb - гемоглобін у г / л.

2.8. Статистична обробка результатів

7.0. У роботі використані стандартні статистичні прийоми підрахунку, медіани, визначення 25 і 75 перцентеля за допомогою пакету прикладних програм Statistica 7.0. Достовірність отриманих даних оцінювали за допомогою непараметричного критерію Манна-Уітні, з вірогідністю Р <0,05, кореляційний аналіз за Спірману.

РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ І ЇХ ОБГОВОРЕННЯ