Реферат на тему:
Поділ білків за розмірами з використанням DDC-Na
2009
Поділ білків за розмірами з використанням DDC-Na
Електрофорез білків у простій системі зручно використовувати для їх поділу, але не характеристики. Електрофоретична рухливість кожного білка в простій системі залежить одночасно і від маси білка, і від його сумарного електричного заряду, і від конфігурації, і від жорсткості упаковки білкової глобули. Внесок кожного з цих факторів невідомий і може істотно змінюватися в залежності від умов електрофорезу. Для встановлення суворої кореляції між яким-небудь одним з перерахованих параметрів і електрофоретичною рухливістю білка треба виключити вплив всіх інших.
Електрофорез у ПААГ з використанням DDC-Na дозволяє розділяти білки, що розрізняються між собою тільки за молекулярною масою. Для цього суміш білків у вихідному препараті обробляють не менш, ніж трикратним надлишком DDC-Na (по вазі). За рахунок гідрофобних взаємодій детергент однаково зв'язується з переважною більшістю білків у співвідношенні 1,4 мг DDC-Na на 1 мг білка.
Величезний надлишок повністю дисоційованому залишків сульфокислоти, що привноситься детергентом, в більшості випадків робить несуттєвою роль власного заряду білка. и длиной, зависящей только от числа звеньев этой цепи, а следовательно — от молекулярной массы белка. Завдяки електростатичному відштовхуванню тісно розташованих негативно заряджених залишків сірчаної кислоти, білкова ланцюг розпрямляється і набуває форми жорсткої палички з поперечником -1,6 m і довжиною, що залежить тільки від числа ланок цього ланцюга, а отже - від молекулярної маси білка.
- S связи внутри молекулы белка. Одночасно з обробкою DDC-Na необхідно забезпечити можливість повного розгортання білкової ланцюга, а для цього - розірвати всі ковалентні S - S зв'язку всередині молекули білка. З цією метою білок перед електрофорезом обробляють ще й високою концентрацією (1%) (3-меркаптоетанол при підвищеній температурі.
- BIgM , где А и В — коэффициенты, зависящие от пористости геля, температуры и других условий эксперимента. Електрофретіческая рухливість, тобто швидкість міграції при напруженості поля 1 В / см, жорсткого комплексу білок DDC-Na виявляється пов'язаної з молекулярною масою білка (М) простим співвідношенням A - BIgM, де А і В - коефіцієнти, які залежать від пористості гелю, температури та інших умов експерименту. Величину і 'зручніше представляти у відносних одиницях, що виражають ставлення шляхів міграції білка і «лідируючого барвника» - бромфенолового синього. . Позначимо це відношення Rf. Така заміна відіб'ється тільки на значенні коефіцієнтів А і В, про які нам відомо тільки те, що вони в даних умовах досліду однакові для всіх білків. Змінені величини коефіцієнтів теж будуть постійними величинами в даному досвіді. Тому замість їх визначення користуються методом порівняння з відомими за своєю масою «маркерами». Одночасно з електрофорезом досліджуваної суміші білків, окремим треком на тій же платівці, тобто в тотожних умовах експерименту, поділяють суміш відомих маркерів. = f ( Rf ), которая, естественно, оказывается прямолинейной. З їх допомогою по точках будують залежність lgM = f (Rf), яка, природно, виявляється прямолінійною. М, а следовательно и М для исследуемого белкА. Спираючись на цю залежність, можна графічно, по виміряних величин Rf визначити значення lg М, а отже і М для досліджуваного білка. Зрозуміло, вся попередня обробка детергентом і Р-меркаптоетанолом повинна бути проведена суворо однаково для цього білка і всіх маркерів.
- Na . Вибір буфера в цьому варіанті не грає ролі, так як заряд білка визначається його комплексом з DDC - Na. Зазвичай використовують нейтральний буфер, додаючи в нього 0,1% DDC-Na, щоб підтримати комплекс детергенту з білками »
Для білків з молекулярною масою менше 12 тисяч дальтон визначення М стає ненадійним. Для різних діапазонів мас білків рекомендується використовувати ПААГ різної пористості, згідно наступної таблиці:
Діапазон М (тисяч дальтон)% ПААГ 12-43 15 16-68 10 36-94 7,5 57-212 5
Сам процес електрофорезу і забарвлення білків після його закінчення виробляють як зазвичай, але DDC-Na від білка переважно відмити до забарвлення, вимочуючи гель в 50%-ної Тху протягом ночі.
DDC-Na в комплексі з білком в деякій мірі перешкоджає фарбуванню (великий негативний заряд!).
Двовимірний електрофорез в ПААГ
Повне поділ складної суміші білків не завжди вдається здійснити в ході одного електрофоретичного експерименту. Завжди існує ймовірність того, що в даній системі електрофорезу різні білки мігрують в одній зоні або в силу близькості їх розмірів, або через збігу їх електрофоретичних подвижностей при обраному значенні рН, або, нарешті, в результаті несприятливої для поділу комбінації цих параметрів. Тому в складних випадках фракціонування суміші білків має сенс використовувати поділ в першому напрямку як вихідне для поділу в другому, перпендикулярному першому напрямку при змінених умовах електрофорезу.
Для цього трек першого напряму (без осадження і забарвлення білків у ньому) вирізають і накладають на стартову зону платівки другого напрямку (без кишень). Контакт між двома гелями забезпечують заливаючи місце їхнього зіткнення розплавленим розчином агарози в тому ж буфері. Електрофорез, природно, ведуть у напрямку, перпендикулярному смужці. Кожна негомогенна смуга в ній може дати кілька плям у другому напрямку, якщо в нових умовах містилися в ній білки знайдуть різну електрофоретична рухливість. У результаті після осадження та фарбування на платівці з'являється картина розподілених по всій поверхні плям («фінгерпрінт»). Число плям різних білків, що вдається зафіксувати на одній пластині може досягти декількох сотень. На рис. , Bogorad Anal . Biochem . 57 200, 1974). 42 відтворена картина розподілу плям, отриманих при двовимірному електрофорезі білків з великої субодиниці однієї з бактерій (у роботі Mets, Bogorad Anal. Biochem. 57 200, 1974).
Витяг білків з гелю після електрофорезу
Для цілей аналітичної ідентифікації білки з ПААГ (без осадження і забарвлення) можна перенести на нітроцелюлозні мембранний фільтр. Такі фільтри мають здатність сорбувати основні білки. Перенесення здійснюється шляхом вимивання білкових смуг з гелю струмом буфера в напрямку, перпендикулярному поверхні пластинки. Фільтр накладають безпосередньо на вологий гель. Пристрій для забезпечення струму буфера від гелю до фільтру буде описано нижче у зв'язку з електрофорезом ДНК.
У результаті на фільтрі виходять «репліки» білків, розділених в гелі. связывались с ДНК или разделению подвергались рибосомальные белки, связывающиеся с РНК рибосом. Для їх ідентифікації можна використовувати характерні реакції, іноді ферментативні або імунні (див. нижче), а також гібридизацію з міченими радіоактивним фосфором ДНК або РНК, якщо ці білки in vivo зв'язувалися з ДНК або поділу піддавалися рибосомальні білки, що зв'язуються з РНК рибосом.
Електрофорез нуклеїнових кислот
Головне, що з точки зору електрофорезу відрізняє нуклеїнові кислоти від білків - це значний за величиною сумарний негативний заряд, обумовлений дисоціацією численних залишків фосфорної кислоти у зв'язках між нуклеозидами. рН навколишнього середовища мало впливає на цей заряд. Тому електрофорез можна вести не в буфері, а в будь-якому відповідному іоносодержащем розчині, наприклад у слабкому розчині лугу. . У всіх випадках у рідке середовище вносять ЕДТА до концентрації 1-2 mM. Це необхідно для блокування дії нуклеаз та попередження осадження (особливо РНК) двовалентними металами.
Таким чином, поділ фрагментів ДНК і РНК електрофорезом доводиться вести тільки за розміром. Проте розміри ці можуть варіювати в дуже широких межах: від десятків нукл-отідних ланок до багатьох сотень тисяч, а якщо виражати через молекулярні маси, то від кількох тисяч до сотень мільйонів дальтон.
Природно, що для фракціонування щодо коротких фрагментів використовують електрофорез у ПААГ, а для поділу високомолекулярних ДНК, більш великопористий носій - агарози. З нею ми познайомимося трохи пізніше. А поки в порядку зв'язку з попередніми параграфами доречно зробити кілька зауважень про електрофорезі ДНК в ПААГ. У нижченаведеної таблиці представлені рекомендації з вибору пористості гелю в залежності від розмірів щодо коротких фрагментів ДНК, охарактеризованих числом пар основ (п.о.):
Діапазон п.о. (Штук)
6-100
25-150
40-200
60-400
80-500
1-2 тис.
% ПААГ
20
15
12
8
5
3,5
В останньому діапазоні цієї таблиці знаходяться граничні розміри ДНК, доступні автоматичного секвенированию послідовності нуклеотидів. Цей революційний метод аналізу ДНК буде розглянуто в наступному розділі.
Зараз же, перш, ніж перейти до електрофорез в агарози, я хочу познайомити учнів і читачів з новими ідеями фракціонування великих фрагментів ДНК в ПААГ з оригінальним використанням імпульсів електричного напруги, що подаються на гель. Ці імпульси подаються по черзі у двох взаємно перпендикулярних напрямках. Ідея тут полягає ось у чому. Навіть дуже довга і гнучка молекула ДНК може протиснутися через відносно малі пори гелю, якщо вона витягнута в напрямку просування до «основному» аноду, скажімо, розташованому внизу платівки. Напруга на цей анод подається не постійно, а імпульсами. Другий, «допоміжний» анод створює напруженість електричного поля, перпендикулярну основному напрямку руху ДНК до низу платівки. Напруга на нього подається теж досить потужними, але більш короткими імпульсами, ніж на основний анод, чергуючись з ними.
Призначення «перпендикулярного» електричного поля полягає в тому, щоб повертати довгі молекули великих ДНК так, щоб у момент подачі «поздовжнього» імпульсу вони знаходилися в положенні, сприятливому для руху уздовж пластинки вниз, до основного аноду. Чим довше ланцюга ДНК, тим повільніше вони будуть міняти свою орієнтування і тому повільніше порухатися в потрібному напрямку. Автори методу стверджують, що таким чином в ПААГ їм вдавалося розділяти фрагменти ДНК довжиною до п'яти мільйонів пар основ.
Запропоновано декілька варіантів використання цієї ідеї. В одному з них чергуються імпульси однакової сили направлені кожен під кутом 45 ° до поздовжньої осі пластини, нав'язуючи таким чином молекулам ДНК рух зигзагом, свого роду «рискання». (Ідея, по всій видимості, почерпнута з практики проштовхування через густий натовп людей.)
Гелі агарози
Агарози - це особливо чиста фракція природного, лінійного полісахариду, агару, що виділяється з морських водоростей. Ми з ним вже зустрічалися.
Молекулярна маса одиночних ниток агарози лежить в межах 10-100 тисяч дальтон. Агарози для електрофорезу поставляється у вигляді ліофілізованого (висушеного у вакуумі) порошку. Гелеутворення відбувається при охолодженні навіть дуже розведеного гарячого розчину агарози в буфері. При температурі 84-96 ° С (а у деяких типів агарози вже при 70 °) нитки полімеру плавляться і утворюють з навколишнім водним середовищем однорідну прозору рідину. Вона має яскраво вираженим температурним гістерезисом - застигає при температурі близько 40 ° С. Остигаючи до цієї температури, навіть 0,4%-ні розчини агарози утворюють міцні гелі. У легкоплавких типів агарози температура затвердіння знижується до 30 °. Така особливість агарози полегшує всі маніпуляції з її розчинами, не побоюючись їх затвердіння. Більш того,, розплавлену на киплячій бані завись агарози у воді охолоджують до 50-55 ° і тільки при цій температурі додають концентрат буфера і всі інші добавки, а потім заливають у форму для електрофорезу. Це зручно і не пов'язане з виникненням теплових деформацій.
Остигаючи, хаотично орієнтовані нитки затверділої агарози завдяки множинним водневим зв'язків між нитками збираються в джгути. Ці джгути вільно перехрещуючись, створюють у навколишньому їх рідини дуже великопористий і, разом з тим, жорстку просторову сітку.
Розмір пор гелю агарози, природно, пов'язаний з концентрацією її вихідного розчину. Можна навести деякі рекомендації з вибору цієї концентрації, почерпнуті з досвіду електрофорезу нуклеїнових кислот:
Для нуклеїнових кислот вірусів і великих плазмід 0,4-0,5%.
Для рестріктов ДНК, що містять 5-20 тисяч пар основ 0,7-0,8%.
Для більш коротких рестріктов ДНК і РНК двунітевих рео-вірусу 1,5%.
Для рибосомних РНК - 1,75%.
Для іРНК і рестріктов ДНК до 1000 п.о. - 2%.
Приготування пластини для електрофорезу в агарози дуже просто. Потрібного розміру скло обклеюють з усіх боків по ребру суцільний липкою стрічкою так, щоб її верхній край на кілька міліметрів виступав над поверхнею скла. Остання кладуть на строго горизонтальний столик. Прямо на скло виливають розрахований обсяг ще рідкого розчину агарози. Потім у нього поблизу одного краю скла встановлюють гребінку, подібну до тієї, яку ставлять у форму ПААГ перед його полімеризацією. Тільки на цей раз гребінку занурюють у агарози перпендикулярно склу (зубці її, однак, не повинні торкатися скла). Після застигання агарози гребінку виймають, утворюючи таким чином «колодязі» для препаратів. Електрофорез ведуть в горизонтальному положенні (в треках), накладаючи гноти, що йдуть від резервуарів з буферами. Робоче значення напруженості поля 2-5 В / см.
ДНК, особливо двунітевих, а також і РНК добре фарбуються жовтим флюоресцентним барвником - бромистим ці-діем. Цей барвник несе позитивний заряд, що дозволяє йому взаємодіяти з фосфатними групами нуклеїнових кислот. Крім того він здатний інтеркальований (вбудовуватися) між підстав двунітевой ДНК, що призводить до різкого посилення його флюоресценції при висвітленні ультрафіолетовим світлом. Забарвлення можна виробляти і після електрофорезу вимочуванням гелю протягом 0,5-1 години на водному розчині барвника (1 мкг / мл), або ж вводити його безпосередньо в гель. В останньому випадку можна стежити за рухом смуг в гелі. Скляну пластину в цьому випадку висвітлюють УФ-лампою знизу. Чутливість забарвлення висока. Можна спостерігати і фотографувати смуги, що містять 0,01 мкгДНК.
В кінці електрофорезу ДНК можна зафіксувати в гелі осадженням з розчину, вимочуючи гель в 70%-ном етанолі.
Піпетки
Звичайно, сучасні мікропіпетки зовсім не схожі на ті, які вживають у шкільному хімічному кабінеті. Їх влаштований так. Досить об'ємисту, пластмасову (зовні) рукоятку піпетки зручно тримати чотирма пальцями руки, залишивши великий палець вільним для натискання кнопки, що стирчить з верхнього кінця рукоятки. Донизу з неї виходить довгий, злегка конічний металевий стрижень, на кінець якого щільно надягає конічний порожнистий наконечник зі спеціальної пластмаси.
У ручці захований механізм, головну частину якого складають дуже точно підігнані один до одного тонкий циліндр і поршень, віджимаємо догори пружиною. Натисканням кнопки поршень переміщається вниз. Опустивши наконечник в рідину і звільнивши попередньо натиснуту кнопку набирають в наконечник обсяг в 1, 2, 3 і більше мікролітрів - відповідно до калібруванням піпетки. Вторинним натисканням кнопки рідина з наконечника повністю виштовхується. Наконечники поставляються стерилізованими і використовуються одноразово.
Є піпетки з можливістю попереднього регулювання обсягу рідини, наприклад, від 2-х до 20-ти мікролітрів. Регулювання здійснюють поворотом головки гвинта, який встановлює довжину ходу поршня. Обраний обсяг вказує пов'язаний з гвинтом градуйований барабанчик.
Вплив вторинної структури ДНК
У електрофоретичному поведінці однониткових (денатурована ДНК, РНК) і двунітевих молекул нуклеїнових кислот багато чого визначається їх розмірами. У випадку коротких полінуклеотидних ланцюгів їх нативна двунітевих молекула має більш жорстку структуру, ніж таких же розмірів однониткових молекула. Вона важче згинається, проходячи через просторову сітку гелю. У силу цього відносно короткі двунітевих фрагменти ДНК будуть відставати при електрофорезі в ПААГ від денатурованих ДНК такої ж довжини. Така ситуація буде мати місце навіть для ДНК бактеріофага ФГ-174 з молекулярною масою в 3,5 мільйона дальтон. Однак для більш великих молекул ситуація може змінитися на протилежну. Довга двунітевих ланцюжок виявляється вже досить гнучкою: вона просувається через пори гелю як би «звиваючись вужем». Між тим однониткових ланцюг тієї ж довжини згортається в рихлий «хаотичний клубок» такого розміру, що його просування в гелі виявляється більш утрудненим. Денатурована ДНК в цьому випадку при електрофорезі відстає від нативної. Природно, що кордон звернення описаного ефекту залежить від розмірів пор гелю.
Вірусні та мітохондріальні двунітевих ДНК, а також плазміди бактерій мають структуру замкнутого двунітевих кільця. Нативне стан такого кільця - «сверхскрученное» (йому відповідає мінімум внутрішніх напружень). Кільце в цілому згортається в «палять», що сильно збільшує його компактність (форма I). Якщо ж хоча б в одній з двох скручених ниток кільця з'являється одиничний розрив цукрово-фосфатної ланцюга, то джгут розгортається і під дією сил електростатістіческого відштовхування фосфатних груп кільце розправляється. Компактність молекули зменшується, її зовнішні розміри збільшуються (форма II). Що стосується лінійної двухніте-вої молекули ДНК (форма III), то в залежності від середнього розміру пір гелю вона може мігрувати швидше або повільніше, ніж сверхскрученное кільце однаковою з нею маси. Для крупнопористого гелю вирішальним фактором може виявитися компактність форми I; для більш дрібних пір на перший план виступає велика гнучкість лінійної молекули ДНК (форма III).
На рис. . coli : основной ее массы (2), кольцевой плазмидной ДНК (1) и сверхскрученной плазмиды (3) в 0,8% геле агарозы. 1, на правому треку показаний результат фракціонування ДНК E. Coli: основний її маси (2), кільцевої плазмідної ДНК (1) і сверхскрученной плазміди (3) в 0,8% гелі агарози. , Science 195, 391, 1977). (Telford, Science 195, 391, 1977). На лівому треку того ж малюнка вказані положення «маркерів» - плазмід відомої молекулярної маси (відповідні цифри вказані в мільйонах дальтон).
Рис.1
Швидкість міграції лінійних двухнитевой молекул ДНК зменшується із збільшенням їх маси, але лише до певної межі. При молекулярній масі більше 5 мільйонів у 1,6%-ном гелі агарози і при масі більше 12 мільйонів дальтон в 0,8%-ної агарози молекули мігрують практично з однаковою швидкістю, незалежно від їх маси. У цих випадках вирішальну роль відіграє гнучкість - здатність дуже довгих молекул, звиваючись, проходити через гель однаково легко (чи однаково важко) при будь-якій довжині.
Рибосомальні РНК можуть мати істотно більш невигідну для міграції в гелі вторинну структуру, ніж ДНК. Справа в тому, що у великих молекул РНК ця структура представлена численними, що стирчать в усі боки «шпильками». Це - місця локального спаровування в жорсткі двунітевих структури окремих, часто далеко віддалених один від одного по основної послідовності, комплементарних ділянок РНК. Така молекула вже не може просуватися через пори гелю Збираючи основний «сендвіч» (гель, фільтр і облягаючі їх листки фільтрувального паперу) слід перевіряти, що між ними не залишаються бульбашки повітря.
Перенесення ДНК на нітроцелюлозні фільтр займає 2-3 години. Слід зауважити, що короткі фрагменти ДНК на нітроцел-люлозном фільтрі затримуються погано. Якщо це суттєво, то краще використовувати фільтри з так званої, «діазобума-ги» або «ДБМ-паперу». 540». Фірма Ватман випускає її під найменуванням «Whatman 540».
Література
Курашвілі Л.В. Порушення, ліпідного обміну при станах напруги. II Захарьінскіе читання. Тези доповідей. - 1995. -С.127.
Курашвілі Л.В. Активність ліпази і ЛХАТ при тривалому зневодненні. У кн.: Актуальні питання діагностики, лікування і реабілітації хворих. Тези доповідей. - Пенза, 1995. -С.71-72.
Курашвілі Л.В. Фосфоліпідний статус при порушенні водно-електролітного обміну. У кн.: Актуальні питання діагностики, лікування і реабілітації хворих. Тези доповідей. - Пенза, 1995.-С.69-70.