Реферат на тему:
Поліакріламідний гель (ПААГ)
2009
1. Поліакріламідний гель (ПААГ)
Це - продукт полімеризації акриламіду. У результаті розривів подвійних зв'язків та конденсації по них виходять довгі безбарвні нитки лінійного полімеру поліакриламіду. Ці нитки можуть бути ковалентно пов'язані («зшиті») між собою.
Звичайно, в реальних полімерах нитки поліакриламіду зовсім не паралельні, а розташовані хаотично, але в окремих точках свого зближення вони зшиті містками «Бісау». Виходять неправильної форми пори просторової решітки, середній розмір яких, тим не менш, визначається частотою розташування зшивок і концентрацією основних ниток полімерів.
Обидва мономеру: акриламід і «Біс» являють собою добре розчинні у водному середовищі порошки. Освіта просторової сітки гелю відбувається прямо в розчині обраного буфера, який завдяки цьому заповнює всі пори гелю.
Полімеризацію стимулюють добавки в малих кількостях ще двох речовин. Одне з них служить ініціатором процесу полімеризації, друге - прискорює цей процес.
Зміст водної фази в гелі дуже велика - від 70 до 97%.
Пористість і механічні характеристики ПААГ задають шляхом вибору процентного відношення сумарної маси обох полімерів до обсягу гелю. Цю величину прийнято позначати буквою Т. Практично вона варіює від 3 до 30%. Вага зшивки («Бісау») становить зазвичай від 1 до 5% сумарної ваги моном-рів. Цю величину позначають буквою С. При малих значеннях зшивки (С <2%) ПААГ не можна вважати жорсткої регулярної просторової гратами. Скоріше це - довгі нитки, лише в окремих точках, випадковим чином пов'язані між собою. Відстань між цими точками вздовж нитки в середньому становить 50-100 мономерних одиниць. Мігруючі в гелі молекули білка можуть розсовувати довгі, гнучкі ділянки лінійних полімерів акриламіду. На це витрачається енергія, що також позначається уповільненням міграції.
ПААГ добре прилипає до чисто вимитому склу.
У вільної рідини швидкість міграції більшості кислих білків при рН8, 5 складає 0,1-0,5 см / годину при напруженості поля 1 В / см. Для ефективного розділення білків в ПААГ, як показує досвід, середня швидкість їх міграції (завдяки опору гелю) повинна бути в 5-10 разів менше. При нормальній напруженості електричного поля в 10-20 В / см цьому відповідає середня швидкість міграції білків в гелі порядку 0,1-2 см / год. Таким чином, при робочій довжині гелю в 20 см за 10 годин електрофорезу найбільш швидкі білки можуть досягти нижнього кінця гелю в той час, як найбільш повільні просунуться лише на 1 см. Напруга, яка при цьому має подаватися на трубочку гелю, складе 200-400 В. Цифри ці, звичайно, суто орієнтовані.
Вибір значення Т залежить від характеру електрофоретичних подвижностей білків в гелі. Якщо сильно розрізняються розміри білкових молекул, а відношення заряду до маси у них більш-менш однакове, то має сенс вибрати Т максимальним. Розділення у цьому випадку буде відбуватися в основному за рахунок тертя об гель. Причому тим ефективніше, чим більше Т, хоча при цьому у зв'язку із збільшенням тривалості електрофорезу посилиться дифузія білків у смугах. Якщо ж компоненти аналізованої суміші мають свідомо різні відносини заряду до маси, то може виявитися вигідним вести поділ в великопористої гелі (при малих значеннях Т), тобто як би в вільної рідини.
Як суто орієнтовною можна рекомендувати таку, отриману на практиці, таблицю відповідності молекулярних мас поділюваних білків (М) і концентрацій ПААГ (Т):
М (тис. дальтон) Т (%) 10-40 15-20 40-100 10-15 100-300 5-10> 300 5
2. Електрофорез білків у вертикальних пластинах
Перші досліди з електрофорезом білків ставилися у вертикально стоять трубочках. Для простоти викладу я в цій системі розглядав і основні особливості електрофорезу, які залежать від форми гелю. Однак у ході експлуатації досить скоро з'ясувалося, що система трубочок незручна в двох відносинах. По-перше, в трубочці важко домогтися однакового охолодження гелю по всьому її перерізу. По-друге, для порівняння результатів електрофорезу декількох зіставляються препаратів білків потрібно було приготувати стільки ж окремих трубочок в абсолютно однакових умовах складу і полімеризації ПААГ, що важко. Тому з середини 70-х років електрофорез білків ведуть виключно у вертикально розташованих пластинах (рис. 1).
2-ПРОКЛАДКИ; 3-ПЛІВКА; 4-ЗАЖИМ
Рис. 1
Зазвичай використовують пластини шириною 8-14 см і довжиною до 30 см. Полімеризацію акриламіду, а потім і сам електрофорез ведуть у формі, утвореної двома пластинами дзеркального скла товщиною 5 мм. Переднє скло (на рис. 37) має виріз, призначення якого буде ясно з подальшого.
Відстань між пластинами, - а значить і товщина гелю, - задається товщиною прокладок з тефлону (0,4-1,5 мм) при ширині 10-15 мм (на малюнку вони показані пунктиром). Ці прокладки встановлюють з боків і внизу форми, за умови щільного прилягання нижньої прокладки до торців бічних. Нижня прокладка - трохи виступає за межі форми, оскільки після затвердіння гелю її слід видалити. Тефлон добре прилягає до дзеркального скла, а нижні торці бічних прокладок можна злегка змастити силіконовим маслом. Прокладки між стеклами надійно затискають по всій периферії пружинними затискачами для паперів. (На малюнку показані тільки 4 затискача з одного боку пластини.) Вся камера таким чином повинна бути надійно герметизирована, крім верхнього її краю, на той час, поки в ній буде проходити полімеризація рідкої суміші попередників ПААГ.
Після закінчення цього процесу (про що можна судити за освітою різкого розмежування між гелем і тонким шаром води, яким захищають полімеризацію від контакту з киснем повітря) затискачі можна зняти. Полімеризація займає звичайно 30-40 хвилин.
В аналітичних дослідах на кожній пластині в паралельних «треках» ведуть електрофорез декількох препаратів, склад яких потім можна зіставляти при строго однакових умовах поділу (рис.2).
Рис2.
Для фіксації цих треків в ході полімеризації на верхньому краї гелю формують ряд однакових поглиблень прямокутної форми «кишень», куди потім і вносять різні препарати.
Для цього в ще не заполімерізовавшійся гель вставляють «гребінку» з тефлону, такої ж товщини, як прокладки між склом. Як видно на розрізі, верхня частина гребінки робиться трохи товщі, ніж нижня (з зубцями). Це зручно тому що дозволяє встановлювати гребінку щоразу однаково і рівно - до упору в торець скляної пластини. Рідкий гель заливають між пластинами з таким розрахунком, щоб при опусканні гребінки до упору він заповнював б проміжки між її зубцями. Торці зубців гребінки перед установкою змочують, потерши їх про скло з налитим на нього рідким гелем. Крім того починають вставляти її з деяким перекосом, стежачи за тим, щоб під зубцями не затрималися бульбашки повітря.
Після завершення полімеризації гелю знімають затискачі, видаляють нижню прокладку і виймають гребінку. Весь «сендвіч» зберігає свою цілісність завдяки прилипанню ПААГ до скла. Його встановлюють у простій прилад, склеєний з оргскла - його неважко виготовити в лабораторних умовах (рис. 3). Так, щоб те скло форми гелю, яке має виріз, прилягало до верхнього резервуару приладу. Вирізи у склі й резервуарі збігаються, а друге, не вирізане скло форми гелю, замикає собою обсяг резервуара.
Рис. 3
Його можна заповнювати буфером, який таким чином потрапляє і в кишені гелю. Природно, що всю форму з гелем треба добре притиснути до стінки приладу (краще через гумову прокладку), щоб запобігти витіканню буфера з верхнього резервуара. На дні коробки нижнього резервуара видно опора, на яку ставлять пластини з гелем. Виїмка на цій опорі забезпечує контакт нижнього буфера з нижнім торцем гелю. Необхідно перевіряти, що на цьому торці теж немає бульбашок повітря.
Препарати білків з доданою в них сахарозою або гліцерином вносять до кишені гелю після закінчення складання приладу, обережно подслаівая їх, як було описано вище, під буфер. Препарати повинні бути свідомо звільнені від пилу, нерастворившихся білків та інших сторонніх часток фільтруванням або центрифугуванням.
У верхньому і нижньому резервуарах для буфера видно зволікання електродів. Через Штиркові роз'єми їх приєднують до клем джерела живлення.
У приладі описаного типу можна обійтися і без вирізів у скляній пластині і верхньому резервуарі, якщо електричний ланцюг між верхнім буфером і гелем замкнути через змочений тим же буфером широкий гніт з товстої фільтрувального паперу. Конструкція приладу спрощується, але при цьому слід мати на увазі можливість обсихання гнота, що призведе до збільшення його електричного опору, а отже до зменшення напруги, що подається на гель.
Після закінчення електрофорезу пластини рознімають, відшаровуючись одну з них від гелю з допомогою шпателя. Його засовують між пластинами з боку кишень і злегка повертають. Цю операцію не слід форсувати. Краще спочатку пройтися шпателем з легким натиском уздовж всього верхнього краю пластини, спостерігаючи за тим як між склом та гелем поступово проникає повітря, а потім вже підвести пластину. З другої пластини гель знімають руками і переносять у ванночку для фіксації білків і їх забарвлення. Цю просту операцію слід проводити в рукавичках. Випадковий дотик руки до робочої поверхні гелю при сучасних високочутливих методах фарбування може залишити на гелі артефактні білкове пляма.
Я навмисно так детально описав операцію проведення електрофорезу в цьому простому пристрої, щоб дати учневі чи читачеві уявлення про необхідність виключної передбачливості і ретельності у постановці відповідних експериментів.
3. Завантаження гелю. Ширина білкових смуг
Очевидно, що розподіл близько йдуть зон білків буде тим успішніше, чим тонше самі ці зони. Тому при електрофорезі слід дбати про зменшення товщини білкових зон. Це накладає обмеження на допустиму завантаження кожного треку пластини гелю. В якості орієнтовного максимуму можна прийняти завантаження в 50 мкг білка в кишеню шириною в 5 мм для пластини товщиною в 1 мм. Ідентифікацію смуг білка за їх забарвленні можна проводити і при завантаженнях в 10 разів менших. При перевантаженні білкові смуги бувають різкими в передній своєї частини і розмитими ззаду. У цьому випадку завжди слід зважати на можливість випадіння білка в осад у момент вступу його в гель, коли всі макромолекули стягуються в тонку смужку і локальна їх концентрація сильно збільшується.
У простому варіанті електрофорезу бажано наносити білкову суміш на гель в мінімальному обсязі, щоб висота вихідного шару в кишені була не більше, ніж 2-3 мм. Виходячи з цифри завантаження в 50 мкг можна підрахувати цифру вихідної концентрації білкового препарату в 3-5 мг / мл.
Поліпшення дозволу зон можна добитися шляхом примусового концентрування вихідного препарату білка в тонку смужку в момент його входження в гель. Основний прийом полягає в тому, щоб створити перед гелем область з підвищеною напруженістю електричного поля, де білки мігрують набагато швидше, ніж у робочому гелі. На межі переходу з цієї області в гель вони будуть стягуватися в тонку смужку, так як знаходилися спочатку далеко позаду молекули білка наздоженуть що йдуть попереду, уповільнити свій рух при вступі в робочий гель. Підвищення напруженості поля в області кишені, де знаходиться вихідний препарат дуже просто досягти шляхом розчинення цього препарату в робочому буфері, але в 5-10 разів менше концентрованому (меншою молярності), ніж в гелі і верхньому резервуарі. Завдяки зменшенню числа носіїв заряду (наприклад іонів С1) різко збільшується локальний опір шару, що містить препарат, а значить і напруга на ньому порівняно з ділянкою такої ж довжини в гелі. Змішування з буфером верхнього резервуара в кишені завадить присутність сахарози в препараті.
Іншим дуже ефективним, але більш складним способом звуження смуг вже в ході їх міграції є використання градієнта пористості гелю в напрямку зменшення середнього розміру пір при просуванні до нижнього краю пластинки.
Припустимо, що ще при формуванні робочого гелю нам вдалося створити такий градієнт пористості. Зробити це можна за допомогою щодо простого пристрою, зображеного на рис. 4.
Рис.4
У лівому з двох сполучених між собою (у самого дна) склянок знаходиться суміш рідких компонентів майбутнього гелю низької концентрації (наприклад. Т = 5%), а в правому-високій концентрації (Т == 20%). У першому з склянок обертається магнітик мішалки (М). З лівого склянки рідину надходить у перистальтичний насос (Н), який повільно через трубочку (Тр) подає її на дно форми для гелю (Ф).
Якщо склянки однакового діаметра були залиті спочатку до однакового рівня, а сумарний об'єм рідини в них дорівнює обсягу форми, то на дно її буде надходити поступово все більш щільна рідина, яка, розтікаючись по дну, стане відтісняти вгору все більш легкі шари. У підсумку, після полімеризації у дна виявиться дрібнопористий 20%-ний гель, а нагорі - великопористий, 5%-ний. Зміна це буде лінійним по висоті пластини.
При міграції білкових зон в такому «градієнтному» гелі передній край кожної смуги буде постійно опинятися в області трохи більш концентрованого гелю, ніж її задній край. Молекули білка, розташовані ближче до переднього краю смуги будуть гальмуватися тертям про гель сильніше, ніж йдуть ззаду, що і призведе до безперервного звуження смуг в ході їх просування вниз по гелю.
Існує безліч фірмових приладів для проведення електрофорезу білків у вертикальних пластинках. У деяких з них передбачено охолодження поверхонь скляної форми гелю, наприклад, струмом буфера, прокачуваного між резервуарами. Проблеми тепловідведення від гелю ми торкнулися, кажучи про недоліки гелів в трубочках. Для пластин з товщиною гелю в 1 мм природне повітряне охолодження є цілком достатнім. Для більш товстих гелів охолодження циркулюючої водним середовищем виправдано.
Деякі фірми випускають прилади для електрофорезу в горизонтально розташованих пластинах. У цьому є свої переваги. Приміром, пластину з гелем можна покласти на охолоджуваний столик. Але є і недоліки. Хоча б уже згадане обсихання гнотів, без яких у цих системах не можна обійтися. А також необхідність захисту від обсихання і самого гелю, який у цих варіантах відкритий зверху для накладення гнотів (гель лежить на одній платівці). Препарати в цих моделях вносять у «колодязі», розташовані з одного краю гелю перпендикулярно його площині. Можна їх розташувати і на середині гелю для того, щоб в одному досвіді розділяти і основні, і кислі білки - вони будуть мігрувати в різні боки. З проблемою обсихання намагаються впоратися закриваючи весь прилад (резервуари, гноти і гель) герметичною кришкою з плексигласу.
4. Фіксація та фарбування білків в гелі
Як тільки припиняється дія електричного поля, які розділились білкові зони схильні «розпливатися» в силу теплової дифузії. Тому відразу після закінчення поділу білки необхідно фіксувати в тих місцях гелю, куди вони встигли дійти. Найпростіше це зробити осадженням з розчину прямо в гелі. Пористість поліакриламідного гелю дозволяє легко змінювати рідке середовище, навколишнє білки, шляхом простого вимочування витягнутої з форми пластинки гелю у відповідному водному розчині. Для фіксації осадженням придатні міцні розчини оцтової кислоти (СНзСООН) або Тху - трихлороцтової кислоти. Останню використовують у вигляді 10%-ного або 50%-ного розчину.
Часто фіксацію білків поєднують з їх фарбуванням. Для цього барвник розчиняють у Тху або в суміші оцтової кислоти з метанолом.
Історично для фарбування білків в гелі були насамперед використані давно апробовані барвники для вовни. Це - складні молекули з кількома ароматичними кільцями і зарядженими групами. Механізм їх взаємодії з білками ще далеко не ясний. Мабуть, початкове зв'язування йде за рахунок кулонівської взаємодії негативно заряджених сульфогрупп з позитивно зарядженими бічними групами основних амінокислот білка. Буфер в момент фарбування замінюється на сильно кисле середовище. У ній переважний заряд будь-якого білка стає позитивним. Оз-группу сохраняет отрицательный заряд даже при малых значениях рН. У той же час барвник, що несе «сильну» S Оз-групу зберігає негативний заряд навіть при малих значеннях рН. Далі зв'язок білка з барвником закріплюється водневими і гідрофобними зв'язками. ). Для кислих білків широко використовують барвники класу «Кумассі яркоголубой» (Coomassie brilliant blue). -250 и СВВ G -250. Його випускають в двох модифікаціях СВВ R -250 і СВВ G -250. Велика кількість ароматичних кілець в барвниках цього типу робить їх погано розчинними не тільки у воді і розведеної оцтової кислоти, але навіть і в 10%-ної Тху. У цих випадках для поліпшення розчинності додають до 40% метанолу. Якщо використовують 50%-ную Тху, то в цьому немає необхідності. Зміст барвника в розчині 0,1-0,25% за вагою. Тривалість фарбування варіює залежно від товщини гелю в межах від 3 до 12 годин. Для прискорення проникнення розчину в гель фарбування можна вести при температурі 37 °.
Спочатку після закінчення процедури забарвленим здається весь гель. Але молекули барвника не зв'язуються акриламідом. Після закінчення забарвлення сам гель можна відмити до повної прозорості, вимочуючи його протягом ночі в досить великому обсязі 7%-ний оцтової кислоти. Чутливість методу дозволяє цілком надійно виявити смужку, що містить 10 мкг білка.
До цих пір мова йшла про кислі білках. Основні білки фарбуються тими ж барвниками ще простіше, так як вони вже несуть позитивний заряд. Досить подбати про розчинності барвника й осадженні білка.
На порядок величини кращу чутливість дає фарбування білків іонами срібла. 3. Після осадження білків оцтовою кислотою і етанолом, ретельної промивки етанолом і водою гель переносять на 30 хвилин в 5 обсягів 0,1% розчину AgNO 3.
Потім після промивання водою в такий же обсяг карбонату натрію + 0,02% формальдегіду (НСНО). Інкубують при кімнатній температурі, похитуючи кювету. Пофарбований смуги білка з'являються через кілька хвилин. Слід дочекатися найкращого контрасту і зупинити реакцію промивкою в 1%-ний оцтової кислоти. Механізм фарбування неясний. Але, мабуть, він у чомусь схожий з відновленням срібла у фотографічному процесі. У всякому разі при прояві забарвлення білків слід точно так само уникати перетримки в проявнику.
Забарвлення білків флуоресцентними барвниками, такими як «данзілхлорід» і «флюоресцамін» або «ортофталевої ангідрид», використовують в тих випадках, коли бажано стежити за ходом електрофоретичного процесу розділення білків. Цими барвниками фарбують сумарний білковий препарат до електрофорезу. Зберігаючи міцний зв'язок з білками, вони мало позначаються на їх електрофоретичної рухливості. За рухом білкових смуг в гелі спостерігають, висвітлюючи його ультрафіолетовим світлом.
Дуже високу чутливість при фіксації положення білкових смуг після електрофреза можна отримати для радіоактивно мічених білків.
с использованием радиоактивно меченых аминокислот или для белков, выделенных из бактерий ауксотрофных по какой-либо аминокислоте (не способной к ее синтезу), когда соответствующую радиоактивно меченую аминокислоту включают в питательную среду. Поки ж зазначимо, що цей метод хороший для дослідження білків, синтезованих in vitro з використанням радіоактивно мічених амінокислот або для білків, виділених з бактерій ауксотрофних з якої-небудь амінокислоті (не здатної до її синтезу), коли відповідну радіоактивно мічену амінокислоту включають в живильне середовище .
Література
Курашвілі Л.В., Бобильова Л.М. Визначення тригліцеридів у фракції ліпопротеїдів високої щільності / Лабораторне справу. - N 7. - 1991. - С.7576.
Курашвілі Л.В., Владимирова А.А. Вміст тригліцеридів у ліпопротеїнів високої щільності у хворих на ішемічну хворобу серця / / Кардіологія. - 7-8. - 1992. - С.35-38.
Курашвілі Л.В., Волков А.С. Прогностична значущість визначення холестерину у фракції ліпопротеїдів високої щільності у донорів крові / / Гематологія і трансфузіологія. - N 5. - 1993. - С.39-41.