Виділення мембранних білків

1. Структура мембранних білків

2. Виділення мембранних білків.

2.1 Солюбілізація мембранних білків

2.1.1 Периферичні білки

3. Характеристика очищених інтегральних мембранних білків

3.1 Визначення молекулярної маси субодиниць (електрофорез в ПААГ)

3.2 Визначення молекулярної маси нативного білка за допомогою гідродинамічних методів

3.3 Метод радіаційної інактивації

3.4 Спектральні методи

3.4.1 Метод кругового дихроїзму

3.4.2 Інфрачервона спектроскопія і спектроскопія комбінаційного розсіювання

3.4.3 ЯМР-спектроскопія

3.5 Визначення ферментативної активності

3.6 Вивчення стехіометрії субодиниць

3.7 Вивчення тривимірної структури за допомогою рентгенівської дифракції та реконструкції зображення

3.7.1 Кристалізація мембранних білків

3.7.2 Реконструкція зображення і двовимірні кристали

4. Приклад структурних досліджень мембранних білків.

4.1 Структура порінов

Висновок

Список літератури

Введення

Мета роботи: ознайомлення з методами вивчення мембранних білків.

Поставлена ​​мета розкривається через наступні завдання:

дослідити структуру мембранних білків;

розглянути методи їх виділення і очищення;

методи дослідження характеристик мембранних білків.

Відомо, що більше третини структурної частини геному кодує мембранні білки, проте серед відомих просторових структур лише менше половини відсотка належить білкам цього класу.

При цьому їх роль в організмі важко переоцінити. Велика кількість функціонально значущих білків є мембранними: рецептори, канали, різні ферменти і пр. Крім того, багато хто з них є мішенями для лікарських препаратів: більше 70% існуючих лікарських засобів діють саме на мембранні білки. Таким чином, вивчення механізмів функціонування мембранних білків необхідно, а одним з перших кроків до розуміння механізму є отримання просторової структури.

1. Структура мембранних білків

Основна роль ліпідів у складі мембран полягає в стабілізації біслойную структури, а білки є активними компонентами біомембран.

Використовуючи мембрану еритроцитів як модель, дослідники виявили два типи мембранних білків. Білки першого типу, звані периферичними білками, пов'язані з мембраною в основному іонними взаємодіями. Якщо обробити препарат мембран буферним розчином з високою концентрацією солей, білки цього типу звільняються від мембрани і переходять в буфер. Приклади периферичних білків - фібронектину (локалізований на зовнішній поверхні більшості клітин, виключаючи циркулюючі клітини крові) і спектрин (знаходиться на внутрішній поверхні більшості клітинних мембран, особливо в еритроцитах).

Мембранні білки другого типу називаються інтегральними білками. Ці протеїни або занурені в товщу ліпідного бішару, або пронизують мембрану наскрізь (трансмембранні білки). До інтегральних відносять також білки, ковалентно пов'язані з молекулами мембрани. Всі інтегральні білки можна виділити. тільки зруйнувавши мембрану. Для виділення та вивчення інтегральних білків їх очищають від ліпідів, або екстрагуючись їх органічними розчинниками (такими як ацетон або спирти), або розчиняють ліпіди за допомогою детергентів. Більшість мембранних білків є інтегральними.

На зорі розвитку мембранології вважали, що мембранні білки по своїй структурі досить гомогенні і покладені як β-шарів по поверхні бішару. Зараз прийнято вважати, що більшість мембранних білків у своїй мембранної частини складаються з однієї або декількох асоційованих α-спіралей, багато мембранні білки олігомерізуются. Причому "правильна" олігомеризація α-спіралей є необхідною умовою виконання білком своєї функції. Найбільш вивченим з олігомерізующіхся мембранних білків є білок еритроцитів людини - глікофорину А, який утворюється стійкий димер не тільки в природних системах, але і в штучних ліпідних середовищах, таких як міцели додецілфосфохоліна (DPC). Інтегральні мембранні білки можуть виявитися набагато складніше, ніж ми зараз представляємо. Класифікація розчинних білків за типами структур була проведена тільки після того, як встановили з високою роздільною здатністю структуру більш 100 різних білків. Що стосується трансмембранних білків, то це вдалося зробити тільки в одному випадку - для білка фотосинтетичного реакційного центру бактерій. Разом з електронно-мікроскопічними даними низького дозволу про структуру бактериородопсина це єдине джерело, на якому може грунтуватися побудова моделей для більшості інших трансмембранних білків. Молекулярна маса мембранних білків звичайно варіює в межах від 10 тис. до 240 тис.

Ще один важливий момент - способи прикріплення білків до мембрани:

1. Зв'язування з білками, зануреними у бішар. 1-часть Н + - АТРазы, которая связывается с Fo -частью, погруженной в мембрану; можно упомянуть также некоторые белки цитоскелета. В якості прикладів можна навести F 1-частина Н + - АТРази, яка зв'язується з Fo-частиною, зануреної в мембрану; можна згадати також деякі білки цитоскелету.

2. Зв'язування з поверхнею бішару. Ця взаємодія має в першу чергу електростатичну природу (наприклад, основний білок мієліну) або гідрофобну (наприклад, поверхнево-активні пептиди і, можливо, фосфоліпази). На поверхні деяких мембранних білків є гідрофобні домени, які утворюються завдяки особливостям вторинної або третинної структури. Зазначені поверхневі взаємодії можуть використовуватися як доповнення до інших взаємодій, наприклад до трансмембранному заякоріванію.

3. Зв'язування з допомогою гідрофобної "якоря"; ця структура зазвичай виявляється як послідовність неполярних амінокислотних залишків (наприклад, у цитохрому 65). Деякі мембранні білки використовують як якір ковалентно пов'язані з ними жирні кислоти або фосфоліпіди.

4. Трансмембранні білки. Одні з них перетинають мембрану тільки один раз (наприклад, глікофорину), інші - кілька разів (наприклад, лактозопермеаза; бактеріородопсин).

Відмінностями між зовнішніми (або периферичними) і внутрішніми (або інтегральними) мембранними білками не задається однозначно спосіб їх прикріплення до бішар; ці відмінності визначають лише відносну силу їх зв'язування.

Рис. 1

Різні способи прикріплення мембранних білків до мембрани. -, либо на С-конце молекулы. N – и С-концы трансмембранных белков (5 и 6) могут находиться как у наружной, так и у внутренней поверхности мембраны. Пептидний якір (4) може перебувати або на N -, або на С-кінці молекули. N - і С-кінці трансмембранних білків (5 і 6) можуть перебувати як у зовнішньої, так і у внутрішній поверхні мембрани.

2. Виділення мембранних білків

Очищення і характеристика мембранних білків ставлять перед дослідником цілий ряд специфічних проблем, з якими він зазвичай не стикається, працюючи з розчинними білками. Мембранні білки, як правило, міцно пов'язані з ліпідного бішару і фактично нерозчинні у воді. Тому для їх солюбілізаціі і очищення доводиться застосовувати детергенти або інші руйнують мембрану речовини. Оскільки виділення інтегральних білків зазвичай пов'язане з руйнуванням мембрани, у багатьох випадках необхідно переконатися, що у процесі виділення й очищення білка його функціональна активність не виявилася порушеною чи втраченої. Для цього, зокрема, можна спробувати провести реконструкцію,

тобто вбудувати очищений білок назад в мембрану. Функціональну активність деяких мембранних білків, таких, як іонні канали або транспортні білки, можна охарактеризувати і виміряти тільки у реконструйованих мембранних системах. Для інших мембранних білків, що виконують функції ферментів чи рецепторів, корисну інформацію часто можна отримати, використовуючи солюбілізірованние препарати. Методи солюбілізаціі і реконструкції не тільки дають цінну інформацію про функції мембранних білків; їх можна також використовувати для того, щоб перевести ці білки в стан, зручне для проведення детального структурного аналізу. Безсумнівно, детергенти будуть грати ключову роль в удосконаленні методів кристалізації мембранних білків для подальшого рентгеноструктурного аналізу.

При солюбілізаціі детергентами виникає питання про можливість виборчого вилучення з мембрани саме тих компонентів, які цікавлять дослідника. Тому будь-який новий детергент бажано перевіряти на можливість виборчої екстракції певних мембранних компонентів. Жоден з наявних детергентів не є універсальним.

Це зумовлено трьома обставинами:

1) сильними відмінностями в дії детергентів навіть на одні й ті ж мембранні білки;

2) відсутністю єдиної стратегії солюбілізаціі та реконструкції;

3) складним характером взаємодій між молекулами білків, ліпідів і детергентів, що мають настільки різну хімічну природу.

Існують певні вимоги до детергентів, застосовуваним для солюбілізаціі та реконструкції. Детергент повинен солюбілізіровать, але не денатурувати білок і повинен бути легко доступний у чистому вигляді; бажано, щоб детергент був недорогим.

2.1 Солюбілізація мембранних білків

2.1.1 Периферичні білки

Залежно від завдання, яке стоїть перед дослідником, мембрана може бути піддана м'якій або жорсткій обробці.

в концентрации более 1 М, с добавлением ЭДТА или без нее. При м'яких умовах обробки використовують як розчини з низькою іонною силою (наприклад, 0,1-1 мМ ЕДТА, який видаляє двовалентні катіони), так і буфери з високою іонною силою, що містять NaCl і КС l в концентрації більше 1 М, з додаванням ЕДТА або без неї. Не слід вводити в ці розчини такі аніони, як йодид або дііодсаліцілат, оскільки вони володіють хаотропнимн властивостями і можуть діяти подібно детергентів. рН середовища може змінюватися в межах від 6,0 до 8,0. У цих умовах необоротна денатурація інтегральних або периферичних білків малоймовірна.

При більш жорсткої обробці з мембран можна видалити значні кількості білка (> 50% від його загального вмісту в мембранах), але, з іншого боку, така обробка зазвичай призводить до денатурації, в багатьох випадках незворотною. Як приклад можна навести обробку мембран 6 М гуанідінійхлорідом, 8 М сечовиною, 1 мМ п-хлормер-курібензоатом, розведеними кислотами (рН 2,0-3,0) або лугами (рН 9,5-11,0). У кислих умовах іноді спостерігається осадження солюбілізірованних білків, і тому частіше вдаються до лужного обробці.

Необхідно мати на увазі, що в результаті видалення значних кількостей білка мембрана може морфологічно змінитися, зокрема може відбутися її вивертання або замикання в везикули. Тому слід так підібрати умови подальшого центрифугування, щоб гарантувати повне осадження мембран. Якщо використовується кислотно-лужна обробка, слід якомога швидше повернути рН до вихідних нейтральним значенням.

2.1.2 Інтегральні білки

При обробці мембран для отримання інтегральних мембранних білків можуть вивільнятися або активуватися протеази. Тому нерідко на цій стадії доводиться додавати інгібітори протеаз, навіть якщо вони вже були введені на попередніх етапах виділення мембран. Існують різні і досить складні суміші інгібіторів, які можна використовувати в залежності від чутливості системи до дії протеолітичних ферментів. Дуже корисним, але не універсальним агентом є інгібітор серинових протеаз, фенілметілсульфонілфторід (ФМСФ). Цей реагент зберігають у концентрації 100 мМ в изопропаноле або етанолі і додають у инкубационную середу до концентрації 100 мкМ. Слід пам'ятати, що він має досить короткий час життя у водних середовищах (ПЗ і 35 хв відповідно при рН 7,0 і 8,0 і 25 ° С). Для інгібування SH-протеаз може виявитися корисним 10 мМ тетратионат натрію.

3. Характеристика очищених інтегральних мембранних білків

Характеристика очищених мембранних білків, навіть найпростіших, може становити певні труднощі. Як і у випадку розчинних білків, потрібно визначити число і молекулярну масу поліпептидних субодиниць, їх стехіометрію, розмір і, можливо, форму молекули, а також, якщо це необхідно, біохімічну активність.

3.1 Визначення молекулярної маси субодиниць (електрофорез в ПААГ)

Електрофорез у поліакриламідному гелі в присутності додеціл-сульфату натрію - це звичайна методика, але у випадку інтегральних мембранних білків при її застосуванні виникають особливі проблеми. У цьому методі додецилсульфат зв'язується з поліпептидними ланцюгами, і комплекси білок-ДНС поділяються в поліакриламідному гелі відповідно до їх стоксовим радіусами, які в більшості випадків залежать від молекулярної маси. Молекулярну масу визначають, порівнюючи електрофоретична рухливість даного комплексу та відомого стандарту. Проте пов'язання ДСН з невідомим білком може якісно відрізнятися від зв'язування зі стандартами, і тоді буде отриманий неправильний результат. Подібна ситуація спостерігається для інтегральних мембранних білків з високим вмістом неполярних амінокислотних залишків. Можлива й інша ситуація. Зв'язується з ДСН мембранний білок може перебувати в не повністю розгорнутому стані, що теж приведе до аномального підвищення електрофоретичної рухливості через утворення більш компактного комплексу білок-ДСС. Всі ці ефекти вельми істотні. Наприклад, лактозопермеаза має уявну молекулярну масу 33 000, якщо вимірювати її за допомогою електрофорезу в ПААГ у присутності ДСН; насправді ж, як показують результати генетичного аналізу, її молекулярна маса дорівнює 46 000. Ще одна проблема - можлива наявність четвертинної структури. Деякі мембранні білки агрегує навіть у присутності ДСН. Наприклад, глікофорину А або білок оболонки бактеріофага М13 (або fd) при електрофорезі в поліакриламідних гелях з ДСН знаходяться в основному у вигляді димерів.

Отже, оцінка молекулярної маси субодиниць сильно неполярних інтегральних мембранних білків, визначена за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН, може виявитися невірною. До нещастя, проста альтернатива цьому методу відсутній, і правильну величину часто отримують або за даними про повну первинної послідовності (зазвичай послідовності відповідного гену), або за допомогою точного гідродинамічного аналізу.

3.2 Визначення молекулярної маси нативного білка за допомогою гідродинамічних методів

Застосування цих методів для мембранних білків може бути пов'язане з великими труднощами, викликаними зв'язуванням детергенту.

Для знаходження молекулярної маси білка використовують два методи.

1. Прямо вимірюють кількість зв'язаного детергенту на 1 г білка. Для цього використовують спектральні методи або радіоактивно мічений детергент, а для виділення комплексів застосовують різні методи, наприклад гель-фільтрацію. реднее значение парциального удельного объема получают как средневзвешенное соответствующих величин для чистого белка и чистого детергента. Встановивши відносний вміст білка і детергенту в комплексі, c реднє значення парціального питомої обсягу отримують як середньозважене відповідних величин для чистого білка і чистого детергенту. к, а поскольку соотношение между белком и детергентом в комплексе известно, находят молекулярную массу белка. Після цього без праці знаходять M до, а оскільки співвідношення між білком і детергентом в комплексі відомо, знаходять молекулярну масу білка.

2. Вимірюють S0 (коефіцієнт седиментації) в середовищах з різними значеннями густини розчину ρ. Такі середовища зазвичай отримують, використовуючи суміші Н2О і D2O. к, так и Vк (ср). З графіка залежності S0 від ρ знаходять як M до, так і Vк (ср). При цьому передбачається, що Vк - це середньозважене відповідних величин для чистого білка і чистого детергенту.

(ср) белок + (Доля детергента) • V (ср) детергент. Vк (ср) = (Частка білка) • V (ср) білок + (Частка детергенту) • V (ср) детергент.

Оцінивши V (ср) білок і взявши V (ср) детергент з таблиці, отримують молекулярну масу білкової складової Mк.

0 от ρ проводят аналитическое центрифугирование. Для побудови графіка залежності S 0 від ρ проводять аналітичне центрифугування. 2 O , но анализ результатов в этом случае гораздо сложнее, хотя принципиально не отличается от предыдущего случая. Можна проводити центрифугування і в градієнті щільності сахарози, використовуючи суміші Н2О і D 2 O, але аналіз результатів у цьому випадку набагато складніше, хоча принципово не відрізняється від попереднього випадку.

3.3 Метод радіаційної інактивації

Метод радіаційної інактивації для визначення розміру мішені все частіше застосовується при дослідженні мембранних білків. Вивчати можна як очищені білки, так і неочищені препарати, в тому числі інтактні біомембрани. Суть методу полягає у визначенні частки білкових молекул, які отримують пошкодження при опроміненні. Для цього використовують ферментативні методи зв'язування гормонів або інших лігандів або спектральні методи. Процедура полягає в наступному. Зразок, зазвичай заморожений, піддають високоенергетичному опромінення (наприклад, опромінюють пучком електронів з синхротрона). Через різні проміжки часу відбирають проби, розморожують їх і проводять вимірювання. Пошкодження білка під дією випромінювання (зокрема, розрив ковалентних зв'язків) виявляють, наприклад, за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН. Як показує досвід, деякі субодиниці повністю втрачають біологічну активність при внесенні радіаційного пошкодження в будь-яке місце поліпептидного ланцюга. Ключовим моментом є те, що, чим більше білкова молекула, тим більше вірогідність її пошкодження і, отже ймовірність інактивації. Ця ймовірність залежить не від форми молекули, а від її маси. Зазвичай для того, щоб полегшити інтерпретацію результатів, паралельно опромінюють білок з відомою молекулярною масою. Якщо досліджуваний білок містить більше однієї субодиниці, виникають певні труднощі при аналізі результатів.

3.4 Спектральні методи

Для визначення вмісту α - спіралей і β - шарів в мембранних білках використовують кілька методів. У відсутність тривимірної організації на їх основі можна спробувати побудувати відповідні моделі. Найчастіше використовується метод кругового дихроїзму (КД). Все більш широке застосування знаходять інфрачервона та раманівська спектроскопія, а також ЯМР.

3.4.1 Метод кругового дихроїзму

Метод заснований на вимірюванні різниці поглинання ліво - і правополярізованного світла; ця оптична активність є мірою хіральності молекул, або мірою їх асиметрії. У далекій ультрафіолетової області (від 190 до 240 нм) КД визначається в основному поглинанням амідів карбонільних груп поліпептидного кістяка. За наявності ділянок вторинної структури, наприклад α-спіралей, спектр КД має цілком певні особливості, пов'язані з особливостями електронного оточення амідних груп в цих структурах. Аналізуючи спектр КД білків, його зазвичай представляють як суму компонентів, що відповідають поглинанню різних ділянок білкової молекули: α-спіралей, β-шарів і випадкових клубків. Визначивши тим чи іншим способом спектри кожної з цих структур, проводять їх підсумовування, підбираючи відповідні коефіцієнти таким чином, щоб було досягнуто найкраще відповідність виміряного спектру. Підібрані вагові коефіцієнти являють собою ту частку, яка припадає в молекулі на кожен з типів вторинної структури.

Ці методи були розроблені для розчинних білків, але немає ніяких підстав сумніватися, що їх можна з успіхом застосовувати і для мембранних білків. Швидше за все, в останніх є ділянки з такими ж типами вторинної структури, як і у розчинних білків, і при їх вивченні виникнуть такі ж труднощі. Деякі білки можна вивчати in situ, використовуючи суспензії мембран. Прикладами такого роду є бактеріородопсин з пурпурної мембрани Halobacterium halobium і Са2 + - АТР-аза з мембрани саркоплазматичного ретикулуму. Очищені мембранні білки можна досліджувати за допомогою КД та в присутності детергентів, якщо поглинання останніх у дальній УФ-області не надто велика, або у складі реконструйованих везикул. Тут виникають дві проблеми:

1) диференціальне світлорозсіювання, коли розмір мембранних часток набагато більше довжини хвилі світла;

2) вирівнювання поглинання через концентрування білка в мембранах або везикулах, тобто через негомогенності його розподілу в розчині. Ці артефакти можуть бути досить істотними, однак їх можна врахувати з допомогою відповідних методів.

На жаль, для внутрішніх мембранних білків відсутні структурні дані високої роздільної здатності, тому точна інтерпретація спектрів КД неможлива. За винятком декількох випадків, різні спектральні методи не використовувалися для вивчення одного і того ж білка і кількісне порівняння результатів не проводилося. Цікаво, що для бактериородопсина, який досліджували методами КД, ІЧ та ЯМР, у всіх трьох випадках були отримані однакові результати, що свідчать про значне вмісті в цьому білку β-шарів. Тим не менше у кожного методу є істотні недоліки. Так, дані про високий вміст в бактеріородопсин β-шарів (-46%), значною мірою залежать від способу обліку оптичних артефактів. Судячи за даними електронно-мікроскопічної реконструкції, що характеризується відносно низьким дозволом, в бактеріородопсин 80% припадає на частку α-спіралей, а β-шари відсутні зовсім. Щоб зрозуміти причину цих невідповідностей, необхідно провести структурний аналіз білка з атомною роздільною здатністю.

3.4.2 Інфрачервона спектроскопія і спектроскопія комбінаційного розсіювання

Ці методи не тільки дозволяють отримати відомості про конформації мембранних ліпідів, а й можуть використовуватися для дослідження вторинної структури білків. Коливальний спектр поліпептидного кістяка залежить від типу вторинної структури і дає інформацію про вміст у молекулі α - і β - структур. Цими методами можна досліджувати висушені на повітрі плівки, водні суспензії мембран, а також очищені білки як у присутності детергенту, так і в складі реконструйованих везикул.

3.4.3 ЯМР-спектроскопія

Цей метод також може використовуватися для вивчення мембранних білків. и в комплексах с детергентом. Проте можливості методу в цьому випадку обмежені, що пов'язано головним чином з відносно повільними рухами інтегральних мембранних білків in situ і в комплексах з миючим засобом.

3.5 Визначення ферментативної активності

Одним з найбільш важливих методів характеристики очищених мембранних білків безсумнівно є визначення біохімічної активності. При цьому використовуються в основному такі ж критерії, як і для розчинних білків, але можуть виникати і свої труднощі. Перша з них пов'язана з тим, що біохімічна активність мембранних білків часто дуже сильно залежить від зв'язування з білком ліпідів і детергентів. Втрата активності може бути як оборотної, так і незворотною. Доцільно мати якусь оцінку питомої активності досліджуваного білка in vivo або у складі мембран до солюбілізаціі. Надлишок детергенту може надавати інгібуючий ефект, наприклад за рахунок розбавлення неполярних субстратів в популяції міцел і зменшення ферментативної активності. Вимірюючи активність будь-якого мембранного білка, необхідно мати на увазі, що in situ він знаходиться в оточенні ліпідів, що забезпечують оптимальну активність. Друга проблема пов'язана з білками, що володіють "трансбіслойной" активністю; прикладами можуть служити білки, що утворюють канали, і транспортні білки. У цих випадках необхідно враховувати переміщення розчинених речовин з одного компартмента в інший (наприклад, всередину ліпосом і назовні).

3.6 Вивчення стехіометрії субодиниць

Багато мембранні ферменти є комплекси, що складаються з декількох субодиниць. +/ К + - АТРазу, митохондриальные комплексы электронного транспорта и фотосинтетические реакционные центры. Як приклад можна навести Н + - АТРази, Na + / К + - АТРази, мітохондріальні комплекси електронного транспорту і фотосинтетичні реакційні центри. - и F 1-компоненты митохондриальной Н + - АТРазы). Деякі інтегральні мембранні білки міцно пов'язані з розчинними білками за допомогою нековалентних взаємодій (прикладами можуть служити Fo - і F 1-компоненти мітохондріальної Н + - АТРази). -компонент, содержащий по данным электрофореза в ПААГ-ДСН три типа субъединиц (а, b , с), образует протонный канал, a F 1, состоящий из пяти типов субъединиц, содержит активный центр, участвующий в гидролизе АТР. У Е. з oli Fo-компонент, який містить за даними електрофорезу в ПААГ-ДСН три типи субодиниць (а, b, c), утворює протонний канал, a F 1, що складається з п'яти типів субодиниць, містить активний центр, який бере участь у гідролізі АТР . Для таких білків дуже важливо визначити характер субодиниць, стехіометрію комплексу і найближчі взаємодії його компонентів. Це дуже непросте завдання навіть тоді, коли білковий комплекс вже ізольований. Виникаючі тут проблеми по суті не відрізняються від таких для розчинних білкових комплексів, але є і свої додаткові складності.

Перш за все слід мати на увазі, що взаємодія між субодиницями дуже сильно залежить від типу ліпідів і детергентів, з якими пов'язані білки.

Ще одна проблема пов'язана з тим, що в бішарі мембранні білки можуть утворювати комплекси з-за високої їх локальної концентрації. При солюбілізаціі ж незалежно від використовуваного детергенту може відбутися розведення мембранних білків і їх роз'єднання. За законом діючих мас це призведе до дисоціації комплексів, в яких взаємодія між компонентами не дуже сильне.

Для вивчення стехіометрії субодиниць та їх асоціації в очищеному комплексі використовується всього кілька методів:

1) хімічна зшивання;

2) кількісний аналіз N-кінцевих амінокислот;

3) визначення ставлення маси субодиниць в ПДН-поліакриламідних гелях шляхом визначення інтенсивності фарбування, за допомогою радіоавтографіі або иммуноблоттинга.

Кожен метод має свої обмеження, але всі вони використовувалися на практиці.

3.7 Вивчення тривимірної структури за допомогою рентгенівської дифракції та реконструкції зображення

3.7.1 Кристалізація мембранних білків

Найбільш детальну структурну інформацію про очищених мембранних білках можна отримати, досліджуючи методом рентгенівської дифракції тривимірні білкові кристали. На жаль, виявилося, що інтегральні мембранні білки дуже важко кристалізувати. Будучи видалені зі свого природного ліпідного оточення, неполярні ділянки ліпідних молекул схильні агрегувати з утворенням невпорядкованих форм, непридатних для кристалографічного аналізу. Ясно, що необхідні спеціальні методи, що дозволяють обійти ці труднощі, і в цьому був досягнутий певний прогрес. Міхель звернув увагу, що мембранні білки утворюють кристали двох типів (рис.2).

Кристали типу I нагадують стопки мембран. У них здійснюється латеральне взаємодія між неполярними ділянками, а мембраноподобние шари пов'язують полярні ділянки білків. Подібні кристали були отримані для декількох білків, але ні в одному випадку їх не можна було дослідити з допомогою дифракції з високою роздільною здатністю. Кристали типу II стабілізуються за рахунок контактування полярних ділянок білкових молекул, а невеликі амфіфільні з'єднання або детергенти в основному заповнюють проміжки між ними. Зауважимо, що дуже важливими є розмір, заряд і інші властивості детергентів; якщо ці параметри несприятливі, то детергент може дестабілізувати кристалічну структуру. Кристали типу II утворюють білки фотосинтетичного реакційного центру Rhodopseudomonas viridis

Рис.2. Два основних типи кристалів мембранних білків.

представляют собой двумерные стопки, упорядоченно расположенные в третьем измерении. Кристали типу I являють собою двовимірні стопки, впорядковано розташовані в третьому вимірі. с гидрофобными поверхностями белков связаны молекулы детергента. У кристалах типу II з гідрофобними поверхнями білків пов'язані молекули детергенту. Пунктиром відзначені гідрофільні домени білків.

Отже, мембранні білки можна кристалізувати, і хоча число успішних спроб поки невелике, можна зробити кілька висновків, що стосуються методології кристалізації.

1. Білки кристалізуються разом з миючим засобом.

2. Дуже важливий вибір детергенту. Мабуть, найбільш придатні цвіттеріонние або неіонні детергенти з високою ККМ і малим розміром міцел

3. Кристалізація полегшується в присутності малих амфіфільних органічних молекул, мабуть, впливають на полярні кінцеві групи детергенту.

4. Поліетиленгліколь і сульфат амонію, зазвичай використовуються при кристалізації розчинних білків, застосовуються і для індукції кристалізації мембранних білків.

3.7.2 Реконструкція зображення і двовимірні кристали

Тривимірні кристали мембранних білків отримати дуже важко, але багато хто з них утворюють двовимірні впорядковані структури. У деяких випадках білки формують такі структури in vivo, (наприклад, бактеріородопсин в пурпурової мембрані). При відповідних умовах такі білки, як і багато інших, утворюють "двовимірні кристали" при їх очищення та реконструкції в присутності фосфоліпідів. Подібні двовимірні впорядковані структури можна, використовувати для отримання тривимірної структурної інформації за допомогою електронної мікроскопії і методів реконструкції зображення.

4. Приклад структурних досліджень мембранних білків.

4.1 Структура порінов

Поріни - це основний клас білків, виявлених в зовнішній мембрані кишкових бактерій

и Salmonella typhimurium выявлены три порина: OmpF , OmpC и PhoE . У Е. coli і Salmonella typhimurium виявлено три поріна: OmpF, OmpC і PhoE. Ці білки мають молекулярну масу приблизно 35 000 і гомологічні амінокислотні послідовності. Поріни екстрагуються із зовнішньої мембрани за допомогою ДСН у вигляді стабільних тримерів; їх можна вбудувати в фосфоліпідних бішару з утворенням неспецифічних пір, здатних пропускати малі (<600 Да) гідрофільні молекули. Мабуть, саме вони надають зовнішній мембрані бактерій властивість молекулярного сита, дозволяючи поживним речовинам проникати всередину клітини, а відходів - виводитися назовні через неспецифічні канали.

, известного также под названием "матриксный порин"; в настоящее время осуществляется кристаллографический анализ, который позволит получить его структуру с высоким разрешением. Були проведені великі структурні дослідження білка OmpF, відомого також під назвою "матриксних порін"; в даний час здійснюється кристалографічних аналіз, який дозволить отримати його структуру з високою роздільною здатністю. Судячи за даними про первинну послідовності, в молекулі немає ніяких довгих гідрофобних ділянок, які можна було б ідентифікувати як трансмембранні, і в середньому в ній міститься більше полярних амінокислот, ніж неполярних. Проте тривимірна електронно-мікроскопічна реконструкція зображення з використанням кристалічних пластинок реконструйованого поріна показала, що білок пронизує бішар, причому за межі мембрани виходять лише невеликі ділянки молекули. Методом негативного контрастування були виявлені канали, утворені тримером. Окремі молекули поріна утворюють біля внутрішньої поверхні канали, які в середині бішару зливаються в одиночний канал, що відкривається назовні. Є й інші дані, що свідчать про те, що порін, незважаючи на відсутність у його молекулі гідрофобних ділянок, є трансмембранним білком. Іноді цей білок виконує роль рецептора для бактеріофага (для цього окремі його ділянки повинні бути експоновані на зовнішній поверхні), а також проявляє спорідненість до компонентів клітинної стінки на періплазматіческой стороні. Очищений порін можна вбудовувати в фосфоліпідних бішару з утворенням потенціалчувствітельних каналів.

Дані інфрачервоної спектроскопії, кругового дихроїзму та ширококутного дифузійної рентгенівської дифракції свідчать про те, що дві третини довжини молекули утворює β-шар, а на частку α - спіралей припадає невелика частина довжини молекули. Крім того, ці дослідження показують, що β - ланцюга антіпараллельни, орієнтовані перпендикулярно площині мембрани не мають середню довжину 10-12 залишків, яких достатньо для перетину неполярної області мембрани. Спосіб укладання β-ланцюгів можна встановити лише за допомогою рентгенівської дифракції. Як показують модельні дослідження, β-ланцюги можуть бути укладені так, що утворюється β-циліндр, при цьому полярні і заряджені амінокислотні залишки вистилають стінки наповнених водою каналів.

Всі відомі про структуру поріна дані показують, що гідрофобна

α-спіраль не є його необхідним трансмембранним елементом. Це означає, що найбільш поширені способи пророкування структури трансмембранних білків мають свої обмеження, оскільки вони грунтуються на припущенні, що перетнути бішар можуть тільки гідрофобні сегменти. Точна структура поріна до цих пір невідома; неясно також, подібна вона зі структурою інших мембранних білків. Втім, є й інші білки зовнішньої мембрани бактерій, які характеризуються високим вмістом β - структур.

Припущення про те, що незвичайна структура порінов пов'язана з унікальною структурою і складом зовнішньої мембрани бактерій, виглядає правдоподібно. Можливо, однак, що вона обумовлена ​​унікальністю способу утворення великих водних каналів через бішар.

Висновок

Дослідження мембранних білків все ще залишається важким завданням, що вимагає оригінальних підходів і нетривіальних рішень. Тим не менше, щороку з'являються все нові повідомлення про вдосконалення вже існуючих методів. З розробкою нових методів очищення мембранних білків, заснованих на застосуванні різних детергентів, а так само з використанням методів секвенування ДНК вдається отримати нову інформацію про структуру мембранних білків. Дані щодо вторинної та четвертинної структурі очищених мембранних білків можна отримати за допомогою біохімічних та спектроскопічних методів. Однак для побудови моделей з високою роздільною здатністю слід застосовувати рентгеноструктурний аналіз. Показовим у цьому відношенні є успіх, досягнутий при вивченні реакційних центрів бактерій.

Список літератури

1. Генніс Р. біомембрани: Молекулярна структура та функції: Пер. з англ. - М.: Мир, 1997,-624с.

2. Фінделем Дж. Б., Еванз Н.Р. Біологічні мембрани. Методи: Пер. з англ. - М.: Мир, 1990, - 424с.

3. Фаллер Дж. М., Шилдс Д. Молекулярна біологія клітини. Керівництво для лікарів: пров. з англ. - М.: Біном - Прес, 2004,-272с.

4. Овчинников Ю.А. Біоорганічна хімія Москва, Освіта 1987.

5. Лефковітс І., Перніс Б. Імунологічні методи досліджень (3 тому) Пер. з англ. - М.: Мир, 1988,-530с.

6. Березів Т.Т., Коровкін Б.Ф. Біологічна хімія. Москва, "Медицина", 1998 рік,-704с.

7. Сім Е. Біохімія мембран: Пер. з англ. - М.: Мир, 1985,-110с.