Отримання мембранного білка бактериородопсина міченого дейтерієм по залишках ароматичних амінокислот

. halobium Комп'ютерна модель мембранного білка бактериородопсина з H. Halobium

Для отримання детальної інформації про структуру поліпептидного ланцюга мембранного білка в нативної мембрані доцільно селективно вводити в білок ізотопні мітки, які дозволяють використовувати спектральні методи високого дозволу, такі як спектроскопія ядерного магнітного резонансу (ЯМР) [3], Раман і лазерна спектроскопія [4,5 ], інфрачервона (ІЧ) спектрометрія [6] і мас-спектрометрія (МС) [7]. У зв'язку з цим особливо перспективні дослідження з мембранними білками, селективно збагаченими стабільними ізотопами, наприклад, дейтерієм по залишках таких функціонально важливих амінокислот, як L-фенілаланін, L-тирозин і L-триптофан [8,9]. Це пов'язано з тим, що зазначені амінокислоти беруть участь у процесі формуванні хромофорного центру бактериородопсина і в його функціонуванні [10]. Тому важливо отримувати подібні модифіковані дейтерієм білки в очищеному вигляді і в препаративних кількостях.

Метою цієї роботи було отримання препаратів бактериородопсина, селективно мічених дейтерієм по залишках ароматичних амінокислот - L-фенілаланіну, L-тирозину і L-триптофану, а також мас-спектрометричний аналіз дейтерій-мічених амінокислот у складі гідролізатів бактериородопсина після їх препаративного поділу методами обернено-фазової високоефективної хроматографії (ВЕРХ) у вигляді метилових ефірів данс-амінокислот і бензілоксікарбонільних похідних амінокислот.

УМОВИ ЕКСПЕРИМЕНТУ.

У роботі використовували солі кваліфікації "х.ч"., DL-амінокислоти (Reanal, Угорщина), аденозин-і уридин-5-монофосфату (Sigma, США.), Панкреотіческую телячу дезоксирибонуклеаза 1 (Fluka Chemie AG, Швейцарія), додецилсульфат натрію (ДСС) (Chemapol, Чехо-Словаччина). L-[2,3,4,5,6 - ² H _{5]-фенілаланін} (90 ат.% ² Н), L-[3,5 - ² H _{2]-тирозин} (96 ат.% ² Н) і L-[2,4,5,6,7 - ² H _{5]-триптофан} (98 ат.% ² Н) (способи отримання вказані в роботах [11,12]), були надані доц. кафедри біотехнології Московської державної академії тонкої хімічної технології ім. М.В. Ломоносова к.х.н. А.Б. Пшеничникова. Для отримання похідних амінокислот використовували N-діметіламінонафталін-5-сульфохлорид (дансілхлорід) (Sigma, США), карбобензоксіхлорід (Войківський хімзавод, РФ) і діазометан. Діазометан отримували з N-нітрозометілмочевіни (Merck, Німеччина).

Бактеріальні штами та поживні середовища. Об'єктом дослідження служив пігментований штам галофільних бактерій Halobacterium halobium ЕТ 1001. Штам був отриманий з колекції культур мікроорганізмів Московського державного університету ім. М.В. Ломоносова. Штам підтримували на пептоновой середовищі з 2%-ним агаром [13].

Для отримання немічених бактериородопсина використовували синтетичну середу, що містить 18 амінокислот (кількості компонентів наведені в г / л): (DL-аланін 0,43, L-аргінін 0,4, DL-аспарагінова кислота 0,45, L-цистеїн 0,05 , L-глутамінова кислота 1,3, L-гліцин 0,06, DL-гістидин 0,3, DL-ізолейцин 0,44, L-лейцин 0,8, L-лізин 0,85, DL-метіонін 0,37 , DL-фенілаланін 0,26, L-пролін 0,05, DL-серин 0,61, DL-треонін 0,5, L-тирозин 0,2, DL-триптофан 0,5, DL-валін 1), нуклеотиди (аденозин-5-монофосфат 0,1, уридин-5 монофосфат 0,1), солі (NaCl 250, MgSO ₄ 7H ₂ O 20, KСl 2, NH ₄ Cl 0,5, KNO ₃ 0,1, KH ₂ PO ₄ 0,05, K ₂ HPO ₄ 0,05, цитрат натрію 0,5, MnSO ₄ H ₂ O 3 10 ^-4, CaCL ₂ 6H ₂ O 0,065, ZnSO ₄ 7H ₂ O 4 10 ^-5, FeSO ₄ 7H ₂ O 5 10 ^-4, CuSO ₄ 5H ₂ O 5 10 ^-5), гліцерин 1, ростові фактори (біотин 0,1 10 ^-3, фолієва кислота жовтня 1910 ^-3, вітамін В ₁₂ 0,02 10 ^-3).

В експериментах по введенню дейтерієво мітки в бактеріородопсин замість L-фенілаланіну, L-тирозину і L-триптофану в синтетичну середу додавали їх дейтерированного аналоги - L-[2,3,4,5,6 - ² H _{5]-фенілаланін,} L- [3,5 - ² H _{2]-тирозин,} і L-[2,4,5,6,7 - ² H _{5]-триптофан.}

Середовища стерилізували при 0,5 ати протягом 30-40 хв, рН доводили до величини 6,5-6,7 за допомогою KOH. Посівний матеріал вирощували в колбах Ерленмейера, об'ємом 250 мл (з наповненням середовищем до 50 мл) при 35-37 ⁰ С в умовах інтенсивної аерації та висвітленні лампами денного світла ЛДС-40. Після доби посівний матеріал в кількості 5-10% переносили в синтетичну середу, що містить дейтерій-мічені аналоги ароматичних амінокислот і культивували протягом 4-5 діб як і при отриманні посівного матеріалу.

Виділення фракції пурпурних мембран. Клітини осаджували на центрифузі Т-24 (Німеччина) (10000 об / хв, 10 хв.), Осад клітин суспендованих в дист. воді, експонували ультразвуком (3 експозиції тривалістю 5 хвилин) і знову центрифугували (10 000 об / хв, 10 хв). Пігменти видаляли обробкою ацетоном, ліпіди екстрагували сумішшю хлороформ-метанол (2:1), розчинник декантировали. Отриманий осад клітин (100-150 мг) суспендованих в 100 мл буфера трис-HCL (рН 7,5), додавали 1 мг дезоксирибонуклеази 1 і инкубировали протягом 5-6 годин при 37 ⁰ С, потім розбавляли дист. водою до 200 мл, після чого инкубировали 15 годин при 4 ⁰ С. Осад промивали водою з наступним відділенням розчинника до отримання безбарвних промивних вод. Контроль чистоти отриманої суспензії пурпурних мембран (Н ₂ О) проводили на спектрофотометрі "Beckman DU-6" (США) за співвідношенням смуг поглинання при 280 нм/568 нм (e ₂₈₀ = 1,1 ¹⁰ травня М ^-1 см ^-1 [ 14] та e ₅₆₈ = 6,3 10 ^{4 м -1} см ^-1 [15]).

Виділення бактериородопсина. Препарати пурпурних мембран (50 мг) солюбілізіровалі в 2 мл 0,5%-ного розчину додецилсульфату натрію (ДСН) в Н ₂ О, витримували протягом 8-10 годин при 22 ⁰ С, потім центрифугували (7000 об / хв, 5 хв ). Осад відокремлювали, до супернатанту додавали 5-ти кратний надлишок метанолу, витримували при ⁰ 0 С протягом 12-14 годин і центрифугували (13000 об / хв, 10 хв). Залишки ДСН видаляли, промиваючи осад білка дист. водою. Вихід бактериородопсина склав 20 мг.

Гідроліз бактериородопсина. Гідроліз бактериородопсина проводили двома методами: (А)-кислотним і (B)-лужним гідролізом. Для цього білок ділили на дві рівні порції по 10 мг і гідролізувати в запаяних скляних ампулах у 30-ти кратному надлишку гідролізуються агента (24 г, 110 ⁰ С): (А) - в 6 н. ² НCl (у ² Н ₂ O ) з 3%-ним (за вагою) фенолом і в (В) - 4 зв. Ba (OH) _2. Після цього гідролізат, отриманий в умовах (А) упаривали в роторному випарнику при 40 ⁰ С. Залишки дейтерій-соляної кислоти видаляли шляхом витримування в ексикаторі над твердим NaOH. Після проведення гідролізу (В), реакційну суміш суспендованих в одному об'ємі гарячої дистильованої води і нейтралізували 2 н. розчином H ₂ SO ₄ до рН 7,0. Випав осад сульфату барію відокремлювали центрифугуванням (10000 об / хв, 5 хв), супернатант декантировали і упаривали в роторному випарнику при 40 ⁰ С. Гідролізати бактериородопсина, отримані в умовах (А) і (В), висушені до постійної маси, обробляли дансілхлорідом і діазометаном (або карбобензоксіхлорідом).

Отримання дансіламінокіслот гідролізатів бактериородопсина. До 10 мг висушених гідролізатів бактериородопсина в 2 мл 2 м. NaHCO ₃ (2 10 ^-4 моль) рН 9-10 дробовими порціями при перемішуванні додавали 16 мг (5,9 10 ^-5 моль) дансілхлоріда у 4 мл ацетону. Реакційну суміш витримували при перемішуванні при 40 ⁰ С протягом години, потім підкисляють 2 н. розчином HCL до рН 3 та екстрагували етилацетатом (3 рази по 5 мл.). Об'єднаний екстракт промивали дист. водою до значення рН 7,0, сушили безводним сульфатом натрію, розчинник видаляли при 10 мм. рт. ст.

Отримання метилових ефірів дансіламінокіслот гідролізатів бактериородопсина. До 20 мл 40%-ного КОН у 40 мл ефіру додавали 3 г вологою нітрозометілмочевіни і перемішували на водяній бані з льодом протягом 15-20 хв. Після інтенсивного газовиділення ефірний шар відокремлювали і промивали крижаною водою до рН 7,0, сушили безводним NaSO ₄ і обробляли їм препарати дансілпроізводних амінокислот у складі гідролізатів бактериородопсина.

Бензілоксікарбонільние похідні амінокислот отримували реакцією Шотт-Баумана за методикою, зазначеної в роботі [16].

Тонкошарову хроматографію (ТШХ) похідних амінокислот проводили на пластинках "Silufol UV-254" (Чехо-Словаччина) у системах: (A)-хлороформ-метанол-оцтова кислота (10:1:0,3) для бензілоксікарбонільних похідних амінокислот і (Б )-хлороформ-метанол-ацетон (7:1:1) для метилових ефірів дансіламінокіслот. Аналітичне та препаративної поділ карбобензоксіпроізводних амінокислот і метилових ефірів дансіламінокіслот у складі гідролізатів бактериородопсина проводили методом обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) на рідинному хроматографі "Knauer" (ФРН), обладнаним насосом "Knauer", УФ-детектором "2563" і інтегратором " З-R 3A "(Shimadzy, Японія). Використовували колонки: Гіперсіл ODS, 5 мкм, 3 250 мм, сіласорб С18, 12 мкм, 10 250 мм. Елюювання проводили в системі розчинників за двома варіантами: (А) - вода-трифторуксусной кислота (100 / 0,1-0,5 об / об) і (В) - ацетонітрил-трифторуксусной кислота (100 / 0,1-0,5 об / об) при різних градієнтних режимах, як описано в роботі [17]. Бензілоксікарбонільние похідні амінокислот детектувала з поглинання при 254 нм. Метилові ефіри данс-амінокислот детектувала по флуоресценції в УФ-світлі.

Мас-спектри електронного удару похідних амінокислот отримані на приладі "MB-80 A" (Hitachi, Японія) при енергії іонізуючих електронів 70 еВ.

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ.

Отримання дейтерій-міченого бактериородопсина. Вибір способу отримання бактериородопсина був визначений метою дослідження, пов'язаної з вивченням принципової можливості отримання дейтерій-мічених препаратів бактериородопсина в препаративних кількостях. При виборі L-[2,3,4,5,6 - ² H _{5]-фенілаланіну,} L-[3,5 - ² H _{2]-тирозину} і L-[2,4,5,6,7 - ² H _{5]-триптофану} в якості джерел ізотопних міток, автори враховували важливість цих амінокислот у функціонуванні бактериородопсина, стабільність дейтерій-мічених аналогів вказаних амінокислот до ^{(1 H-2} H) обміну у водному середовищі в умовах культивування, а також можливість їх детектування методами мас -спектрометрії. Криві, що відображають динаміку росту штаму H. halobium ЕТ 1001 на пептоновой середовищі (1), звичайної синтетичному середовищі (2) і синтетичному середовищі (3), що містить дейтерій-мічені аналоги амінокислот L-Phe, L-Tyr і L-Trp представлені на рис. 1. Як видно з рис.1, зростання H. halobium ЕТ 1001 на пептоновой середовищі відбувається краще ніж на синтетичній, проте для отримання дейтерій-міченого бактериородопсина пептоновая середовище не підходить через наявність у ній немічених амінокислот. Тому пептоновая середовище було замінено на синтетичну середу, в яку додавали дейтерій-мічені аналоги ароматичних амінокислот.

Спосіб отримання дейтерій-міченого бактериородопсина представлений на схемі. Основними етапами при отриманні дейтерированного препаратів бактериородопсина було: культивування штаму H.halobium ЕТ 1001 на середовищах, що містять дейтерій-мічені аналоги ароматичних амінокислот, руйнування клітин та отримання суспензії пурпурних мембран, очищення суспензії пурпурних мембран від уламків клітин і клітинної ДНК, очищення від каротиноїдів, солюбілізація білка в додецилсульфату натрію (ДСН) і осадження кінцевого продукту метанолом (див. схему). При отриманні пурпурних мембран, клітини обробляли дезоксирибонуклеаза, для того щоб зруйнувати клітинну ДНК. Внаслідок того, що препарати пурпурних мембран містять домішки каротиноїдів і уламки клітинних стінок, було необхідно застосовувати спеціальні методи очищення і виділення білка. При виділенні фракції білків з бактеріальних об'єктів необхідно враховувати наявність в них небілкових домішок. У разі багатих білками штамів порівняно невеликою кількістю домішкових сполук в них часто нехтують, використовуючи як білкової фракції залишок після вичерпного відділення пігментів і ліпідів екстракцією органічними розчинниками. У спеціальних випадках для отримання фракції індивідуальних білків слід вдаватися до їх осадженню та очищення [18]. Виділення мембранного білка полягає в його солюбілізаціі в розчині детергенту і наступним осадженні білка. Для цього пурпурні мембрани суспендованих в розчині ДСС. Вибір ДСН в якості детергенту в даному випадку виправданий, оскільки бактеріородопсин є інтегральним білком. Виділення бактериородопсина після відділення осколків клітинних стінок з розчину ДСН досягали, облягаючи білок метанолом. Найбільш трудомісткою була стадія очищення бактериородопсина від каротиноїдів, яка приводила до значних втрат хромопротеїд. Для цього був використаний метод низькотемпературної екстракції каротиноїдів ацетоном.

Культивування H. halobium ЕТ 1001на синтетичному середовищі, що містить L-[2,3,4,5,6 - ² H _{5]-фенілаланін,} L-[3,5 - ² H _{2]-тирозин} і L-[2,4,5, 6,7 - ² H _{5]-триптофан.}

Культуральна рідина

Відділення біомаси

Сира біомаса

Промивання клітин дист. Н ₂ О

Дезінтеграція клітин ультразвуком

Ацетон. Екстракція пігментів і ліпідів Екстракт пігментів і

Хлороформ, ліпідів

метанол.

Фракція сумарних білків

Обробка дезоксирибонуклеаза

Фракція пурпурних мембран.

Ацетон Очищення від каротиноїдів Екстракт каротиноїдів

Розчин ДСН Осадження білка Залишки клітинних стінок

Метанол

Бактеріородопсин

Гідроліз білка

Розчин 6 н. HCL з 3%-ним фенолом Розчин 4 н. Ba (OH) ₂

1. Дансілхлорід,

діазометан Модифікація амінокислот

2. Карбобензоксіхлорід

Поділ похідних амінокислот обернено-фазової ВЕРХ

Індивідуальні похідні амінокислот

Мас-спектрометричний аналіз похідних амінокислот

Схема отримання дейтерій-міченого бактериородопсина з H. halobium та визначення ступеня включення дейтерію в амінокислоти білку.

Як приклад на рис.2, а-в зображені спектри поглинання пурпурних мембран на різних стадіях очищення від каротиноїдів. Як видно з рис. 2, в, спектр поглинання бактериородопсина після екстракції від каротиноїдів має трьохсмуговий вигляд: смуги на довжинах хвиль 568 нм і 410 нм визначаються наявністю хромопротеїд, смуга поглинання при довжині хвилі 280 нм визначається вмістом ароматичних амінокислот у поліпептидному ланцюзі цього білка. (Для чистого бактериородопсина співвідношення D ₂₈₀ / D ₅₆₈ одно 2:1). Згідно із запропонованою схемою можна отримати десятки міліграм дейтерій-міченого бактериородопсина, переробивши 200-300 мг бактеріальної біомаси. Обернено-фазова високоефективна хроматографія ВЕРХ метилових ефірів дансілпроізводних амінокислот і бензілоксікарбонільних похідних амінокислот, отриманих з гідролізатів бактериородопсина показала високі ступені хроматографічної чистоти виділених амінокислот і відсутність домішок не білкової природи в гидролизатах бактериородопсина (див. нижче).

Гідроліз дейтерій-міченого бактериородопсина. Гідроліз дейтерій-міченого бактериородопсина проводили в умовах запобігання ізотопного обміну водню на дейтерій в ході гідролізу і збереження залишків триптофану в білку. Для цього було розглянуто два альтернативних варіанти проведення гідролізу-кислотний і лужний гідроліз бактериородопсина. Кислотний гідроліз білка в стандартних умовах (6 н. HCL, 24 год, 110 ⁰ С), як відомо, призводить до повного руйнування триптофану та часткового руйнування серину, треоніну та деяких інших амінокислот у білку [19], які для наших експериментів не грають суттєвої ролі. Іншим значним недоліком при проведенні гідролізу в HCL є ізотопний обмін ароматичних протонів (дейтеронов) в молекулах триптофану і тирозину [20]. Модифікація методу проведення кислотного гідролізу бактериородопсина полягала у використанні дейтерій-мічених реагентів (6 н. Розчин ² НCl (у ² Н ₂ O)) і додаванні в реакційну суміш 3% - ного фенолу. Інший варіант гідролізу бактериородопсина полягав у використанні 4 н. розчину Ba (OH) ₂ (110 ⁰ C, 24 год). У цих умовах гідролізу білка реакцій ізотопного обміну водню на дейтерій в ароматичних амінокислотах триптофану і тирозин не відбувається, і що особливо важливо - не руйнується триптофан. Обидва методи гідролізу бактериородопсина показали хороші результати. Однак внаслідок високої гидролизующее здібності гідроокису барію і легкості виділення вільних амінокислот з лужних гідролізатів шляхом нейтралізації гідрооксиду барію сірчаної кислотою, автори віддали перевагу лужному варіанту гідролізу бактериородопсина. Для подальшого мас-спектрометричного аналізу гідролізати бактериородопсина обробляли дансілхлорідом і діазометаном (і / або карбобензоксіхлорідом) з отриманням летючих похідних амінокислот, які потім розділяли методами обернено-фазової ВЕРХ.

Мас-спектрометричний аналіз метилових ефірів дансільних похідних L-[2,3,4,5,6 - ² H _{5]-фенілаланіну,} L-[3,5 - ² H _{2]-тирозину} і L-[2,4,5 , 6,7 - ² H _{5]-триптофану,} виділених з гідролізатів бактериородопсина. Мас-спектр гідролізату бактериородопсина, отриманий з середи, що містить L-[2,3,4,5,6 - ² H _{5]-фенілаланін,} L- [3,5 - ² H _{2]-тирозин} і L-[2,4,5,6,7 - ² H _{5]-триптофан} після обробки дансілхлорідом і діазометаном представлений на рис. 4. Як видно з представлених даних, у мас-спектрі цього гідролізату бактериородопсина присутні піки молекулярних іонів збагачених дейтерієм метилових ефірів дансілпроізводних-фенілаланіну з М ^+. M / z 417 (замість 412 для нативного фенілаланіну), тирозину з М ^+. З m / z 429 (замість 428) і триптофану з М ^+. m / z 456 (замість 451). Отримані дані свідчать про високу ефективність мічення бактериородопсина по залишках дейтерированного фенілаланіну і триптофану. Що стосується ізотопного збагачення тирозину в бактеріородопсин (згідно з даними мас-спектрометрії ступінь дейтерірованності тирозину становить 50%), автори не виключають, що подібний результат міг бути обумовлений не внеском біосинтезу тирозину de novo, а можливим ^{(1 Н-2} Н)-обміном при виділення амінокислот або при хімічній модифікації тирозину. Крім вищеназваних амінокислот в мас-спектрі модифікованого дансілхлорідом і діазометаном гідролізату бактериородопсина, зображеного на рис.3, чітко фіксуються піки молекулярних іонів похідних інших амінокислот, таких, як гліцин (М ^+. З m / z 322), аланін (М ^+. З m / z 336), валін (М ^+. з m / z 364) і лейцин (ізолейцин) (М ^+. з m / z 378). Як і слід було очікувати, ці амінокислоти в бактеріородопсин НЕ дейтерированного.

Як видно з рис.4, в мас-спектрі гідролізату бактериородопсина піки молекулярних іонів, відповідним похідним ароматичним амінокислот мали недостатньо високу інтенсивність, за рахунок чого молекулярна область збагачення дейтерієм цих з'єднань була сильно розширені. Тому було необхідно хроматографічно виділяти і аналізувати індивідуальні дейтерій-мічені аналоги вказаних амінокислот з білкових гідролізатів. Для цих цілей автори використовували метод обернено-фазової високоефективної хроматографії (ВЕРХ), добре апробований для аналітичного і препаративного поділу бензілоксікарбонільних похідних дейтерій-мічених амінокислот, що виділяються з інших мікробних об'єктів [17]. Цей метод був адаптований до умов хроматографічного розділення сумішей метилових ефірів дансільних похідних амінокислот бактериородопсина.

В якості прикладу на рис. 5, б представлений мас-спектр чистого метилового ефіру L-[2,3,4,5,6 - ² H _{5]-дансілфенілаланіна,} виділеного методом обернено-фазової ВЕРХ з гідролізату бактериородопсина, зображеного на рис.4 (Мас спектр наведено щодо немічених похідного L-фенілаланіну (а)). Доказом наявності дейтерію в фенілаланіну, хроматографічних виділеному з гідролізату бактериородопсина є присутність у мас-спектрі дейтерірованнного зразка піку молекулярного іона дейтерированного похідного L-фенілаланіну (М ^+. З m / z 417 (замість 412 для контрольних умов (а)) та збагаченого дейтерієм бензильного фрагмента фенілаланіну з m / z 96 (замість 91 у контролі). Крім цього, в мас спектрі електронного удару метилового ефіру данс-фенілаланіну зафіксовані піки фрагментів з m / z 170, 234, 250 і 353, три з яких за масою відповідають дансільному фрагменту і продуктів його розпаду до N-діметіламінонафталіна (ці фрагменти не дейтерированного), а низькоінтенсивний пік з m / z 353 є продуктом відщеплення групи-соосно ₃ з похідного фенілаланіну. Отримані дані свідчать про те, що 5 атомів водню в молекулі фенілаланіну заміщені на дейтерій , що в цілому збігається із ступенем дейтерірованності вихідного L-[2,3,4,5,6 - ² H _{5]-дансілфенілаланіна,} який додається в середу культивування. Згідно з даними з розділення метилових ефірів дансілпроізводних амінокислот гідролізатів бактериородопсина методом обернено-фазової ВЕРХ, ступінь чистоти отриманих метилових ефірів L-[2,3,4,5,6 - ² H _{5]-дансілфенілаланіна,} L-[3,5 - ² H _{2]-тирозину} і L-[2,4,5,6, 7 - ² H _{5]-триптофану} становить від 96% для похідних L-фенілаланіну і L-тирозину до 98% для похідного L-триптофану.

Таким чином, отримані дані свідчать про високу ефективність мічення бактериородопсина по залишках дейтерій-мічених ароматичних амінокислот. Надалі також планується отримувати за розробленим методом повністю дейтерированного препарати бактериородопсина для реконструкції функціонально активних систем мембранних білків у з очищених компонентів у ² Н ₂ O з участю дейтерій-мічених ліпідів та інших дейтерированного біологічно активних сполук (дані з отримання повністю дейтерированного бактериородопсина будуть опубліковані в окремій статті). Ці дослідження дозволять дати відповідь на питання як функціонує дейтерій-мічений бактеріородопсин у складі нативних мембран в умовах, близьких до адаптації організму до ² Н ₂ О.