Біосинтез 2Н-міченого інозину високого рівня дейтерірованності

Біосинтез ² h-міченого інозину високого рівня дейтерірованності

О. В. Мосіна ^*

^* Московська державна академія тонкої хімічної технології ім. М. В. Ломоносова, 117571 Москва, просп. Вернадського, 86.

Здійснено біосинтез ² Н-міченого пуринового рибонуклеозид інозину (вихід 3.9 г c 1 л ростової середовища) з використанням адаптованого до дейтерію штаму Bacillus subtilis в тяжеловодородной середовищі високого рівня дейтерірованності (89-90 ат.% ² Н) з 2% гідролізатом біомаси метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum як джерела ² Н-мічених ростових субстратів (умови синтезу: синтетична середу М9 з 98% ² Н ₂ О і 2% ^[U-2 H] метанолом, інкубаційний період 5-6 діб при 37 ⁰ С). Дослідження рівня дейтерірованності биосинтетического інозину методом мас-спектрометрії FAB виявило поліморфізм включення дейтерію в молекулу (ізотопний склад інозину: 4 ат. ² Н, 20%; 5 ат. ² Н, 38%; 6 ат. ² Н, 28%; 7 ат . ² Н, 14%) з включенням дейтерію в рібозний і гіпоксантіновий фрагменти молекули.

Ключові слова: Bacillus subtillis; ² Н-мічений інозин; біосинтез; мас-спектрометрія FAB.

ВСТУП

В даний час в усьому світі зростає інтерес до отримання природних біологічно активних сполук (БАС), мічених стабільними ізотопами ⁽² Н, ¹³ С, ¹⁵ N, ¹⁸ Про та ін), які необхідні для численних біохімічних і діагностичних цілей [1], структурно -функціональних досліджень [2], а також для вивчення клітинного метаболізму [3]. Тенденції до кращого використання стабільних ізотопів порівняно з радіоактивними аналогами обумовлені відсутністю радіаційної небезпеки і можливістю визначення локалізації мітки в молекулі спектроскопією ¹ Н ЯМР [4, 5], ІК-і лазерної спектроскопією [6], а також мас-спектрометрією [7]. Розвиток технічної та комп'ютерної оснащеності аналітичних методів дозволило істотно підвищити ефективність проведення біологічних досліджень de novo, а також вивчати структуру і механізм дії БАС на молекулярному рівні [8]. Велике науково-прикладне значення в цьому аспекті мають сполуки нуклеїнової природи, що містять дейтерієву мітку в вуглецевому кістяку молекули [9]. Зокрема, ² Н-мічені рибонуклеозид в найближчому майбутньому зможуть знайти застосування в матричних синтезах молекул дейтерированного РНК для вивчення їх просторової структури і конформаційних змін [10].

Важливим моментом у дослідженнях із застосуванням ізотопно мічених БАС є їх доступність. Дейтеріймечение БАС можуть бути синтезовані з використанням хімічних, ферментативних і біосинтетичні методів [11, 12]. Однак хімічні синтези часто багатостадійний, вимагають великих витрат коштовних реагентів і мічених субстратів і призводять до кінцевого продукту, який представляє собою рацемічну суміш D - і L-форм, для поділу яких потрібні спеціальні методи [13]. Більш тонкі синтези мічених БАС пов'язані з комбінацією хімічних [14] та ферментативних підходів [15, 16]. Стратегія синтезу ізотопно-мічених БАС більш докладно висвітлена в роботі ЛеМастера [17].

Для багатьох науково-практичних цілей біотехнологія пропонує альтернативний хімічному синтезу біосинтетичних метод отримання дейтеріймечених БАС, який призводить до високих виходів синтезованих продуктів, до ефективного включення дейтерію в молекули і до збереження природного конфігурації синтезованих сполук [18]. Традиційним підходом при цьому залишається запропонований Креспі метод вирощування штамів-продуцентів у середовищах з максимальними концентраціями дейтерію [19]. Проте основною перешкодою є нестача ² Н-мічених ростових субстратів з високим рівнем дейтерірованності. Перш за все це пов'язано з обмеженою доступністю і дорожнечею самого високоочищеного дейтерію, що виділяється з природних джерел. Природна поширеність дейтерію становить лише 0.015% (відносно загальної кількості елемента), однак незважаючи на невисокий вміст дейтерію в пробах розроблені в останні роки методи збагачення і очищення дозволяють отримувати ² Н-мічені субстрати високого рівня ізотопної чистоти [20].

Починаючи з перших експериментів Даболла і Кокса з вирощування природних об'єктів у важкій воді, розробляються підходи з використанням гідролізатів ² Н-міченої біомаси як ростових субстратів для синтезу штамів-продуцентів БАС [21, 22]. Однак експерименти виявили бактеріостатичний ефект ² Н ₂ О, що полягає в інгібуванні життєво-важливих функцій клітини, наданої 40% ² Н ₂ О на рослинні клітини [23] і 80-90% ² Н ₂ О на клітини найпростіших і бактерій [24]. Спроби використовувати для синтезу в ² Н ₂ О природних об'єктів різної таксономічної приналежності, включаючи бактерії, мікроводорості [25] і дріжджі [26] робилися протягом тривалого часу. Однак широкого поширення в біотехнології вони не отримали через труднощі синтезу, використання складних комплексних ростових середовищ, складності технологічної схеми синтезу і т. п. Тому цілий ряд практичних питань біосинтезу ² Н-мічених БАС в ² Н ₂ О залишається не з'ясованим.

Більше перспективні схеми синтезу з використанням як ² Н-мічених ростових субстратів біомаси метилотрофних бактерій, асиміляційні метанол по рибулезо-5-монофосфатному (РМФ) і серинових шляху фіксації вуглецю, інтерес до яких зростає завдяки інтенсивному розвитку технології хімічного синтезу метанолу [27, 28 ]. Рівень асиміляції біомаси метілотрофов клітинами найпростіших організмів і еукаріот становить 85-98%, а їх продуктивність, виміряна за рівнем біоконверсії метанолу в клітинні компоненти, досягає 50% [29]. Як було показано нами раніше, метилотрофних бактерії дуже невибагливі об'єкти, зростають на мінімальних середовищах з 2-4% метанолом, у яких інші контамінантние бактерії не розмножуються і досить легко адаптуються до максимальних концентрацій ² Н ₂ О, що істотно для синтезу ² Н-мічених БАС [30, 31]. Великий науково-практичний інтерес до використання дейтерированного метилотрофних біомаси для синтезу продуцентів рибонуклеозид визначив мету цієї роботи, пов'язаної з вивченням принципової можливості біосинтезу ² Н-міченого інозину штамом Bacillus subtilis за рахунок використання гідролізату факультативних метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum.

Таблиця 1. Ізотопний склад ростових середовищ і біосинтетичні характеристики B. methylicum

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Для синтезу ² Н-міченого інозину використовували мутантний штам грампозитивних бактерій Bacillus subtilis (попередньо адаптований до дейтерію скринінгом до окремих колоній), який через порушення метаболічних шляхів регуляції біосинтезу пуринових рибонуклеозид синтезує в стандартних умовах вирощування (дріжджова середа, пізній експонентний ріст, 32 -34 ⁰ С) 17 г інозину на 1 л культуральної рідини (ЯЖ) [32]. Максимальний вихід інозину досягався при використанні природного протоновану середовища, що містить як в якості джерел ростових факторів і амінного азоту 2% БВК дріжджів, а в якості джерела вуглецю і енергії глюкозу (не менше 12 мас.%). При проведенні синтезу потрібно замінити протоновані ростові субстрати їх дейтерированного аналогами, а також використовувати ² Н ₂ О високого рівня ізотопної чистоти. Для вирішення поставленого завдання використовували адаптований до дейтерію штам факультативних метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum з 50% рівнем біоконверсії метанолу (при ефективності конверсії 15.5 - 17.3 г сух. Біомаси на 1 г спожитого субстрату) [33]. Проведення адаптації для B. methylicum визначалося необхідністю поліпшити ростові характеристики штаму в максимально дейтерированного середовищі, тому використали східчасто-збільшується градієнт концентрації ² Н ₂ О в ростових середовищах в присутності 2% метанолу (табл. 1). Для вивчення впливу рівня дейтерірованності джерела вуглецю на ростові параметри штаму в дослідах (1, 3, 5, 7 і 9) використовували протоновані метанол, а в дослідах (2, 4, 6, 8 і 10) ^[U-2 Н] метанол. Згідно з отриманими даними заміна протоновану метанолу його дейтерированного аналогом в умовах однакової концентрації ² Н ₂ О в середовищі приводила до невеликих зменшенням ростових характеристик штаму (табл. 1, досліди 2, 4, 6, 8 і 10). Тому в подальших дослідах використовували середовища з ² Н ₂ О і ^[U-2 Н] метанолом. На контрольної протоновану середовищі (1) з водою і метанолом тривалість лаг-періоду і часу клітинної генерації B. methylicum склали 20 і 2.2 год, а вихід мікробної біомаси 200 г з 1 л ЯЖ (табл. 1, досвід 1). У проміжних дослідах (2-10) біосинтетичні параметри змінювалися пропорційно концентрації ² Н ₂ О. Знайдена закономірність полягала у збільшенні тривалості лаг-періоду і часу клітинної генерації при зменшенні виходів мікробної біомаси з фіксуванням найнижчих значень цих параметрів у максимально дейтерированного середовищі з 98% ² Н ₂ О і 2% ^[U-2 H] метанолом (табл. 1 , досвід 10). За ходом адаптації, умови якої показані в досвіді 10 '(табл. 1) спостерігали, знімаючи динаміки зростання вихідного (б) і адаптованого до дейтерію (в) штаму в максимально дейтерированного середовищі М9 (рис. 1, контроль (а) отриманий в протоновану середовищі), а також щодо зміни тривалості лаг-періоду, часу генерації та виходів мікробної біомаси (рис. 2). На відміну від адаптованого штаму (в), ростові динаміки вихідного штаму (б) у максимальній дейтерированного середовищі інгібувати дейтерієм (рис. 1).

Вихід мікробної біомаси у адаптованого штаму (в) зменшувався на 13% в порівнянні з контрольними умовами (рис. 2, а) при збільшенні часу генерації до 2.8, а тривалості лаг-періоду до 40 год (рис. 2, в). Адаптований штам повертався до нормального зростання при перенесенні в протоновану середу після пролонгованої лаг-періоду, що доводить фенотипическую природу феномена адаптації, хоча теоретично не виключається, що ефект реверсії стабільно зберігається при зростанні в ² Н ₂ О, але маскується при перенесенні клітин в протоновану середу . Поліпшені ростові характеристики адаптованого метілотрофа существено спрощують схему синтезу ² Н-міченої біомаси, оптимальними умовами якої задовольняє максимально дейтерированного середу М9 з 98% ² Н ₂ О і 2% ^[U-2 Н] метанолом з інкубаційним періодом 5-6 діб при 37 ⁰ С.

Схема синтезу ² Н-міченого інозину розроблялася з урахуванням здатності метилотрофних бактерій синтезувати велику кількість білка (вихід 50% від ваги сухої речовини), 15 - 17% полісахаридів, 10 - 12% ліпідів (в основному, фосфоліпіди) та 18% зольних речовин [ 34]. Гідроліз біомаси проводили автоклавуванням в 0.5 н. ² НCl (у ² Н ₂ O), щоб забезпечити високі виходи цих з'єднань і мінімізувати реакції зворотного ^{(1 Н-2} Н) обміну в амінокислотних залишках молекул білків. Якісний і кількісний склад ароматичних амінокислот метилотрофних гідролізату вивчали в дейтерированного середовищі М9 на катіонообмінної колонці Biotronic LC-5001 (ФРН) з сульфовані смолою UR-30, а рівні дейтерірованності молекул мас-спектрометрією електронного удару метилових ефірів N-діметіламінонафталін-5-сульфонільного похідних амінокислот . Гідролізат представлений п'ятнадцятьма ідентифікованими амінокислотами (за винятком проліну, який детектувала при 440 нм) при виходах амінокислот, порівнянному з потребами штаму в джерелах вуглецю і амінного азоту (табл. 2). При цьому індикатором, що визначає високу ефективність включення дейтерію в синтезується продукт служить високий рівень дейтерірованності молекул амінокислот, який варіює від 49% для лейцину / ізолейцин до 97.5% для аланіну (табл. 2).

Біосинтетичні характеристики штаму B. subtilis знімали в протоновану дріжджовий середовищі зі звичайною водою і синтетичної тяжеловодородной середовищі з ² Н ₂ О і 2% ² Н-міченим метилотрофних гідролізатом B. methylicum (рис. 3). Відзначено кореляція в характері зміни ростових динамік (рис. 3, 1а, 2а), виходу інозину (рис. 3, 1б, 2б) і асиміляції глюкози (рис. 3, 1в, 2в). Максимальний вихід інозину (17 г / л) зафіксовано в досвіді 1б (рис. 3, 1б) на протоновану середовищі при рівні асимільованих глюкози 10 г / л (рис. 3, 1в). На тяжеловодородной середовищі вихід інозину знижувався у 4.4 (3.9 г / л) (рис. 3, 2б), а рівень асиміляції глюкози в 4 рази, про що свідчить 40 г / л неасимільовані глюкози в ЯЖ (рис. 3, 2в).

Таблиця 2. Амінокислотний склад метилотрофних гідролізату та рівні дейтерірованності молекул

Отриманий результат вимагав вивчення вмісту глюкози в біомасі штаму після гідролізу, здійснене методом обернено-фазової ВЕРХ (табл. 3). Суміш гідролізних цукрів у табл. 3 (нумерація наведена за послідовності їх елюції з колонки) становили моно-(глюкоза, фруктоза, Рамноза, арабіноза), ді-цукориди (мальтоза, сахароза), а також чотири інші неідентифіковані цукру з часами утримування 3.08 (15.63%), 4.26 ( 7.46%), 7.23 (11.72%) і 9.14 (7.95%) хв (не показані). Вихід глюкози в дейтерированного гідролізаті складає 21.4% від сух. ваги, тобто вище, ніж фруктози (6.82%), рамнози (3.47%), арабінози (3.69%) і мальтози (11.62%). Їх виходу істотно не відрізнялися від контролю на Н ₂ О, за винятком сахарози, не Детектируемая в дейтерированного гідролізаті.

Таблиця 3. Склад цукрів гідролізату штаму-продуцента

Застосування складних фізико-хімічних методів для виділення біосинтетичних ² Н-міченого інозину з ЯЖ диктувалося необхідністю отримувати інозин високого ступеня хроматографічної чистоти. Оскільки в ЯЖ поряд з синтезується продуктом присутні домішки неорганічних солей, білків і полісахаридів, а також супутні вторинні метаболіти нуклеїнової природи (аденозин, гуанозин) і непрореагіровавшіх субстрати (глюкоза, амінокислоти), проводили поетапне фракціонування ЯЖ. Підвищена чутливість інозину до кислот і лугів і його нестабільність при виділенні диктували використання кислотних і лужних розчинів низької концентрації, а також по-можливості проводити виділення при низьких температурах, уникаючи тривалого перегріву реакційної суміші. Фракціонування ЯЖ полягало в низькотемпературному осадженні високомолекулярних домішок органічними розчинниками ацетоном і метанолом, твердофазної адсорбції / десорбції на поверхні активованого вугілля, екстрактивних вилучення продукту, перекристалізації та іонообмінної хроматографії. Білки і полісахариди видаляли низькотемпературної осадженням ацетоном при -4 ⁰ С, проводячи подальшу адсорбцію суми рибонуклеозид активованим вугіллям на холоду. Десорбувався рибонуклеозид витягували з прореагованою твердої фази елюція етанольних-аміачним розчином при 60 ⁰ С, а сам інозин екстракцією 0.3 М NH _{4-форміатним} буфером (рН 8.9) з подальшою перекристалізацією в 80% етанолі. Остаточна стадія очищення полягала в колонкової іонообмінної хроматографії на катіонообменнік AG50WX 4, врівноваженим 0.3 М NH _{4-форміатним} буфером з 0.045 М NH ₄ Cl з ТШХ контролем при R _f 0.5. Дані щодо виділення інозину з ЯЖ штаму-продуцента представлені у вигляді спектрів УФ-поглинання на рис. 4, а-в. Наявність у синтетичному зразку (в) основної смуги поглинання I, відповідної нативному інозину (l _max 249 нм, e ₂₄₉ 7100 М ^-1 см ^-1) і відсутність вторинних метаболітів II і III незаперечно доводить його однорідність і тим самим ефективність розробленого методу виділення зі ступенем хроматографічної чистоти 92%.

Рівень дейтерірованності інозину досліджували методом мас-спектрометрії FAB із за високої чутливості, що дозволяє детектувати 10 ^{-8 -10} -10 моль речовини в пробі, що істотно вище ніж при використанні ¹ Н ЯМР-спектроскопії [7]. Шляхи фрагментації молекули методом FAB призводять до розпаду інозину на фрагмент рибози А з Мr при масовому співвідношенні m / z 133 і гіпоксантіновий фрагмент Б c Мr m / z 136 (їх розпад супроводжувався міграцією протона Н ^+), який у свою чергу розщеплюється на ряд менш низькомолекулярних осколкових фрагментів В, Г, Д, Е та Ж при m / z 109, 108, 82, 81 і 54 за рахунок елімінування НСN і СО з гіпоксантину (схема).

Біосинтетичних ² Н-мічений інозин (мас-спектр наведено на рис. 5, б щодо контролю (а)), представлений сумішшю ізотопнозамещенних форм молекул з різною кількістю атомів водню, заміщених на дейтерій. Підрахунок рівня дейтерірованності молекули інозину визначали, порівнюючи величини піків молекулярних іонів Мr інозину дейтерированного і протоновану зразків (формування піку молекулярного іона інозину супроводжувалося міграцією протона Н ^+). Пік (М + Н) ⁺ поліморфно розщеплювався на окремі кластери з домішкою молекул зі статистичними набором масових чисел m / z з різним внеском в сумарний рівень дейтерірованності з включенням чотирьох (m / z 273, 20%), п'яти (m / z 274, 38%), шести (m / z 275, 28%) і семи атомів дейтерію (m / z 276, 14%) (табл. 4).

Сумарний рівень дейтерірованності молекули (УД), обчислень по наведеній нижче формулі склав 61% від загальної кількості атомів водню в вуглецевому кістяку молекули.

M _r1 C ₁ + M _r2 C ₂ + ....... + M _rn C _n