Реферат на тему:
Можливості іонообмінної хроматографії.
Адсорбційна хроматографія
У ситуації, зображеної на рис. доцільно використовувати "увігнутий" градієнт концентрації солі: повільно наростаючою в області її малих значень і круто - в області великих концентрацій. Це наблизить пік білка 5 до іншим і тим самим скоротить час хроматографії.
Я навів для прикладу спосіб вибору вмісту солі в елюент у разі вже обраного рН буфера. Аналогічний досвід можна поставити і для дослідження впливу рН при одній певної концентрації солі. (Нагадаю, що величина рН обов'язково впливає на стан йоногенних груп білка і, отже, на розподіл зарядів по поверхні білкової глобули. У разі використання слабкого іонообмінника від рН залежить і кількість активних іонів на матриці) Далі результати обох дослідів можна розумно об'єднати, варіюючи ( ступінчасто або в градієнті) обидва параметри. Можливо, що доведеться змінити іонообмінник або істотно подовжити колонку.
Якщо, незважаючи на всі зусилля, розділити білки суміші в одному хроматографічному досвіді не вдасться, то можна вийшли з колонки фракції нероздільний білків об'єднати і внести в колонку з іншим іонообмінників або використовувати інший вид хроматографії.
Нерідко перед дослідником стоїть завдання очищення одного певного білка з суміші з іншими. У цьому випадку оптимальні умови елюції підбирають так, щоб інші білки, не поділяючись, відходили від потрібного білка в ту або іншу сторону, тобто елюіровалісь раніше за нього або затримувалися на колонці.
Резюмуючи, слід укласти, що використання способу фракціонування білків методом іонообмінної хроматографії вимагає дуже серйозною і вдумливої попередньої роботи з оптимізації умов проведення цієї хроматографії.
Зрозуміло, завдання ще ускладнюється, якщо в розпорядженні дослідника немає чистих білків, що входять до складу фракціоніруемой суміші. У цьому випадку доводиться задовольнятися або літературними даними про їх властивості, або вести підбір умов використовуючи по можливості близькі аналоги відсутніх білків.
Поділ аж ніяк не блискуче. Методом електрофорезу можна домогтися помітно кращого результату. Але зате всі білки отримані в одному хроматографічному поділі, не обмеженому щодо препартівного масштабу (можна збільшити кількість матеріалу і розмір колонки) і немає проблеми елюції білків з гелю.
400 300
Рис.
Рис. демонструє зазначені раніше переваги хро-матографіі при середньому тиску в системі FPLC. На аніонообмінником "Моно Ф" (див. вище) проводили розділення білків отрути Crotalus atrox. Елюція вели лінійним градієнтом концентрації NaCI (0-0,35 М) при рН7, 5. За 20 хвилин вдалося добре розділити більш десятка білкових піків.
Ці рівноваги повинні бути сильно зміщені в бік нерухомої фази. У іонообмінної хроматографії такий зсув відбувався за рахунок електростатичної, іонного зв'язку кожного з речовин з твердої хроматографічної матрицею.
З потоком рухомої фази (елюента), яка забирає розчинені в ній речовини, всі ці рівноваги порушуються і негайно відновлюються (на більш низькому рівні концентрацій) за рахунок часткового виходу з нерухомої фази кожного з речовин.
Шаром нижче йде зворотний процес - динамічні рівноваги встановлюються за рахунок переходу речовин з рухомої фази в нерухому до тих пір, поки ці нові рівноваги не досягнуто найвищого рівня концентрацій. Після чого знову починається вимивання речовин елюентом, точно таке ж, як відбувалося в вищележачому шарі, який тим часом спустошується.
Так відбувається переміщення пов'язаних з матрицею зон різних речовин вниз по стовпчику. Ці зони рухаються з різними швидкостями, що з відмінностями сил зв'язування кожної з них з матрицею і, відповідно, відмінністю співвідношень рівноважних концентрацій поділюваних речовин в нерухомої і рухомої зонах.
Повторне виклад суті хроматографічного процесу має на меті звернути увагу читача на те, що в ньому не фігурує механізм зв'язку речовин з матрицею.
Власне кажучи, не заявлена навіть необхідність такого зв'язку, а тільки умова відмінності рівноважних концентрацій у двох зонах, специфічне для кожного з фракціоніруемих речовин.
Така умова може бути виконане і іншими способами. Наприклад, можна використовувати відмінність розчинність цих речовин у різних розчинниках. Гідрофільні речовини, що мають на поверхні своїх молекул поляризовані ділянки або іони. Вони добре розчиняються у воді і погано - в органічних розчинниках.
Гідрофобні ж речовини погано розчиняються у воді і добре - в органіці. Були навіть названі найбільш типові з гідрофобних речовин: аліфатичні ланцюжка виду СНз-CH2-CH2 ... і ароматичні молекули - замкнуті цикли з сполученими зв'язками типу бензолу чи фенолу.
Слід зауважити, що абсолютної нерастворимости не буває. Гідрофільні речовини погано, але все-таки розчиняються в органічних розчинниках. Те ж саме відноситься і до її відносин гідрофобних речовин і води.
Уявімо тепер собі колонку, заповнену целюлозою, набряклої у воді. Усередині гранул такий целюлози теж буде знаходитися нерухома вода. Потім пропустимо через цю колонку фенол, який заповнить простір між гранулами.
Нарешті внесемо на цю колонку суміш гідрофільних речовин, хоча б звичайних водорозчинних білків. Велика їх частина негайно "сховається" в нерухомій водній фазі всередині гранул. Мала ж їх частка (для різних білків - різна) все-таки розчиниться в фенолу. Встановляться динамічні рівноваги концентрацій білків, що відповідають співвідношенням їх розчинності, в усіх випадках сильно зрушені до нерухомій фазі. Але це і є умова реалізації колонкової хроматографії.
Можна сподіватися, що якщо достатньо довго подавати на таку колонку фенол як елюента, то в кінці кінців на виході з колонки з'являться розділені між собою, дуже пологі піки наших білків, розчинених у фенолу.
Це - "розподільна хроматографія". заснована на різниці розчинності. Історично такий розподіл, коли водна фаза знаходиться всередині гранул, а елюентом служить органічний розчинник, названо "нормальнофазовой" хроматографією. Вона широкого поширення не отримала.
Головним чином тому, що фракціоніруемие речовини виходять з колонки в органічному розчиннику, в той час, як для переважної більшості біологічних речовин нормальне середовище - водяна.
На відміну від цього, запропонований пізніше варіант так званої "зверненої" або "обратнофазовой" розподільної хроматографії виявився дуже продуктивним. Тут зв'язування молекул в нерухомій фазі відбувається за рахунок їх, нехай навіть не яскраво виражених, але існуючих гідрофобних властивостей. (Наприклад, наявності гідрофобних ділянок на поверхні білкової глобули).
У нерухомій фазі створюються умови для добре вираженого гідрофобної взаємодії. Зазвичай не з рідиною, що знаходиться всередині гранул, оскільки органічний розчинник важко утримати всередині звичайної гідрофільної матриці (він її не змочує).
Гідрофобну середу створюють або на поверхні самої матриці, змушуючи частково гідрофобні молекули у водному середовищі "прилипати" до цієї поверхні, або в тонкій плівці сильно гідрофобного розчинника, надійно пов'язаного з матрицею.
Відповідно модифіковані матриці іменуються: "октіл-сефароза", "октілдеціл-сефароза" і "феніл-Сефа-троянда". Приєднані радикали створюють сильно гідрофобну середу на поверхні самої сефарозной матриці.
Розділяти білки по силі гідрофобної взаємодії з цим середовищем можна шляхом простої ізократіческой елюції водним буфером. Проте розподіл можна прискорити і поліпшити, якщо вести елюція лінійним градієнтом слабкого розчину NaCI (0,02-0,3 М) в буфері. Справа в тому, що в слабких сольових розчинах білки розчиняються краще, ніж у воді.
Поліпшення розчинності білкових молекул в елюент сприяє відриву білків від гидрофобізірованной поверхні матриці, а отже, і вилучення їх з нерухомої фази.
Цікаво, що на тій же самій гидрофобізірованной матриці ті ж самі білки можна розділяти зворотним - знижується градієнтом концентрації солі. У дуже концентрованих водних розчинах солі, зокрема сульфату амонію, розчинність білків падає до нуля.
Цим можна скористатися для забезпечення шляхом елюції знижується градієнтом сульфату амонію (напрімер.1-0, 5М) поступового збільшення розчинності білків у елюент, що призведе до тих самих результатів, що і в попередньому випадку.
У ньому використовується сильно гідрофобна рідина, тонкою плівкою надійно обволікає нитки гидрофобізірованной матриці, наприклад ліпофільній модифікації сефадекса з торговельною назвою "сефадекса LH-20".
Плівку утворює рідину зі складним хімічним найменуванням - трикаприлилмонометиламмоний хлорид (торговельна назва "Адоген 464"). З її хімічної формули: видно, що молекули цієї рідини містять велику алифатическую оболонку, навколишнє атом азоту, що несе позитивний заряд.
Система ХОФ-5 виявилася досить ефективною для фракціонування нуклеїнових кислот. Нуклеїнові основи являють собою сукупність замкнутих циклів з сполученими зв'язками і тому володіють високим ступенем ароматичної гідрофобності, що і забезпечує їх схильність до розчинення в гідрофобною плівці.
Мабуть, такого розчинення сприяє і тяжіння негативно заряджених фосфатів нуклеїнової кислоти до позитивно заряджених атомів азоту в адогене 464.
Елюція колонок ХОФ-5 ведуть відносно пологим зростаючим градієнтом концентрації NaCl. Присутність солі блокує названу електростатичну зв'язок азот-фосфор, полегшуючи вихід ДНК з гідрофобного плівки в навколишнє її водно-сольову середу.
Як приклад на ріс.59 показаний результату хроматографічної очистки плазміди pBR322 від оточуючих її в лізатів бактерій РНК і високомолекулярної ДНК (за даними фірми BRL, 1981). Пунктирна лінія на малюнку позначає градієнт концентрації NaCl.
Особливо часто обратнофазовую розподільну хроматографію використовують для розділення низькомолекулярних об'єктів (амінокислот, пептидів, нуклеотидів та ін) при високому тиску (ЖХВД). Конкурентну елюція у більшості випадків ведуть градієнтом відносно слабко гідрофобних органічних розчинників: метанолу, етанолу, пропанолу, ацетонітрилу або тетрагідроф урану (ТГФ).
Хоча раніше було вирішено, що ми залишаємо осторонь ЖХВД, але тут має сенс про неї згадати, щоб прояснити одну раніше залишилася без роз'яснення ситуацію. Справа в тому, що саме за допомогою такого виду хроматографії здійснюють ідентифікацію амінокислот при секвенування білків за методом Ердмана.
Секвенування ведеться шляхом послідовного відщеплення "складних і вельми гідрофобних похідних амінокислот". Тут я можу привести їх загальне хімічну назву ("фенілтіогідантоіновие похідні" - ФТГ) з однією тільки метою - вказати на початок цього найменування, де фігурує феніл - радикал фенолу. Це і є причина гідрофобності.
На Ріс.60 показаний хроматографічний профіль розділення суміші ФТГ-похідних 20-ти амінокислот методом ЖХВД на колонці, де на основі силікагелю закріплені аліфатичні 18-ти членні радикали октілдеціла. По суті справи це той же самий перший варіант твердої гідрофобною матриці, який
Афінних означає споріднений (від латинського af finis) або, точніше, володіє спорідненістю. Афінна зв'язок в нашому випадку мається на увазі біоспеціфіческое взаємодія, що відрізняється винятковою вибірковістю. Така вибірковість лежить в основі множини строго детермінованих процесів, що протікають в організмі.
В якості прикладів можна назвати взаємодії між ферментами і їх субстратами або інгібіторами, між гормонами та їх рецепторами, між антигенами і антитілами до них, між багатьма малими молекулами, наприклад, вітамінами і специфічними транспортними білками, що доставляють їх у клітку.
Нарешті, між нуклеїновими кислотами і специфічними білками, які керують реалізацією їх функцій: редуплікації, транскрипцією і трансляцією.
Будь-який з компонентів названих та їм подібних біоспеціфіческіх пар можна надійно закріпити на хроматографічної матриці в якості так званого "ліганда". З його допомогою другої партнер такої пари може бути витягнутий із суміші з іншими, не комплементарними ліганда речовинами і тимчасово затримано на матриці у складі біоспеціфіческого (аффинного) комплексу.
Після видалення всіх сторонніх домішок промиванням тим же елюентом, в якому здійснювалося утворення цього комплексу, можна зробити заміну елюента на такий, який порушить біоспеціфіческую зв'язок ліганда з його афінним партнером. Це забезпечить швидкий вихід останнього з колонки, на якій залишиться звільнений для нових афінних зв'язків ліганд.
Біоспеціфіческое взаємодія реалізується за рахунок тих же, добре знайомих нам сил зв'язку, які фігурували в розглянутих раніше видах хроматографії: електростатичного притягання різнойменних іонів, водневих зв'язків і сил гідрофобної взаємодії.
Біоспеціфічность визначається конформаційним відповідністю ділянок зв'язування на ліганди і речовині, в результаті якого різні їх взаємодії здійснюються одночасно в декількох точках і їх ефекти сумуються.
Одна з тонкощів постановки дослідів з використанням афінної хроматографії полягає у створенні умов, коли жодна з цих кількох зв'язків не буде надмірно міцною. В іншому випадку речовина не вдасться "зняти" з ліганду.
Вся суть методу полягає в конформаційної відповідно. Жодна з зв'язків не є специфічною. Тому їх розрив при елюції очищеного речовини може бути здійснений за допомогою звичайних прийомів: зміною рН, збільшенням іонної сили (іноді і температури) елюента, введенням до його складу органічних розчинників та детергентів.
У деяких випадках може знадобитися втручання денатуруючих агентів (сечовина, формамід), що порушують саме конформационное відповідність пари ліганд - речовина.
Зі сказаного ясно, що головна перевага афінної хроматографії полягає в її дуже високої вибірковості. Разом з тим, сам спосіб зв'язування речовини з матрицею через ліганд в умовах конформаційного відповідності є, як правило, ідеально м'яким і, на відміну від інших видів хроматографії, не загрожує нативної очищуваного речовини, наприклад, його ферментативної активності.
Дійсно, тут фермент "сідає" у точно відповідає її конфігурації "ямку", між тим, як в іонообмінної або розподільної хроматографії зв'язування з сорбентом хоча б тільки в двох, але випадково розташованих, точках може істотно деформувати молекулу ферменту.
У тих "деяких випадках", коли елюція ферменту не вдається здійснити без його денатурації, можна піти по шляху ослаблення первинного біоспеціфіческого зв'язування. Наприклад, замінити в якості ліганда істинний субстрат ферменту на його аналог.
Важливою перевагою афінної хроматографії є і та обставина, що в ній гідролітичні ферменти (протеази і нуклеази) з самого початку відокремлюються від своїх субстратів.
Зокрема, цією обставиною обумовлений високий вихід при очищенні макромолекулярних препаратів. Крім того, зважаючи на виборчій сорбції малої частки речовини, що знаходиться у вихідній суміші, афінної хроматографії відрізняє можливість використання великих обсягів вихідних препаратів. У ході ступінчастою елюції здійснюється дуже ефективне концентрування потрібного речовини.
Є ще одна особливість афінної хроматографії, яку слід відзначити з самого початку. Спосіб зв'язування ліганда з матрицею не повинен створювати стеричних перешкод для здійснення його аффинного взаємодії з сорбуємість речовиною.
Якщо в якості ліганда виступає біополімер (білок або нуклеїнова кислота) та його ділянку біоспеціфіческого взаємодії виявляється досить віддаленим від точки закріплення на матриці, проблема не виникає.
Однак якщо в якості ліганда використовується низькомолекулярний субстрат, кофермент чи гормон, то близькість його розташування до матриці може створювати стеричні перешкоди для правильної орієнтації білка, що взаємодіє з таким лігандом.
У результаті ступінь аффинного спорідненості речовини до обмінника може зменшитись і навіть впасти до нуля. У таких випадках необхідно біологічно активний ліганд видалити від матриці, вводячи між ними тонку "ніжку", наприклад, лінійну ланцюжок метиленових залишків (... - СН2-СН2-СН2..) Або іншу відповідну структуру, так званого "спейсера" "
Хоча принцип афінної хроматографії дуже простий, з наведених коротких зауважень легко зрозуміти, що "конструювання" аффинного обмінника для очищення потрібного речовини є справою делікатним. Необхідно розумно вибрати матрицю, знайти спосіб стабільного та, разом з тим, надійного (як правило хімічного) закріплення на ній ліганду.
Якщо необхідно, то закріплення через спейсер, який теж треба вибрати найкращим чином як щодо його розміру і ступеня гідрофільності, так і щодо способів його зв'язування з матрицею і лігандом.
Зрозуміло, для багатьох приватних, а також і загальних випадків ця задача вирішена зусиллями фірм, що випускають аффінниє сорбенти. Номенклатура їх безперервно розширюється і приводити її тут не має сенсу.
Тим більше, що кожен дослідник, що розуміє виняткові можливості афінної хроматографії, повинен бути готовий до того, щоб сконструювати афінних обмінник для вирішення своєї особливого завдання.
2. Дятловський Е.В., Безуглов В.В. Ліпіди як біоеффектори. Біохімія. 1998. Т.67. вип.1. - С. - 3-6.
3. Єршова Л.П., Курбанова Г.М., Горбунова Н.А. Про механізми посттравматичної анемії. / / Пат. фізіологія. 1992. - N 2. - С. - 54-55.
Можливості іонообмінної хроматографії.
Адсорбційна хроматографія
Градієнтна елюція
Замість ступінчастою елюції може виявитися доцільним поступово збільшувати концентрацію солі, тобто перейти на елюція безперервним градієнтом концентрації солі. Лінійним або нелінійним - щоб скоротити розрив між піками.У ситуації, зображеної на рис. доцільно використовувати "увігнутий" градієнт концентрації солі: повільно наростаючою в області її малих значень і круто - в області великих концентрацій. Це наблизить пік білка 5 до іншим і тим самим скоротить час хроматографії.
Я навів для прикладу спосіб вибору вмісту солі в елюент у разі вже обраного рН буфера. Аналогічний досвід можна поставити і для дослідження впливу рН при одній певної концентрації солі. (Нагадаю, що величина рН обов'язково впливає на стан йоногенних груп білка і, отже, на розподіл зарядів по поверхні білкової глобули. У разі використання слабкого іонообмінника від рН залежить і кількість активних іонів на матриці) Далі результати обох дослідів можна розумно об'єднати, варіюючи ( ступінчасто або в градієнті) обидва параметри. Можливо, що доведеться змінити іонообмінник або істотно подовжити колонку.
Якщо, незважаючи на всі зусилля, розділити білки суміші в одному хроматографічному досвіді не вдасться, то можна вийшли з колонки фракції нероздільний білків об'єднати і внести в колонку з іншим іонообмінників або використовувати інший вид хроматографії.
Нерідко перед дослідником стоїть завдання очищення одного певного білка з суміші з іншими. У цьому випадку оптимальні умови елюції підбирають так, щоб інші білки, не поділяючись, відходили від потрібного білка в ту або іншу сторону, тобто елюіровалісь раніше за нього або затримувалися на колонці.
Резюмуючи, слід укласти, що використання способу фракціонування білків методом іонообмінної хроматографії вимагає дуже серйозною і вдумливої попередньої роботи з оптимізації умов проведення цієї хроматографії.
Зрозуміло, завдання ще ускладнюється, якщо в розпорядженні дослідника немає чистих білків, що входять до складу фракціоніруемой суміші. У цьому випадку доводиться задовольнятися або літературними даними про їх властивості, або вести підбір умов використовуючи по можливості близькі аналоги відсутніх білків.
Можливості іонообмінної хроматографії
На рис. показаний результат хроматографічного розділення 20-ти білків з 40S - субодиниці рибосоми рачка Artemia salina (Ting Shih etal. 1979) Фракціонування вели на колонці СМ-целюлози (1х30 см) лінійним градієнтом NaCI (0-0,4 М) у фосфатному буфері рН6, 5.Поділ аж ніяк не блискуче. Методом електрофорезу можна домогтися помітно кращого результату. Але зате всі білки отримані в одному хроматографічному поділі, не обмеженому щодо препартівного масштабу (можна збільшити кількість матеріалу і розмір колонки) і немає проблеми елюції білків з гелю.
400 300
Рис.
Рис. демонструє зазначені раніше переваги хро-матографіі при середньому тиску в системі FPLC. На аніонообмінником "Моно Ф" (див. вище) проводили розділення білків отрути Crotalus atrox. Елюція вели лінійним градієнтом концентрації NaCI (0-0,35 М) при рН7, 5. За 20 хвилин вдалося добре розділити більш десятка білкових піків.
Розподільна хроматографія
У попередній главі ми ввели поняття нерухомої і рухомої фаз при хроматографії. Далі було встановлено, що для розділення речовин, нанесених на колонку у вигляді суміші, необхідно, щоб для кожного з компонентів цієї суміші встановилася динамічна рівновага концентрацій між двома фазами.Ці рівноваги повинні бути сильно зміщені в бік нерухомої фази. У іонообмінної хроматографії такий зсув відбувався за рахунок електростатичної, іонного зв'язку кожного з речовин з твердої хроматографічної матрицею.
З потоком рухомої фази (елюента), яка забирає розчинені в ній речовини, всі ці рівноваги порушуються і негайно відновлюються (на більш низькому рівні концентрацій) за рахунок часткового виходу з нерухомої фази кожного з речовин.
Шаром нижче йде зворотний процес - динамічні рівноваги встановлюються за рахунок переходу речовин з рухомої фази в нерухому до тих пір, поки ці нові рівноваги не досягнуто найвищого рівня концентрацій. Після чого знову починається вимивання речовин елюентом, точно таке ж, як відбувалося в вищележачому шарі, який тим часом спустошується.
Так відбувається переміщення пов'язаних з матрицею зон різних речовин вниз по стовпчику. Ці зони рухаються з різними швидкостями, що з відмінностями сил зв'язування кожної з них з матрицею і, відповідно, відмінністю співвідношень рівноважних концентрацій поділюваних речовин в нерухомої і рухомої зонах.
Повторне виклад суті хроматографічного процесу має на меті звернути увагу читача на те, що в ньому не фігурує механізм зв'язку речовин з матрицею.
Власне кажучи, не заявлена навіть необхідність такого зв'язку, а тільки умова відмінності рівноважних концентрацій у двох зонах, специфічне для кожного з фракціоніруемих речовин.
Така умова може бути виконане і іншими способами. Наприклад, можна використовувати відмінність розчинність цих речовин у різних розчинниках. Гідрофільні речовини, що мають на поверхні своїх молекул поляризовані ділянки або іони. Вони добре розчиняються у воді і погано - в органічних розчинниках.
Гідрофобні ж речовини погано розчиняються у воді і добре - в органіці. Були навіть названі найбільш типові з гідрофобних речовин: аліфатичні ланцюжка виду СНз-CH2-CH2 ... і ароматичні молекули - замкнуті цикли з сполученими зв'язками типу бензолу чи фенолу.
Слід зауважити, що абсолютної нерастворимости не буває. Гідрофільні речовини погано, але все-таки розчиняються в органічних розчинниках. Те ж саме відноситься і до її відносин гідрофобних речовин і води.
Уявімо тепер собі колонку, заповнену целюлозою, набряклої у воді. Усередині гранул такий целюлози теж буде знаходитися нерухома вода. Потім пропустимо через цю колонку фенол, який заповнить простір між гранулами.
Нарешті внесемо на цю колонку суміш гідрофільних речовин, хоча б звичайних водорозчинних білків. Велика їх частина негайно "сховається" в нерухомій водній фазі всередині гранул. Мала ж їх частка (для різних білків - різна) все-таки розчиниться в фенолу. Встановляться динамічні рівноваги концентрацій білків, що відповідають співвідношенням їх розчинності, в усіх випадках сильно зрушені до нерухомій фазі. Але це і є умова реалізації колонкової хроматографії.
Можна сподіватися, що якщо достатньо довго подавати на таку колонку фенол як елюента, то в кінці кінців на виході з колонки з'являться розділені між собою, дуже пологі піки наших білків, розчинених у фенолу.
Це - "розподільна хроматографія". заснована на різниці розчинності. Історично такий розподіл, коли водна фаза знаходиться всередині гранул, а елюентом служить органічний розчинник, названо "нормальнофазовой" хроматографією. Вона широкого поширення не отримала.
Головним чином тому, що фракціоніруемие речовини виходять з колонки в органічному розчиннику, в той час, як для переважної більшості біологічних речовин нормальне середовище - водяна.
На відміну від цього, запропонований пізніше варіант так званої "зверненої" або "обратнофазовой" розподільної хроматографії виявився дуже продуктивним. Тут зв'язування молекул в нерухомій фазі відбувається за рахунок їх, нехай навіть не яскраво виражених, але існуючих гідрофобних властивостей. (Наприклад, наявності гідрофобних ділянок на поверхні білкової глобули).
У нерухомій фазі створюються умови для добре вираженого гідрофобної взаємодії. Зазвичай не з рідиною, що знаходиться всередині гранул, оскільки органічний розчинник важко утримати всередині звичайної гідрофільної матриці (він її не змочує).
Гідрофобну середу створюють або на поверхні самої матриці, змушуючи частково гідрофобні молекули у водному середовищі "прилипати" до цієї поверхні, або в тонкій плівці сильно гідрофобного розчинника, надійно пов'язаного з матрицею.
Гідрофобізовані матриці сефарози
Перший варіант представлений, зокрема, модифікованими матрицями на основі добре знайомої нам сефарози. За безліччю ОН-груп ниток агарози ковалентним зв'язком приєднують гідрофобні радикали.Відповідно модифіковані матриці іменуються: "октіл-сефароза", "октілдеціл-сефароза" і "феніл-Сефа-троянда". Приєднані радикали створюють сильно гідрофобну середу на поверхні самої сефарозной матриці.
Розділяти білки по силі гідрофобної взаємодії з цим середовищем можна шляхом простої ізократіческой елюції водним буфером. Проте розподіл можна прискорити і поліпшити, якщо вести елюція лінійним градієнтом слабкого розчину NaCI (0,02-0,3 М) в буфері. Справа в тому, що в слабких сольових розчинах білки розчиняються краще, ніж у воді.
Поліпшення розчинності білкових молекул в елюент сприяє відриву білків від гидрофобізірованной поверхні матриці, а отже, і вилучення їх з нерухомої фази.
Цікаво, що на тій же самій гидрофобізірованной матриці ті ж самі білки можна розділяти зворотним - знижується градієнтом концентрації солі. У дуже концентрованих водних розчинах солі, зокрема сульфату амонію, розчинність білків падає до нуля.
Цим можна скористатися для забезпечення шляхом елюції знижується градієнтом сульфату амонію (напрімер.1-0, 5М) поступового збільшення розчинності білків у елюент, що призведе до тих самих результатів, що і в попередньому випадку.
Система ХОФ-5
Інший варіант розподільної хроматографії у звернених фазах під скороченим найменуванням ХОФ-5 (RPC-5) був свого часу дуже популярний і, здається, зберіг своє значення і зараз.У ньому використовується сильно гідрофобна рідина, тонкою плівкою надійно обволікає нитки гидрофобізірованной матриці, наприклад ліпофільній модифікації сефадекса з торговельною назвою "сефадекса LH-20".
Плівку утворює рідину зі складним хімічним найменуванням - трикаприлилмонометиламмоний хлорид (торговельна назва "Адоген 464"). З її хімічної формули: видно, що молекули цієї рідини містять велику алифатическую оболонку, навколишнє атом азоту, що несе позитивний заряд.
Система ХОФ-5 виявилася досить ефективною для фракціонування нуклеїнових кислот. Нуклеїнові основи являють собою сукупність замкнутих циклів з сполученими зв'язками і тому володіють високим ступенем ароматичної гідрофобності, що і забезпечує їх схильність до розчинення в гідрофобною плівці.
Мабуть, такого розчинення сприяє і тяжіння негативно заряджених фосфатів нуклеїнової кислоти до позитивно заряджених атомів азоту в адогене 464.
Елюція колонок ХОФ-5 ведуть відносно пологим зростаючим градієнтом концентрації NaCl. Присутність солі блокує названу електростатичну зв'язок азот-фосфор, полегшуючи вихід ДНК з гідрофобного плівки в навколишнє її водно-сольову середу.
Як приклад на ріс.59 показаний результату хроматографічної очистки плазміди pBR322 від оточуючих її в лізатів бактерій РНК і високомолекулярної ДНК (за даними фірми BRL, 1981). Пунктирна лінія на малюнку позначає градієнт концентрації NaCl.
Особливо часто обратнофазовую розподільну хроматографію використовують для розділення низькомолекулярних об'єктів (амінокислот, пептидів, нуклеотидів та ін) при високому тиску (ЖХВД). Конкурентну елюція у більшості випадків ведуть градієнтом відносно слабко гідрофобних органічних розчинників: метанолу, етанолу, пропанолу, ацетонітрилу або тетрагідроф урану (ТГФ).
Хоча раніше було вирішено, що ми залишаємо осторонь ЖХВД, але тут має сенс про неї згадати, щоб прояснити одну раніше залишилася без роз'яснення ситуацію. Справа в тому, що саме за допомогою такого виду хроматографії здійснюють ідентифікацію амінокислот при секвенування білків за методом Ердмана.
Секвенування ведеться шляхом послідовного відщеплення "складних і вельми гідрофобних похідних амінокислот". Тут я можу привести їх загальне хімічну назву ("фенілтіогідантоіновие похідні" - ФТГ) з однією тільки метою - вказати на початок цього найменування, де фігурує феніл - радикал фенолу. Це і є причина гідрофобності.
На Ріс.60 показаний хроматографічний профіль розділення суміші ФТГ-похідних 20-ти амінокислот методом ЖХВД на колонці, де на основі силікагелю закріплені аліфатичні 18-ти членні радикали октілдеціла. По суті справи це той же самий перший варіант твердої гідрофобною матриці, який
Адсорбційна хроматографія. Загальна характеристика методу
Це - найскладніший, тонкий і, мабуть, самий примхливий метод хроматографії. Але зате, в разі успіху, - фантастично ефективний! З його допомогою в одній хроматографічної операції вдається повністю очистити речовина, представлене в суміші з іншими компонентами незначною часткою - порядку кількох сотих відсотка.Афінних означає споріднений (від латинського af finis) або, точніше, володіє спорідненістю. Афінна зв'язок в нашому випадку мається на увазі біоспеціфіческое взаємодія, що відрізняється винятковою вибірковістю. Така вибірковість лежить в основі множини строго детермінованих процесів, що протікають в організмі.
В якості прикладів можна назвати взаємодії між ферментами і їх субстратами або інгібіторами, між гормонами та їх рецепторами, між антигенами і антитілами до них, між багатьма малими молекулами, наприклад, вітамінами і специфічними транспортними білками, що доставляють їх у клітку.
Нарешті, між нуклеїновими кислотами і специфічними білками, які керують реалізацією їх функцій: редуплікації, транскрипцією і трансляцією.
Будь-який з компонентів названих та їм подібних біоспеціфіческіх пар можна надійно закріпити на хроматографічної матриці в якості так званого "ліганда". З його допомогою другої партнер такої пари може бути витягнутий із суміші з іншими, не комплементарними ліганда речовинами і тимчасово затримано на матриці у складі біоспеціфіческого (аффинного) комплексу.
Після видалення всіх сторонніх домішок промиванням тим же елюентом, в якому здійснювалося утворення цього комплексу, можна зробити заміну елюента на такий, який порушить біоспеціфіческую зв'язок ліганда з його афінним партнером. Це забезпечить швидкий вихід останнього з колонки, на якій залишиться звільнений для нових афінних зв'язків ліганд.
Біоспеціфіческое взаємодія реалізується за рахунок тих же, добре знайомих нам сил зв'язку, які фігурували в розглянутих раніше видах хроматографії: електростатичного притягання різнойменних іонів, водневих зв'язків і сил гідрофобної взаємодії.
Біоспеціфічность визначається конформаційним відповідністю ділянок зв'язування на ліганди і речовині, в результаті якого різні їх взаємодії здійснюються одночасно в декількох точках і їх ефекти сумуються.
Одна з тонкощів постановки дослідів з використанням афінної хроматографії полягає у створенні умов, коли жодна з цих кількох зв'язків не буде надмірно міцною. В іншому випадку речовина не вдасться "зняти" з ліганду.
Вся суть методу полягає в конформаційної відповідно. Жодна з зв'язків не є специфічною. Тому їх розрив при елюції очищеного речовини може бути здійснений за допомогою звичайних прийомів: зміною рН, збільшенням іонної сили (іноді і температури) елюента, введенням до його складу органічних розчинників та детергентів.
У деяких випадках може знадобитися втручання денатуруючих агентів (сечовина, формамід), що порушують саме конформационное відповідність пари ліганд - речовина.
Зі сказаного ясно, що головна перевага афінної хроматографії полягає в її дуже високої вибірковості. Разом з тим, сам спосіб зв'язування речовини з матрицею через ліганд в умовах конформаційного відповідності є, як правило, ідеально м'яким і, на відміну від інших видів хроматографії, не загрожує нативної очищуваного речовини, наприклад, його ферментативної активності.
Дійсно, тут фермент "сідає" у точно відповідає її конфігурації "ямку", між тим, як в іонообмінної або розподільної хроматографії зв'язування з сорбентом хоча б тільки в двох, але випадково розташованих, точках може істотно деформувати молекулу ферменту.
У тих "деяких випадках", коли елюція ферменту не вдається здійснити без його денатурації, можна піти по шляху ослаблення первинного біоспеціфіческого зв'язування. Наприклад, замінити в якості ліганда істинний субстрат ферменту на його аналог.
Важливою перевагою афінної хроматографії є і та обставина, що в ній гідролітичні ферменти (протеази і нуклеази) з самого початку відокремлюються від своїх субстратів.
Зокрема, цією обставиною обумовлений високий вихід при очищенні макромолекулярних препаратів. Крім того, зважаючи на виборчій сорбції малої частки речовини, що знаходиться у вихідній суміші, афінної хроматографії відрізняє можливість використання великих обсягів вихідних препаратів. У ході ступінчастою елюції здійснюється дуже ефективне концентрування потрібного речовини.
Є ще одна особливість афінної хроматографії, яку слід відзначити з самого початку. Спосіб зв'язування ліганда з матрицею не повинен створювати стеричних перешкод для здійснення його аффинного взаємодії з сорбуємість речовиною.
Якщо в якості ліганда виступає біополімер (білок або нуклеїнова кислота) та його ділянку біоспеціфіческого взаємодії виявляється досить віддаленим від точки закріплення на матриці, проблема не виникає.
Однак якщо в якості ліганда використовується низькомолекулярний субстрат, кофермент чи гормон, то близькість його розташування до матриці може створювати стеричні перешкоди для правильної орієнтації білка, що взаємодіє з таким лігандом.
У результаті ступінь аффинного спорідненості речовини до обмінника може зменшитись і навіть впасти до нуля. У таких випадках необхідно біологічно активний ліганд видалити від матриці, вводячи між ними тонку "ніжку", наприклад, лінійну ланцюжок метиленових залишків (... - СН2-СН2-СН2..) Або іншу відповідну структуру, так званого "спейсера" "
Хоча принцип афінної хроматографії дуже простий, з наведених коротких зауважень легко зрозуміти, що "конструювання" аффинного обмінника для очищення потрібного речовини є справою делікатним. Необхідно розумно вибрати матрицю, знайти спосіб стабільного та, разом з тим, надійного (як правило хімічного) закріплення на ній ліганду.
Якщо необхідно, то закріплення через спейсер, який теж треба вибрати найкращим чином як щодо його розміру і ступеня гідрофільності, так і щодо способів його зв'язування з матрицею і лігандом.
Зрозуміло, для багатьох приватних, а також і загальних випадків ця задача вирішена зусиллями фірм, що випускають аффінниє сорбенти. Номенклатура їх безперервно розширюється і приводити її тут не має сенсу.
Тим більше, що кожен дослідник, що розуміє виняткові можливості афінної хроматографії, повинен бути готовий до того, щоб сконструювати афінних обмінник для вирішення своєї особливого завдання.
Література
1. Душкін М.П., Іванова М.В. Трансформація перітоніческіх макрофагів у пінисті клітини при внутрішньочеревних введенні мишам ліпопротеїдів низької щільності, холестерину і його продуктів окислення. / / Патофізіологія і експеримент. терапія. - 1993. - N 2. - С.9-11.2. Дятловський Е.В., Безуглов В.В. Ліпіди як біоеффектори. Біохімія. 1998. Т.67. вип.1. - С. - 3-6.
3. Єршова Л.П., Курбанова Г.М., Горбунова Н.А. Про механізми посттравматичної анемії. / / Пат. фізіологія. 1992. - N 2. - С. - 54-55.