Реферат на тему:
Рухома фаза для рідинної хроматографії
ЗМІСТ
1. Рухома фаза для ВЕРХ
1.1 Основні вимоги до розчинників
1.2 Елюірующая сила розчинника і елюотропние ряди
1.1 Елюотропние серії для адсорбційної хроматографії на силікагелі
1.3 Суміші розчинників
1.5 Очищення розчинників для ВЕРХ
1.4 Селективність розчинника
Література
1. Рухлива фаза ДЛЯ ВЕРХ
Роль рухомої фази (розчинника) у рідинній хроматографії дуже різноманітна. Поряд з чисто транспортної функцією розчинник активно бере участь у самому процесі розділення і має суттєвий вплив на можливості детектування. Часто незначна зміна складу рухомої фази дає можливість оптимізувати процес, поліпшити форму піків, дозвіл окремих компонентів і навіть змінити механізм поділу. Тому при виборі розчинників необхідно враховувати весь комплекс їх властивостей, в тій чи іншій мірі впливають на проведення хроматографічного експерименту. Властивості розчинників для ВЕРХ наведені у додатку 2. Дані за фізико-хімічними характеристиками розчинників в основному взяті з найбільш авторитетних джерел.
1.1 ОСНОВНІ ВИМОГИ до розчинників
Розчинники, які застосовуються в ВЕРХ, повинні відповідати таким основним вимогам: чистота, хімічна інертність, сумісність з детектором, достатня растворяющая здатність по відношенню до аналізованих речовин, низька в'язкість, безпека, доступність. У деяких випадках суттєве значення мають змішуваність з іншими розчинниками, температура кипіння і можливість легкого вилучення речовини з елюата. Чистота розчинника в рідинної хроматографії має дуже велике значення, тому що різні домішки в рухомій фазі впливають на всі основні стадії процесу: подачу розчинника, розділення в колонці, детектування та відтворюваність результатів. Необхідна ступінь чистоти розчинника визначається обраним варіантом поділу і використовуваної апаратурою. Наявність домішок в розчиннику може викликати такі типові труднощі.
1. Погіршення ефективності розподілу і відтворюваності результатів (приклад - неконтрольована вологість розчинника в адсорбційної хроматографії).
2. Сильне відхилення нульової лінії та освіта помилкових піків при градієнтному елюювання.
3. Погіршення можливостей детектування (приклади - домішки олефінів в парафінових вуглеводнях при УФ-детектуванні, домішка етанолу в хлороформі при ІК-детектуванні).
4. Псування сорбенту: домішки підстав призводять до розчинення силікагелю; домішки дієнів та інших лабільних сполук осмоляются і блокують поверхню адсорбентів, особливо оксиду алюмінію; домішки карбонільних сполук реагують з прищепленими сорбентами, що містять аміногрупу; пероксиди окислюють щеплені фази й полістирольні гелі.
5. Забруднення речовин, що виділяються з елюата. У препаративної хроматографії доводиться виділяти речовини з дуже розбавлених розчинів. При цьому навіть незначні домішки або добавки, які не заважають аналітичного поділу, можуть концентруватися в витягуваний речовині, істотно знижуючи його чистоту.
6. Розкладання або хімічна зміна компонентів проби (типові приклади - гідроліз багатьох металоорганічних сполук, окислювання лабільних речовин пероксидами або розчиненим киснем).
7. Корозія апаратури (приклад - домішка НСl в хлорвмісних розчинниках).
Хімічна інертність. Все, що сказано вище про хімічно активних домішках, має набагато більше значення стосовно хімічної активності самих розчинників. Додатково можна відзначити, що такі класи сполук, як кетони, аліфатичні та ароматичні аміни, слід застосовувати з особливою обережністю і тільки в тих випадках, коли їх важко замінити більш стабільними розчинниками. Такі елюент, як хлорорганічні сполуки, тетрагідрофуран і інші прості ефіри, слід використовувати тільки свежеочіщеннимі. Працює з детектором. Найбільш поширеними детекторами в даний час є УФ-детектори та диференціальні рефрактометри. Можливість використання тих чи інших розчинників у поєднанні з УФ-детектором прийнято визначати мінімальною довжиною хвилі, на якій при оптичному шляху 10 мм падіння інтенсивності світлового потоку складає 90%. Граничні довжини хвиль, пов'язані з розчинників дуже високого ступеня очищення, наведені в додатку 2. Розгляд цих даних показує, що з УФ-детектором практично не можуть бути використані такі розчинники, як бензол, толуол, тетрахлорид вуглецю, диметилформамід і хлороформ, а також складні ефіри та кетони. З рефрактометрическим детектором в принципі можна застосовувати будь-які розчинники, але його чутливість визначається різницею показників заломлення розчинника і аналізованої речовини. Тому при виборі розчиннику слід враховувати його показник заломлення. В'язкість розчинника повинна бути по можливості низькою, тому що її підвищення веде до погіршення массопередачи, а тим самим і ефективності поділу, а також ускладнює роботу насосів. За інших рівних умов варто вибирати розчинники, що мають в'язкість 0,5-0,7 мПа • с при температурі поділу. Безпека роботи з тими чи іншими розчинниками визначається їх займистістю і токсичністю. Практично всі розчинники, застосовувані в ВЕРХ, або мають дуже низьку температуру спалаху, або в певній мірі токсичні. Тому приміщення, в якому проводять роботи з рідинної хроматографії, повинно мати ефективну припливно-витяжну вентиляцію. На робочому місці неприпустимі погано продуваються і застійні зони, тому що в них можуть накопичуватися пари розчинників, що мають велику щільність ніж повітря. Нижня межа вибуховості багатьох розчинників становить 1-2%, тому в застійних зонах можливе утворення вибухонебезпечної суміші. У всіх випадках слід вибирати найменш пожежонебезпечні та токсичні розчинники, керуючись відповідними даними, наведеними у додатку. Так, діетиловий ефір можна замінити діізопропіловий, а бензол - толуолом практично без шкоди для поділу. З нашої точки зору, токсичність є більш важливим фактором, ніж пожежна небезпека. При гарній організації робочого місця і ретельному дотриманні правил техніки безпеки небезпека загоряння практично виключена, а контакту з розчинником повністю уникнути неможливо. Багато ароматичні і хлорсодержащие розчинники мають здатність накопичуватися в організмі людини. За останніми даними, деякі з них, що вважалися раніше малотоксичними (хлороформ, тетрахлоретилен) є канцерогенами, тому робота з цими розчинниками вимагає обережності. Слід зазначити, що ГДК необхідно розглядати з урахуванням температури кипіння розчинника: хоча метиленхлорид і хлорбензол мають однакову ГДК (50 мг / м 3), але за інших рівних умов у випадку низкокипящей метиленхлориді ця величина досягається значно легше, ніж для хлорбензолу. Температура кипіння - менш істотний фактор, ніж характеристики, розглянуті вище. Її слід враховувати в основному у двох аспектах: в надійності роботи насосів та детекторів і легкості виділення речовини з елюата. Низкокипящие розчинники часто утворюють пухирці в насосах і детекторах. При використанні найбільш поширених в даний час плунжерних насосів ймовірність утворення бульбашок тим більше, чим вище тиск парів розчинника та швидкість плунжера у фазі всмоктування. Наявність бульбашок в насосі різко знижує точність подачі розчинника, а бульбашки в детекторі викликають сильний шум і нестабільність нульової лінії. Для запобігання цьому явищу найпростіше застосовувати розчинники, температура кипіння яких принаймні на 20-50. ° Понад кімнатної. З іншого боку, при необхідності препаративного виділення речовини недоцільно використовувати висококиплячі розчинники. Змішуваність з іншими розчинниками необхідно враховувати при роботі в режимі градієнтного елюювання і при підготовці аналізованого зразка з використанням попереднього екстракційного розділення. Слід пам'ятати, що рухома фаза в ВЕРХ завжди повинна бути гомогенної. Однак такі важливі полярні розчинники, як метанол і ацетонітрил, обмежено змішуються з гексаном. Для розширення діапазону концентрацій, відповідних гомогенним сумішей, гексан замінюють на циклогексан або ізооктан. Повна змішуваність в подібних системах досягається заміною полярного компонента на етанол або ізопропанол.
1.2 ЕЛЮІРУЮЩАЯ СИЛА Розчинники та ЕЛЮОТРОПНИЕ ЛАВИ
Взаємодія розчинника з розчиненим речовиною визначається комплексом чотирьох основних типів міжмолекулярних взаємодій: дисперсійного, індукційного, донорно-акцепторної (включаючи освіту водневого зв'язку) і діелектричного (сольватація іонів). Сумарний ефект всіх типів взаємодій визначає полярність розчинника, а переважне прояв будь-якого з них - його селективність. У процесі розвитку рідинної розподільної хроматографії пропонувалися різні способи оцінки відносної полярності розчинників. В якості міри полярності, прийнятий параметр Р ', який дозволяє помітно надійніше оцінювати відносну активність розчинників, ніж широко використовуваний раніше параметр розчинності Гільдебранда. Полярність розчинника визначає його елюірующую силу: в адсорбційної і нормально-фазної розподільної хроматографії із збільшенням полярності елюірующая сила розчинника зростає, а в обернено-фазною - знижується. Чим більше елюірующая сила рухомої фази, тим менше коефіцієнт ємності для даної речовини на даному сорбенті. Розташування розчинників відповідно зі зростанням їхньої елюірующей сили називають елюотропним поруч. У адсорбційної хроматографії загальноприйнятим є елюотропний ряд Снайдера. Розчинники, перераховані в додатку 2, розташовані у відповідності з цим поруч. Мірою елюірующей сили розчинника служить величина ε °, експериментально визначена для ряду розчинників на оксиді алюмінію в порівнянні з n-пентаном (ε ° = 0). Величина ε ° пропорційна різниці питомих енергій взаємодій розчинника і пентану з чистою поверхнею адсорбенту. Для силікагелю значення ε ° в середньому в 1,25 рази нижче, ніж для оксиду алюмінію.
Таблиця 1.1 Елюотропние серії для адсорбційної хроматографії на силікагелі
ε ° I II III
0,00 Пентан Пентан Пентан
0,05 Ізопропілхлорід Дихлоретан (3%) - Бензол (4%) - пентан
(4,2%)-пентан Пентан
0,10 Ізопропілхлорід Дихлоретан (7%) - Бензол (11%) - пентан
(10%)-пентан пентан
0,15 Ізопропілхлорід Дихлоретан (14%) - Бензол (26%) - пентан
(21%) - пентан пентан
0,20 Ефір (4%)-пентан Дихлоретан (26%) - етилацетат (4%) -
Пентан пентан
0.25 Ефір (11%) - Дихлоретан (50%) - етилацетат (11%) -
пентан пентан пентан
0,30 Ефір (23%) - Дихлоретан (82%) - етилацетат (23%) -
пентан пентан пентан
0,35 Ефір (56%) - ацетонітрил (3%) - етилацетат (56%) -
пентан бензол пентан
0,40 Метанол (2%) - ацетонітрил (11%) -
ефір бензол
0.45 Метанол (4%) - ацетонітрил (31%) -
ефір бензол
0,50 Метанол (8%) - ацетонітрил
ефір 0,55 Метанол (20%) -
ефір 0,60 Метанол (50%) -
Примітка. Зазначено зміст сильного розчинника (в% об.), В елюент.
---------------
Виведений елюотропний ряд справедливий для всіх сорбентів оксидного типу і, в загальному випадку, практично збігається з рядом, побудованим за зростанням діелектричної проникності розчинників. Для адсорбційної хроматографії розроблені також елюотропние серії (I-III), що представляють собою суміші розчинників з поступово зростаючою елюірующей силою. Приклади таких серій наведено в табл. 1.1. Вплив елюірующей сили розчинника на k 'орієнтовно можна оцінити по наступних співвідношеннях: k' змінюється в 2,2-3 рази при вимірі Р 'на одиницю (розподільна хроматографія) і в 3-4 рази-за зміни ε ° на 0,05 ( адсорбційна хроматографія).
1.3 суміші розчинників
У практичній роботі індивідуальні розчинники (за винятком Ексклюзійна хроматографії) застосовують рідко, тому що використання сумішей розчинників різко розширює можливості рідинної хроматографії. Це відноситься і до регулювання елюірующей сили рухомої фази. B розподільної хроматографії полярність суміші розчинників А (слабкий розчинник) і В (сильний розчинник) можна легко розрахувати за формулою
Pсм '= VaPа' + VbPb ',
де Va і Vb - об'ємна частка; Р'а і Р'b - полярність розчинників А і В відповідно. У адсорбційної хроматографії вже невеликі добавки розчинника В суттєво збільшують елюірующую силу, а при подальшому збільшенні його концентрації елюірующая сила асимптотично наближається до величини ε 0 розчинника В. Слід зазначити, що в адсорбційної хроматографії краще використовувати суміші розчинників з досить близькими значеннями ε °. В іншому випадку часто спостерігаються «вторинні ефекти» розчинника, істотно знижують відтворюваність результатів. Більш детально оптимізація складу змішаного розчинника розглянута в розділах, присвячених окремим варіантам ВЕРХ.
1.4 селективними розчинниками
При аналізі багатокомпонентних сумішей, що містять сполуки різної хімічної природи, часто спостерігається перекривання деяких тиків. Найкращим способом оптимізації розділення в цьому випадку є зміна селективності рухомої фази при тій же самій елюірующей силі. Селективність розчинників визначається співвідношенням вкладів різних типів міжмолекулярних взаємодій у системі розчинник - речовина. На запропонованої Снайдером трикутної діаграмі розчинники розбиті на вісім груп, що розрізняються за типом селективності (рис.1.1). Крайні групи I, II, V я VIII мають найбільш яскраво виражену селективність: до групи I ходять акцептори протонів (прості ефіри, аміни), до групи VIII-донори протонів (хлороформ, вода, м-крезол), до групи II-донори- акцептори (спирти) і в групу V-розчинники, переважно взаємодіють з речовинами, що мають великий дипольний момент (метиленхлорид, дихлоретан), Розчинники групи VII (ароматичні з'єднання, нітроалкани) характеризуються підвищеним взаємодією з акцепторами електронів. Належність розчинника до певної групи також вказана у додатку 2.
Рис. 1.1 Групи селективності розчинників:
Xe - протоноакцепторние властивості; Xd - протонодонорності властивості; Хn - діпольвое взаємодія
Селективність рухомої фази змінюють шляхом заміни розчинника В, використаного для отримання необхідної елюірующей сили, на розчинник, що відноситься до іншої групи, і підбору такої його концентрації, яка забезпечувала б ту ж елюірующую силу рухомої фази. У різних видах рідинної хроматографії рішення цього завдання має свої специфічні особливості, розглянуті у відповідних розділах.
1.5 ОЧИЩЕННЯ Розчинник для ВЕРХ
Добре відомо, що абсолютно чистих речовин у природі не буває. Тому до питання про чистоту розчинника слід підходити розумно. Одні й ті ж домішки в різних умовах можуть або взагалі не впливати на результат, або зробити аналіз неможливим. Так, незначна домішка олефінів у алканових розчиннику абсолютно не заважає при роботі з рефрактометром, але практично не дозволяє проводити детектування УФ-детектором при довжині хвилі менше 260 нм. Навпаки, навіть помітна добавка гептана до гексаном не зробить ніякого впливу на сигнал УФ-детектора, але спотворить кількісні дані рефрактометра. У адсорбційної хроматографії особливе значення має ретельна осушка розчинників, тому що навіть невелика зміна вмісту води в рухомій фазі може помітно змінити k 'і ступінь поділу компонентів. Вимоги до чистоти розчинника при градієнтному елюювання значно вище, ніж при ізократіческом. У процесі градієнтного елюювання домішки, що містяться в розчинниках, концентруються на початку колонки і вимиваються з неї в міру зростання елюірующей сили рухомої фази. При цьому спостерігається сильний дрейф нульової лінії, а деякі домішки елюіруются вузькими зонами і реєструються детектором у вигляді самостійних піків. У ізократічеоком режимі домішки на початку експерименту також можуть концентруватися на сорбенті, але в системі досить швидко встановлюється динамічна рівновага, і нульова лінія вирівнюється на якомусь певному рівні сигналу детектора. Цей сигнал у багатьох випадках можна компенсувати електрично, але при цьому відповідно зменшується лінійний динамічний діапазон детектора. Не менш важливою є очищення розчинників від механічних домішок (пил з атмосфери, частки адсорбентів і т.п.), які забивають фільтри і порушують нормальну роботу насосів. Для видалення цих домішок розчинники необхідно фільтрувати через фільтри з розміром пор приблизно 0,5 мкм. Основними методами очищення розчинників є перегонка і адсорбційна відділення домішок. Часто для досягнення необхідної чистоти досить простий перегонки. Однак і в тих випадках, коли необхідна адсорбційна очистка, доцільно спочатку висушити і перегнати розчинник. При цьому на тій же кількості адсорбенту можна отримати значно більше очищеного продукту. Спільною проблемою для всіх розчинників є видалення вологи. Багато розчинники утворюють з водою азеотропниє суміші, що дозволяє відокремити основна кількість води відгоном суміші. Для повного видалення вологи використовують молекулярні сита - цеоліти типу NaA (4А) або КА (3А), які попередньо активують прокаливанием в муфельній печі при 420-450 ° С. Адсорбційну очищення проводять методом класичної колонкової хроматографії. В якості адсорбентів використовують оксид алюмінію і силікагель з великою питомою поверхнею (наприклад, КСМ-5) і розміром зерна 0,1-0,5 мм. Сорбенти попередньо сушать протягом декількох годин при 250-300 ° С і 160-180 ° С. Зазвичай застосовують скляні колонки досить великої місткості з відношенням висоти до діаметра в межах 20-30 і краном, що працюють без мастила. Найкращі результати досягаються на колонках з двома шарами сорбенту: нижню половину колонки набивають оксидом алюмінію, а верхню-силікагелем. На колонці, яка містить по 100 г цих адсорбентів, в залежності від їх активності та вмісту домішок можна очистити 300-600 мл неполярних розчинників і в півтора - два рази менше полярних розчинників типу хлороформу або тетрагідрофуран. Якість очищення зазвичай контролюють за пропускання в УФ-області. Як правило, перша порція (20-50 мл) розчинника має недостатню чистоту, і її повертають у верхню частину колонки. Більш полярні розчинники, розташовані в елюотропном ряду Снайдера нижче етилацетату, даним методом очищати не можна. Очищені розчинники зберігають в ретельно закритих товстостінних бутлях з темного скла, в які додають 10-20 г активного цеоліту. З сулій з розчинниками, схильними до окислення, доцільно перед закриванням видалити повітря продувкою сухим аргоном або азотом. Ретельне очищення розчинників - досить складний і трудомісткий процес, і її слід проводити тільки в тій мірі, в якій це дійсно необхідно. Аліфатичні вуглеводні очищають від неграничних сполук обробкою сумішшю концентрованих сірчаної та азотної кислот з наступною відмиванням дистильованою водою до нейтральної реакції і осушенням. Висушені розчинники переганяють. Описано також метод видалення олефінів колоночной хроматографією на силікагелі, просякнутому нітратом срібла. Сорбент готують наступним чином: на висушений силікагель з розміром зерен 100-300 мкм наносять нітрат срібла з 10%-ного водного розчину (аналогічно нанесення нерухомої рідкої фази в газовій хроматографії) і сушать при 125 ° С. З цієї групи розчинників найбільш вживаним є гексан.
Хлорсодержащие вуглеводні часто містять микропримеси соляної кислоти, що утворюється при їх зберіганні, під дією якої сильно піддаються корозії металеві деталі і руйнуються адсорбенти. Кислоту видаляють адсорбційної очищенням на лужному оксиді алюмінію. Серед хлорвмісних розчинників особливої лабільністю відрізняється хлороформ, який легко розкладається під дією світла з утворенням фосгену. Для уповільнення цієї реакції хлороформ стабілізують добавкою 0,5-1% етилового спирту. Таким чином, в хлороформі зазвичай одночасно присутні домішки НСl, етилового спирту і фосгену. Для їх видалення продажний хлороформ промивають водою і переганяють, відокремлюючи основну кількість води у вигляді азеотропної суміші. Перегнанной хлороформ наливають у бутель з темного скла і додають 5-10% (об.) активного цеоліту Саа (5А). Безпосередньо перед вживанням розчинник ще раз переганяють. Загальним правилом при роботі з хлорсодержащими вуглеводнями є використання тільки свіжоприготовленою розчинників. Їх суміші з іншими розчинниками також готують у розрахунку на добову потребу. Прості ефіри, особливо циклічного будови, легко окислюються повітрям з утворенням пероксидів. Присутність останніх вкрай небажано, тому що вони руйнують сорбенти з прищепленої фазою і полімерні сорбенти, а також окислюють лабільні компоненти аналізованих сумішей і поглинають в УФ-області. Найбільш часто з розчинників цього класу застосовують тетрагідрофуран, зазвичай стабілізований гидрохиноном. Перед перегонкою перевіряють наявність пероксидів у тетрагідрофурані. До 1 мл розчинника додають 1 мл. 10%-ного розчину KI або Nal у крижаній оцтової кислоти. При низькій концентрації пероксиду розчин забарвлюється в жовтий колір, а при високій - в коричневий. При помітному змісті пероксидів щоб уникнути вибуху при перегонці їх видаляють кип'ятінням з 0,5% Cu2Cl2 протягом 30 хв. Тетрагідрофуран після видалення пероксиду зберігають над твердим КОН (10-15% об.) В щільно закритій сулії з темного скла в атмосфері інертного газу і переганяють безпосередньо перед. застосуванням. Чистота отриманого розчинника цілком достатня для проведення Ексклюзійна хроматографії на напівжорстких полістирольних гелях при детектуванні рефрактометром. В інших варіантах, особливо при роботі з УФ-детектором, може знадобитися додаткова адсорбційна очистка. Зокрема, обробка тетрагідрофуран і диизопропилового ефіру цеолітами NaX та зберiгають дозволяє видалити до 90-99% пероксидів. Відносно недавно для заміни діетилового і диизопропилового ефірів запропоновано новий розчинник - метил-трет-бутиловий ефір, який практично не утворює пероксидів. Цей розчинник, мабуть, знайде широке застосування в препаративної рідинної хроматографії, так як усувається небезпека забруднення виділяються речовин продуктами окислення розчинника. Слід ще раз підкреслити, що при перегонці розчинників, схильних до утворення пероксидів, необхідно ретельно дотримуватися техніки безпеки. Перегонку слід вести на водяній або силіконовій лазні, не допускаючи перегріву розчинника. У колбу обов'язково повинні бути внесені свіжі ініціатори кипіння (краще всього шматочки скляних фільтрів або пористого фторопласту); перегонку необхідно припиняти, залишаючи в кубі не менше 1 / 5 об'єму завантаження. Кубовий залишок можна додати до свіжої порції розчинника, підготовленої для хімічного видалення пероксидів. Ацетонітрил очищають від домішок, що поглинають в УФ-області, кип'ятінням з перманганатом і перегонкою. У колбу місткістю 2 л поміщають 1,5 л ацетонітрилу і 30 г КМnO4, кип'ятять із зворотним холодильником 1 год і переганяють з дефлегматором, відбираючи фракції по 200 мл. Коли в кубі залишиться близько 200 мл продукту, перегонку припиняють. Решту можна змішувати з новою порцією розчинника. Першу фракцію відкидають, а інші перевіряють на поглинання в УФ-області. Для цього заповнюють робочу кювету УФ-детектора по черзі водою вищого очищення і випробуваним розчинником (порівняльна кювету заповнена повітрям). Чим менше при цьому різниця показань самописця, тим вище якість розчинника. Зазвичай при виконанні цієї отримують близько 1 л ацетонітрилу, придатного для роботи в градієнтному режимі при 254 нм. Значно складніша многостадийная процедура, яка забезпечує отримання розчинника з обмеженою довжиною хвилі <200 нм, описана в роботі. Ізопропанол найчастіше використовують як модифікатор в адсорбційної хроматографії. Тому найбільш небезпечною домішкою в ньому є вода. Ізопропанол утворює з водою азеотропну суміш, що кипить при 80,3 ° С і містить, за різними даними, 9-12% води. При невеликій концентрації води у вихідному продукті її найлегше видалити шляхом відгонки суміші. Якщо ж вміст води вище 5-6%, то розчинник спочатку сушать над безводним сульфатом натрію. Для видалення слідів води ізопропанол витримують над цеолітом NaA.
Метанол. Найбільш важко відокремлюваної домішкою в метанолі є ацетон, який краще всього видаляти обробкою гіпоіодітом натрію NaOI. Розчин 25 г йоду в 1 л метанолу повільно вливають при перемішуванні в 500 мл 1 М розчину NaOH і додають 150 мл води. Через 6-10 год фільтрують утворився йодоформ і кип'ятять фільтрат зі зворотним холодильником до зникнення запаху йодоформу. Більшість домішок, в тому числі і основну масу води, видаляють перегонкою. Для отримання дуже сухого продукту його витримують над цеолітами NaA або КА. Вода являє собою найважливіший розчинник в обернено-фазною та іонообмінної хроматографії. Основними домішками у воді, які заважають проведенню хроматографічного процесу, є різні солі і микропримеси вуглеводнів та інших органічних сполук. Присутність солей неприпустимо в іонообмінної хроматографії, а домішки органічних сполук викликають істотні труднощі в обернено-фазною хроматографії (особливо в градієнтному елюювання) при використанні флуоресцентного і УФ-детекторів. У літературі описано багато різних методів очищення води. Для видалення мінеральних солей, мабуть, найкращим є деионизация на іонообмінника з наступною перегонкою в кварцовою посуді. Задовільна очищення від органічних забруднень досягається фільтрацією деіонізованої води через активоване вугілля. Для вищої ступеня очищення воду пропускають через колонку з обернено-фазним сорбентом, яку потім регенерують промиванням метанолом, ацетонітрилом або тетрагідрофураном. Дуже ефективним є також жорстка УФ-опромінення. У обернено-фазною хроматографії воду зазвичай використовують у вигляді сумішей з полярними органічними розчинниками. Тому практично важливо знати про особливому властивості таких сумішей - аномально високої в'язкості.
Таблиця 1.2 Максимальна в'язкість органічних розчинників з водою
Органічний η 20, (м 2 / с) 10 5 Зміст органі-η 20, (м 2 / с) 5 жовтня
компонент тичного компонента в
суміші з водою,% (об).
Ацетон 0,32 10 1,2
Ацетонітрил 0,38 10 1.1
Етанол 1,20 40 2,8
Метанол 0,60 40 1.8
Таблиця 1.3. В'язкість водно-органічних сумішей
У табл.1.2 наведено склади водно-органічних сумішей,. яким відповідає максимальна в'язкість при 20 ° С, а в табл. 6.3 - значення в'язкості сумішей води з метанолом і ацетонітрилом в широкому діапазоні концентрації при 25 ° С. Дані таблиць показують, що в'язкість водно-органічних сумішей при певних концентраціях істотно вишe, ніж у індивідуальних компонентів. Це явище призводить до зростання опору колонки і відповідного підвищення тиску на її вході, а також погіршує поділ за рахунок зниження коефіцієнта дифузії.
Література
1. Kucera PJ Chromatogr, 1980, v. 198, p. 93-109.
2. Bowermaster J., McNair Я.J. Chromatogr, 1983, v. 279, p. 431-438.
3. Scott RPFAdv. Chromatogr., 1983, v. 22, p. 247-294.
4. Van der Berg JHM, Horsels HWM, Groenen RJAf. / Chromatogra-phia, 1984, v. 18, No. 10, p. 574-578.
5. Freebairn KW, Knox J.Я. / Chromafographia, 1984, v. 19, No. 1, p. 37-47.
6. Schoenmakers P., Billiet HAH, DeGalan LJ Chromatogr, 1981, v. 205, p. 13-30.
7. Jandera P., Churacek JJ Chromatogr, 1980, v. 192, No. 1, p. 19-36.
Рухома фаза для рідинної хроматографії
ЗМІСТ
1. Рухома фаза для ВЕРХ
1.1 Основні вимоги до розчинників
1.2 Елюірующая сила розчинника і елюотропние ряди
1.1 Елюотропние серії для адсорбційної хроматографії на силікагелі
1.3 Суміші розчинників
1.5 Очищення розчинників для ВЕРХ
1.4 Селективність розчинника
Література
1. Рухлива фаза ДЛЯ ВЕРХ
Роль рухомої фази (розчинника) у рідинній хроматографії дуже різноманітна. Поряд з чисто транспортної функцією розчинник активно бере участь у самому процесі розділення і має суттєвий вплив на можливості детектування. Часто незначна зміна складу рухомої фази дає можливість оптимізувати процес, поліпшити форму піків, дозвіл окремих компонентів і навіть змінити механізм поділу. Тому при виборі розчинників необхідно враховувати весь комплекс їх властивостей, в тій чи іншій мірі впливають на проведення хроматографічного експерименту. Властивості розчинників для ВЕРХ наведені у додатку 2. Дані за фізико-хімічними характеристиками розчинників в основному взяті з найбільш авторитетних джерел.
1.1 ОСНОВНІ ВИМОГИ до розчинників
Розчинники, які застосовуються в ВЕРХ, повинні відповідати таким основним вимогам: чистота, хімічна інертність, сумісність з детектором, достатня растворяющая здатність по відношенню до аналізованих речовин, низька в'язкість, безпека, доступність. У деяких випадках суттєве значення мають змішуваність з іншими розчинниками, температура кипіння і можливість легкого вилучення речовини з елюата. Чистота розчинника в рідинної хроматографії має дуже велике значення, тому що різні домішки в рухомій фазі впливають на всі основні стадії процесу: подачу розчинника, розділення в колонці, детектування та відтворюваність результатів. Необхідна ступінь чистоти розчинника визначається обраним варіантом поділу і використовуваної апаратурою. Наявність домішок в розчиннику може викликати такі типові труднощі.
1. Погіршення ефективності розподілу і відтворюваності результатів (приклад - неконтрольована вологість розчинника в адсорбційної хроматографії).
2. Сильне відхилення нульової лінії та освіта помилкових піків при градієнтному елюювання.
3. Погіршення можливостей детектування (приклади - домішки олефінів в парафінових вуглеводнях при УФ-детектуванні, домішка етанолу в хлороформі при ІК-детектуванні).
4. Псування сорбенту: домішки підстав призводять до розчинення силікагелю; домішки дієнів та інших лабільних сполук осмоляются і блокують поверхню адсорбентів, особливо оксиду алюмінію; домішки карбонільних сполук реагують з прищепленими сорбентами, що містять аміногрупу; пероксиди окислюють щеплені фази й полістирольні гелі.
5. Забруднення речовин, що виділяються з елюата. У препаративної хроматографії доводиться виділяти речовини з дуже розбавлених розчинів. При цьому навіть незначні домішки або добавки, які не заважають аналітичного поділу, можуть концентруватися в витягуваний речовині, істотно знижуючи його чистоту.
6. Розкладання або хімічна зміна компонентів проби (типові приклади - гідроліз багатьох металоорганічних сполук, окислювання лабільних речовин пероксидами або розчиненим киснем).
7. Корозія апаратури (приклад - домішка НСl в хлорвмісних розчинниках).
Хімічна інертність. Все, що сказано вище про хімічно активних домішках, має набагато більше значення стосовно хімічної активності самих розчинників. Додатково можна відзначити, що такі класи сполук, як кетони, аліфатичні та ароматичні аміни, слід застосовувати з особливою обережністю і тільки в тих випадках, коли їх важко замінити більш стабільними розчинниками. Такі елюент, як хлорорганічні сполуки, тетрагідрофуран і інші прості ефіри, слід використовувати тільки свежеочіщеннимі. Працює з детектором. Найбільш поширеними детекторами в даний час є УФ-детектори та диференціальні рефрактометри. Можливість використання тих чи інших розчинників у поєднанні з УФ-детектором прийнято визначати мінімальною довжиною хвилі, на якій при оптичному шляху 10 мм падіння інтенсивності світлового потоку складає 90%. Граничні довжини хвиль, пов'язані з розчинників дуже високого ступеня очищення, наведені в додатку 2. Розгляд цих даних показує, що з УФ-детектором практично не можуть бути використані такі розчинники, як бензол, толуол, тетрахлорид вуглецю, диметилформамід і хлороформ, а також складні ефіри та кетони. З рефрактометрическим детектором в принципі можна застосовувати будь-які розчинники, але його чутливість визначається різницею показників заломлення розчинника і аналізованої речовини. Тому при виборі розчиннику слід враховувати його показник заломлення. В'язкість розчинника повинна бути по можливості низькою, тому що її підвищення веде до погіршення массопередачи, а тим самим і ефективності поділу, а також ускладнює роботу насосів. За інших рівних умов варто вибирати розчинники, що мають в'язкість 0,5-0,7 мПа • с при температурі поділу. Безпека роботи з тими чи іншими розчинниками визначається їх займистістю і токсичністю. Практично всі розчинники, застосовувані в ВЕРХ, або мають дуже низьку температуру спалаху, або в певній мірі токсичні. Тому приміщення, в якому проводять роботи з рідинної хроматографії, повинно мати ефективну припливно-витяжну вентиляцію. На робочому місці неприпустимі погано продуваються і застійні зони, тому що в них можуть накопичуватися пари розчинників, що мають велику щільність ніж повітря. Нижня межа вибуховості багатьох розчинників становить 1-2%, тому в застійних зонах можливе утворення вибухонебезпечної суміші. У всіх випадках слід вибирати найменш пожежонебезпечні та токсичні розчинники, керуючись відповідними даними, наведеними у додатку. Так, діетиловий ефір можна замінити діізопропіловий, а бензол - толуолом практично без шкоди для поділу. З нашої точки зору, токсичність є більш важливим фактором, ніж пожежна небезпека. При гарній організації робочого місця і ретельному дотриманні правил техніки безпеки небезпека загоряння практично виключена, а контакту з розчинником повністю уникнути неможливо. Багато ароматичні і хлорсодержащие розчинники мають здатність накопичуватися в організмі людини. За останніми даними, деякі з них, що вважалися раніше малотоксичними (хлороформ, тетрахлоретилен) є канцерогенами, тому робота з цими розчинниками вимагає обережності. Слід зазначити, що ГДК необхідно розглядати з урахуванням температури кипіння розчинника: хоча метиленхлорид і хлорбензол мають однакову ГДК (50 мг / м 3), але за інших рівних умов у випадку низкокипящей метиленхлориді ця величина досягається значно легше, ніж для хлорбензолу. Температура кипіння - менш істотний фактор, ніж характеристики, розглянуті вище. Її слід враховувати в основному у двох аспектах: в надійності роботи насосів та детекторів і легкості виділення речовини з елюата. Низкокипящие розчинники часто утворюють пухирці в насосах і детекторах. При використанні найбільш поширених в даний час плунжерних насосів ймовірність утворення бульбашок тим більше, чим вище тиск парів розчинника та швидкість плунжера у фазі всмоктування. Наявність бульбашок в насосі різко знижує точність подачі розчинника, а бульбашки в детекторі викликають сильний шум і нестабільність нульової лінії. Для запобігання цьому явищу найпростіше застосовувати розчинники, температура кипіння яких принаймні на 20-50. ° Понад кімнатної. З іншого боку, при необхідності препаративного виділення речовини недоцільно використовувати висококиплячі розчинники. Змішуваність з іншими розчинниками необхідно враховувати при роботі в режимі градієнтного елюювання і при підготовці аналізованого зразка з використанням попереднього екстракційного розділення. Слід пам'ятати, що рухома фаза в ВЕРХ завжди повинна бути гомогенної. Однак такі важливі полярні розчинники, як метанол і ацетонітрил, обмежено змішуються з гексаном. Для розширення діапазону концентрацій, відповідних гомогенним сумішей, гексан замінюють на циклогексан або ізооктан. Повна змішуваність в подібних системах досягається заміною полярного компонента на етанол або ізопропанол.
1.2 ЕЛЮІРУЮЩАЯ СИЛА Розчинники та ЕЛЮОТРОПНИЕ ЛАВИ
Взаємодія розчинника з розчиненим речовиною визначається комплексом чотирьох основних типів міжмолекулярних взаємодій: дисперсійного, індукційного, донорно-акцепторної (включаючи освіту водневого зв'язку) і діелектричного (сольватація іонів). Сумарний ефект всіх типів взаємодій визначає полярність розчинника, а переважне прояв будь-якого з них - його селективність. У процесі розвитку рідинної розподільної хроматографії пропонувалися різні способи оцінки відносної полярності розчинників. В якості міри полярності, прийнятий параметр Р ', який дозволяє помітно надійніше оцінювати відносну активність розчинників, ніж широко використовуваний раніше параметр розчинності Гільдебранда. Полярність розчинника визначає його елюірующую силу: в адсорбційної і нормально-фазної розподільної хроматографії із збільшенням полярності елюірующая сила розчинника зростає, а в обернено-фазною - знижується. Чим більше елюірующая сила рухомої фази, тим менше коефіцієнт ємності для даної речовини на даному сорбенті. Розташування розчинників відповідно зі зростанням їхньої елюірующей сили називають елюотропним поруч. У адсорбційної хроматографії загальноприйнятим є елюотропний ряд Снайдера. Розчинники, перераховані в додатку 2, розташовані у відповідності з цим поруч. Мірою елюірующей сили розчинника служить величина ε °, експериментально визначена для ряду розчинників на оксиді алюмінію в порівнянні з n-пентаном (ε ° = 0). Величина ε ° пропорційна різниці питомих енергій взаємодій розчинника і пентану з чистою поверхнею адсорбенту. Для силікагелю значення ε ° в середньому в 1,25 рази нижче, ніж для оксиду алюмінію.
Таблиця 1.1 Елюотропние серії для адсорбційної хроматографії на силікагелі
ε ° I II III
0,00 Пентан Пентан Пентан
0,05 Ізопропілхлорід Дихлоретан (3%) - Бензол (4%) - пентан
(4,2%)-пентан Пентан
0,10 Ізопропілхлорід Дихлоретан (7%) - Бензол (11%) - пентан
(10%)-пентан пентан
0,15 Ізопропілхлорід Дихлоретан (14%) - Бензол (26%) - пентан
(21%) - пентан пентан
0,20 Ефір (4%)-пентан Дихлоретан (26%) - етилацетат (4%) -
Пентан пентан
0.25 Ефір (11%) - Дихлоретан (50%) - етилацетат (11%) -
пентан пентан пентан
0,30 Ефір (23%) - Дихлоретан (82%) - етилацетат (23%) -
пентан пентан пентан
0,35 Ефір (56%) - ацетонітрил (3%) - етилацетат (56%) -
пентан бензол пентан
0,40 Метанол (2%) - ацетонітрил (11%) -
ефір бензол
0.45 Метанол (4%) - ацетонітрил (31%) -
ефір бензол
0,50 Метанол (8%) - ацетонітрил
ефір 0,55 Метанол (20%) -
ефір 0,60 Метанол (50%) -
Примітка. Зазначено зміст сильного розчинника (в% об.), В елюент.
---------------
Виведений елюотропний ряд справедливий для всіх сорбентів оксидного типу і, в загальному випадку, практично збігається з рядом, побудованим за зростанням діелектричної проникності розчинників. Для адсорбційної хроматографії розроблені також елюотропние серії (I-III), що представляють собою суміші розчинників з поступово зростаючою елюірующей силою. Приклади таких серій наведено в табл. 1.1. Вплив елюірующей сили розчинника на k 'орієнтовно можна оцінити по наступних співвідношеннях: k' змінюється в 2,2-3 рази при вимірі Р 'на одиницю (розподільна хроматографія) і в 3-4 рази-за зміни ε ° на 0,05 ( адсорбційна хроматографія).
1.3 суміші розчинників
У практичній роботі індивідуальні розчинники (за винятком Ексклюзійна хроматографії) застосовують рідко, тому що використання сумішей розчинників різко розширює можливості рідинної хроматографії. Це відноситься і до регулювання елюірующей сили рухомої фази. B розподільної хроматографії полярність суміші розчинників А (слабкий розчинник) і В (сильний розчинник) можна легко розрахувати за формулою
Pсм '= VaPа' + VbPb ',
де Va і Vb - об'ємна частка; Р'а і Р'b - полярність розчинників А і В відповідно. У адсорбційної хроматографії вже невеликі добавки розчинника В суттєво збільшують елюірующую силу, а при подальшому збільшенні його концентрації елюірующая сила асимптотично наближається до величини ε 0 розчинника В. Слід зазначити, що в адсорбційної хроматографії краще використовувати суміші розчинників з досить близькими значеннями ε °. В іншому випадку часто спостерігаються «вторинні ефекти» розчинника, істотно знижують відтворюваність результатів. Більш детально оптимізація складу змішаного розчинника розглянута в розділах, присвячених окремим варіантам ВЕРХ.
1.4 селективними розчинниками
При аналізі багатокомпонентних сумішей, що містять сполуки різної хімічної природи, часто спостерігається перекривання деяких тиків. Найкращим способом оптимізації розділення в цьому випадку є зміна селективності рухомої фази при тій же самій елюірующей силі. Селективність розчинників визначається співвідношенням вкладів різних типів міжмолекулярних взаємодій у системі розчинник - речовина. На запропонованої Снайдером трикутної діаграмі розчинники розбиті на вісім груп, що розрізняються за типом селективності (рис.1.1). Крайні групи I, II, V я VIII мають найбільш яскраво виражену селективність: до групи I ходять акцептори протонів (прості ефіри, аміни), до групи VIII-донори протонів (хлороформ, вода, м-крезол), до групи II-донори- акцептори (спирти) і в групу V-розчинники, переважно взаємодіють з речовинами, що мають великий дипольний момент (метиленхлорид, дихлоретан), Розчинники групи VII (ароматичні з'єднання, нітроалкани) характеризуються підвищеним взаємодією з акцепторами електронів. Належність розчинника до певної групи також вказана у додатку 2.
Рис. 1.1 Групи селективності розчинників:
Xe - протоноакцепторние властивості; Xd - протонодонорності властивості; Хn - діпольвое взаємодія
Селективність рухомої фази змінюють шляхом заміни розчинника В, використаного для отримання необхідної елюірующей сили, на розчинник, що відноситься до іншої групи, і підбору такої його концентрації, яка забезпечувала б ту ж елюірующую силу рухомої фази. У різних видах рідинної хроматографії рішення цього завдання має свої специфічні особливості, розглянуті у відповідних розділах.
1.5 ОЧИЩЕННЯ Розчинник для ВЕРХ
Добре відомо, що абсолютно чистих речовин у природі не буває. Тому до питання про чистоту розчинника слід підходити розумно. Одні й ті ж домішки в різних умовах можуть або взагалі не впливати на результат, або зробити аналіз неможливим. Так, незначна домішка олефінів у алканових розчиннику абсолютно не заважає при роботі з рефрактометром, але практично не дозволяє проводити детектування УФ-детектором при довжині хвилі менше 260 нм. Навпаки, навіть помітна добавка гептана до гексаном не зробить ніякого впливу на сигнал УФ-детектора, але спотворить кількісні дані рефрактометра. У адсорбційної хроматографії особливе значення має ретельна осушка розчинників, тому що навіть невелика зміна вмісту води в рухомій фазі може помітно змінити k 'і ступінь поділу компонентів. Вимоги до чистоти розчинника при градієнтному елюювання значно вище, ніж при ізократіческом. У процесі градієнтного елюювання домішки, що містяться в розчинниках, концентруються на початку колонки і вимиваються з неї в міру зростання елюірующей сили рухомої фази. При цьому спостерігається сильний дрейф нульової лінії, а деякі домішки елюіруются вузькими зонами і реєструються детектором у вигляді самостійних піків. У ізократічеоком режимі домішки на початку експерименту також можуть концентруватися на сорбенті, але в системі досить швидко встановлюється динамічна рівновага, і нульова лінія вирівнюється на якомусь певному рівні сигналу детектора. Цей сигнал у багатьох випадках можна компенсувати електрично, але при цьому відповідно зменшується лінійний динамічний діапазон детектора. Не менш важливою є очищення розчинників від механічних домішок (пил з атмосфери, частки адсорбентів і т.п.), які забивають фільтри і порушують нормальну роботу насосів. Для видалення цих домішок розчинники необхідно фільтрувати через фільтри з розміром пор приблизно 0,5 мкм. Основними методами очищення розчинників є перегонка і адсорбційна відділення домішок. Часто для досягнення необхідної чистоти досить простий перегонки. Однак і в тих випадках, коли необхідна адсорбційна очистка, доцільно спочатку висушити і перегнати розчинник. При цьому на тій же кількості адсорбенту можна отримати значно більше очищеного продукту. Спільною проблемою для всіх розчинників є видалення вологи. Багато розчинники утворюють з водою азеотропниє суміші, що дозволяє відокремити основна кількість води відгоном суміші. Для повного видалення вологи використовують молекулярні сита - цеоліти типу NaA (4А) або КА (3А), які попередньо активують прокаливанием в муфельній печі при 420-450 ° С. Адсорбційну очищення проводять методом класичної колонкової хроматографії. В якості адсорбентів використовують оксид алюмінію і силікагель з великою питомою поверхнею (наприклад, КСМ-5) і розміром зерна 0,1-0,5 мм. Сорбенти попередньо сушать протягом декількох годин при 250-300 ° С і 160-180 ° С. Зазвичай застосовують скляні колонки досить великої місткості з відношенням висоти до діаметра в межах 20-30 і краном, що працюють без мастила. Найкращі результати досягаються на колонках з двома шарами сорбенту: нижню половину колонки набивають оксидом алюмінію, а верхню-силікагелем. На колонці, яка містить по 100 г цих адсорбентів, в залежності від їх активності та вмісту домішок можна очистити 300-600 мл неполярних розчинників і в півтора - два рази менше полярних розчинників типу хлороформу або тетрагідрофуран. Якість очищення зазвичай контролюють за пропускання в УФ-області. Як правило, перша порція (20-50 мл) розчинника має недостатню чистоту, і її повертають у верхню частину колонки. Більш полярні розчинники, розташовані в елюотропном ряду Снайдера нижче етилацетату, даним методом очищати не можна. Очищені розчинники зберігають в ретельно закритих товстостінних бутлях з темного скла, в які додають 10-20 г активного цеоліту. З сулій з розчинниками, схильними до окислення, доцільно перед закриванням видалити повітря продувкою сухим аргоном або азотом. Ретельне очищення розчинників - досить складний і трудомісткий процес, і її слід проводити тільки в тій мірі, в якій це дійсно необхідно. Аліфатичні вуглеводні очищають від неграничних сполук обробкою сумішшю концентрованих сірчаної та азотної кислот з наступною відмиванням дистильованою водою до нейтральної реакції і осушенням. Висушені розчинники переганяють. Описано також метод видалення олефінів колоночной хроматографією на силікагелі, просякнутому нітратом срібла. Сорбент готують наступним чином: на висушений силікагель з розміром зерен 100-300 мкм наносять нітрат срібла з 10%-ного водного розчину (аналогічно нанесення нерухомої рідкої фази в газовій хроматографії) і сушать при 125 ° С. З цієї групи розчинників найбільш вживаним є гексан.
Хлорсодержащие вуглеводні часто містять микропримеси соляної кислоти, що утворюється при їх зберіганні, під дією якої сильно піддаються корозії металеві деталі і руйнуються адсорбенти. Кислоту видаляють адсорбційної очищенням на лужному оксиді алюмінію. Серед хлорвмісних розчинників особливої лабільністю відрізняється хлороформ, який легко розкладається під дією світла з утворенням фосгену. Для уповільнення цієї реакції хлороформ стабілізують добавкою 0,5-1% етилового спирту. Таким чином, в хлороформі зазвичай одночасно присутні домішки НСl, етилового спирту і фосгену. Для їх видалення продажний хлороформ промивають водою і переганяють, відокремлюючи основну кількість води у вигляді азеотропної суміші. Перегнанной хлороформ наливають у бутель з темного скла і додають 5-10% (об.) активного цеоліту Саа (5А). Безпосередньо перед вживанням розчинник ще раз переганяють. Загальним правилом при роботі з хлорсодержащими вуглеводнями є використання тільки свіжоприготовленою розчинників. Їх суміші з іншими розчинниками також готують у розрахунку на добову потребу. Прості ефіри, особливо циклічного будови, легко окислюються повітрям з утворенням пероксидів. Присутність останніх вкрай небажано, тому що вони руйнують сорбенти з прищепленої фазою і полімерні сорбенти, а також окислюють лабільні компоненти аналізованих сумішей і поглинають в УФ-області. Найбільш часто з розчинників цього класу застосовують тетрагідрофуран, зазвичай стабілізований гидрохиноном. Перед перегонкою перевіряють наявність пероксидів у тетрагідрофурані. До 1 мл розчинника додають 1 мл. 10%-ного розчину KI або Nal у крижаній оцтової кислоти. При низькій концентрації пероксиду розчин забарвлюється в жовтий колір, а при високій - в коричневий. При помітному змісті пероксидів щоб уникнути вибуху при перегонці їх видаляють кип'ятінням з 0,5% Cu2Cl2 протягом 30 хв. Тетрагідрофуран після видалення пероксиду зберігають над твердим КОН (10-15% об.) В щільно закритій сулії з темного скла в атмосфері інертного газу і переганяють безпосередньо перед. застосуванням. Чистота отриманого розчинника цілком достатня для проведення Ексклюзійна хроматографії на напівжорстких полістирольних гелях при детектуванні рефрактометром. В інших варіантах, особливо при роботі з УФ-детектором, може знадобитися додаткова адсорбційна очистка. Зокрема, обробка тетрагідрофуран і диизопропилового ефіру цеолітами NaX та зберiгають дозволяє видалити до 90-99% пероксидів. Відносно недавно для заміни діетилового і диизопропилового ефірів запропоновано новий розчинник - метил-трет-бутиловий ефір, який практично не утворює пероксидів. Цей розчинник, мабуть, знайде широке застосування в препаративної рідинної хроматографії, так як усувається небезпека забруднення виділяються речовин продуктами окислення розчинника. Слід ще раз підкреслити, що при перегонці розчинників, схильних до утворення пероксидів, необхідно ретельно дотримуватися техніки безпеки. Перегонку слід вести на водяній або силіконовій лазні, не допускаючи перегріву розчинника. У колбу обов'язково повинні бути внесені свіжі ініціатори кипіння (краще всього шматочки скляних фільтрів або пористого фторопласту); перегонку необхідно припиняти, залишаючи в кубі не менше 1 / 5 об'єму завантаження. Кубовий залишок можна додати до свіжої порції розчинника, підготовленої для хімічного видалення пероксидів. Ацетонітрил очищають від домішок, що поглинають в УФ-області, кип'ятінням з перманганатом і перегонкою. У колбу місткістю 2 л поміщають 1,5 л ацетонітрилу і 30 г КМnO4, кип'ятять із зворотним холодильником 1 год і переганяють з дефлегматором, відбираючи фракції по 200 мл. Коли в кубі залишиться близько 200 мл продукту, перегонку припиняють. Решту можна змішувати з новою порцією розчинника. Першу фракцію відкидають, а інші перевіряють на поглинання в УФ-області. Для цього заповнюють робочу кювету УФ-детектора по черзі водою вищого очищення і випробуваним розчинником (порівняльна кювету заповнена повітрям). Чим менше при цьому різниця показань самописця, тим вище якість розчинника. Зазвичай при виконанні цієї отримують близько 1 л ацетонітрилу, придатного для роботи в градієнтному режимі при 254 нм. Значно складніша многостадийная процедура, яка забезпечує отримання розчинника з обмеженою довжиною хвилі <200 нм, описана в роботі. Ізопропанол найчастіше використовують як модифікатор в адсорбційної хроматографії. Тому найбільш небезпечною домішкою в ньому є вода. Ізопропанол утворює з водою азеотропну суміш, що кипить при 80,3 ° С і містить, за різними даними, 9-12% води. При невеликій концентрації води у вихідному продукті її найлегше видалити шляхом відгонки суміші. Якщо ж вміст води вище 5-6%, то розчинник спочатку сушать над безводним сульфатом натрію. Для видалення слідів води ізопропанол витримують над цеолітом NaA.
Метанол. Найбільш важко відокремлюваної домішкою в метанолі є ацетон, який краще всього видаляти обробкою гіпоіодітом натрію NaOI. Розчин 25 г йоду в 1 л метанолу повільно вливають при перемішуванні в 500 мл 1 М розчину NaOH і додають 150 мл води. Через 6-10 год фільтрують утворився йодоформ і кип'ятять фільтрат зі зворотним холодильником до зникнення запаху йодоформу. Більшість домішок, в тому числі і основну масу води, видаляють перегонкою. Для отримання дуже сухого продукту його витримують над цеолітами NaA або КА. Вода являє собою найважливіший розчинник в обернено-фазною та іонообмінної хроматографії. Основними домішками у воді, які заважають проведенню хроматографічного процесу, є різні солі і микропримеси вуглеводнів та інших органічних сполук. Присутність солей неприпустимо в іонообмінної хроматографії, а домішки органічних сполук викликають істотні труднощі в обернено-фазною хроматографії (особливо в градієнтному елюювання) при використанні флуоресцентного і УФ-детекторів. У літературі описано багато різних методів очищення води. Для видалення мінеральних солей, мабуть, найкращим є деионизация на іонообмінника з наступною перегонкою в кварцовою посуді. Задовільна очищення від органічних забруднень досягається фільтрацією деіонізованої води через активоване вугілля. Для вищої ступеня очищення воду пропускають через колонку з обернено-фазним сорбентом, яку потім регенерують промиванням метанолом, ацетонітрилом або тетрагідрофураном. Дуже ефективним є також жорстка УФ-опромінення. У обернено-фазною хроматографії воду зазвичай використовують у вигляді сумішей з полярними органічними розчинниками. Тому практично важливо знати про особливому властивості таких сумішей - аномально високої в'язкості.
Таблиця 1.2 Максимальна в'язкість органічних розчинників з водою
Органічний η 20, (м 2 / с) 10 5 Зміст органі-η 20, (м 2 / с) 5 жовтня
компонент тичного компонента в
суміші з водою,% (об).
Ацетон 0,32 10 1,2
Ацетонітрил 0,38 10 1.1
Етанол 1,20 40 2,8
Метанол 0,60 40 1.8
Таблиця 1.3. В'язкість водно-органічних сумішей
| Вміст органічного компонента в суміші з водою,% (об) | η25 смемі, (м 2 • с) 10 травень | |
| метанол | ацетонітрил | |
| 0 20 40 60 80 100 | 0,89 1,26 1,42 1,40 1,01 0,57 | 0,89 0,91 0,98 0,76 0,58 0,34 |
Література
1. Kucera PJ Chromatogr, 1980, v. 198, p. 93-109.
2. Bowermaster J., McNair Я.J. Chromatogr, 1983, v. 279, p. 431-438.
3. Scott RPFAdv. Chromatogr., 1983, v. 22, p. 247-294.
4. Van der Berg JHM, Horsels HWM, Groenen RJAf. / Chromatogra-phia, 1984, v. 18, No. 10, p. 574-578.
5. Freebairn KW, Knox J.Я. / Chromafographia, 1984, v. 19, No. 1, p. 37-47.
6. Schoenmakers P., Billiet HAH, DeGalan LJ Chromatogr, 1981, v. 205, p. 13-30.
7. Jandera P., Churacek JJ Chromatogr, 1980, v. 192, No. 1, p. 19-36.