Апаратура для сучасної рідинної хроматографії

АПАРАТУРА ДЛЯ ВЕРХ

У сучасній рідинної хроматографії використовують прилади самої різного ступеня складності - від найпростіших систем, зібраних з мінімально необхідної кількості блоків, до комплектних хроматографів, забезпечених міні-комп'ютерами, які контролюють задані робочі параметри, формують градієнт рухомої фази, керують різними додатковими пристроями (автоматичне введення 1-проби, колектор фракцій тощо) і проводять обробку одержуваних даних. Комплектні прилади з високим ступенем автоматизації звичайно забезпечують високу продуктивність і точність результатів, що особливо важливо у виробничих умовах для контролю якості продукції. Однак самостійна збірка хроматографа з окремих блоків дає можливість легко модифіковані прилад залежно від поставленого завдання і більш ефективно використовувати наявне обладнання.

Рис. 1.1. Принципова схема рідинного хроматографа: 1 - посудина для рухомої фази, 2 - насос; 3 - манометр, 4 - фільтр, 5 - демпфер; 6 - термостат; 7 - інжектор; 8 - колонка; 9-детектор, 10 - самописець

На рис. 1.1 представлена принципова схема сучасного рідинного хроматографа. При необхідності цей протягнутої прилад може бути забезпечений різними додатковими пристроями.

НАСОСИ

Сучасні насоси для рідинної хроматографії представляють собою прецизійні пристрої, що забезпечують постійну подачу розчинника в колонку і здатні створювати тиску до декількох десятків мегапаскалей. Продуктивність насосів знаходиться в діапазоні від 1 мкл / хв (мікроколоночная і капілярна хроматографія) до 25-100 мл / хв (препаративна хроматографія). Насоси для ВЕРХ повинні відповідати таким основним вимогам.

Хімічна інертність матеріалів по відношенню до рухомої фазі. Металеві деталі насоса, які контактують з рухомою фазою, звичайно виготовляють із нержавіючої сталі, а ущільнення-з високоінертних нерозчинних матеріалів (як правило, на основі фторопласта або полиимидов). Нержавіюча сталь не є повністю інертним матеріалом і коррозирует під дією сильних основ, деяких солей і слабкою соляної кислоти, яка часто присутня у вигляді домішки в галогеносодержащих розчинниках. Для особливих випадків ці деталі виготовляють з більш стійких матеріалів - титану, спеціальних сплавів або кераміки. Деякі ущільнення руйнуються під дією окремих розчинників (найчастіше хлорованих вуглеводнів), тому необхідно суворо дотримуватися рекомендації, викладені в інструкції до насоса.
Досить високий робочий тиск. Необхідний робочий тиск визначається опором використовуваних колонок і швидкістю потоку і може коливатися в досить широких межах. Можна вважати, що тиск 15-20 МПа достатньо для вирішення більшості аналітичних завдань. Проте краще мати насос з півтора-дворазовим запасом придушення, так як при цьому істотно полегшуються умови його роботи, особливо ущільнень і клапанів. В даному випадку стабільність потоку рухомої фази буде зберігатися значно довше, ніж у насоса, що працює при тисках, близьких до граничних.
Висока стабільність швидкості потоку. Точність підтримки швидкості потоку у колонці багато в чому визначає результати як якісного, так і кількісного аналізу. Для основних варіантів ВЕРХ нестабільність потоку не повинна перевищувати 0,5-1%. У ексклюзіонной хроматографії при аналізі молекулярно-масового розподілу полімерів вимоги ще вище-0 ,1-0, 3%. Крім того, дуже бажано, щоб насос не давав пульсації потоку і мав малий робочий об'єм для швидкої зміни розчинника в режимі градієнтного. елюювання. Всі насоси для ВЕРХ діляться на дві групи: постійної витрати і постійного тиску. Головними достоїнствами насосів постійного тиску є висока продуктивність і відсутність пульсації. Найбільш досконалою конструкцією насосів цього типу є насос з пневмоусилителя, принциповий пристрій якого показано на рис. 1.2. Поршень 1 великого діаметру, що приводиться в дію газом, що надходять по штуцера 2, пов'язаний з поршнем 3 меншого діаметру, який через систему клапанів 4 здійснює подачу рідини з резервуара в колонку. Для швидкого перезаполненія насоса зворотний хід поршня відбувається під дією тиску газу, що надходить через штуцер 5. Максимальний тиск, що розвивається таким насосом, залежить від ставлення площ поршнів і вхідного тиску газу. У відомому насосі фірми «Хаскеля», що використовується для упаковки колонок, воно досягає 100 МПа. Основний недолік насосів постійного тиску - зміна витрати рухомої фази при зміні опору системи. Опір колонки може підвищитися через забруднення вхідного фільтра, насадки або предколоночного фільтра. Воно змінюється зі зміною в'язкості розчинника, що відбуваються при коливаннях температури і практично завжди спостерігається при градієнтному елюювання. Тому насоси даного типу поступово витісняються насосами постійної витрати і застосовуються, головним чином, в препаративної хроматографії і для набивання колонок.

Рис. 1.2. Схема насоса постійного тиску 1-поршень повітряного циліндра; 2, 5 - штуцери подачі повітря, 3 - поршень насоса, 4 - клапани

Рис. 1.3. Схема поршневого насоса постійної витрати: 1 - електродвигун, 2 - ексцентрик, 3 - поршень, 4 - ущільнення, 5 - циліндр; 6 - вхідний клапан, 7 - вихідний клапан; 8 - поворотна пружина

Насоси постійної витрати поділяються на дві основні групи: шприцеві і зворотно-поступальні. Шприцеві насоси, як випливає з їх назви, за конструкцією являють собою шприц досить великої місткості, в якому електродвигун через силову передачу переміщує поршень, видавлюють розчинник з постійною швидкістю. Після проходження всього робочого об'єму шприца потік переривається для перезаполненія поршня. Через цього недоліку і складності виготовлення ущільнень великого діаметру шприцеві іасоси середньої продуктивності (до 5-10 мл / хв) практично вийшли з ужитку. Однак у зв'язку з швидким розвитком мікроколоночной хроматографії, в якій витрата рухомої фази порівняно невеликий, конструктори насосів знову повертаються до цієї системи, важливими достоїнствами якої є висока точність, беспульсаціонная подача розчинника і відсутність клапанів. Мабуть, у найближчому майбутньому можна чекати значного збільшення випуску шприцевих насосів малої продуктивності. Зворотно-поступальні насоси використовують в ВЕРХ найбільш широко, так як вони задовольняють більшості вимог. Практично єдиний їхній принциповий недолік - пульсація потоку, для згладжування якої застосовують спеціальні пристрої, що демпфірують, описані нижче. Менш істотні недоліки - порушення нормальної роботи клапанів за рахунок їх забруднення механічними домішками в рухомий фазі і утворення парових пробок під час такту всмоктування при роботі з розчинниками, що мають високий тиск парів (пентан, метиленхлорид та ін.) Дані насоси випускають двох типів: поршневі, або плунжерні, і мембранні, або діафрагмові. В обох випадках прокачування розчинника відбувається за рахунок зворотно-поступального руху поршня або мембрани в порожнині, обмеженій кульковими клапанами.

У мембранних насосах поршень переміщається в порожнини з маслом, викликаючи знакозмінні вигини мембрани, укріпленої на іншій стороні порожнини. Перевагою даних насосів є відсутність контакту розчинника з ущільненням поршня. При цьому істотно знижуються вимоги до матеріалу ущільнення поршня, а продукти його ерозії не можуть засмітити клапани насоса. Зміна продуктивності насоса здійснюється або зміною робочого об'єму циліндра (шляхом обмеження ходу поршня), або зміною частоти переміщення поршня. Другий спосіб забезпечує більш точну подачу розчинника, особливо при низьких витратах.

У насосах із звичайною круглою формою ексцентрика тривалість тактів всмоктування і нагнітання однакова, що призводить до досить високого рівня пульсації потоку. Конструкторам вдалося помітно знизити пульсацію за рахунок використання ексцентриків спеціально розрахованої складної форми, які забезпечують різке скорочення протяжності такту всмоктування. При закінченні такту нагнітання відбувається швидше перезаполненіе насоса і відразу ж починається новий цикл. Висока стабільність потоку досягнута також при істотному зменшенні робочого об'єму насоса з одночасним збільшенням частоти руху поршня (до 50 Гц). У цьому випадку розчинник подається маленькими порціями, швидко наступними один за одним.

Недоліком описаних систем є підвищена схильність до утворення парових пробок при роботі з легкокипящих розчинниками, тому в деяких конструкціях введено спеціальне регулювання тривалості перезаполненія насоса. Дуже часто для зниження пульсації використовують насоси з двома і навіть з трьома головками і різні системи електронного регулювання. Рівень пульсації у простого насоса з одного головкою становить близько 9%; застосування двох головок, що працюють в протифазі, знижує його приблизно до 3%. Найбільш складні насоси з трьома головками і спеціально розрахованої формою кулачка при малому робочому обсязі забезпечують подачу розчинника майже без пульсації з нерівномірністю не більше 0,2%. За останніми даними, застосування схем електронного регулювання із зворотним зв'язком дозволяє знизити цю величину удвічі.

При тисках вище 10-15 МПа починає виявлятися стисливість деяких розчинників, що призводить до зменшення швидкості потоку. Тому багато насоси постачають спеціальними системами поправки на стисливість рухомої фази.

Перевагою поршневих насосів є можливість легко змінювати продуктивність за рахунок використання змінних головок з іншим діаметром поршня. Зміна головки займає не більше кількох хвилин. До багатьох моделям насосів випускаються змінні головки для препаративної хроматографії з продуктивністю до 25-50 мл / хв, а деякі конструкції мають до трьох змінних головок.

Більшість сучасних насосів забезпечено покажчиками і обмежувачами нижнього і верхнього меж робочого тиску. Тиск у хроматографічної системі є виключно важливим параметром, і його необхідно контролювати. Для цієї мети зазвичай використовують покажчик тиску з проточними тензодатчиками. Обсяг датчиків дуже малий, тому не виникає труднощів при заміні розчинника в градієнтному елюювання. Обмежувачі тиску автоматично відключають насос при виході тиску з встановленого діапазону, що істотно підвищує безпеку роботи. Обмежувач верхньої межі також дуже корисний для запобігання псування колонок з деякими сорбентами, які можуть зруйнуватися при перевищенні допустимого для них робочого тиску. Одним з останніх досягнень є нова конструкція насосної системи, розроблена фірмою «Х'юлет Пакард» (США) для рідинного хроматографа моделі 1090. У цій вельми складній системі розділені функції точного дозування рідини і створення необхідного тиску, що зокрема, усуває вплив стисливості рідини на точність подачі. Блок дозування являє собою здвоєний шприцевий насос з місткістю кожного шприца 110 мкл, з кроковим електродвигуном і перемикаючим клапаном. Коли один шприц подає розчинник, інший заповнюється. Обсяг, що відповідає одному «кроку» електродвигуна, становить 7 нл. В кінці циклу напрямок ходу поршнів змінюється і одночасно спрацьовує швидкодіючий клапан, що перемикає напрямок потоків рідини. Процес перемикання займає всього 50 мс. Тиск, що створюється шприцевим насосом, не перевищує 0,6 МПа. У приладі можуть бути встановлені три таких блоку, що дозволяє працювати в режимі градієнтного елюювання з трьома розчинниками. З блоків дозування, керованих мікропроцесором, розчинники надходять в змішувач місткістю 9 мкл, потім в діафрагмовий насос, який працює з частотою 10 Гц за звичайною схемою і створює тиск до 44 МПа, і далі в демпфер малого обсягу. В описаній системі досягнуті справді унікальні характеристики: при швидкості потоку від 1 мкл / хв до 5 мл / хв нестабільність потоку становить менше 1%, а відтворюваність результатів в режимі градієнтного елюювання краще 1%. Такі параметри дозволяють успішно працювати з колонками будь-яких типів, застосовуваними в аналітичній ВЕРХ. Різноманітність конструкційних рішень, спрямованих на стабілізацію витрати розчинника, привело до того, що асортимент зворотно-поступальних насосів, що випускаються різними фірмами світу, дуже широкий. У той же час не існує насоса, що має найвищі експлуатаційні характеристики для всіх можливих областей застосування. Хоча найбільш складні і дорогі моделі, природно, дають найкращі результати, але для їх експлуатації потрібно, висока кваліфікація оператора та обслуговуючого персоналу. Так, в насосі з трьома головками ймовірність засмічення клапана значно вище, а відшукати засмічений клапан набагато важче, ніж в насосі з одного голівкою. Тому такі насоси слід застосовувати тільки при необхідності найвищої точності подачі розчинника, наприклад в ексклюзіонной хроматографії полімерів. Можна вважати, що в більшості варіантів ВЕРХ цілком задовільну роботу забезпечить насос з двома головками, оптимізованої формою ексцентрика і регулюванням витрати шляхом зміни частоти ходів поршня.

1.2 ПРИСТРОЇ ДЛЯ ФОРМУВАННЯ ГРАДІЄНТ

Призначення пристрою для формування градієнта - змінювати в ході аналізу складу розчинника таким чином, щоб його елюірующая сила постійно збільшувалася відповідно до обраного законом. Це має забезпечити елюювання з колонки як слабо, так і сильно утримуються речовин з хорошим розподілом у вигляді вузьких піків правильної форми і за відносно короткий час аналізу. Пристрої для формування градієнта можуть бути простими за конструкцією або складними в залежності від того, який вид градієнта потрібно, як часто він використовується, який насос є в наявності і т.д. Найпростіший вид градієнта - ступінчастий, для його здійснення на вхід насоса встановлюють багатоходової кран, яким послідовно подають в насос розчинники від найслабшого до найсильнішого, через обрані дослідником інтервали часу, повертаючи кран. Такий вид градієнта може бути легко автоматизований, якщо до крана додати повертає його пристрій і з'єднати його з таймером. Недолік ступеневої градієнта - різкі відхилення нульової лінії детекторів, коли до кювети доходить кордон нового розчинника, а також труднощі проведення кількісного аналізу. Близьким до такого ступінчастому градієнту є використовуваний в хроматографі «Міліхром». Він формується в. насосі за принципом «коктейлю», незмішувані шари заздалегідь приготовлених розчинів різної елюірующей сили послідовно набирають у шприц насоса від самого сильного до самого слабкого. У шприці насоса формується, таким чином, багатоступінчастий градієнт.

Рис. 1.4. Схема пристрою для створення градієнта низького тиску з двома сполученими посудинами і кранами: 1 - кран, 2 - камера змішування, 3 - магнітна мішалка, 4 - до насоса; А і Б - слабкий і сильний розчинники

Обсяг кожного шару і його елюірующая сила підбираються дослідником експериментально, на кожен новий аналіз градієнт набирається знову. При наборі шарів у шприц і при їх подачі в колонку межі шарів розмиваються, це зменшує різкість сходинок градієнта і наближає його до градієнту з плавним профілем.

Одне з простих пристроїв для створення плавного градієнта зображено на рис. 1.4. Воно являє собою систему з двома сполученими посудинами конічної форми. Коли все-крани відкриті, рівні в судинах з розчинниками А і Б однакові. У міру витрачання розчинників в насос буде потрапляти суміш, яка містить все більше розчинника Б і все менше-розчинника А. Змінюючи форму судин, їх об'єм і подачу насоса, можна отримати градієнти різної форми.

Експоненціальні градієнти можна отримати з використанням пристосування, зробленого зі шприца (рис. 1.5). У шприц набирають певний обсяг слабкого розчинника А. Цей обсяг можна змінювати, пересуваючи поршень шприца. Якщо включити подачу насоса, спочатку на колонку подаватиметься розчинник А, який потім буде за експоненціальним заколи змішуватися з більш сильним розчинником Б. Форму одержуваного градієнта можна міняти, підбираючи концентрації розчинів А і Б, місткість камери шприца та швидкість подачі розчинника насосом. Розраховане на високий тиск пристрій аналогічної конструкції може бути встановлено між насосом і інжектором. Воно також дозволяє отримати експонентний градієнт. Його перевага - можливість створення градієнта для мікроколонок з одним насосом, так як при цьому місткість насоса і підвідних трубок не спотворює і не затримує початку градієнта. Недолік наведених пристроїв для формування градієнта - складність роботи з ними, низька відтворюваність, труднощі підготовки багатьох сумішей розчинників, неможливість точного формування градієнта заданої форми, а цінність в тому, що в скрутних випадках за допомогою відносно нескладних саморобних пристроїв вдається вирішити завдання, принципово нерозв'язані ізократіческі . Пристрій для формування градієнта довільної форми діляться на дві великі групи: пристрої формування градієнта при низькому тиску (на вході в насос) і при високому тиску (на виході з двох або більше насосів). Обидві групи мають переваги і недоліки. Поява і розвиток нових пристосувань, методів роботи та варіантів ВЕРХ дозволило зменшити недоліки обох варіантів пристроїв формування градієнта і не дало остаточного переваги ні тому, ні іншому. Система формування градієнта при високому тиску зображена на рис. 1.6 (частина системи до інжектора). Як видно з малюнка, програматор 6 управляє кроковими двигунами насосів, що подають розчинники А і Б в постійно мінливому за обраним дослідником закону співвідношенні. Розчинники надходять в динамічний (іноді статичний, менш ефективний) змішувач з магнітною мішалкою, змішуються і подаються на інжектор і колонку. Як видно зі схеми, в порівнянні з ізократіческой система ускладнюється і, отже, коштує дорожче: додається другий насос, програматор і змішувач, ряд електричних і гідравлічних ліній. Якщо буде потрібно градієнт з трьох або чотирьох розчинників, то для цієї схеми будуть необхідні додатково ще 1 чи 2 насоса.

Рис. 1.5. Схема пристрою для створення градієнта низького тиску з використанням шприца: 1 - кран; 2 - шприц, 3 - поршень шприца, 4 - камера змішування, 5 - магнітна мішалка, 6 - до насоса; А і Б - слабкий і сильний розчинники

Рис. 1.6. Схема пристрою для створення градієнта високого тиску: 1 - до інжектору; 2 - змішувач, 3 - магнітна мішалка, 4 - насос для подачі розчинника А, 5 - насос для подачі розчинника Б; 6 - програматор; А і Б - слабкий і сильний розчинники

Рис. 1.7. Схема пристрою з клапанами для створення градієнта низького тиску: 1 - до інжектору; 2 - змішувач, 3 - магнітна мішалка, 4 - насос; 5,6 - клапани, 7 - програматор; А і Б - слабкий і сильний розчинники

Схема формування градієнта при низькому тиску представлена на рис. 1.7. Управління градієнтом також покладено на програматор, однак він не керує насосом, а двома електромагнітними клапанами, відкриваючи або закриваючи той чи інший за заданою програмою. Цим забезпечується надходження на вхід насоса 4 суміші розчинників А і Б в заданому співвідношенні. Суміш перемішується в клапанної системі, підвідних лініях, поршневих камерах і остаточно стає однорідною в змішувачі.

На перший погляд здається, що система ця простіше і краще попередньої: клапанна система стоїть, очевидно, дешевше додаткового насоса. Однак клапанна система, що працює при деякому розрідженні, через складну геометрії і в умовах змішування при цьому двох розчинників, що містять розчинені гази, при звичайній дегазації працює з постійними відмовами. Утворилися при змішуванні бульбашки налипають в клапанах і поршневих камерах, насос перестає подавати розчинник. Це особливо характерно для звернення-фазних та буферних розчинів, широко застосовуються в ВЕРХ. Складно не тільки провести глибоку дегазацію, а й. охороняти дегазований розчинники від контакту з повітрям, що приводить до розчинення газів.

Вартість складних дегазуючих пристроїв в сумі з вартістю клапанної системи приблизно зрівнюють ціну приладів, що працюють з градієнтом високого і низького тиску. Однак якщо у дослідника виникає необхідність у градієнті з трьох або чотирьох розчинників, прилад з градієнтом низького тиску при інших рівних умовах виявиться дешевше.

Таким чином, підсумовуючи переваги і недоліки пристроїв для створення градієнта високого і низького тиску, можна зробити наступні висновки.

Пристрій для створення градієнта високого тиску протягнути і стабільно в роботі, не вимагає особливої дегазації розчинників, легко перебудовується для препаративної, полумікро-і мікроколоночной роботи. Воно може працювати з відносно дешевими насосами з кроковим двигуном і одним плунжером, що працюють за циклом: повільна подача - швидке перезаполненіе. Воно може мати вбудовані в насосні лінії і не викликають особливих проблем непроточні манометри, демпфери великого обсягу, колонки зі спеціальними сорбентами, «поліруючими» один або обидва розчинника, - все це не позначається на відтворюваності і точності градієнта. Пристрій для створення градієнта низького тиску повинен обов'язково мати надійну систему глибокої дегазації, без якої стабільна робота неможлива. Це може бути або система дегазації продувкою розчинників безперервним потоком гелію в процесі роботи (великий струм спочатку, і повільний для підтримки дегазованого стану); витрата гелію при цьому значний. Можна використовувати систему динамічної дегазації розчинників при їхньому проходженні через напівпроникні фторопластові трубки з полімеру особливого сорту, що знаходяться у вакуумі, вона коштує досить дорого, але дозволяє уникнути витрат гелію і отримати розчинники, з яких вилучено понад 99% розчинених газів. Пристрій для створення градієнта низького тиску повинен працювати з насосами, усмоктувальними і подаючими розчинники; їх неможливо використовувати для мікроколоночной і важко - для препаративної роботи великої продуктивності. Програматори градієнта створюються, як правило, на базі персональних мікроЕОМ з об'ємом пам'яті від 48 до 64 К. Запис програм градієнта ведеться на гнучких дисках або ж з використанням касет і магнітофонів. При роботі з більш старими моделями потрібно щоденний набір програм оператором. Якщо для створення градієнта та управління ім використовують мікро-ЕОМ з досить великим обсягом пам'яті і можливістю гнучкого програмування з використанням мови Бейсік, часто цю ж ЕОМ використовують і для обробки отриманих хроматограм. Змішувачі представляють собою камеру невеликої місткості з нержавіючої сталі з вміщеній всередину магнітною мішалкою, привід якої знаходиться зовні. Для однорідності перемішування в деяких моделях використовують подвійну камеру з двома магнітними мішалками від одного приводу. Обсяг таких змішувачів звичайно становить 1-1,5 мл. Якщо змішання здійснюється неефективно, розчинник в колонку і далі в детектор надходить негомогенний. Це призводить до порушення хроматографічного процесу у колонці і помітно збільшує шуми детектора. Якщо хроматографіст забув включити в мережу магнітну мішалку, негомогенності складу розчинника і шуми детектора досягають максимального значення.

Статичні змішувачі, які становлять канали складної форми, призначені для змішування за рахунок зіткнення потоків, менш ефективні. Для препаративної роботи потрібні змішувачі зі значно більшою місткістю, розраховані на роботу з великими подачами розчинників. Для мікроколоночной ВЕРХ з градієнтом розчинника необхідний мікросмесітель місткістю менше 100 мкл; спроба використовувати змішувач на 1-1,5 мл призводить до сильного перекручування форми градієнта. Це легко зрозуміти, оскільки витрата) астворітеля при роботі з микроколонки діаметром 1 мм становить 30 мкл / хв. Розчинник у великому змішувачі буде-(Амен новим за 30-50 хв.

1.3 ІНЖЕКТОР

Інжектори для введення проби повинні забезпечувати введення проб від 0,1 мкл до декількох мілілітрів (відповідно в мікро-і препаративних колонках) з високою воспроізводімосгью при тисках до 30-50 МПа. Розмивання проби в інжекторі має бути мінімальним. Інжектори повинні працювати при підвищених температурах і в середовищі активних розчинників і реагентів, при цьому їх ущільнення повинні бути механічно міцними. Було запропоновано велику кількість конструкцій інжекторів різних типів, багато з яких через складність виготовлення, і ненадійність роботи, високої вартості не отримали широкого розповсюдження. Розглянемо типи інжекторів, використовуваних в ВЕРХ. Найпростішим є інжектор із зупинкою потоку («стоп флоу»). Він включає кран для перекривання потоку перед інжектором і трійник, до якого приєднані колонка, підвідний розчинник капіляр і заглушка (рис. 1.8). Коли потрібно ввести пробу, зупиняють насос, перекривають кран, відвертають заглушку, набирають пробу в мікро шприца, вводять голку до рупора у фільтр колонки, наносять пробу, виймають мікро шприца, загортають заглушку, відкривають кран і включають насос. Потік розчинника вимиває пробу в колонку. Інжектор простий по конструкції, легко може бути виготовлений самостійно. Недоліки: багато ручних операцій при роботі, нестаціонарність потоку розчинника дає помилковий пік і ускладнює точні кількісні вимірювання утримування, ефективності та інших параметрів. 1 - заглушка, 2 - корпус інжектора; 3 - колонка, 4 - кран для зупинки потоку, 5 - подача розчинника від насоса Рис. 1.9. Схема роботи петлевого інжектора: а - заповнення петлі пробою; б - введення проби на колонку1-до петлі, 2 - до насоса, 3 - до колонки, 4 - введення проби, 5, 6 - скидання надлишку проби; 7 - петля Інжектор з гумовою мембраною за конструкцією схожий на попередній, в ньому не використовують кран зупинки потоку розчинника і на місці заглушки затискається пружна гумова мембрана. Введення проби здійснюють мікро шприца, розрахованим на роботу в герметичних умовах при високому тиску. Пробу вводять в потік розчинника без його зупинки шляхом проколювання мембрани, введення мікро шприца до упору голки у фільтр колонки і нанесення проби. Інжектор простий за конструкцією і легко може бути виготовлений.

Рис. 1.8. Інжектор із зупинкою потоку розчинника:

Основний недолік - наявність гумової мембрани, яка набухає в розчинниках, втрачає герметичність при багатьох проколах, виділяє в потік розчинника інгредієнти, що дають неправдиві піки і підвищують фон і шуми детектора. Частинки мембрани, фарбували при проколах, забруднюють вхідний фільтр колонки, створюють ефект «пам'яті». Вибір для мембрани марки гуми, найбільш стійкою до даного розчинника, використання мембран багатошарових із зовнішніми шарами з фторполімерів або з металевої фольги дозволяє зменшити, але не виключити ці недоліки. Мікро шприца високого тиску також дороги, більш важко промиваються і менш надійні, ніж звичайні. Цей тип інжектора також використовують в основному для навчальних цілей. Найбільше поширення мають петльові інжектори (петльові крани). Пробу вводять в петлю заданої місткості при тиску, близькому до атмосферного, за допомогою мікро шприца або шприца. Потім поворотом крана петля повідомляється з лінією подачі розчинника від насоса і входом колонки, проба вимивається з петлі і потрапляє в колонку. Схема роботи одного з петльових інжекторів представлена на рис. 8.9. У положенні «заповнення петлі» потік розчинника від насоса йде безпосередньо в колонку, а петля з'єднується з лініями «скидання» і «введення проби» і знаходиться при атмосферному тиску. У цьому положенні петля промивається чистим розчинником за допомогою шприца місткістю 2-5 мл від залишків попередньої проби, потім за допомогою мікро шприца в петлю вводиться певний обсяг проби. Проба може вводитися або з повним заповненням петлі, або з її частковим заповненням. Перший спосіб є кращим при кількісному аналізі і дозволяє отримати найбільш відтворювані результати аналізу. Він вимагає для повного заповнення петлі подачі в неї об'єму проби, в 5-6 разів перевищує місткість петлі. Це необхідно для повного витіснення з петлі розчинника пробій. Часткове заповнення петлі зручніше, так як дозволяє, не міняючи петлі місткістю, наприклад, 50 мкл, вводити проби від 1 до 40 мкл. При цьому обсяг проби, що потрапляє в петлю, не повинен перевищувати приблизно 4 / 5 місткості петлі. Так як обсяг проби, що потрапляє в петлю в цьому випадку, не точно дорівнює тому, який подано мікро шприца (так як частина проби залишається у підвідних каналах від кінця мікро шприца до початку петлі), то точність кількісного аналізу в цьому випадку буде нижче, ніж при повному заповненні петлі. Чітко уявляти, що відбувається при заповненні петлі, дуже важливо для вибору найкращого способу роботи з інжектором того чи іншого типу. Чому при повному заповненні петлі потрібно вводити 4-5 обсягів проби? Чому при частковому заповненні не можна вводити більше 80% від місткості петлі? Це пов'язано з гідродинаміки заповнення петлі і ілюструється рис. 8.10. Зі схеми видно, що через тертя у стінок петлі залишається вихідний розчинник, а передній фронт набуває форму «язика». Якщо при частковому заповненні петлі подати об'єм, рівний місткості петлі або близький до нього, частина «мови» вийде за межі петлі в злив і не потрапить в колонку. Точно так само при повному заповненні петлі, не витіснивши весь розчинник від стінок, неможливо отримати відтворюваних результатів аналізу. У каналі 3 залишається частина проби, яка не потрапляє в колонку при частковому заповненні петлі. Ясно, що чим вона менша, тим краще для роботи. У інжекторів різної конструкції ця частина проби може бути від кількох десятих часток мікролітра до 7 - 15 мкл.

Рис. 1.10. Схема розмивання проби при заповненні петлі: 1 - голка мікро шприца; 2-ущільнення голки, 3 - канал з пробою, не потрапляє в колонку, 4 - петля, 5 - «мова» фронту проби

- J ЮЛ.

1 2 3 4 5

Петльові інжектори зазвичай можуть працювати при тисках до 49-70 МПа, проте термін їхньої служби значно подовжується, якщо притиск тертьових деталей зменшується так, щоб герметичність зберігалася до 35 МПа. Це розумно, тому що дуже рідко робота проводиться при тисках вище 35 МПа. Якщо це все ж потрібно, то збільшити тиск натискних пружин можна дуже швидко і просто за кілька хвилин.

Петльові інжектори діляться на що мають зовнішню і внутрішню петлі. Зовнішні петлі являють собою звичайно шматки капіляра певної місткості, які можна легко замінити. Внутрішні петлі є канали певної місткості, виконані в тілі інжектора. Як правило, місткість внутрішніх петель мала (0,06-10 мкл), і інжектори такого типу призначаються для мікроколоночной ВЕРХ. Зміна такої внутрішньої петлі-це, як правило, досить складна розбирання з заміною вузла інжектора на новий, що має інший об'єм каналу. Тому для спрощення роботи іноді такі інжектори постачають декількома внутрішніми петлями, які за бажанням можуть знаходитися в робочій або запасний позиції. Є інжектори, які можуть перебудовуватися від варіанту роботи з внутрішньою петлею до роботи із зовнішнього петлею. Деякі інжектори забезпечуються пристроями для фільтрування вводяться зразків. Існують пневматичні або електричні приводи до інжекторам, що дозволяють вводити пробу по команді від мікропроцесора.

Купуючи інжектор, завжди слід уважно ознайомитися з особливостями його конструкції: який мертвий об'єм до петлі, яке перетин каналів, при якій температурі і тиску інжектор може працювати, які петлі можна з ним використовувати. Враховуючи, що виходять з ладу пластмасові деталі ущільнення, потрібно їх придбати заздалегідь, так само як і конусні муфти, накидні гайки і капіляри для виготовлення різних петель.

Крім ручних інжекторів, існують численні конструкції повністю автоматичних інжекторів, які відповідно до заданої програми можуть вводити від 20 до 100 і більше зразків. Вони забезпечують виконання всіх циклів введення проби: промивку петлі, заповнення, введення проби автоматично. При цьому послідовність аналізу зразків і число вводів однієї і тієї ж проби можуть бути задані. Вони досить дорогі, як правило, вимагають лінії стисненого повітря для роботи і висококваліфікованого обслуговування. Тому їх застосування виправдане тільки в тих випадках, коли необхідно аналізувати велику кількість ідентичних проб.

Нарешті, слід згадати про інжекторах-насосах, здатних по команді подати на колонку пробу певного обсягу і зупинитися. Їх застосування повністю виправдане, коли потрібно багаторазово подавати на препаративної колонку відтворено і без розмивання один і той же зразок. З використанням такого насоса, керованого мікропроцесором колектора фракцій, можна легко зібрати автоматичну препаративної ізократіческую систему, яка стоїть дуже недорого.

1.4 ДЕТЕКТОРИ ДЛЯ ВЕРХ

Детектори для ВЕРХ повинні фіксувати зміну будь-яких властивостей розчинника, що виходить з колонки, пов'язане з наявністю в ньому аналізованих речовин. Це може бути поставленні оптичних властивостей елюента (в ІЧ-, УФ-або видимої області), його показника заломлення, здібності флюоресціровать, електропровідності, здатності окислюватися або відновлюватися, діелектричної проникності і т.д.

Детектори поділяються на селективні і універсальні. Селективні детектори здатні зафіксувати елюювання цікавлять дослідника речовин, що володіють специфічними властивостями, на тлі багатьох інших компонентів, такими властивостями не володіють. Ці детектори (флюоресцентний, електрохімічний і ін) знаходять широке застосування в аналізі слідових кількостей лікарських препаратів у біологічних зразках, мікродомішок, біогенних амінів. Універсальні детектори повинні реагувати на елюювання будь-яких речовин незалежно від того, мають вони якимись особливими властивостями чи ні. Такі детектори знаходять широке застосування в органічній хімії, нафтохімії, фармацевтичної, хімічної, медичної промисловості, біологічних науках. Якими ж властивостями повинен володіти ідеальний детектор для ВЕРХ? Він не повинен викликати розмивання зони піка, що виходить з колонки, і її розширення. Повинен мати високу чутливість і відгук на проходження речовини, який можна передбачити. Зразок не повинен розкладатися, проходячи через детектор. Зміни температури, швидкості потоку і складу розчинника не повинні впливати на працездатність детектора. Відгук детектора на кількість речовини повинен бути лінійним, і лінійний діапазон повинен бути широким. Детектор повинен бути простим і зручним у роботі й обслуговуванні. Детектор при проходженні речовини повинен давати не тільки кількісну інформацію, а й якісну, яка підтверджує склад або будову речовини. Відгук детектора повинен з'являтися при проходженні через кювету будь-якої речовини, цей відгук не повинен залежати від розчинника, він повинен бути швидким. Детектори, використовувані для ВЕРХ, звичайно, далеко не в повній мірі володіють властивостями ідеального детектора. Таких, що наближаються за характеристиками до ідеальних детекторам, як полум'яно-іонізаційний або по теплопровідності в газовій хроматографії, в ВЕРХ немає. Проте наявний асортимент детекторів дозволяє виконувати багато цікаві роботи, причому цей асортимент постійно поповнюється новими розробками.

Які ж характеристики детекторів потрібно брати до уваги, підбираючи відповідний для даної задачі детектор? Ці характеристики слід поділяти на ті, які пов'язані з самою конструкцією детектора, і на ті, які залежать від властивостей розчинника, аналізованої речовини. Кожен детектор характеризується певним шумом, який для різних типів детекторів виражається в різних одиницях. Його зазвичай визначають виробники детекторів умовах, коли він мінімальний. Чим менше шум у детектора в порівнянні з іншим такого ж типу, тим краще використані конструкційні елементи, більш вдала схема, краще регулювання. Різниця в шумі у різних детекторів одного типу може становити порядок і навіть більше (за даними фірм-виробників).

Інша дуже важлива величина - це дрейф нульової лінії, який визначається зміщенням нульової лінії в процесі роботи детектора за певний відрізок часу після прогріву. Ця величина також може мати різницю у детекторів одного типу більш ніж на порядок. Місткість кювети детектора є фактором, поряд з її геометрією (розмиває або розмиваються), що визначає, наскільки можуть бути розмиті піки, що потрапляють в неї з колонки. Місткість кювети повинна бути не більше 0,1 обсягу першого піку, який представляє інтерес для дослідника (наприклад, якщо перший такий пік виходить в обсязі 30 мкл, місткість кювети не повинна перевищувати 3 мкл). Це особливо істотно для експрес-аналізів методом ВЕРХ, що виконуються на коротких (3-5 см) колонках, заповнених сорбентом зернового 3 мкм. Важливо це і длЯг-мікроколонок діаметром 2, 1 мм і менше.

Спотворити пік може також недостатня швидкодія детектора (цей недолік найбільш часто зустрічається у детекторів старої розробки); якщо це так, то більш ранні піки будуть ширше і нижче їх реальної форми. Однак швидкодія більш ніж 0,1 с (крім прямої стиковки детектора з ЕОМ) також марно, зважаючи на те що швидкодія самописців і інтеграторів зазвичай складає 0,3-0,4 з відгуку на 90% шкали. Не зайве зазначити, що використання самописця з повільним відгуком призводить до такого ж ефекту.

Лінійний динамічний діапазон, що характеризує діапазон концентрацій, в якому відгук детектора пропорційний концентрації, у детектора повинен бути широким (бажано більше 10 ^5), для того щоб з одного аналізу можна було визначати як основні компоненти, так і домішки, що містяться в слідових кількостях.

Нарешті, якщо детектор працює в градієнтному режимі або в умовах, що не виключають деякого зміни навколишньої температури, дуже велике значення має нечутливість детектора до флуктуацій температури, швидкості потоку і зміни складу розчинника і стабільність його відгуку незалежно від зміни цих умов.

1.4.1 Фотометри для роботи в ультрафіолетовому та видимому діапазонах

Фотометри, що працюють в УФ-діапазоні, мабуть, є найбільш широко поширеними і популярними детекторами в ВЕРХ. Це пов'язано з їх відносно низькою вартістю, надійністю роботи лампи (до 6000 год і більше), нечутливістю до зміни температури і складу розчинника.

Принципова схема найпростішого УФ-фотометра представлена на рис. 1.11. Джерелом УФ-випромінювання в ньому є ртутна лампа низького або середнього тиску, що має інтенсивні лінійчаті спектри, з яких промені з певною довжиною хвилі вирізаються за допомогою фільтрів. Ртутна лампа низького тиску близько 90% енергії випромінює при 254 нм, що дає можливість виключити фільтри. Іноді з її допомогою збуджують випромінювання фосфорного екрану при 280 нм, яке використовують як другу довжину хвилі. Інші лампи в поєднанні з фільтрами і (іноді) блоками живлення дозволяють працювати при 206, 214, 229, 254, 280, 313, 334, 365 нм і більше (тобто у видимій області). Вартість таких ламп, блоків живлення до них і фільтрів визначає, чи має сенс використовувати їх або ж перейти до спектрофотометричного детектора. Велике значення має, звичайно, термін служби таких ламп, який помітно різниться від 300 - 500 год (що близько до сpoкy служби дейтерієвої лампи спектрофотометра) до 5000-6000 год - цим також визначають переваги перед спектрофотометром. Нерідко вартість такого «складного» фотометричного детектора з повним набором фільтрів, ламп, блоків живлення не менше, а більше вартості спектрофотометричного детектора.

Рис. 1.11. Принципова схема УФ-фотометра з фільтрами: 1 - фотоприймач, 2 - робоча мікрокювета; 3 - фільтр; 4 - ртутна лампа, 5 - мікрокювета порівняння

Слід зазначити, що дуже багато органічних речовин досить інтенсивно поглинають при 254 нм. Це всі ароматичні і поліароматичні сполуки, гетероциклічні сполуки, речовини, що містять у своєму складі гетероатомами, карбонільну групу і багато інших. У всіх цих випадках застосування найпростішого дешевого і надійного УФ-фотометра цілком виправдано. Чутливість цього приладу досягла 0,001-0,0002 е.о.п. на всю шкалу, а характеристики щодо шумів і дрейфу помітно покращилися. З'явилися у продажу для них і повні комплекти кювет від мікроколоночних (0,5 - 2 мкл) до препаративних (з довжиною оптичного шляху 0,1 - 0,5 мм). Випускаються УФ-фотометри, що наближаються до спектрофотометра. У них, в якості джерела випромінювання вмонтована дейтерієва лампа з широким спектром від 190 до 360 нм, замість дорогого монохроматора використовують фільтр. Якщо набір потрібних довжин хвиль невеликий, вартість такого фотометра з набором фільтрів помітно нижче, ніж спектрофотометра.

1.4.2 Спектрофотометричні детектори

Якщо у спрощеній схемі фотометра лампу замінити на таке джерело випромінювання, який може випромінювати монохроматичне світло будь-якої необхідної довжини хвилі без застосування фільтрів, це і буде схемою спектрофотометричного детектора для ВЕРХ. Опис досить складних оптичних схем такого джерела випромінювання можна знайти в більшості посібників з ВЕРХ. За допомогою таких схем з широкого, безперервного спектру випромінювання дейтерієва лампи (190-360 нм) і лампи видимого світла (довжина хвилі понад 360 нм) з використанням голографічного решітки вирізається більш-менш вузька смуга УФ-або видимого випромінювання. Це випромінювання і потрапляє в порівняльну і робочу кювети, які далі працюють за тією ж схемою, за якою влаштований фотометр. Відмінності між різними конструкціями спектрофотометричних детекторів викликаються більш-менш вдалими оптичними схемами, більш вузьким або широким пучком монохроматичного світла, кращою чи гіршою відтворюваністю «повторної установки тієї ж довжини хвилі. Розрізняють також УФ-спектро-фотометричні детектори, які використовують як джерело випромінювання тільки дейтерієву лампу, і працюючі в УФ-та видимому діапазонах - вони додатково оснащуються лампою видимого світла.

Характеристики різних спектрофотометрів так само, як фотометрів, можуть помітно відрізнятися за шумів, дрейфу нульової лінії, максимальної чутливості - ця різниця може скласти більше одного порядку. Особливо велика різниця між старими моделями менш вдалою розробки, оптичні та електронні блоки яких через тривалої роботи зістарені і вже не забезпечують паспортних характеристик, і новими моделями останніх розробок. Це слід враховувати, особливо в тих випадках, коли досягнення максимально можливої чутливості тільки і дозволяє вирішити поставлену задачу. Якщо таке завдання не ставиться, немає сенсу гнатися за рекордними показниками спектрофотометра, а краще вибрати більш дешеву модель, але в більш повній комплектації. Основні труднощі при роботі з спектрофотометрами - це відносно короткий термін служби досить дорогих дейтерієва ламп. Він становить зазвичай 300-700, рідко 1000 год, після чого шуми різко зростають і лампу необхідно міняти. Якщо спектрофотометр передбачається встановити і експлуатувати в умовах атмосфери, яка містить пари органічних речовин, води, пилу (наприклад, у виробничих лабораторіях), доцільно придбати спектрофотометр, чутлива оптична схема якого герметично захищена від шкідливого впливу забруднень атмосфери. Цьому ж сприяє регулярна заміна осушувача, зазвичай силікагелю, що розміщується всередині спектрофотометра. Необхідно укомплектувати спектрофотометр запасними дейтерієва лампами, запасними кварцовими вікнами і прокладками для кювети (прокладки часто одноразового використання), мікроколоночной та препаративної кюветами, якщо такі режими роботи можуть знадобитися. Спектрофотометр за своїми характеристиками наближається до універсальних і селективним детекторам (залежно від обраної довжини хвилі). При довжинах хвиль, близьких до 190 нм, він дозволяє детектувати цукру, жири, складні і прості ефіри, ПАР поліоксіетіленгліколевого ряду і інші речовини, практично не поглинають УФ-випромінювання при 210 нм і вище - тут він наближається до універсального детектора. Деякі спектрофотометри оснащені додатковими пристроями, які дозволяють записати (зупинивши потік розчинника в момент проходження піку через кювету) ультрафіолетовий спектр піку, відповідного даної речовини. Така можливість часто представляється початківцям дуже привабливою. Проте слід враховувати, що УФ-спектр сам по собі не дуже інформативний. Можна зробити простіше, зібравши препаративної фракції, відповідні цікавлять пікам, і досліджувати не тільки їх УФ-спектри, а й інші фізико-хімічні характеристики. Існують швидко скануючі спектрофотометричні детектори, які дозволяють зняти УФ-спектр речовини при його проходженні через кювету без зупинки потоку. Один з найбільш вдалих детекторів такого типу використовують в хроматографі «Міліхром», в якому за допомогою дзеркала, що повертається за заданою програмою на певний кут із заданою частотою, кювети з зразком і порівняльна кювету висвітлюються послідовно монохроматичними променями з вибраними оператором різними довжинами хвиль. Отримана при цьому хроматограмма, що представляє собою комбінацію з двох, трьох або більше хроматограм, знятих при різних довжинах хвиль, дозволяє отримати якісну інформацію про можливі домішки, замаскованих в одному піку, про природу і структуру речовини, про довжину хвилі, при якій поглинання даної речовини максимально і можна визначити його мінімальна кількість. Ця інформація часто дозволяє по одній хроматограмме вирішити відразу декілька досить складних завдань: виявити домішки, встановити чистоту речовин, визначити довжину хвилі, при якій поглинання кожної речовини найбільше, провести ідентифікацію. Працювати з таким детектором, звичайно, складніше, ніж з простим спектрофотометром. Існують ще більш ускладнені спектрофотометри, наприклад такі, які дозволяють, відповідно до записаною програмою, змінювати довжину хвилі для кожного піка або групи піків таким чином, щоб отримати максимальну чутливість. Довжина хвилі при цьому змінюється автоматично кілька разів за час аналізу. На закінчення хотілося б підкреслити два положення. Застосуванню спектрофотометрів як універсальних детекторів, що працюють при довжинах хвиль близько 200 нм, великою мірою перешкоджає дуже малий вибір розчинників, УФ-прозорих в цьому діапазоні. Тільки ретельно очищені ацетонитрил і вода можуть використовуватися в обіг-фазному варіанті при 200 нм і нижче. Отримати такі високочисті розчинники дуже важко, і коштують вони дорого. Ще важче очистити для роботи в цій області алкани (гексан, гептан та ін.)

1.4.3 Рефрактометричний детектори

Диференціальний рефрактометр безперервно реєструє зміну показника заломлення елюату на виході з колонки. Головною перевагою цього детектора є універсальність, так як при виборі відповідного розчинника він може детектувати будь-які речовини. Тому він займає друге місце (після УФ-детектора) за частотою використання. До інших достоїнств рефрактометра відносяться можливість роботи з будь-якими розчинниками в широкому інтервалі швидкості потоку, невисокі вимоги до чистоти рухомої фази, надійність і зручність в експлуатації. Деякі моделі детекторів можуть працювати при температурі до 150 ° С, що є виключно важливим для ексклюзіонной хроматографії ряду синтетичних полімерів.

Рефрактометр являє собою недеструктивная концентраційний детектор середньої чутливості. Остання визначається різницею показників заломлення елюента і аналізованих речовин і часто може бути підвищена за рахунок правильного вибору рухомої фази. В оптимальних умовах межа виявлення для рефрактометра досягає 5 • 10 ^-7 г / мл. Основні недоліки рефрактометричних детекторів-практична неможливість використання при градієнтному елюювання і необхідність ретельної стабілізації температури. Для роботи на максимальній чутливості потрібно підтримувати температуру елюента і обох осередків кювети. з точністю до 10 ^-3 -10 ^-4 ° С, що важко навіть при приміщенні кювети в металевий блок з великою теплоємністю і використанні ефективних теплообмінників. Останні, в свою чергу, збільшують мертвий об'єм між колонкою і кюветою детектора, що призводить до додаткового розмивання хроматографічних зон і зниження ефективності розділення.

Рефрактометри вельми чутливі до пульсації потоку, тому при роботі з цими детекторами необхідно застосовувати демпфіруючі пристрою.

Промисловість виробляє рефрактометричних детектори трьох типів, що розрізняються принципами вимірювання.

Рефрактометр оптичного відхилення - найбільш поширений тип даного приладу. Принцип дії детектора заснований на тому, що при проходженні променя світла через кювету, заповнену двома рідинами з різними показниками заломлення, промінь відхиляється на кут, пропорційний різниці цих показників заломлення.

Принципова схема рефрактометра показана на рис. 8.12. Світло від лампи 1 проходить через маску 2, збирається в паралельний пучок лінзою 3 та потрапляє в кювету. Кювету являє собою два осередки у вигляді призм із загальною гранню; в вимірювальну комірку 4 надходить елюент з колонки, а порівняльна комірка 5 заповнена чистим розчинником. При зміні показника заломлення у вимірювальному осередку промінь світла відхиляється від первинного напряму, відбивається дзеркалом 6 назад в кювету, знову відхиляється і через лінзу 3 фокусується на фотосопротівленій 7. Останнє виробляє електричний сигнал, пропорційний положенню променя світла, який посилюється електронним підсилювачем 8. Спеціальна скляна пластина 9 служить для встановлення оптичного нуля.

Рефрактометр оптичного відхилення може працювати з будь-якими розчинниками і має широкий діапазон лінійності. Місткість кювети зазвичай дорівнює 10 мкл, а поріг чутливості становить 5 • 10 ^-8 -2 • 10 ^-7 од. рефракції. До цього типу належать широко відомий рефрактометр R 401 фірми «Уотерс» та унікальний лазерний рефрактометр ЛР-1 [24] з місткістю кювети всього 0,1 мкл.

Рис. 1.13. Схема рефрактометра Френеля: 1 - призма, 2 - дзеркальна сталева пластина, 3 - проектор, 4 - кювети, 5 - фокусують лінзи; 6 - здвоєне фотосопротівленіе

Рефрактометр Френеля. Дія цього детектора засноване на законі Френеля, який свідчить, що кількість світла, відбитого від поверхні розділу двох речовин (рідини і скла), пропорційно різниці показників заломлення цих речовин і куту падіння світла на поверхню розділу. Для отримання максимальної чутливості кут віддзеркалення повинен бути близький до критичного. Основою конструкції рефрактометра Френеля (рис. 8.13) є скляна призма 7 з кутом при вершині 90 °, заснування якої є верхньою стінкою кювет. Вимірювальна і порівняльна щілиноподібні кювети утворені отворами спеціальної форми в тонкій прокладці з фторопласту, затиснутої між основою призми 1 і дзеркальною пластиною з нержавіючої сталі 2 (нижня стінка кювет), яка одночасно є теплообмінником. Проектор 3 виробляє два паралельних пучка світла, які сфокусовані на поверхні розділу скла і рідини в робочій і порівняльної кюветах 4. Світловий потік в кюветах проходить через тонкий шар рідини і відбивається від пластини 2. Відбите світло фокусується лінзами 5 на вимірювальне і порівняльне фотосопротівленія 6. Різницевий сигнал посилюється електронним підсилювачем. Проектор 3 змонтований на окремій оптичної лаві, яку можна повертати для зміни кута падіння і підтримки кута відбиття, близьким до критичного. Головним достоїнством рефрактометра Френеля є мала місткість кювети - 3-5 мкл, що дозволяє прийняти його в поєднанні з сучасними високоефективними колонками. Основні недоліки - необхідність використання двох призм (1,31-1,44 і 1,40-1,55) для перекривання всього необхідного діапазону показників заломлення розчинників і дуже високі вимоги до чистоти кювет. Цей детектор найбільш чутливий до пульсацій потоку і має менший діапазон лінійності, ніж рефрактометр оптичного відхилення, а поріг чутливості-~ 10 ^-7 од. рефракції.

Основним виробником рефрактометрів Френеля є фірма «LDC» (детектори типу «Рефрактомонітор»). Інтерферометричний рефрактометр відносно недавно розроблений фірмою «Оптілаб» (Швеція) і випускається тільки розробником. Він являє собою інтерферометр c двома проточними кюветами, який вимірює різницю показників Переломлення в одиницях довжини світлової хвилі. За даними фірми, у цього детектора дуже висока лінійність сигналу, а чутливість на порядок вище, ніж у інших дефрактометров. Проте невеликий досвід роботи з цим детектором показує, що для отримання стабільної нульової лінії потрібно дуже ретельне термостатування всієї хроматографічної системи, і повністю реалізувати його високу чутливість практично не вдається.

1.4.4 Флуоріметріческійметод детектори

Детектування по флуоресценції застосовують в біології, медицині, форма-кологіі, при аналізі харчових продуктів і контролі забруднення навколишнього середовища. Флуоресцентними властивостями, тобто здатністю випромінювати світло (у видимій області спектра) під дією ультрафіолетового випромінювання, мають багато біологічно-активні речовини: ліки, вітаміни, стероїди. Барвники, з'єднання із зв'язаними зв'язками, в тому числі поліядерні ароматичні вуглеводні, також можна визначати за допомогою флуоріметріческого удетектора, при цьому чутливість визначення велика.

Інтенсивність флуоресцентного випромінювання залежить від інтенсивності збуджуючого випромінювання та квантового виходу процесу збудження. Тому для підвищення чутливості методу слід використовувати досить потужні джерела світла, наприклад газорозрядні лампи або лазери. Застосування лазерів дозволяє детектувати кількість речовини на рівні 10 ^-12 р. Метод двухфотонного лазерного збудження віддає можливість використовувати лазер з нижчою енергією, наприклад, аргоновий. Для впровадження в практику такого методу необхідно мати достатньо широкий спектр лазерів, перебудовуються по довжинах хвиль. Чутливість детекторів по флуоресценції для деяких сполук виявляється на кілька порядків вище чутливості детекторів з поглинання, оскільки відлік вдається вести фактично від інтенсивності регістріpyeмогo випромінювання, близької до нуля, на яку не накладається збудливу випромінювання.

Розроблено детектори, які можуть одночасно працювати і як спектрофотометри і як флуориметр. Детектори з монохроматора, що дозволяють вибрати необхідні довжини хвиль для збудливого і флуоресцентного випромінювання, забезпечують високу чутливість і селективність, однак вони виявляються значно дорожчими, ніж флуориметр з постійною спектральної смугою. Одним з надійних флуориметр є детектор «Кратос».

Як причини зменшення чутливості детекторів слід вказати на поглинання випромінювання при високій концентрації речовини в комірці, а також втрату випромінювання за рахунок відбиття від віконець осередки. Тому при роботі з флуориметр слід використовувати досить розбавлені розчини, крім того, можливе застосування детекторів без віконець, наприклад з Не-Cd-лазером.

Деякі нефлуоресцірующіе з'єднання поділяють у вигляді похідних з флуорогеннимі речовинами. Похідні отримують до хроматографічного поділу або після, вводячи реагент в Т-подібне пристрій між колонкою і детектором. Аміни і феноли утворюють діазільние похідні при взаємодії з 5-диметил-аміно-1-нафтілсульфохлорідом до поділу, а амінокислоти після поділу обробляють флуорескаміном.

Флуориметр застосовують при аналізі мікродомішок, коли мала концентрація розчиненої речовини, що підлягає виявленню. Хоча динамічний діапазон флуориметр досить великий (10 ^4), його лінійний динамічний діапазон може бути обмежений для деяких розчинених речовин відносно вузьким інтервалом концентрацій (10-кратним). Для кількісного аналізу його слід перевіряти в цікавому інтервалі концентрацій.

Перед кількісним виміром необхідно переконатися у відсутність фонової флуоресценції, ефектів гасіння та перевірити відгук детектора на реальний зразок.

Кисневмісні розчинники гасять флуоресценцію, і їх так само як і елюента, що поглинають світло в області порушеної випромінювання, не можна застосовувати. Галогенсодержащие розчинники (хлороформ і метиленхлорид) повинні бути використані з обережністю, тому що мають тенденцію послаблювати флуоресценцію. Якщо в розчиннику немає флуоресціюючих речовин, флуориметр може працювати в градієнтному режимі. Флуориметр менше, ніж інші детектори, залежить від змін температури або тиску. Проте зменшення температури або збільшення в'язкості деяких розчинників ускладнює флуоресценцію.

1.4.5 Інші детектори

Крім детекторів, описаних вище, для ВЕРХ використовують і інші прилади: електрохімічний, інфрачервоний, детектор з діодним матрицею, мас-спектрометричний, транспортний з полум'яно-іонізаційним детектуванням, радіоактивний, за діелектричної проникності, електронозахватний, кулонометрический та ін Одні з них мають високу селективністю або чутливістю, інші дають важливу якісну інформацію. Розглянемо більш детально деякі з них.

Рис. 1.14. Електродна осередок електрохімічного детектора: 1 - вихід колонки, 2 - до електрода порівняння; 3 - фтороплатовая прокладка, 4 - робоча камера кювети, 5 - робочий електрод; 6 - блок осередки

Електрохімічний детектор. Цей детектор можна застосовувати для аналізу всіх речовин, що володіють електрохімічної активністю, тобто спосіб при певному потенціалі окислюватися або відновлюватися, відповідно віддаючи або приймаючи гектрони. У водних розчинах ці потенціали можуть бути від +1,2 до -0,8 В (електрод порівняння - хлорсеребряного).

Речовини, що містять фенольну, індольного або альдегідну групи, здатні окислюватися при низьких потенціалах (0,4-0,7 В), а речовини з нітро-або кетогруппу - відновлюватися. Так, важливі в біології класи речовин - катехоламіни і 5-гідроксііндоли - в цих умовах здатні окислюватися, віддаючи два електрони. При цьому і виникає струм в кюветі детектора, який потім посилюється амперометричних детектором.

Електродна осередок (кювету), схема якої представлена на малюнку 1.14, складається з двох блоків, розділених фторопластовою прокладкою з вирізом, що представляє собою робочу камеру. У центрі камери розташований тонкошаровий електрод (анод) з скловуглецю. Електрод порівняння розміщується на виході з осередку. Місткість робочої камери 1 мкл, що дозволяє працювати з микроколонки.

Електрохімічний детектор більш селективен при низьких потенціалах робочих електродів. Для 5-гідроксііндолов потрібен потенціал 0,5-0,55 В, для катехоламінів - 0.5-0,7 В, для пептидів - 0,9-1,2 В. Чутливість і специфічність електрохімічного детектора високі. За чутливості вони не поступаються кулонометрії-ного детекторам, хоча окислююча здатність тонкошарових електродів з робочою поверхнею 2-4 мм ² становить лише 1-10% від кількості аналізованої речовини. Нижня межа детектування катехоламінів і 5-гідроксііндолов становить від 5 до 20 пг введеного в колонку речовини. На рис. 8.15 приведена хроматограмма 5-гідроксііндолов з солянокислого екстракту 0,5 мл плазми крові.

При роботі з електрохімічним детектором необхідно враховувати наступне. Фонові шуми тим нижче, чим чистіше використовувані реактиви, тому фосфати потрібно очищати перекристалізацією, використовувати високочистих воду і розчинники марок «осч» або для ВЕРХ. Шліфувати поверхні робочого електрода слід у міру його забруднення та збільшення шумів не частіше 1 разу на місяць з наступним промиванням його 50%-ним метанолом. Обов'язковою є гарне дегазації розчинників, бажано продувкою гелієм.

Електрохімічний детектор знаходить застосування в аналізі катехоламінів, серотоніну, ацетилхоліну та їх метаболітів, нейропептидів, ряду лікарських препаратів. Його можна використовувати для аналізу фенолів, ароматичних амінів, тіоспіртов, аскорбінової кислоти, сечової кислоти та інших речовин в режимі окислення. У режимі відновлення їм можна детектувати хінони, нітросполуки, металоорганічні та інші coедіненія.

Існують інші типи комірок, крім вищеописаної, в тому числі з капає ртутним електродом, трубчастим електродом, багатоелектродного осередку та ін УФ-детектор з діодним матрицею. Як вже зазначалося вище, в УФ-детекторах широко поширених типів використовують проходження через кювети (як зразка, так і порівняльної) монохроматичного світла. В УФ-детекторі з фільтрами таке світло з лінійного спектра випускання ртутної лампи вирізається фільтром, а в спектрофотометрі - вирізається з широкого спектру випускання дейтерієвої лампи з використанням дифракційної решітки. Тільки в скануючому спектрофотометрі (наприклад, з «стрибаючою» дзеркалом, використовуваним в «Міліхроме») кювета висвітлюється послідовно декількома монохроматичними променями світла. Останнім часом з'явилося дуже витончене рішення, що дозволяє отримувати безперервно інформацію про повне УФ-спектрі речовин, що проходять через кювету. У цьому випадку через кювету проходить поліхроматичних світло, тобто весь безперервний спектр випускання дейтерієвої лампи, який після кювети потрапляє на дифракційну решітку, де ділиться на монохроматичні пучки, кожен з яких потрапляє далі на свою фотоячейку (фотодіод), розташовані в ряд або лінійку. Звідси назва - детектор з діодним матрицею або діодним лінійкою. З кожної такої комірки можна в будь-який момент отримати інформацію про те, як речовина, що проходить через кювету, поглинає світло при даній довжині хвилі. Існують діодні лінійки з різним числом діодів: 8, 32, 64 і більше.

Якщо вивести інформацію з кожного діода на самописець, то він запише стільки хроматограм, скільки є діодів, кожну при своїй довжині хвилі. Кожна така хроматограмма може бути розглянута, розрахована, досліджена в сукупності з іншою або іншими із залученням математичних методів з метою знаходження домішок в піках, домішок, які не детектируются при використанні якоїсь однієї довжини хвилі. Якщо такий детектор підключити до багатоканального комп'ютера, він може вести обрахунок хроматограм, наприклад, при 8 довжинах хвиль. Якщо використовують достатнє число діодів, може бути в будь-який момент записаний повний УФ-спектр речовини в кюветі.

Рис. 1.15. Хроматограмма 5-гідроксііндолов з солянокислого екстракту 0,5 мл плазми крові, отримана на колонці розміром 200х3, 2 мм з нуклеосілом С18 (5 мкм), рухома фаза - 0,1 М нітратно-фосфатний буферний розчин з 12% метанолу і 0,5 мМ октілсульфата, рН == 4,6, витрата 0,8 мл / хв, потенціал +0,5 В, проба 50 мкл: 1 - 5-оксітріптофан; 2 - 5-оксііндоліл-З-оцтова кислота, 3 - N- метілдопамін (стандарт), 4 - серотонін

Взагалі можна вважати, що детектор з діодним матрицею-це детектор, найбільш наближається до універсального детектору для дослідницької роботи. Він дозволяє, знявши тільки одну хроматограму, отримати дуже великий обсяг інформації не тільки кількісної, але і якісною. Такі детектори випускаються в даний час вже декількома фірмами, і з'являються роботи з їх використання, особливо там, де об'єкти дослідження досить складні, а обсяги проб дуже обмежені. Хоча вартість таких детекторів з повним набором необхідного обслуговуючого обладнання (досить потужних комп'ютерів, багатоканальних інтеграторів, графобудівники, дисководів з дисками і т.д.) досить висока, однак можна очікувати щодо швидкого зниження їх ціни в майбутньому та розширення застосування в різних областях.

ІЧ-детектори. Детектори, засновані на поглинанні в інфрачервоній області спектра, в ВЕРХ застосовують порівняно недавно і достатньою мірою обмежено. Головною причиною такого становища є несумісність ІЧ-детектора з основними розчинниками, застосовуваними в адсорбційної і звернення-фазною хроматографії, а також порівняно невисока чутливість. Практично для детектування можна використовувати тільки деякі смуги з найбільш високими молярного коефіцієнта поглинання, а в якості рухомої фази - головним чином хлоровані вуглеводні. В окремих випадках, наприклад при детектуванні з поглинання карбонільної групи або подвійного зв'язку, для роботи придатні дуже багато розчинники в широкому діапазоні полярності - від гексану до ацетонітрилу і метанолу.

Рис. 1.16. ММР (1, 2) та розподіл за складом (1 ', 2') кополімерів піперілена з метилметакрилатом (ММА); тривалість сополимеризации: 1 ч (1, 1 '). 18 год (2, 2 ')

Незважаючи на ці недоліки, цей детектор має безперечні переваги. По-перше, він є одночасно універсальним і селективним: при детектуванні з поглинання С-Н-зв'язку він виявляє практично будь-які органічні речовини, а з поглинання функціональних груп (наприклад, ОН, С = О, С = С і т.д.) - тільки сполуки, що містять такі групи. По-друге, сигнал детектора майже не залежить від молекулярної маси речовини, що істотно полегшує кількісну інтерпретацію результатів. По-третє, він може працювати при температурах до 150 ° С. Всі ці особливості обумовлюють цінність ІЧ-детектора для ексклюзіонной хроматографії синтетичних полімерів.

При дослідженні кополімерів ІЧ-детектор дозволяє отримати унікальну інформацію про композиційної неоднорідності, яку часто не можна отримати ніякими іншими методами. На рис. 1.16 наведено результати дослідження двох зразків кополімерів піперілена з метилметакрилатом. Композиційну неоднорідність оцінювали за співвідношенням відповідних висот на двох хроматограмах, записаних ІЧ-детектором Міран-1A з поглинання груп С-Н (А, = 3,43 мкм) і С = 0 (^ = 5,75 мкм). Перша Хроматограмма відображала загальне ММР сополімеру, а друга - розподіл метилметакрилату в межах цього ММР. Хроматограми знімали на складовою колонці розміром 2 (300Х7, 8 мм) з ц-сферогелем (10 ³ А +10 ⁵ А) при 40 ° С і швидкості потоку тетрагідрофурану 1 мл / хв. Дані рис. 8.16 наочно показують зміну диференціальних кривих ММР, складу і композиційної неоднорідності на початковій і кінцевій стадіях реакції, які обумовлені різною реакційною здатністю сомономером. Чутливість ІЧ-детектора в оптимальних умовах досягає 10 ^-6 -5.10 ^-7 г / мл, тобто порівнянна з чутливістю рефрактометра. В останні роки ведуться інтенсивні дослідження з використання в якості детекторів ІЧ-спектрофотометрів з перетворенням Фур'є, що дозволить підвищити їх чутливість приблизно на порядок.

Література:

Fitzpatrick FA, Wanalda MA, Kaiser D. G. Anal. chem, 1977, v. 49, p. 1032.
Dunlap KL, Sandridge RL, Keller. Anal. Chem, 1976, v. 48, p. 297.
Poole CF, EAJ High Resol. Chromatogr. Commun., 1978, v. 1, p. 83.
Denkert MEAJ Chromatogr, 1981, v. 218, p. 31-43.
Bartha AEAJ Chromatogr, 1984, v. 303, p. 29-38.
Gloor R., Johnson EL. Chromatogr. Sci, 1977, v. 15, p. 413 - 423.
Kraak JC, Jonker KM, Huber JFKJ Chromatogr, 1977, v. 142, p. 671 - 680.
Wehli AEAJ Chromatogr, 1979, v. 149, p. 199-210.
Даванков В.Л. Журн. ВХО ім. Менделєєва, 1983, т. XXVIII, № 1, с. 25-29.
Даванков В.А. в кн. Прикладна хроматографія Під ред. К. І. Сакодинского. М, Наука, 1984, с. 24-32.
Davankov VA, Kurganov AA, Bochkov ASfln Advances in Chroma-tographyed. JC Giddings EAN Y, M. Dekker, 1983, v. 22, p. 139 - 185.
Apffel JA, Alfredson TV, Major RE / J. Chromatogr, 1981, v. 206, p. 43-57.