Реферат на тему:
Використання афінної хроматографії
Є безліч способів хімічної активації як самих матриць, так і віддалених від матриці решт спейсерів. Така активація необхідна для забезпечення простоти "посадки" на них ліганда (в умовах біохімічної лабораторії).
Тут недоцільно розглядати все це безліч способів, тим більше, що більшість з них потребує більш серйозного знання органічної хімії, ніж дає середня школа. (Що цікавиться і краще підготовленим читачам я можу рекомендувати свою книгу "Хроматографія білків і нуклеїнових кислот" ("Наука", 1985)).
Тим не менш, для ілюстрації підходу до проблеми опишу в загальних рисах один простий і раніше інших запропонований варіант (втім, використовуваний до сих пір).
У ньому активація полисахаридной матриці, що несе на собі безліч вільних ОН-груп, проводиться шляхом обробки її бромцианом (BrCN). У результаті отримують (у сильно лужному середовищі) міцно сидять на нитках сефарози хімічно активні групи імідокарбоната, відповідно до реакції. Ці електрофільні групи "охоче" утворюють ковалентні зв'язки з нуклеофільними групами ліганда.
Так наприклад, ліганд, що має вільну аміногрупу, може зв'язатися з активовано таким чином матрицею через залишок ізомочевіни.
Можливі ще два варіанти протікання цієї реакції (з виділенням аміаку), але обидва вони призводять до того ж кінцевому результату: ліганд (або спейсер з аминогруппой на кінці) хімічно міцно пов'язується з матрицею.
Безумовним недоліком описаного методу активації матриці слід назвати отруйність бромціана і токсичність деяких побічних продуктів реакції (у тому числі і НВг), що містяться в промивних водах після активації сефарози.
Як спейсерів зазвичай використовують або 1,6 діаміногексан,, або 6-амінокапронову кислоту. Таким чином на вільному кінці спейсера виявляється аміногрупа або карбоксил. Приєднання до нього ліганда також потребує спеціальної хімічної реакції.
Тому фірма "Pharmacia" випускає готові матриці, в яких спейсер (6-амінокапронова кислота) активований етерифікацією кінцевого карбоксилу N-оксісукцінімідом.
Приєднання ліганда по аміногрупи відбувається в м'яких умовах, протягом однієї години, що дуже важливо для лабільних лігандів. N-оксісукцінімід відщеплюється і на його місце надійної пептидного зв'язком приєднується ліганд.
Використання з метою очищення афінної пари фермент-субстрат передбачає такі умови хроматографічного процесу, коли фермент не може здійснити каталітичний акт перетворення субстрату, а тільки зв'язується з ним в фермент-субстратної комплекс. (Наприклад у відсутність необхідного другого субстрату, відповідних іонів або при несприятливому значенні рН).
З іншого боку, важливий розділ біохімії, особливо в прикладному аспекті, становить конструювання обмінників із закріпленими ферментами, на цей раз провідними каталіз в умовах, коли його продукти легко відділяються від ферментів.
Ці продукти випливають з колонки або залишаються в супернатанті після проведення ферментативної реакції в обсязі суспензії, з якої матриця із закріпленим на ній ферментом потім віддаляється в осад.
Природно, що в цих випадках в оточенні іммобілізованого ферменту створюються умови не тільки зв'язування субстрату, але і каталізу відповідної реакції.
Очевидна перевага ферментів, закріплених на хроматографічної матриці, полягає в простій можливості багаторазового використання цих ферментів, оскільки вони автоматично звільняються з суміші з продуктами реакції.
Так само, як ферменти, білки-рецептори можуть служити лігандами для зв'язування та очищення гормонів та інших низькомолекулярних ефекторів. Транспортні білки плазми крові і білки - переносники клітинних мембран - для очищення своїх низькомолекулярних партнерів.
Білки - регулятори і учасники процесів матричного синтезу, використовувані як лігандів, дозволяють вирішувати завдання по вичлененню регуляторних та інших особливих ділянок нуклеїнових кислот. Те ж відноситься до систем вироблення і транспорту енергії.
Зрозуміло, всі учасники названих тут біоспеціфіческіх пар можуть мінятися ролями - ті, що були іммобілізовані, можуть стати об'єктом афінної очистки. Вельми продуктивним виявилося і створення імуносорбент, що мають спорідненість до певних антигенів.
Ліганди з груповою специфічністю володіють спорідненістю до цілої групи речовин. Наприклад, "кофермент А" бере участь у багатьох ферментативних реакціях. Закріплений на афінної матриці, він може забезпечувати очищення будь-якого з відповідних ферментів. У тих випадках, коли у вихідному препараті є тільки один з них, очищення буде не гірше, ніж при використанні лігандів з індивідуальною специфічністю. Іноді групова специфічність деяких досвідченим шляхом відібраних лігандів не має навіть чіткого пояснення цієї їхньої здатності.
Наприклад, кислий амінополісахарид гепарин (М> 10 000) відомий як антикоагулянту крові. Але крім того він знайшов застосування в біохімії як конкурентний інгібітор рибонуклеази. Це його якість, мабуть, відображає певну схожість полімеру з РНК.
Тому гепарин може бути використаний як ліганда для ряду білків, що взаємодіють з нуклеїновими кислотами: полімераз, растріктаз, зворотної транскриптази, факторів ініціації білкового синтезу та інших.
В якості лігандів можуть виступати і самі нуклеїнові кислоти. Є способи хімічного закріплення їх на активованих матрицях.
Але частіше ДНК і РНК, використовуючи їх Стек гілок структуру, закріплюють на матрицях нековалентно: або заплавляются в 4%-ную агарози у її затвердіння з розплавленого стану, або "заплутують" між нитками набряклої у воді целюлози - при її висиханні.
На відібраних шляхом клонування і закріплених у афінної матриці фрагментах ДНК, що містять певний ген, можна затримувати і очищати відповідну цього гену іРНК.
Синтезовану в лабораторних умовах поліуріділовую кислоту (полі У) довжиною до сотні мономерів уридину можна ковалентно фіксувати на BrCN-активованої сефароза.
Потім, завдяки наявності у більшості іРНК вищих організмів більш-менш довгого поліаденілового "хвоста", виділяти сумарну фракцію іРНК з суміші з усіма іншими РНК клітинного лізата. Щодо короткі ланцюжки (10-20 нуклеотидів) оліго-дезоксітіміділовой кислоти (оліго ДТ) закріплюють через кінцевий 5'-фосфат на матриці волокнистої целюлози.
На такому ліганда можна так само, як у попередньому випадку, через хвостову полі А закріпити певну іРНК. Потім за допомогою зворотної транскриптази, для якої оліго ДП буде служити праймером, синтезувати з цієї іРНК двунітевих до ДНК, яка в цьому випадку залишається пов'язаної з матрицею і сама може виступати в якості ліганда.
На цьому обмежимо перелік можливих лігандів, далеко не вичерпавши їх список, і на закінчення короткого нарису афінної хроматографії розглянемо три простих прикладу: два з індивідуальною специфічністю і один - з груповою.
На BrCN-активовану сефароза 4В садили білковий інгібітор карбоксипептидази А, виділений з картоплі. Фракцію гомогенату м'язи, екстрагованих між 0,4 М КС1 і 2М NaCI в нейтральному буфері, додатково очищали осадженням сульфатом амонію і саджали на афінних колонку з інгібітором, врівноважену тим же 2М NaCI в нейтральному буфері, потім промивали таким же розчином. Елюція ферменту вели теж 2М NaCI, але в 0,01 М Na2CO3 при рН 11,2.
Відрив ферменту від інгібітора відбувався за рахунок сильного защелачивания елюента. Домішкові білки виходили при промиванні, а фермент елюіровался гострим піком після зміни буфера
Ефективність очищення на цьому етапі можна оцінити зіставляючи площі під двома піками, позначеними пунктиром.
Однак для того, щоб уявити собі з чим ми будемо мати справу, необхідно, хоча б поверхово, познайомитися з механізмом вироблення імунітету, а також зі специфічними клітинами крові і молекулами його реалізують.
Широко поширене поняття імунітету до недавнього часу обмежувалося поданням про те, що мова йде про систему, що забезпечує тривалу невразливість людини для збудників хвороб, якими він якось перехворів хоча б в самій легкій формі (щеплення). Це теж вірно.
Але не було у нас імунної системи, то смертність від самих "дріб'язкових" на сьогоднішній погляд хвороб була б жахливою. Людство це по-справжньому зрозуміло, коли зіткнулося з вірусом СНІД, який атакує саме імунну систему.
У наш організм з повітря і їжі щодня проникають мільйони хвороботворних мікробів і вірусів. Їх усіх зустрічає не знає ні сну, ні відпочинку "військо" імунного захисту. Так що це за військо?
Люди, трохи знайомі з питанням, говорять, що імунна система виробляє якісь "антитіла", які чи то вбивають вторглися мікроорганізми, чи то обліплюють їх, знешкоджують і разом із собою виводять з організму.
Все це не зовсім так. "Зайд" знищують спеціальні великі клітини - фагоцити. "Дізнавшись" чужорідну клітку або вірус, вони буквально "заковтують" їх. Зовнішня мембрана фагоцита утворює поглиблення, на зразок мішечка, яке огортає "чужинця". Потім горловина мішечка змикається, оболонка фагоцита відновлюється і "ворог" виявляється в його цитоплазмі. Тут він піддається атаці різноманітних літичних ферментів, що руйнують спочатку оболонку, а потім і серцевину підступні жертви.
У крові фагоцити називають гранулоцитами. Вони входять до складу білих кров'яних клітин - лейкоцитів "Фагоцити, які осідають в тканинах тіла, іменуються макрофагами, В обох випадках фагоцит повинен в першу чергу" дізнатися "чужинця. Ось тут-то роль розвідників і" навідників "виконують особливого роду білкові молекули, іменовані антитілами "Звідки вони беруться і як дізнаються" противника "?
Взагалі-то кажучи, його в першу чергу "дізнаються" (за допомогою антитіл) інші білі кров'яні клітини - лімфоцити. Це - досить дрібні клітини. До моменту своєї зустрічі з інфекцією лімфоцити не діляться і можуть циркулювати в крові місяці й роки. Великі скупчення лімфоцитів знаходяться в лімфатичних вузлах і особливо в селезінці, через яку проходить уся кров.
Зустрівшись з інфікують або просто стороннім агентом, що опинилися в крові (їх об'єднують загальним терміном антигени) і "дізнавшись" його, лімфоцити перетворюються. Прискорюються процеси метаболізму, збільшуються розміри, відновлюється синтез ДНК. Потім слід поділ. В умовах гострих інфекцій один лімфоцит дає сотні тисяч клітин-нащадків і всі вони зберігають здатність "впізнавати" той же самий антиген. Частина цих нащадків так і залишаться в крові, формуючи імунітет ("імунологічну пам'ять").
Число "розвідників", які отримали прикмети цього антигену, таким чином різко зростає. Наступного разу, коли він потрапить у кров, то не встигне розмножитися, як буде розпізнано. Але що ж далі? Як лімфоцити повідомляють про небезпеку фагоцитами? І як, все-таки, вони самі "дізнаються" антигени?
Тільки частина активованих первинної зустріччю з антигеном лімфоцитів розмножується для створення імунітету. Інша їх частина зазнає іншу метаморфозу. Збільшується об'єм цитоплазми, ядро відтісняється у бік, розростається ретикулярна система. У рибосомах починається інтенсивний синтез особливих білків - тих самих "навідників", яких ми вище назвали антитілами.
Через апарат Гольджі вони викидаються назовні. Минуле цю метаморфозу лімфоцити, яких тепер називають плазмацітамі секретують до двох тисяч антитіл в секунду. Частина їх надходить прямо в кров, а частина залишається у лімфатичних вузлах, де осідають плазмаціти. Всі антитіла, що синтезуються в нащадках першого дозорного лімфоцита зберігають здатність впізнавання того антигену, зустріч з яким стимулювала весь ланцюг трансформацій.
Ну а перший лімфоцит, як він "дізнався" антиген? Та за допомогою тих же антитіл, які в кількості приблизно ста тисяч покривали його поверхню. Виходить замкнуте коло. Виходить справа, що узнающие даний антиген антитіла існували ще до його появи. Його чекали! Для того, щоб "дізнатися" саме його і його нащадків (якщо він здатний розмножуватися), припасти до їх поверхнях і тим самим позначити як цілі для атаки фагоцитів.
Але звідки взялася первісна інформація про структуру ще не з'явився в організмі антигену? Більшість учених вважає, що все величезне безліч варіантів такої інформації, - закладені початково, спадковим шляхом у такому ж безлічі початкових лімфоцитів, можливо, як результат відповідних "знайомств" у попередніх поколіннях тварини або людини. (Деякі вчені, навпаки, вважають, що всі імунні відповіді формуються протягом життя людини під впливом вторгаються антигенів.
Вони підкреслюють, що в перші місяці життя новонародженого, у нього імунна система ще не працює)
Спробуємо оцінити першу версію, оперуючи деякими цифрами. Задамося спершу питанням: що ж "дізнаються" антитіла на поверхні антигену.
Зважаючи можливого розмаїття природи і походження антигенів, швидше за все якусь просторову конфігурацію, яка може будуватися з будь-якого матеріалу: з декількох молекул амінокислот, ліпідів, Сахаров, нуклеотидів і навіть з органічних молекул не тваринного походження. Але ця конфігурація, зважаючи на вибірковості зв'язування антитіла з антигеном, повинна бути непростим.
Разом з тим, число помітно різняться просторових комбінацій органічних молекул не безмежне, тому що природа хімічних зв'язків між молекулами накладає свої обмеження. Припустимо, що це число для всіх можливих природних (бактерії, віруси, білки, нуклеїнові кислоти, тощо) і штучних антигенів має величину порядку десятка мільйонів (~ 10 7). Відомо, що кількість лімфоцитів, які містяться в організмі людини ~ 10 12.
Це означає, що число "розвідників", спочатку мають "прикметами" кожного можливого антигену ~ 10 5. Це не так вже й багато у порівнянні із загальним числом лімфоцитів. Якщо "інтервент" залишається одинаком, то ймовірність зустрічі зі "своїм розвідником" у нього мізерно мала. Але тоді від нього і ніякого відчутного шкоди бути не може.
Однак, як це завжди буває, якщо в організм проникають одночасно багато тисяч однакових антигенів, то ймовірність зустрічі відповідно зростає. Особливо, якщо ці антигени суть хвороботворні мікроорганізми, які починають у ньому швидко розмножуватися.
Тут уже ситуація змінюється радикально, і незабаром "фатальна зустріч" стає неминучою. Негайно починається масова напрацювання антитіл потрібної специфічності. Їх розмноження вступає в конкурентну боротьбу з розмноженням "прибульців".
Якщо антитіла швидко виграють цю гонку, то зуміють помітити собою всю "армію вторгнення" і всі її солдати будуть знищені фагоцитами обох типів перш, ніж з'являться явні ознаки захворювання. Такі явища відбуваються в нашому організмі повсякденно. Очевидно, що для фагоцитів байдужа природа антигену.
Вони "впізнають" лише факт наявності на його поверхні антитіл будь специфічності. (Принагідно зауважимо, що в разі вторгнення більш великих антигенів, ніж фагоцити, для знищення "ворога" мобілізуються зовсім інші засоби - серія білків, так званого комплементу, втім, що направляється тим же антитілом. Ми ці кошти розглядати не будемо - в біохімічних методів дослідження вони застосування не знайшли)
Якщо ж розмноження бактерій або вірусів випереджає напрацювання специфічних антитіл, то хвороба розвивається. У боротьбу вступають інші засоби захисту, наприклад, підвищення температури тіла, яке гальмує це розмноження ... Нарешті, на допомогу організму залучаються ліки або лікарські трави, які тварини вміють знаходити.
У разі повторного вторгнення патогенних мікроорганізмів, їх вже чекає багатомільйонна армія специфічних антитіл і лімфоцитів, створена імунітетом. Початкові умови для описаної вище "гонки розмножень" виявляються явно на користь захисників організму ...
Підраховано, що в крові людини вільно циркулюють і постійно оновлюються близько 19 жовтня антітел.10 12 лімфоцитів несуть на собі 17 жовтня антитіл. Значить в 100 разів більша їх кількість знаходиться "у вільному пошуку" супротивника. Значна їх частина - носії імунітету.
У відповідь на введення в кров піддослідного тварини (зазвичай кролика) якогось антигену, наприклад, чужорідного білка (ця дія іменується імунізацією кролика), в його організмі, протягом певного часу будуть вироблятися у великій кількості специфічні антитіла, здатні "дізнаватися" тільки цей білок .
І ми тепер знаємо, що "впізнавання" означає міцний зв'язок цих антитіл з молекулами відповідного антигену і тільки з ними одними. Всі інші антитіла різноманітної специфічності, що містяться в так званій імунної антисироватки тварини, наш білок не зможуть "помітити". Точно так само, як антитіла, вироблені у відповідь на імунізацію кролика певним білком-антигеном, ні з якими іншими білками зв'язатися не можуть.
2. Долгов В.В. Морфо-функціональна характеристика ендотелію судинної стінки в нормі і при атеросклерозі. Автореф. Док. дис. - М. - 1985.
3. Долгушин І.І., Зурочка А.В., Чукічев А.В., Колесніков А.Л. Роль нейтрофілів у регуляції імунної реактивності і репаративних реакцій пошкодження тканини. / / Вісник Росс. Акад. мед. наук. - 2000. N 2. - C. - 14-19.
Використання афінної хроматографії
Активовані матриці і спейсери
Твердим підставою для афінної матриці найчастіше служать добре відомі нам 4% або 6% сефароза, іноді хімічно скріплена (CL-сефароза), а в деяких спеціальних випадках (див. нижче) і целюлоза.Є безліч способів хімічної активації як самих матриць, так і віддалених від матриці решт спейсерів. Така активація необхідна для забезпечення простоти "посадки" на них ліганда (в умовах біохімічної лабораторії).
Тут недоцільно розглядати все це безліч способів, тим більше, що більшість з них потребує більш серйозного знання органічної хімії, ніж дає середня школа. (Що цікавиться і краще підготовленим читачам я можу рекомендувати свою книгу "Хроматографія білків і нуклеїнових кислот" ("Наука", 1985)).
Тим не менш, для ілюстрації підходу до проблеми опишу в загальних рисах один простий і раніше інших запропонований варіант (втім, використовуваний до сих пір).
У ньому активація полисахаридной матриці, що несе на собі безліч вільних ОН-груп, проводиться шляхом обробки її бромцианом (BrCN). У результаті отримують (у сильно лужному середовищі) міцно сидять на нитках сефарози хімічно активні групи імідокарбоната, відповідно до реакції. Ці електрофільні групи "охоче" утворюють ковалентні зв'язки з нуклеофільними групами ліганда.
Так наприклад, ліганд, що має вільну аміногрупу, може зв'язатися з активовано таким чином матрицею через залишок ізомочевіни.
Можливі ще два варіанти протікання цієї реакції (з виділенням аміаку), але обидва вони призводять до того ж кінцевому результату: ліганд (або спейсер з аминогруппой на кінці) хімічно міцно пов'язується з матрицею.
Безумовним недоліком описаного методу активації матриці слід назвати отруйність бромціана і токсичність деяких побічних продуктів реакції (у тому числі і НВг), що містяться в промивних водах після активації сефарози.
Як спейсерів зазвичай використовують або 1,6 діаміногексан,, або 6-амінокапронову кислоту. Таким чином на вільному кінці спейсера виявляється аміногрупа або карбоксил. Приєднання до нього ліганда також потребує спеціальної хімічної реакції.
Тому фірма "Pharmacia" випускає готові матриці, в яких спейсер (6-амінокапронова кислота) активований етерифікацією кінцевого карбоксилу N-оксісукцінімідом.
Приєднання ліганда по аміногрупи відбувається в м'яких умовах, протягом однієї години, що дуже важливо для лабільних лігандів. N-оксісукцінімід відщеплюється і на його місце надійної пептидного зв'язком приєднується ліганд.
Ліганди
Безліч лігандів, описаних у науковій літературі, можна розбити на дві головні категорії. Це ліганди з індивідуальною специфічністю і ліганди з груповою специфічністю, Як індивідуальних лігандів можуть виступати ферменти, а також субстрати або інгібітори відповідних ферментативних реакцій (для очищення ферментів).Використання з метою очищення афінної пари фермент-субстрат передбачає такі умови хроматографічного процесу, коли фермент не може здійснити каталітичний акт перетворення субстрату, а тільки зв'язується з ним в фермент-субстратної комплекс. (Наприклад у відсутність необхідного другого субстрату, відповідних іонів або при несприятливому значенні рН).
З іншого боку, важливий розділ біохімії, особливо в прикладному аспекті, становить конструювання обмінників із закріпленими ферментами, на цей раз провідними каталіз в умовах, коли його продукти легко відділяються від ферментів.
Ці продукти випливають з колонки або залишаються в супернатанті після проведення ферментативної реакції в обсязі суспензії, з якої матриця із закріпленим на ній ферментом потім віддаляється в осад.
Природно, що в цих випадках в оточенні іммобілізованого ферменту створюються умови не тільки зв'язування субстрату, але і каталізу відповідної реакції.
Очевидна перевага ферментів, закріплених на хроматографічної матриці, полягає в простій можливості багаторазового використання цих ферментів, оскільки вони автоматично звільняються з суміші з продуктами реакції.
Так само, як ферменти, білки-рецептори можуть служити лігандами для зв'язування та очищення гормонів та інших низькомолекулярних ефекторів. Транспортні білки плазми крові і білки - переносники клітинних мембран - для очищення своїх низькомолекулярних партнерів.
Білки - регулятори і учасники процесів матричного синтезу, використовувані як лігандів, дозволяють вирішувати завдання по вичлененню регуляторних та інших особливих ділянок нуклеїнових кислот. Те ж відноситься до систем вироблення і транспорту енергії.
Зрозуміло, всі учасники названих тут біоспеціфіческіх пар можуть мінятися ролями - ті, що були іммобілізовані, можуть стати об'єктом афінної очистки. Вельми продуктивним виявилося і створення імуносорбент, що мають спорідненість до певних антигенів.
Ліганди з груповою специфічністю володіють спорідненістю до цілої групи речовин. Наприклад, "кофермент А" бере участь у багатьох ферментативних реакціях. Закріплений на афінної матриці, він може забезпечувати очищення будь-якого з відповідних ферментів. У тих випадках, коли у вихідному препараті є тільки один з них, очищення буде не гірше, ніж при використанні лігандів з індивідуальною специфічністю. Іноді групова специфічність деяких досвідченим шляхом відібраних лігандів не має навіть чіткого пояснення цієї їхньої здатності.
Наприклад, кислий амінополісахарид гепарин (М> 10 000) відомий як антикоагулянту крові. Але крім того він знайшов застосування в біохімії як конкурентний інгібітор рибонуклеази. Це його якість, мабуть, відображає певну схожість полімеру з РНК.
Тому гепарин може бути використаний як ліганда для ряду білків, що взаємодіють з нуклеїновими кислотами: полімераз, растріктаз, зворотної транскриптази, факторів ініціації білкового синтезу та інших.
В якості лігандів можуть виступати і самі нуклеїнові кислоти. Є способи хімічного закріплення їх на активованих матрицях.
Але частіше ДНК і РНК, використовуючи їх Стек гілок структуру, закріплюють на матрицях нековалентно: або заплавляются в 4%-ную агарози у її затвердіння з розплавленого стану, або "заплутують" між нитками набряклої у воді целюлози - при її висиханні.
На відібраних шляхом клонування і закріплених у афінної матриці фрагментах ДНК, що містять певний ген, можна затримувати і очищати відповідну цього гену іРНК.
Синтезовану в лабораторних умовах поліуріділовую кислоту (полі У) довжиною до сотні мономерів уридину можна ковалентно фіксувати на BrCN-активованої сефароза.
Потім, завдяки наявності у більшості іРНК вищих організмів більш-менш довгого поліаденілового "хвоста", виділяти сумарну фракцію іРНК з суміші з усіма іншими РНК клітинного лізата. Щодо короткі ланцюжки (10-20 нуклеотидів) оліго-дезоксітіміділовой кислоти (оліго ДТ) закріплюють через кінцевий 5'-фосфат на матриці волокнистої целюлози.
На такому ліганда можна так само, як у попередньому випадку, через хвостову полі А закріпити певну іРНК. Потім за допомогою зворотної транскриптази, для якої оліго ДП буде служити праймером, синтезувати з цієї іРНК двунітевих до ДНК, яка в цьому випадку залишається пов'язаної з матрицею і сама може виступати в якості ліганда.
На цьому обмежимо перелік можливих лігандів, далеко не вичерпавши їх список, і на закінчення короткого нарису афінної хроматографії розглянемо три простих прикладу: два з індивідуальною специфічністю і один - з груповою.
Деякі приклади використання афінної хроматографії
Приклад 1. Очищення ферменту карбоксипептидази А з м'яза щури (Bodwell, Meyer, 1981).На BrCN-активовану сефароза 4В садили білковий інгібітор карбоксипептидази А, виділений з картоплі. Фракцію гомогенату м'язи, екстрагованих між 0,4 М КС1 і 2М NaCI в нейтральному буфері, додатково очищали осадженням сульфатом амонію і саджали на афінних колонку з інгібітором, врівноважену тим же 2М NaCI в нейтральному буфері, потім промивали таким же розчином. Елюція ферменту вели теж 2М NaCI, але в 0,01 М Na2CO3 при рН 11,2.
Відрив ферменту від інгібітора відбувався за рахунок сильного защелачивания елюента. Домішкові білки виходили при промиванні, а фермент елюіровался гострим піком після зміни буфера
Ефективність очищення на цьому етапі можна оцінити зіставляючи площі під двома піками, позначеними пунктиром.
Імунна система
Звичайно ж, ми не будемо намагатися глибоко проникнути в велику область медичної імунології. Торкнемося лише тих можливостей, які використання иммунохимического підходу надає для дослідження біополімерів.Однак для того, щоб уявити собі з чим ми будемо мати справу, необхідно, хоча б поверхово, познайомитися з механізмом вироблення імунітету, а також зі специфічними клітинами крові і молекулами його реалізують.
Широко поширене поняття імунітету до недавнього часу обмежувалося поданням про те, що мова йде про систему, що забезпечує тривалу невразливість людини для збудників хвороб, якими він якось перехворів хоча б в самій легкій формі (щеплення). Це теж вірно.
Але не було у нас імунної системи, то смертність від самих "дріб'язкових" на сьогоднішній погляд хвороб була б жахливою. Людство це по-справжньому зрозуміло, коли зіткнулося з вірусом СНІД, який атакує саме імунну систему.
У наш організм з повітря і їжі щодня проникають мільйони хвороботворних мікробів і вірусів. Їх усіх зустрічає не знає ні сну, ні відпочинку "військо" імунного захисту. Так що це за військо?
Люди, трохи знайомі з питанням, говорять, що імунна система виробляє якісь "антитіла", які чи то вбивають вторглися мікроорганізми, чи то обліплюють їх, знешкоджують і разом із собою виводять з організму.
Все це не зовсім так. "Зайд" знищують спеціальні великі клітини - фагоцити. "Дізнавшись" чужорідну клітку або вірус, вони буквально "заковтують" їх. Зовнішня мембрана фагоцита утворює поглиблення, на зразок мішечка, яке огортає "чужинця". Потім горловина мішечка змикається, оболонка фагоцита відновлюється і "ворог" виявляється в його цитоплазмі. Тут він піддається атаці різноманітних літичних ферментів, що руйнують спочатку оболонку, а потім і серцевину підступні жертви.
У крові фагоцити називають гранулоцитами. Вони входять до складу білих кров'яних клітин - лейкоцитів "Фагоцити, які осідають в тканинах тіла, іменуються макрофагами, В обох випадках фагоцит повинен в першу чергу" дізнатися "чужинця. Ось тут-то роль розвідників і" навідників "виконують особливого роду білкові молекули, іменовані антитілами "Звідки вони беруться і як дізнаються" противника "?
Взагалі-то кажучи, його в першу чергу "дізнаються" (за допомогою антитіл) інші білі кров'яні клітини - лімфоцити. Це - досить дрібні клітини. До моменту своєї зустрічі з інфекцією лімфоцити не діляться і можуть циркулювати в крові місяці й роки. Великі скупчення лімфоцитів знаходяться в лімфатичних вузлах і особливо в селезінці, через яку проходить уся кров.
Зустрівшись з інфікують або просто стороннім агентом, що опинилися в крові (їх об'єднують загальним терміном антигени) і "дізнавшись" його, лімфоцити перетворюються. Прискорюються процеси метаболізму, збільшуються розміри, відновлюється синтез ДНК. Потім слід поділ. В умовах гострих інфекцій один лімфоцит дає сотні тисяч клітин-нащадків і всі вони зберігають здатність "впізнавати" той же самий антиген. Частина цих нащадків так і залишаться в крові, формуючи імунітет ("імунологічну пам'ять").
Число "розвідників", які отримали прикмети цього антигену, таким чином різко зростає. Наступного разу, коли він потрапить у кров, то не встигне розмножитися, як буде розпізнано. Але що ж далі? Як лімфоцити повідомляють про небезпеку фагоцитами? І як, все-таки, вони самі "дізнаються" антигени?
Тільки частина активованих первинної зустріччю з антигеном лімфоцитів розмножується для створення імунітету. Інша їх частина зазнає іншу метаморфозу. Збільшується об'єм цитоплазми, ядро відтісняється у бік, розростається ретикулярна система. У рибосомах починається інтенсивний синтез особливих білків - тих самих "навідників", яких ми вище назвали антитілами.
Через апарат Гольджі вони викидаються назовні. Минуле цю метаморфозу лімфоцити, яких тепер називають плазмацітамі секретують до двох тисяч антитіл в секунду. Частина їх надходить прямо в кров, а частина залишається у лімфатичних вузлах, де осідають плазмаціти. Всі антитіла, що синтезуються в нащадках першого дозорного лімфоцита зберігають здатність впізнавання того антигену, зустріч з яким стимулювала весь ланцюг трансформацій.
Ну а перший лімфоцит, як він "дізнався" антиген? Та за допомогою тих же антитіл, які в кількості приблизно ста тисяч покривали його поверхню. Виходить замкнуте коло. Виходить справа, що узнающие даний антиген антитіла існували ще до його появи. Його чекали! Для того, щоб "дізнатися" саме його і його нащадків (якщо він здатний розмножуватися), припасти до їх поверхнях і тим самим позначити як цілі для атаки фагоцитів.
Але звідки взялася первісна інформація про структуру ще не з'явився в організмі антигену? Більшість учених вважає, що все величезне безліч варіантів такої інформації, - закладені початково, спадковим шляхом у такому ж безлічі початкових лімфоцитів, можливо, як результат відповідних "знайомств" у попередніх поколіннях тварини або людини. (Деякі вчені, навпаки, вважають, що всі імунні відповіді формуються протягом життя людини під впливом вторгаються антигенів.
Вони підкреслюють, що в перші місяці життя новонародженого, у нього імунна система ще не працює)
Спробуємо оцінити першу версію, оперуючи деякими цифрами. Задамося спершу питанням: що ж "дізнаються" антитіла на поверхні антигену.
Зважаючи можливого розмаїття природи і походження антигенів, швидше за все якусь просторову конфігурацію, яка може будуватися з будь-якого матеріалу: з декількох молекул амінокислот, ліпідів, Сахаров, нуклеотидів і навіть з органічних молекул не тваринного походження. Але ця конфігурація, зважаючи на вибірковості зв'язування антитіла з антигеном, повинна бути непростим.
Разом з тим, число помітно різняться просторових комбінацій органічних молекул не безмежне, тому що природа хімічних зв'язків між молекулами накладає свої обмеження. Припустимо, що це число для всіх можливих природних (бактерії, віруси, білки, нуклеїнові кислоти, тощо) і штучних антигенів має величину порядку десятка мільйонів (~ 10 7). Відомо, що кількість лімфоцитів, які містяться в організмі людини ~ 10 12.
Це означає, що число "розвідників", спочатку мають "прикметами" кожного можливого антигену ~ 10 5. Це не так вже й багато у порівнянні із загальним числом лімфоцитів. Якщо "інтервент" залишається одинаком, то ймовірність зустрічі зі "своїм розвідником" у нього мізерно мала. Але тоді від нього і ніякого відчутного шкоди бути не може.
Однак, як це завжди буває, якщо в організм проникають одночасно багато тисяч однакових антигенів, то ймовірність зустрічі відповідно зростає. Особливо, якщо ці антигени суть хвороботворні мікроорганізми, які починають у ньому швидко розмножуватися.
Тут уже ситуація змінюється радикально, і незабаром "фатальна зустріч" стає неминучою. Негайно починається масова напрацювання антитіл потрібної специфічності. Їх розмноження вступає в конкурентну боротьбу з розмноженням "прибульців".
Якщо антитіла швидко виграють цю гонку, то зуміють помітити собою всю "армію вторгнення" і всі її солдати будуть знищені фагоцитами обох типів перш, ніж з'являться явні ознаки захворювання. Такі явища відбуваються в нашому організмі повсякденно. Очевидно, що для фагоцитів байдужа природа антигену.
Вони "впізнають" лише факт наявності на його поверхні антитіл будь специфічності. (Принагідно зауважимо, що в разі вторгнення більш великих антигенів, ніж фагоцити, для знищення "ворога" мобілізуються зовсім інші засоби - серія білків, так званого комплементу, втім, що направляється тим же антитілом. Ми ці кошти розглядати не будемо - в біохімічних методів дослідження вони застосування не знайшли)
Якщо ж розмноження бактерій або вірусів випереджає напрацювання специфічних антитіл, то хвороба розвивається. У боротьбу вступають інші засоби захисту, наприклад, підвищення температури тіла, яке гальмує це розмноження ... Нарешті, на допомогу організму залучаються ліки або лікарські трави, які тварини вміють знаходити.
У разі повторного вторгнення патогенних мікроорганізмів, їх вже чекає багатомільйонна армія специфічних антитіл і лімфоцитів, створена імунітетом. Початкові умови для описаної вище "гонки розмножень" виявляються явно на користь захисників організму ...
Підраховано, що в крові людини вільно циркулюють і постійно оновлюються близько 19 жовтня антітел.10 12 лімфоцитів несуть на собі 17 жовтня антитіл. Значить в 100 разів більша їх кількість знаходиться "у вільному пошуку" супротивника. Значна їх частина - носії імунітету.
У відповідь на введення в кров піддослідного тварини (зазвичай кролика) якогось антигену, наприклад, чужорідного білка (ця дія іменується імунізацією кролика), в його організмі, протягом певного часу будуть вироблятися у великій кількості специфічні антитіла, здатні "дізнаватися" тільки цей білок .
І ми тепер знаємо, що "впізнавання" означає міцний зв'язок цих антитіл з молекулами відповідного антигену і тільки з ними одними. Всі інші антитіла різноманітної специфічності, що містяться в так званій імунної антисироватки тварини, наш білок не зможуть "помітити". Точно так само, як антитіла, вироблені у відповідь на імунізацію кролика певним білком-антигеном, ні з якими іншими білками зв'язатися не можуть.
Література
1. Довгяло О.П., Федоренко Н.М. Ішемічна хвороба серця. - М.: Медицина, - 1986.2. Долгов В.В. Морфо-функціональна характеристика ендотелію судинної стінки в нормі і при атеросклерозі. Автореф. Док. дис. - М. - 1985.
3. Долгушин І.І., Зурочка А.В., Чукічев А.В., Колесніков А.Л. Роль нейтрофілів у регуляції імунної реактивності і репаративних реакцій пошкодження тканини. / / Вісник Росс. Акад. мед. наук. - 2000. N 2. - C. - 14-19.