Регуляція біосинтезу білків на етапі транскрипції
Введення
Проблеми, пов'язані з регулюванням метаболічних процесів - найважливіші в системі біохімічних знань, і діляться на два великі класи:
1.Представленія про молекулярні механізми процесів регуляції, які є, швидше, предметом молекулярної біології і, частково, молекулярної генетики.
2.Феноменологіческое вираз наслідків регуляторних подій, що визначає напрямок протікання біохімічних процесів, що, власне, і є предметом біохімії. Саме останній аспект проблеми буде лежати в основі поданого матеріалу, але, з огляду на невеликий обсяг допомоги, обмежимося лише деякими ключовими питаннями. Для більш детального ознайомлення з проблемою слід звернутися до фундаментальних праць.
1. Основні визначення
Регулюванням метаболізму називається управління швидкістю біохімічних процесів шляхом оборотного зміни кількості білкових посередників, які беруть участь у цих процесах, або їх активності.
Білковий посередник - більш загальний і точний термін, ніж термін фермент. Хоча в багатьох біохімічних процесах білкові посередники є саме ферменти - каталізатори хімічних перетворень субстратів, але, наприклад, у транспорті субстратів через біологічні мембрани перенесення опосередковується білками, які не є ферментами, так як вони не каталізують будь-яких хімічних реакцій, а забезпечують впізнавання і транслокацію субстратів.
В окремих випадках роль посередника виконують не білки, а рибонуклеопротеїни або сама РНК, але це, швидше, виняток.
Відповідно до наведеного визначенням слід виділяти два основних рівня регуляції: біосинтезу білкових посередників; їх активності.
Обидва рівні життєво необхідні для організму, і мутанти з порушенням хоча б одного, як правило, витісняються з популяції.
2. Регуляція біосинтезу білків
Біосинтез білків складається з процесів безпосередньої побудови і модифікації білкової молекули, а також з «підготовчих» процесів: реплікації генетичного матеріалу і його транскрипції.
Реплікація ДНК докладно розглядається в курсах молекулярної біології і фундаментальних підручниках біохімії. Ми зупинимося лише на деяких принципових питаннях, що мають значення для регуляції біосинтезу білка.
Необхідно відзначити, що термін хромосома як місце локалізації ДНК застосуємо тільки до клітин еукаріотів, тоді як часто використовуваний термін бактеріальна хромосома неточний і краще говорити про генофоре або нуклеоида, маючи на увазі під цими термінами ДНК-РНК-білковий комплекс.
Ще точніше термін геномний еквівалент, тому що частина ДНК у бактеріальній клітині є у кількох копіях. Якщо в бактеріальну клітину надходить додатковий фрагмент ДНК, що несе нові алелі тих же локусів, то виникає так званий меродіплоід.
3. Особливості процесу реплікації
Як і у випадку біосинтезу інших біополімерів, процес реплікації ДНК включає три етапи: ініціацію, елонгацію і тер-мінацію. Для реплікації характерні такі особливості:
1. Вона здійснюється за напівконсервативним механізму, причому ланцюга ДНК антіпараллельни (З'конец містить залишок ортофосфату - Р, а 5 'кінець - ОН) і подальшої транскрипції піддається тільки один ланцюг:
2.Сінтез, мабуть, протікає переривчасто і в напрямку 5 '3'.
3.Каждая ланцюг починається з РНК-затравки, фрагменти об'єднуються ДНК-лігази з відщепленні РНК.
4.Система реплікації є мультиферментного, в неї входять 2-3 ДНК-полімерази, ДНК-лігаза, топоізомерази, необхідні для розплітання ланцюгів ДНК і подальшої їх сверхспіралізаціі. Всього близько 15 генетичних локусів кодують той чи інший поліпептид, необхідний для реплікації.
5.Существуют чотири основних типи: синтез фрагментів, реплікація плазмід, рекомбінаційний синтез ДНК, репараційний синтез ДНК. У кожному з них беруть участь як загальні, так і специфічні компоненти.
6.Натівная система реплікації ДНК є мембранної і інактивується при руйнуванні мембран. Тому для моделювання процесу реплікації використовуються, як правило, спрощені системи, отримані з бактеріальних «умовних» мутантів або з «маленьких» фагів.
Регуляція процесу реплікації ДНК найбільш суворо здійснюється на етапі ініціації. Реплікація знаходиться під позитивним і негативним контролем, причому обидва вони скоординовані з клітинним поділом.
У загальних рисах принцип такої регуляції можна сформулювати наступним чином. При позитивному контролі відбувається накопичення активатора реплікації до порогового, достатнього для ініціації нового циклу реплікації рівня. Граничний рівень досягається при подвоєнні клітинної маси так, щоб у новоутворених клітинах процес реплікації був би вже запущений і встиг завершитися до моменту нового поділу. При негативному контролі відбувається накопичення інгібітора ініціації реплікації, який повинен синтезуватися лише в обмеженій кількості незабаром після початку попереднього циклу реплікації. Такий інгібітор може бути продуктом гена, локалізованого поблизу від точки початку реплікації, транскрипція якого осушествляется тільки в період реплікації даної ділянки ДНК. У процесі росту клітини інгібітор «розбавляється», а до моменту подвоєння маси клітини рівень його падає нижче критичного, що дозволяє клітині ініціювати новий цикл реплікації. Взаємодія цих двох механізмів і повинно координувати процеси реплікації ДНК і поділу клітини.
Реальні механізми регуляції реплікації ще не розшифровані. У еукаріотів певну роль у регуляції реплікації, мабуть, грають гістони.
4. Транскрипція генетичної інформації
Цей етап біосинтезу білків полягає в «переписуванні» інформації, закодованої у ДНК, на олігонуклеотидно послідовність інформаційної РНК і здійснюється РНК-полімеразою. Будова цього ферменту найкраще вивчено у бактерій Escherichia. Це складний білок з молекулярною масою 450 кДа. Його серцевина включає дві ідентичні а-субодиниці і дві різні р-субодиниці. До складу «повного» ферменту входить також а-субодиниця, відповідальна за процес пізнавання промотору та ініціацію транскрипції. Нарешті, існує ще один білковий компонент, що позначається р-фактор, який відповідальний за правильну терми-націю транскрипції. Таким чином, РНКП Escherichia coli і ряду інших грамнегативних бактерій виглядає наступним чином:
У грампозитивних бактерій РНКП влаштована ще складніше. Наприклад, у разі Bacillus subtilis вона може містити кілька а-факторів, а у ряду архей РНКП складається з 9-10 компонентів, наближаючись за складністю будови до РНКП еукаріот.
У клітинах еукаріотів виявлено принаймні три типи РНКП. Полімераза I знаходиться в ядерце і транскрибує гени більшості рибосомних РНК; полімераза II - у нуклеоплазмі і транскрибує велику частину інших генів; полімераза III - гени транспортних РНК і однією з рРНК. Крім того, в мітохондріях і хлоропластах еукаріот присутні власні РНКП.
Тим часом власне полімеразна реакція може здійснюватися набагато простішими ферментами. Так, РНКП «непарних» ТЗ і Т7 фагів Escherichia coli складається з єдиного поліпептиду з молекулярною масою ПО кДа, а мітохондріальна РНКП являє собою поліпептид з молекулярною масою 64 кДа.
Мабуть, складний пристрій бактеріальної та, особливо, еукаріотичних РНКП, з одного боку, обумовлено необхідністю «впізнавати» велике число промоторів, а з іншого - дозволяє здійснювати різноманітну регуляцію транскрипції в процесі функціонування цього ферменту.
5. Регуляція процесу транскрипції
Виходячи з можливості управління синтезом білкових посередників на етапі транскрипції, їх можна розділити на три основні групи:
1) конститутивні білки, синтез яких не залежить від наявності субстратів та продуктів;
2) індуцибельних білки - їх синтез прискорюється в присутності субстратів;
3) репрессібельние білки, синтез яких пригнічується надлишком кінцевого продукту даного метаболічного шляху.
Регулювання на етапі ініціації транскрипції. У 1960-і роки Ф. Жакоб і Ж. Моно встановили, що в явищах індукції та репресії беруть участь білкові фактори - репрессора, продукти спеціальних генетичних елементів - генів-регуляторів, здатні в певних умовах гальмувати процес транскрипції на етапі ініціації, тому обидва цих типу регуляції відносять до негативних.
У индуцируемой оперон ген-регулятор кодує активний реп-ресор, який блокує транскрипцію, взаємодіючи з операторних ділянкою ДНК і перешкоджаючи просуванню РНКП. Індуктор, що представляє собою вихідний субстрат даного метаболічного шляху або близьке до нього з'єднання, здатний взаємодіяти з репрессором та інактивувати його, звільняючи таким чином операторний ділянка ДНК. У результаті РНКП починає транскрипцію даного оперону. Ці події відображено в схемі.
У репресованих оперон ген-регулятор кодує неактивний репрессор, який може переходити в активний стан і блокувати транскрипцію, з'єднуючись з оператором, тільки після взаємодії з надлишком кінцевого продукту даного метаболічного шляху. Процес відображений у схемі.
Велику роль у регуляції транскрипції грає так звана катаболітная репресія, яка проявляється в діауксіі в процесі росту бактерій. Феномен діауксіі виявляється, коли в середовищі присутні два субстрату, причому ферменти, що здійснюють катаболізм одного з них, індуцибельних, а ферменти, що здійснюють катаболізм іншого, конститутивні. У цьому випадку спочатку споживається тільки глюкоза, тоді як індукція лактозна ферментів не відбувається до тих пір, поки не буде спожита основна частина глюкози. Це відбивається в тимчасовому уповільненні зростання культури на той період, який необхідний для індукції та синтезу р-галактозидази. Таким чином, незважаючи на присутність у середовищі індуктора, альтернативний субстрат перешкоджає індукції.
Механізм явища катаболітной репресії полягає в наступному. Для індукції деяких «слабких» Оперон, в тому числі Дзс-оперону, недостатньо інактивації негативного регулятора - репрессора. Необхідно і участь позитивного регулятора, що представляє собою комплекс спеціального активуючого білка з циклічною AMP. Цей білок, що активує транскрипцію, отримав назву БАК-білка або «білка, що активує катаболітние гени». БАК-білок являє собою димер з молекулярною масою 45 кДа. Під дією Самро він піддається конформаційних змін і набуває підвищену здатність зв'язуватися з промотором. Вважають, що приєднання комплексу сАМР-ВАК до ДНК послаблює спаровування Г-Ц-підстав, сприяє частковому поділу спіралей ДНК і полегшує формування ініціюючого транскрипцію комплексу РНКП з ДНК. Рівень сАМР в клітині обернено пропорційний рівню АТР, і в присутності легко метаболізуються субстратів, що сприяють підвищенню рівня АТР, сАМР «не вистачає» для утворення комплексу з ВАК.
Тонкі механізми регуляції рівня сАМР пов'язані з функціонуванням фосфотрансферазной системи транспорту Сахаров і будуть розглянуті в розділі, присвяченому регуляції процесів мембранного транспорту.
Необхідно відзначити, що у ряду бактерій роль глюкози в катаболітной репресії можуть виконувати інші джерела енергії, які в цьому випадку гальмують катаболізм глюкози.
У індуцибельних оперона можливі й інші типи позитивної регуляції, незалежної від сАМР. Наприклад, в арабінозном оперон Escherichia coti арабіноза не просто інактивує репрессор, але перетворює його в позитивний регулятор. Аналогічне явище виявлено у разі Оперон галактози і рамнози.
У дівергентних регулон транскрипція протікає в різних напрямках і може бути некоординованою, тобто здійснюватися з різною швидкістю. При цьому можливе зчитування з різних ланцюгів ДНК. Прикладом служить аргінінових оперон: у його частини, що включає 4 гени з 9, транскрипція трьох генів здійснюється в одному напрямку, а транскрипція іншого гена - у протилежному:
Ще одним прикладом позитивної регуляції процесу транскрипції є регулювання за участю генів - «енхансери». Раніше вважали, що цей тип регулювання характерний тільки для еукаріот. Але останнім часом формально подібні механізми виявлені і у прокаріотів.
Особливість генів - «енхансери» в тому, що вони виявляють свою стимулюючу активність незалежно від орієнтації і розташування щодо активованого гена: можуть перебувати перед геном, за ним і навіть усередині нього.
Продуктами генів - «енхансери» є білки з молекулярною масою 25-30 кДа, здатні зв'язуватися з промоторної областю. Як правило, така система двокомпонентних і включає «сигнальний» білок, здатний «почувати» зміну умов навколишнього середовища і стимулювати синтез іншого білка - «активатора», який і запускає транскрипцію шуканого білкового посередника.
Перераховані механізми регуляції транскрипції на стадії ініціації досить швидко реагують на зміну зовнішніх умов, проте управляють роботою одного або невеликого числа Оперон в кожен момент часу.
Поряд з ними існують механізми системної регуляції, пов'язані зі зміною функціонування одночасно великої кількості Оперон.
У клітинах еукаріот це досягається шляхом конформаційних перебудов хроматину, процесингу та РНК, а також за рахунок управління трансляцією шляхом формування так званих інформосом.
У клітинах прокаріотів системна регуляція здійснюється шляхом модифікації специфічності роботи РНКП за допомогою зміни її компонентного складу. Ці механізми вступають в дію, коли потрібно активувати одночасно велику кількість нових промоторів або змінити матрицю. Останній випадок вивчений найбільш докладно на прикладі фагів Escherichia coii і Bacillus subtilis.
У геномі бактеріофагів присутні три типи генів: ранні, середні та пізні, що класифікуються на підставі порядку їх транскрипції в ході розвитку фага. Ранні гени завжди транскрибуються РНКП клітини-господаря, а в разі транскрипції середніх і пізніх генів можливо кілька варіантів:
1) серед продуктів ранніх генів присутня власна фагів РНКП, а також білки-інгібітори РНКП господаря. Таким чином, відбувається зміна РНКП;
2) серед продуктів ранніх генів присутні нові а-фактори, що взаємодіють з «серцевиною» РНКП господаря і забезпечують транскрипцію середніх генів. Серед продуктів середніх генів, у свою чергу, присутні білки з функціями а-факторів, які забезпечують транскрипцію пізніх генів, Таким чином, відбувається зміна про-факторів;
3) серед продуктів «ранніх» генів присутні білки, модифікуючі «серцевину» РНКП господаря, тоді як а-фактор господаря зберігається.
Регуляція транскрипції шляхом утворення специфічних а-факторів широко поширена і в бактеріальних системах.
Особливий а-фактор контролює транскрипцію деяких генів азотного метаболізму. Нарешті, існують промотори, активуються тільки при 50 °, в їх транскрипції бере участь фактор а Е.
Прикладом системної регуляції є і регуляція процесу спорообразования у бацил. У цей процес втягуються сотні локусів, організовані в спеціальні структури і розкидані по всій молекулі ДНК. Одним із способів перемикання зростання на спорообразование служить зміна РНКП і, в першу чергу, її про-фактора. Така РНКП переважно транскрибує «ранні» гени спороутворення, важливу роль в якому грає також регуляція на рівні трансляції.
Інший приклад системної регуляції у прокаріотів: при впливі на мікроорганізми нагрівання до супраоптімальной температури настає тепловий шок, що викликає координовану індукцію «білків теплового шоку». Транскрипція їх локусів та освіта головного чинника а здійснюється під контролем мінорного фактора з 32.
Цей механізм забезпечує координацію процесів транскрипції і трансляції і докладніше буде обговорюватися під час розгляду способів керування швидкістю росту клітин.
6. Регулювання на етапі термінації транскрипції
РНКП може «впізнавати» специфічні послідовності ДНК, що сигналізують про закінчення транскрипції. Ця її здатність посилюється або модифікується під впливом особливого поліпептиду - р-фактора, що забезпечує нормальну терминацию.
Поряд з цим у складі ряду регулон виявлені так звані атенюатори, тобто ділянки ДНК, викликають передчасну терминацию, також р-залежну. Ці генетичні елементи розташовуються між оператором і першим структурним геном в регулон, контролюючих біосинтез ряду амінокислот. Всі амінокислотні регулон, керовані за допомогою аттенюаціі, характеризуються збагаченням ділянки і РНК, відповідного відстані до аттенюатора кодонами тієї амінокислоти, яка служить негативним ефекторів.
Регулювання шляхом аттенюаціі заснована на тісному поєднанні у прокаріот транскрипції і трансляції, які, як правило, протікають одночасно. У процесі трансляції синтезується іРНК рибосома, що екранує близько 10 нуклеотидів, може істотно впливати на конформацію транслюється іРНК, а та, у свою чергу, на просування РНКП по матриці ДНК. При формуванні «критичної» конформації іРНК настає дисоціація РНКП від ДНК.
Триптофанового оперон у Escherichia coli регулюється одночасно двома негативними механізмами: репресією і аттенюа-цією. При надлишку триптофану вони діють адитивно, практично цілком придушуючи транскрипцію. Але навіть за відсутності репресії аттенюація знижує швидкість транскрипції на 90%.
Гистидинового оперон регулюється тільки за допомогою аттенюаціі. Аналогічна регулювання характерна для синтезу деяких аміноацил-тРНК-синтетаз і, можливо, ряду екзоферментів. Аттенюатор присутній також у геномі фага X. У цьому випадку ефект аттенюатора може бути нейтралізований спеціальним регуляторним білком антітермінатором. Отримано дані про те, що комплекс білка ВАК з Самро також може виконувати функцію антітермінатора, наприклад в оперон, і, таким чином, не тільки стимулювати ініціацію транскрипції, а й запобігати передчасну терминацию.
Регуляція транскрипції шляхом зміни кількості активної РНКП. РНКП може служити негативним регулятором свого власного біосинтезу, і при відносному надлишку в клітці її подальшу освіту гальмується. Координування регулюється освіту з переходом її в латентний стан. У певних умовах латентна РНКП активується, викликаючи підвищення швидкості транскрипції. За деякими даними, така латентна РНКП може складати до 50% всієї РНКП клітини.
7. Регуляція транскрипції шляхом зміни конформації або структури ДНК
Одним із способів системної регуляції транскрипції служить зміна ступеня сверхспіралізаціі ДНК. У цьому процесі бере участь особливий клас ферментів - топоізомерази,
Релаксуючі топоізомерази знижують ступінь сверхспіралізаціі без витрати енергії і приймають участь в ініціації реплікації. За сучасною класифікації їх називають топоізомерази I
Білки, що підвищують ступінь сверхспіралізаціі ДНК, залежать від АТР і беруть участь у реплікації ДНК, а також необхідні для здійснення рекомбінацій і кон'югатівной передачі генетичного матеріалу. Їх називають топоізомерази II.
Непрямим вказівкою на можливість зміни специфічності транскрипції при зміні ступеня сверхспіралізаціі ДНК служить той факт, що в присутності інгібіторів ДНК-гірази змінюється спектр синтезованих білків, хоча самі по собі ці інгібітори не впливають на процеси транскрипції чи трансляції. Наприклад, у Escherichia coii знижується синтез близько 20 білків, але одночасно стимулюється синтез інших, а освіта деяких білків залишається на колишньому рівні.
Перебудова транскрипції при зміні ступеня сверхспіралізаціі ДНК пояснюється принаймні двома причинами. По-перше, може змінюватися специфічність впізнавання промоторів РНК-полімеразою. По-друге, зміна сверхспіралізованності повинно приводити до зміни сили взаємодії з ДНК регуляторних білків.
Оскільки АТР є необхідним компонентом для роботи ДНК-гірази, повинна існувати зв'язок ступеня сверхспіралізаціі ДНК з енергетичним зарядом клітини, що відкриває ще одну можливість для регуляції транскрипції.
Принципово інший спосіб регулювання може бути здійснено шляхом оборотного зміни структури ДНК за рахунок відщепленні рухомих генетичних елементів, а потім вбудовування їх в інші місця геному. При цьому може змінюватися характер регуляції транскрипції як генетичних локусів, що входять до складу переміщуються ділянок, так і сусідніх з ними локусів. Можливо також вбудовування генетичного елемента в ту саму ділянку ДНК, звідки він був вищеплен, але в інвертованому вигляді. Така інверсія використовується іноді як спосіб регуляції розвитку фагів, а також освіти джгутикових антигенів у сальмонел.
Введення
Проблеми, пов'язані з регулюванням метаболічних процесів - найважливіші в системі біохімічних знань, і діляться на два великі класи:
1.Представленія про молекулярні механізми процесів регуляції, які є, швидше, предметом молекулярної біології і, частково, молекулярної генетики.
2.Феноменологіческое вираз наслідків регуляторних подій, що визначає напрямок протікання біохімічних процесів, що, власне, і є предметом біохімії. Саме останній аспект проблеми буде лежати в основі поданого матеріалу, але, з огляду на невеликий обсяг допомоги, обмежимося лише деякими ключовими питаннями. Для більш детального ознайомлення з проблемою слід звернутися до фундаментальних праць.
1. Основні визначення
Регулюванням метаболізму називається управління швидкістю біохімічних процесів шляхом оборотного зміни кількості білкових посередників, які беруть участь у цих процесах, або їх активності.
Білковий посередник - більш загальний і точний термін, ніж термін фермент. Хоча в багатьох біохімічних процесах білкові посередники є саме ферменти - каталізатори хімічних перетворень субстратів, але, наприклад, у транспорті субстратів через біологічні мембрани перенесення опосередковується білками, які не є ферментами, так як вони не каталізують будь-яких хімічних реакцій, а забезпечують впізнавання і транслокацію субстратів.
В окремих випадках роль посередника виконують не білки, а рибонуклеопротеїни або сама РНК, але це, швидше, виняток.
Відповідно до наведеного визначенням слід виділяти два основних рівня регуляції: біосинтезу білкових посередників; їх активності.
Обидва рівні життєво необхідні для організму, і мутанти з порушенням хоча б одного, як правило, витісняються з популяції.
2. Регуляція біосинтезу білків
Біосинтез білків складається з процесів безпосередньої побудови і модифікації білкової молекули, а також з «підготовчих» процесів: реплікації генетичного матеріалу і його транскрипції.
Реплікація ДНК докладно розглядається в курсах молекулярної біології і фундаментальних підручниках біохімії. Ми зупинимося лише на деяких принципових питаннях, що мають значення для регуляції біосинтезу білка.
Необхідно відзначити, що термін хромосома як місце локалізації ДНК застосуємо тільки до клітин еукаріотів, тоді як часто використовуваний термін бактеріальна хромосома неточний і краще говорити про генофоре або нуклеоида, маючи на увазі під цими термінами ДНК-РНК-білковий комплекс.
Ще точніше термін геномний еквівалент, тому що частина ДНК у бактеріальній клітині є у кількох копіях. Якщо в бактеріальну клітину надходить додатковий фрагмент ДНК, що несе нові алелі тих же локусів, то виникає так званий меродіплоід.
3. Особливості процесу реплікації
Як і у випадку біосинтезу інших біополімерів, процес реплікації ДНК включає три етапи: ініціацію, елонгацію і тер-мінацію. Для реплікації характерні такі особливості:
1. Вона здійснюється за напівконсервативним механізму, причому ланцюга ДНК антіпараллельни (З'конец містить залишок ортофосфату - Р, а 5 'кінець - ОН) і подальшої транскрипції піддається тільки один ланцюг:
2.Сінтез, мабуть, протікає переривчасто і в напрямку 5 '3'.
3.Каждая ланцюг починається з РНК-затравки, фрагменти об'єднуються ДНК-лігази з відщепленні РНК.
4.Система реплікації є мультиферментного, в неї входять 2-3 ДНК-полімерази, ДНК-лігаза, топоізомерази, необхідні для розплітання ланцюгів ДНК і подальшої їх сверхспіралізаціі. Всього близько 15 генетичних локусів кодують той чи інший поліпептид, необхідний для реплікації.
5.Существуют чотири основних типи: синтез фрагментів, реплікація плазмід, рекомбінаційний синтез ДНК, репараційний синтез ДНК. У кожному з них беруть участь як загальні, так і специфічні компоненти.
6.Натівная система реплікації ДНК є мембранної і інактивується при руйнуванні мембран. Тому для моделювання процесу реплікації використовуються, як правило, спрощені системи, отримані з бактеріальних «умовних» мутантів або з «маленьких» фагів.
Регуляція процесу реплікації ДНК найбільш суворо здійснюється на етапі ініціації. Реплікація знаходиться під позитивним і негативним контролем, причому обидва вони скоординовані з клітинним поділом.
У загальних рисах принцип такої регуляції можна сформулювати наступним чином. При позитивному контролі відбувається накопичення активатора реплікації до порогового, достатнього для ініціації нового циклу реплікації рівня. Граничний рівень досягається при подвоєнні клітинної маси так, щоб у новоутворених клітинах процес реплікації був би вже запущений і встиг завершитися до моменту нового поділу. При негативному контролі відбувається накопичення інгібітора ініціації реплікації, який повинен синтезуватися лише в обмеженій кількості незабаром після початку попереднього циклу реплікації. Такий інгібітор може бути продуктом гена, локалізованого поблизу від точки початку реплікації, транскрипція якого осушествляется тільки в період реплікації даної ділянки ДНК. У процесі росту клітини інгібітор «розбавляється», а до моменту подвоєння маси клітини рівень його падає нижче критичного, що дозволяє клітині ініціювати новий цикл реплікації. Взаємодія цих двох механізмів і повинно координувати процеси реплікації ДНК і поділу клітини.
Реальні механізми регуляції реплікації ще не розшифровані. У еукаріотів певну роль у регуляції реплікації, мабуть, грають гістони.
4. Транскрипція генетичної інформації
Цей етап біосинтезу білків полягає в «переписуванні» інформації, закодованої у ДНК, на олігонуклеотидно послідовність інформаційної РНК і здійснюється РНК-полімеразою. Будова цього ферменту найкраще вивчено у бактерій Escherichia. Це складний білок з молекулярною масою 450 кДа. Його серцевина включає дві ідентичні а-субодиниці і дві різні р-субодиниці. До складу «повного» ферменту входить також а-субодиниця, відповідальна за процес пізнавання промотору та ініціацію транскрипції. Нарешті, існує ще один білковий компонент, що позначається р-фактор, який відповідальний за правильну терми-націю транскрипції. Таким чином, РНКП Escherichia coli і ряду інших грамнегативних бактерій виглядає наступним чином:
У грампозитивних бактерій РНКП влаштована ще складніше. Наприклад, у разі Bacillus subtilis вона може містити кілька а-факторів, а у ряду архей РНКП складається з 9-10 компонентів, наближаючись за складністю будови до РНКП еукаріот.
У клітинах еукаріотів виявлено принаймні три типи РНКП. Полімераза I знаходиться в ядерце і транскрибує гени більшості рибосомних РНК; полімераза II - у нуклеоплазмі і транскрибує велику частину інших генів; полімераза III - гени транспортних РНК і однією з рРНК. Крім того, в мітохондріях і хлоропластах еукаріот присутні власні РНКП.
Тим часом власне полімеразна реакція може здійснюватися набагато простішими ферментами. Так, РНКП «непарних» ТЗ і Т7 фагів Escherichia coli складається з єдиного поліпептиду з молекулярною масою ПО кДа, а мітохондріальна РНКП являє собою поліпептид з молекулярною масою 64 кДа.
Мабуть, складний пристрій бактеріальної та, особливо, еукаріотичних РНКП, з одного боку, обумовлено необхідністю «впізнавати» велике число промоторів, а з іншого - дозволяє здійснювати різноманітну регуляцію транскрипції в процесі функціонування цього ферменту.
5. Регуляція процесу транскрипції
Виходячи з можливості управління синтезом білкових посередників на етапі транскрипції, їх можна розділити на три основні групи:
1) конститутивні білки, синтез яких не залежить від наявності субстратів та продуктів;
2) індуцибельних білки - їх синтез прискорюється в присутності субстратів;
3) репрессібельние білки, синтез яких пригнічується надлишком кінцевого продукту даного метаболічного шляху.
Регулювання на етапі ініціації транскрипції. У 1960-і роки Ф. Жакоб і Ж. Моно встановили, що в явищах індукції та репресії беруть участь білкові фактори - репрессора, продукти спеціальних генетичних елементів - генів-регуляторів, здатні в певних умовах гальмувати процес транскрипції на етапі ініціації, тому обидва цих типу регуляції відносять до негативних.
У индуцируемой оперон ген-регулятор кодує активний реп-ресор, який блокує транскрипцію, взаємодіючи з операторних ділянкою ДНК і перешкоджаючи просуванню РНКП. Індуктор, що представляє собою вихідний субстрат даного метаболічного шляху або близьке до нього з'єднання, здатний взаємодіяти з репрессором та інактивувати його, звільняючи таким чином операторний ділянка ДНК. У результаті РНКП починає транскрипцію даного оперону. Ці події відображено в схемі.
У репресованих оперон ген-регулятор кодує неактивний репрессор, який може переходити в активний стан і блокувати транскрипцію, з'єднуючись з оператором, тільки після взаємодії з надлишком кінцевого продукту даного метаболічного шляху. Процес відображений у схемі.
Велику роль у регуляції транскрипції грає так звана катаболітная репресія, яка проявляється в діауксіі в процесі росту бактерій. Феномен діауксіі виявляється, коли в середовищі присутні два субстрату, причому ферменти, що здійснюють катаболізм одного з них, індуцибельних, а ферменти, що здійснюють катаболізм іншого, конститутивні. У цьому випадку спочатку споживається тільки глюкоза, тоді як індукція лактозна ферментів не відбувається до тих пір, поки не буде спожита основна частина глюкози. Це відбивається в тимчасовому уповільненні зростання культури на той період, який необхідний для індукції та синтезу р-галактозидази. Таким чином, незважаючи на присутність у середовищі індуктора, альтернативний субстрат перешкоджає індукції.
Механізм явища катаболітной репресії полягає в наступному. Для індукції деяких «слабких» Оперон, в тому числі Дзс-оперону, недостатньо інактивації негативного регулятора - репрессора. Необхідно і участь позитивного регулятора, що представляє собою комплекс спеціального активуючого білка з циклічною AMP. Цей білок, що активує транскрипцію, отримав назву БАК-білка або «білка, що активує катаболітние гени». БАК-білок являє собою димер з молекулярною масою 45 кДа. Під дією Самро він піддається конформаційних змін і набуває підвищену здатність зв'язуватися з промотором. Вважають, що приєднання комплексу сАМР-ВАК до ДНК послаблює спаровування Г-Ц-підстав, сприяє частковому поділу спіралей ДНК і полегшує формування ініціюючого транскрипцію комплексу РНКП з ДНК. Рівень сАМР в клітині обернено пропорційний рівню АТР, і в присутності легко метаболізуються субстратів, що сприяють підвищенню рівня АТР, сАМР «не вистачає» для утворення комплексу з ВАК.
Тонкі механізми регуляції рівня сАМР пов'язані з функціонуванням фосфотрансферазной системи транспорту Сахаров і будуть розглянуті в розділі, присвяченому регуляції процесів мембранного транспорту.
Необхідно відзначити, що у ряду бактерій роль глюкози в катаболітной репресії можуть виконувати інші джерела енергії, які в цьому випадку гальмують катаболізм глюкози.
У індуцибельних оперона можливі й інші типи позитивної регуляції, незалежної від сАМР. Наприклад, в арабінозном оперон Escherichia coti арабіноза не просто інактивує репрессор, але перетворює його в позитивний регулятор. Аналогічне явище виявлено у разі Оперон галактози і рамнози.
У дівергентних регулон транскрипція протікає в різних напрямках і може бути некоординованою, тобто здійснюватися з різною швидкістю. При цьому можливе зчитування з різних ланцюгів ДНК. Прикладом служить аргінінових оперон: у його частини, що включає 4 гени з 9, транскрипція трьох генів здійснюється в одному напрямку, а транскрипція іншого гена - у протилежному:
Ще одним прикладом позитивної регуляції процесу транскрипції є регулювання за участю генів - «енхансери». Раніше вважали, що цей тип регулювання характерний тільки для еукаріот. Але останнім часом формально подібні механізми виявлені і у прокаріотів.
Особливість генів - «енхансери» в тому, що вони виявляють свою стимулюючу активність незалежно від орієнтації і розташування щодо активованого гена: можуть перебувати перед геном, за ним і навіть усередині нього.
Продуктами генів - «енхансери» є білки з молекулярною масою 25-30 кДа, здатні зв'язуватися з промоторної областю. Як правило, така система двокомпонентних і включає «сигнальний» білок, здатний «почувати» зміну умов навколишнього середовища і стимулювати синтез іншого білка - «активатора», який і запускає транскрипцію шуканого білкового посередника.
Перераховані механізми регуляції транскрипції на стадії ініціації досить швидко реагують на зміну зовнішніх умов, проте управляють роботою одного або невеликого числа Оперон в кожен момент часу.
Поряд з ними існують механізми системної регуляції, пов'язані зі зміною функціонування одночасно великої кількості Оперон.
У клітинах еукаріот це досягається шляхом конформаційних перебудов хроматину, процесингу та РНК, а також за рахунок управління трансляцією шляхом формування так званих інформосом.
У клітинах прокаріотів системна регуляція здійснюється шляхом модифікації специфічності роботи РНКП за допомогою зміни її компонентного складу. Ці механізми вступають в дію, коли потрібно активувати одночасно велику кількість нових промоторів або змінити матрицю. Останній випадок вивчений найбільш докладно на прикладі фагів Escherichia coii і Bacillus subtilis.
У геномі бактеріофагів присутні три типи генів: ранні, середні та пізні, що класифікуються на підставі порядку їх транскрипції в ході розвитку фага. Ранні гени завжди транскрибуються РНКП клітини-господаря, а в разі транскрипції середніх і пізніх генів можливо кілька варіантів:
1) серед продуктів ранніх генів присутня власна фагів РНКП, а також білки-інгібітори РНКП господаря. Таким чином, відбувається зміна РНКП;
2) серед продуктів ранніх генів присутні нові а-фактори, що взаємодіють з «серцевиною» РНКП господаря і забезпечують транскрипцію середніх генів. Серед продуктів середніх генів, у свою чергу, присутні білки з функціями а-факторів, які забезпечують транскрипцію пізніх генів, Таким чином, відбувається зміна про-факторів;
3) серед продуктів «ранніх» генів присутні білки, модифікуючі «серцевину» РНКП господаря, тоді як а-фактор господаря зберігається.
Регуляція транскрипції шляхом утворення специфічних а-факторів широко поширена і в бактеріальних системах.
Особливий а-фактор контролює транскрипцію деяких генів азотного метаболізму. Нарешті, існують промотори, активуються тільки при 50 °, в їх транскрипції бере участь фактор а Е.
Прикладом системної регуляції є і регуляція процесу спорообразования у бацил. У цей процес втягуються сотні локусів, організовані в спеціальні структури і розкидані по всій молекулі ДНК. Одним із способів перемикання зростання на спорообразование служить зміна РНКП і, в першу чергу, її про-фактора. Така РНКП переважно транскрибує «ранні» гени спороутворення, важливу роль в якому грає також регуляція на рівні трансляції.
Інший приклад системної регуляції у прокаріотів: при впливі на мікроорганізми нагрівання до супраоптімальной температури настає тепловий шок, що викликає координовану індукцію «білків теплового шоку». Транскрипція їх локусів та освіта головного чинника а здійснюється під контролем мінорного фактора з 32.
Цей механізм забезпечує координацію процесів транскрипції і трансляції і докладніше буде обговорюватися під час розгляду способів керування швидкістю росту клітин.
6. Регулювання на етапі термінації транскрипції
РНКП може «впізнавати» специфічні послідовності ДНК, що сигналізують про закінчення транскрипції. Ця її здатність посилюється або модифікується під впливом особливого поліпептиду - р-фактора, що забезпечує нормальну терминацию.
Поряд з цим у складі ряду регулон виявлені так звані атенюатори, тобто ділянки ДНК, викликають передчасну терминацию, також р-залежну. Ці генетичні елементи розташовуються між оператором і першим структурним геном в регулон, контролюючих біосинтез ряду амінокислот. Всі амінокислотні регулон, керовані за допомогою аттенюаціі, характеризуються збагаченням ділянки і РНК, відповідного відстані до аттенюатора кодонами тієї амінокислоти, яка служить негативним ефекторів.
Регулювання шляхом аттенюаціі заснована на тісному поєднанні у прокаріот транскрипції і трансляції, які, як правило, протікають одночасно. У процесі трансляції синтезується іРНК рибосома, що екранує близько 10 нуклеотидів, може істотно впливати на конформацію транслюється іРНК, а та, у свою чергу, на просування РНКП по матриці ДНК. При формуванні «критичної» конформації іРНК настає дисоціація РНКП від ДНК.
Триптофанового оперон у Escherichia coli регулюється одночасно двома негативними механізмами: репресією і аттенюа-цією. При надлишку триптофану вони діють адитивно, практично цілком придушуючи транскрипцію. Але навіть за відсутності репресії аттенюація знижує швидкість транскрипції на 90%.
Гистидинового оперон регулюється тільки за допомогою аттенюаціі. Аналогічна регулювання характерна для синтезу деяких аміноацил-тРНК-синтетаз і, можливо, ряду екзоферментів. Аттенюатор присутній також у геномі фага X. У цьому випадку ефект аттенюатора може бути нейтралізований спеціальним регуляторним білком антітермінатором. Отримано дані про те, що комплекс білка ВАК з Самро також може виконувати функцію антітермінатора, наприклад в оперон, і, таким чином, не тільки стимулювати ініціацію транскрипції, а й запобігати передчасну терминацию.
Регуляція транскрипції шляхом зміни кількості активної РНКП. РНКП може служити негативним регулятором свого власного біосинтезу, і при відносному надлишку в клітці її подальшу освіту гальмується. Координування регулюється освіту з переходом її в латентний стан. У певних умовах латентна РНКП активується, викликаючи підвищення швидкості транскрипції. За деякими даними, така латентна РНКП може складати до 50% всієї РНКП клітини.
7. Регуляція транскрипції шляхом зміни конформації або структури ДНК
Одним із способів системної регуляції транскрипції служить зміна ступеня сверхспіралізаціі ДНК. У цьому процесі бере участь особливий клас ферментів - топоізомерази,
Релаксуючі топоізомерази знижують ступінь сверхспіралізаціі без витрати енергії і приймають участь в ініціації реплікації. За сучасною класифікації їх називають топоізомерази I
Білки, що підвищують ступінь сверхспіралізаціі ДНК, залежать від АТР і беруть участь у реплікації ДНК, а також необхідні для здійснення рекомбінацій і кон'югатівной передачі генетичного матеріалу. Їх називають топоізомерази II.
Непрямим вказівкою на можливість зміни специфічності транскрипції при зміні ступеня сверхспіралізаціі ДНК служить той факт, що в присутності інгібіторів ДНК-гірази змінюється спектр синтезованих білків, хоча самі по собі ці інгібітори не впливають на процеси транскрипції чи трансляції. Наприклад, у Escherichia coii знижується синтез близько 20 білків, але одночасно стимулюється синтез інших, а освіта деяких білків залишається на колишньому рівні.
Перебудова транскрипції при зміні ступеня сверхспіралізаціі ДНК пояснюється принаймні двома причинами. По-перше, може змінюватися специфічність впізнавання промоторів РНК-полімеразою. По-друге, зміна сверхспіралізованності повинно приводити до зміни сили взаємодії з ДНК регуляторних білків.
Оскільки АТР є необхідним компонентом для роботи ДНК-гірази, повинна існувати зв'язок ступеня сверхспіралізаціі ДНК з енергетичним зарядом клітини, що відкриває ще одну можливість для регуляції транскрипції.
Принципово інший спосіб регулювання може бути здійснено шляхом оборотного зміни структури ДНК за рахунок відщепленні рухомих генетичних елементів, а потім вбудовування їх в інші місця геному. При цьому може змінюватися характер регуляції транскрипції як генетичних локусів, що входять до складу переміщуються ділянок, так і сусідніх з ними локусів. Можливо також вбудовування генетичного елемента в ту саму ділянку ДНК, звідки він був вищеплен, але в інвертованому вигляді. Така інверсія використовується іноді як спосіб регуляції розвитку фагів, а також освіти джгутикових антигенів у сальмонел.