Вивчення біосинтезу амінокислот штамом Вrevibacterium methylicum при зростанні на середовищах містять

ВИВЧЕННЯ БІОСИНТЕЗУ АМІНОКИСЛОТ ШТАМІВ Вrevibacterium methylicum ПРИ ЗРОСТАННЯ НА СЕРЕДОВИЩАХ, що містить важкі ВОДУ І дейтерій-МЕТАНОЛ.

О. В. Мосіна

Московська державна академія тонкої хімічної технології ім. М.В. Ломоносова, м. Москва, просп. Вернадського, д.86.

Представлені дані по біосинтезу дейтерій-мічених амінокислот L-фенілаланін-які продукують штамом факультативних метилотрофних бактерій B. methylicum. Амінокислоти різного ступеня ізотопної заміщення на дейтерій, як секретуються в культуральну рідину в процесі ферментації штаму-продуцента, так і в складі гідролізатів сумарних білків біомаси, були отримані за рахунок біоконверсії СН ₃ ОН / CD ₃ OD на середовищах, що містять різні концентрації важкої води, включаючи 24,5 об. % D ₂ O аж до 98 об.% D ₂ O. Для вивчення ступенів включення дейтерію в амінокислоти використовували метод мас-спектрометрії електронного удару метилових ефірів N-диметиламіно-5-нафталін-сульфонільного (дансільних) похідних амінокислот. Ступені ізотопного включення дейтерію в фенілаланін, секретується в культуральну рідину і в складі гідролізатів сумарного білка змінюються від 27,5 до 95% залежно від концентрації D ₂ O в середовищі. Показано, що при ферментації поряд з основним продуктом біосинтезу (фенілаланін) в культуральній рідині накопичуються інші амінокислоти, такі як аланін, валін і лейцин (ізолейцин).

ВСТУП

Метод мічення стабільними ізотопами є ключовим напрямком у різнопрофільних біохімічних дослідженнях з використанням амінокислот та інших біологічно активних сполук (БАС) [1,2]. Тенденції до кращого застосування стабільних ізотопів, зокрема, дейтерію-порівнянні з радіоактивними аналогами обумовлені такими їх перевагами, як відсутністю радіаційної небезпеки і можливістю визначення локалізації мітки в молекулі прямими методами. Інтенсивний розвиток ізотопно-чутливої ​​техніки, перш за все спектроскопії ядерного магнітного резонансу (ЯМР), інфрачервоної та лазерної спектроскопії та мас-спектрометрії (МС), за останні роки дозволило значно удосконалити проведення численних біологічних досліджень de novo, а також вивчати структуру і механізм дії клітинних БАС на молекулярному рівні [3,4].

Починаючи з перших експериментів Катца з співавт. [5] з культивування мікроводоростей Chlorella на важкій воді тривають розробки методичних підходів щодо отримання БАС, в тому числі амінокислот, мічених дейтерієм. Потреби в дейтерированного амінокислотах обумовлені їх важливою роллю у різноманітних біохімічних і медичних дослідженнях, а також можливістю їх використання в синтезах широкого кола дейтерированного БАС, наприклад, в синтезах пептидних гормонів і нейротрансмітерів з використанням L-фенілаланіну [6-8].

В даний час біотехнологічний потенціал метилотрофних бактерій для отримання амінокислот, мічених стабільними ізотопами, зокрема, дейтерієм, загальновизнаний [9]. Сучасні методи мутагенезу та селекції відкривають широкі перспективи для отримання нових З _{1-утилізують} штамів-продуцентів амінокислот, придатних для зростання на D ₂ O. У зв'язку з цим, великий практичний інтерес представляє дослідження процесів біосинтезу амінокислот генетично маркованими штамами метилотрофних бактерій, які стійкі до високих концентрацій дейтерію в ростових середовищах.

Раннє нами була вивчена можливість використання штаму факультативних метилотрофних бактерій B. methylicum для отримання дейтерированного фенілаланіну [10]. На відміну від традиційних штамів-продуцентів фенілаланіну, у яких порушені активності префенатдегідратази або дезоксиарабиногептулозофосфатсинтетазы, унікальність цього штаму полягає в тому, що для біосинтезу L-фенілаланіну необхідний L-лейцин.

Метою цієї роботи було вивчення рівнів включення дейтерію в молекули амінокислот штаму B. methylicum як секретується в культуральну рідину, так і амінокислот в складі білкових гідролізатів біомаси цих бактерій на середовищах з різним вмістом СН ₃ ОН / CD ₃ OD і D ₂ O в них.

УМОВИ ЕКСПЕРИМЕНТУ.

Бактеріальні штами. Дослідження проводили з L-лейцин-залежним штамом факультативних метилотрофних бактерій B. methylicum, продуцентом L-фенілаланіну. Штам був отриманий з колекції культур Всеросійської колекції промислових мікроорганізмів (ВКПМ) Державного науково-дослідного інституту генетики та селекції промислових мікроорганізмів.

Для приготування поживних середовищ з різним вмістом дейтерію в них (див. табл.1) використовували безводні солі кваліфікації "х.ч.", D ₂ O (99,9% D) і СD ₃ ОD (97,5% D), отримані з Російського науково-дослідного центру "Ізотоп" (Санкт-Петербург, РФ). За необхідності важку воду очищали від шкідливих домішок, переганяючи її над перманганатом калію. Для отримання похідних амінокислот використовували N-діметіламінонафталін-5-сульфохлорид (дансілхлорід) (Sigma, CША) і діазометан. Діазометан отримували з N-нітрозометілмочевіни (Мerck, Німеччина).

Культивування штаму В. methylicum проводили на мінімальних середовищах М9 [11] як описано в роботі [10].

Екстракцію ліпідів проводили сумішшю хлороформ-метанол (2:1) за методом Блай і Дайера [12].

Лужний гідроліз білка. Білок (4-5 мг) гідролізувати в запаяних скляних ампулах в 5 мл 4 н. Ba (OH) ₂ протягом 24 год при 110 ⁰ С. Гідролізати суспендованих в 20 мл гарячої дист. води і нейтралізували 2 н. розчином H ₂ SO ₄ з наступним відділенням осаду центрифугуванням (10 000 об / хв, 5 хв). Гідролізати упаривали в роторному випарнику при 40 ⁰ С.

Отримання дансіламінокіслот культуральної рідини. До 200 мг ліофілізованих препаратів культуральної рідини в 5 мл 2 м. NaHCO ₃ (2 10 ^-3 моль) рН 9-10 дробовими порціями при перемішуванні додавали 320 мг (1,2 10 ^-3 моль) дансілхлоріда в 5 мл ацетону. Реакційну суміш витримували при перемішуванні при 40 ⁰ С протягом години, потім підкисляють 2 м. розчином HCL до рН 3,0 і екстрагували етилацетатом (3 рази по 5 мл). Об'єднаний екстракт промивали водою до значення рН 7,0, сушили безводним сульфатом натрію, розчинник видаляли при 10 мм. рт. ст.

Дансіламінокіслоти у складі білкових гідролізатів B. methylicum отримували як описано в роботі [9].

Отримання метилових ефірів дансіламінокіслот. До 20 мл 40%-ного КОН у 40 мл ефіру додавали 3 г вологою нітрозометілмочевіни і перемішували на водяній бані з льодом протягом 15-20 хв. Після інтенсивного газовиділення ефірний шар відокремлювали і промивали крижаною водою до рН 7,0, сушили безводним NaSO ₄ і обробляли їм препарати дансілпроізводних амінокислот у складі культуральної рідини і гідролізатів білка біомаси.

Кількісне визначення L-фенілаланіну в культуральній рідині проводили на спектрофотометрі "Beckman DU-6" (США) при 540 нм після обробки препаратів культуральної рідини нінгідрином, як зазначено у роботі [10].

Мас-спектри електронного удару похідних амінокислот отримані на приладі "MB-80A" (Hitachi, Японія) при енергії іонізуючих електронів 70 еВ.

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ.

Отримання дейтерій-мічених амінокислот і їх мас-спектрометричний аналіз.

Дані по зростанню штаму B. methylicum і максимального рівня накопичення фенілаланіну в культуральній рідині на середовищах з 2 об.% СН ₃ ОН (СD ₃ OD), що містять східчасто збільшуються концентрації D ₂ O представлені в таблиці 1. Як видно з даних таблиці, зростання досліджуваних бактерій на середовищах із зростаючими концентраціями важкої води супроводжувався зміною виходів біомаси, часу клітинної генерації та тривалості лаг-фази при збереженні здатності синтезувати і накопичувати фенілаланін в культуральної рідини. Тому було необхідно вивчити, як змінюються ступеня включення дейтерію в фенілаланін і амінокислотні залишки сумарних білків біомаси B. methylicum в цих умовах.

ТАБЛИЦЯ 1.

Вплив ізотопного складу середовища на ріст штаму B. methylicum та рівень накопичення L-фенілаланіну в культуральній рідині.

Для визначення ступеня включення дейтерію в амінокислоти методом мас-спектрометрії електронного удару використовували метилові ефіри данс-амінокислот, які хімічно стабільні й дають інтенсивні піки молекулярних іонів у мас спектрах [13]. Як приклад на мал.1 показана фрагментація метилового ефіру дансілфенілаланіна при електронному ударі. У мас-спектрах цього похідного, як правило, чітко детектується пік молекулярного іона метилового ефіру дансілфенілаланіна М +. з m / z 412. Пік амінного фрагмента А має невисоку інтенсивність, а пік аміноацільного фрагмента У вкрай низьку або взагалі відсутній (див. рис. 1). Інтенсивності піків амінних А і аміноацільних У фрагментів інших похідних амінокислот, наприклад присутніх в культуральній рідині аланіну, валіну та лейцину (ізолейцин) при електронному ударі також порівнянні. Крім вищеозначених піків, в мас-спектрах електронного удару метилових ефірів данс-амінокислот фіксуються піки з m / z 250, 234, 170, які відповідають дансільному фрагменту і продуктів його розпаду до N-діметіламінонафталіна.

Модифікація методу отримання метилових ефірів данс-амінокислот полягала в прямій обробці препаратів культуральної рідини, отриманої після відділення клітин, дансілхлорідом і діазометаном. У результаті застосування цього підходу вдалося отримати чітко інтерпретовані мас-спектри електронного удару метилових ефірів данс-амінокислот в присутності слідових кількостей низькомолекулярних метаболітів середовища та супутніх амінокислот не вдаючись до їх попередньою хроматографічного розділення та очищення. Слід зазначити, що в умовах проведення дансільной деріватізаціі, для основної амінокислоти лізину характерне утворення ді-дансільних похідних, а для тирозину також відбувається додаткове дансілірованіе по гідроксильної-ОН-групі. При етерифікації амінокислот діазометаном не виключено додаткове N-метилювання по а-NH _2-групі амінокислот, що призводить до появи у мас-спектрі метилових ефірів данс-амінокислот піків, що відповідають сполукам з молекулярною масою на 14 масових одиниць більше вихідних [14]. В якості прикладу на рис. 2, б наведено мас-спектр секретованої фенілаланіну і супутніх амінокислот у складі деріватізірованной культуральної рідини в умовах експерименту 5 (див. табл.1, досвід 5), де концентрація D ₂ О в середовищі досягає 49 об.% (Спектр наведено щодо контрольних умов (а), де використовували звичайну воду і метанол). З рис.2, б видно, що в цих умовах величина піку молекулярного іона похідного фенілаланіну (М +. З m / z 414,2) збільшується в порівнянні з контрольними умовами (М +. З m / z 412,0) на 2 , 2 одиниці, що становить 27,5% від загальної кількості атомів водню в молекулі. Пік з m / z 400, зафіксований в мас-спектрі культуральної рідини (рис.2, б) найімовірніше відповідає продукту відщеплення метильної групи-СН ₃ від дейтерированного похідного фенілаланіну.

Мас-спектр культуральної рідини, отриманої на середовищі, що містить 73,5 об.% D ₂ О і 2 об. % СН ₃ ОН після обробки дансілхлорідом і діазометаном представлений на рис. 3, а. Присутність в мас-спектрі цього зразка піку молекулярного іона метилового ефіру данс-фенілаланіну з М +. з m / z 416,1 (замість 412 в контролі) вказує на збільшення маси фенілаланіну на 4,1 одиницю, тобто, 51,2% атомів в молекулі фенілаланіну заміщені на дейтерій (рис. 3, а). Необхідно підкреслити, що вишеобозначенние атоми дейтерію включаються в молекулу фенілаланіну за рахунок процесу біосинтезу de novo, тобто з вуглецевого скелету молекули, так як малоймовірно, що вони замістити в в ході виділення амінокислоти з культуральної рідини або при хімічній модифікації фенілаланіну. Що стосується протонів (дейтеронов) при гетероатома в NH ₂ -, NH-, і-COOH групах амінокислот, то вони за рахунок легкості дисоціації легко обмінюються на дейтерій навіть при розчиненні амінокислот в D ₂ O. Так як всі етапи, пов'язані з обробкою культуральної рідини, що містить дейтерій і її хімічної модифікації проводилися з використанням немічених компонентів, розчинників і в т.ч. водних розчинів, то ці протони (дейтерони) через легкості дисоціації найважче піддаються точному підрахунку і контролю. Це могло служити причиною невеликої розбіжності результатів при підрахунку ступенів дейтерірованності амінокислот.

У всіх досліджуваних зразках культуральної рідини B. methylicum крім основної секретируемой амінокислоти (фенілаланін), виявлені домішки (на рівні 3-5 мМ) метаболічно пов'язаних з ним аланіну, валіну та лейцину (ізолейцин) (див., наприклад рис 3, а). Як видно з рис.3, а, ізотопний склад аланіну характеризувався збільшенням молекулярної маси на 2,5 одиниці, валіну-3, 5 одиниці, а лейцину (ізолейцин) -4,6 одиницями. Таким чином, на відміну від фенілаланіну, кількість включеного дейтерію в останніх трьох амінокислотах зберігає стабільне сталість у досить широкому інтервалі концентрацій D ₂ O у середовищі (від 49 об.% До 98 об.%).

Контроль за включенням дейтерію в фенілаланін за рахунок асиміляції дейтерометанола при зростанні бактерій на середовищі, що містить звичайну воду і 2% СD ₃ OD (відповідають досвіду 2, табл.1) показав незначне кількість дейтерію, яке надходить в молекулу фенілаланіну разом з вуглецем СD ₃ OD . Відсоток дейтерірованія фенілаланіну був оцінений за величиною піку 413 за вирахуванням вкладу піку домішки природного ізотопу (не більше 4%, мас-спектр не наведено). Отриманий результат може бути обумовлений розбавленням дейтерієво мітки за рахунок протікання як біохімічних процесів, пов'язаних з розпадом дейтерій-метанолу при його засвоєнні клітиною, так і реакціями ізотопного обміну і дисоціації. Наприклад, з чотирьох атомів дейтерію, наявних у молекулі СD ₃ OD, лише атом дейтерію при гідроксильної групи - OD самий рухливий і тому легко дисоціює у водному середовищі з утворенням СD ₃ OH. Три залишилися атомів дейтерію в складі СD ₃ OH входять до циклу ферментативного окислення метанолу, який також міг призвести до втрати дейтерію за рахунок утворення сполук більш окислених, ніж метанол. Зокрема, отриманий результат за рівнем включення дейтерію в фенілаланін підтверджує класичну схему ферментативного окислення метанолу до формальдегіду в клітинах метілотрофов, який лише після цього асимілюється у даного штаму метилотрофних бактерій рібулозомонофосфатним шляхом фіксації вуглецю [15].

Так як базовий штам продуцент фенілаланіну був ауксотрофом по лейцину, то очевидно, що рівні включення дейтерію в секретується L-фенілаланін на тлі максимальних концентрацій важкої води, можуть бути нижче теоретично допустимих, внаслідок функціонування в клітині ряду біохімічних реакцій, пов'язаних з асиміляцією протоновану L- лейцину ззовні. Зазначена особливість проявляється при біосинтезі L-фенілаланіну на дейтерированного середовищі, в якій крім метанолу джерелом додаткових протонів є немічених лейцин. Так, в фенілаланіну, отриманому з середи, що містить 98 об.% D ₂ О і 2 об.% СН ₃ ОН, тільки шість атомів (з восьми обговорюваних) у молекулі біосинтетичних заміщені на дейтерій (М +. З m / z 418 замість 412) (Мас-спектр наведено на рис. 3, б). Ці два незаміщений атома водню могли походити з лейцину та метанолу, проте автори не виключають, що подібний ефект є результатом не асиміляції протоновані субстратів, а внеском протонів солей у складі ростової середовища. Слід підкреслити, що в цьому мас-спектрі фіксується пік збагаченого дейтерієм бензильного фрагмента з m / z 97 (замість 91 у контролі), що вказує на те, що місцями локалізації атомів дейтерію в молекулі фенілаланіну є положення С1-С6 ароматичних атомів і суміжну з ними положення при вуглецевому атомі b. Причому, як мініум чотири з них можуть бути локалізовані в самому бензольному кільці молекули фенілаланіну.

Мас-спектрометричний аналіз сумішей дейтерій мічених амінокислот білкових гідролізатів B. methylicum.

Загальні принципи вивчення ступеня дейтерірованності амінокислот при даному способі введення мітки були також продемонстровані на прикладі аналізу складних мультикомпонентного сумішей, отриманих після гідролізу білка біомаси. Як приклад на рис.4, б (щодо контрольних умов (а) наведено мас-спектр деріватізованного білкового гідролізату, отриманого з середи, що містить 49 об.% D ₂ O і 2 об.% СН ₃ ОН (табл.1, досвід (5)). Як видно з рис.4, до десяти амінокислот можуть бути ідентифіковані в мас-спектрі гідролізату білка, отриманого після обробки дансілхлорідом і діазометаном. Для індивідуальних амінокислот білкових гідролізатів кількість включених атомів дейтерію по скелету молекули варіює в межах 49% - ної концентрації D ₂ O і становить від 36,2% для L-валіну до 45,0% для L-фенілаланіну (рис. 4, б).

Внаслідок того, що великий інтерес представляє використання даного штаму метилотрофних бактерій для напрацювання уніформно міченого білка і амінокислот, було необхідно вивчити рівні включення дейтерію в амінокислоти білкових гідролізатів B. methylicum, при зростанні бактерій на середовищі, що містить максимальні концентрації важкої води. Дані за ступенями включення дейтерію в амінокислоти білка B. methylicum, отриманого з середи, що містить 98 об.% D ₂ O і 2 об.% СD ₃ ОD (табл.1, досвід (10)) представлені в таблиці 2. Як видно з таблиці 2, для таких амінокислот, як гліцин і аланін дейтерірованіе в цих умовах близько до уніформному, про що свідчать високі ступені включення дейтерію в ці амінокислоти, які складають 90% і 97,5% відповідно. Ступінь включення дейтерію в L-фенілаланін у складі гідролізатів білка біомаси в умовах максимально насиченою дейтерієм середовища також висока, що становить 95% (приблизно 8 атомів водню в молекулі заміщені на дейтерій). Низькі ступеня включення дейтерію в інші амінокислоти білку, перш за все в лейцин (ізолейцин) (49%) в цих умовах можуть бути пояснені за рахунок ауксотрофності штаму в лейцин, який додавали в середовище культивування в протоновану вигляді. Мабуть, в умовах ауксотрофності по лейцину внесок атомів дейтерію, синтезованих de novo в ступінь дейтерірованності самого лейцину, а також метаболічно близьких з ним амінокислот незначний.

ТАБЛИЦЯ 2.

Ступені ізотопного включення дейтерію в амінокислоти білка B. methylicum, отриманого на середовищі, що містить 98 об.% D ₂ O і 2 об.% СD ₃ OD.

Таким чином, проведені дослідження показали високу ефективність використання штаму факультативних метилотрофних бактерій B. methylicum для отримання дейтерій-мічених амінокислот різного ступеня ізотопної заміщення на дейтерій, в тому числі і уніформно мічених. Ці амінокислоти можна виділяти як з культуральної рідини, так і з гідролізатів біомаси. Вибір штаму для цих досліджень уявляють автори виправданим, так як B. methylicum характеризується стійкістю до максимальних концентрацій важкої води в середовищі.