Ідентифікація генів біосинтезу ектоіна у метилотрофних бактерій Methylarcula marina

Аніонні органічні осмоліти, що містять фосфатні або сульфатні групи

Трегалоза

и S.ambivalens; Pyrobaculum aerophilum; Sulfolobus solfataricus і S.ambivalens;

емейства Thiocapsa, Thiocystis, Chromatium, а Thermoproteus tenax; Thermoplasma acidophilum; Actinopolyspora halophila; Scytonema species c емейства Thiocapsa, Thiocystis, Chromatium, а також Azotobacter chroococcum, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Rhizobium meliloti, Chromohalobacter israelensis; Desulfovibrio halophilus; Rhodothermus obamensis; Narialba magadii T. Thermophilus; Sinorhizobium meliloti

Galinski, 1995;

da Costa et al., 1998

Page-Sharp et al., 1999

Nunes et all., 1995;

Elbein et all., 2003

Goufii et all., 1999

Сахароза

Synechocystis sp., Anabaena sp., Phormidium autumnale; Scytonema species;

Chroococcidiopsis . sp. Sinorhizobium meliloti

Reed et al., 1986;

Hershkovitz et al., 1991;

Page-Sharp et al., 1999;

Desplats et all., 2005.

a -карбамоил- L -глутамин-1-амид N a-карбамоїл-L-глутамін-1-амід

Ectothiorhodospira marismortui

Oren et ., 1991 . al., 1991.

- α -ацетил-глутаминил-глутаминамид N - α-ацетил-глутамініл-глутамінамід

Sinorhizobium ; Rhizobium meliloti; Rhizobium ; Pseudomonas leguminosarum; Pseudomonas

; пурпурные сульфобактерии Rhizobium aeruginosa; пурпурні сульфобактеріі Rhizobium , P . fluorescens , P . aeruginosa , P . putida , P . mendocina meliloti, P. fluorescens, P. aeruginosa, P. putida, P. mendocina

Smith and Smith, 1989; D'Souza-Ault et al., 1993; Kets et al., 1996.

Манносахароза

Agrobacterium tumefaciens

Smith et ., 1990 al., 1990

Цвіттеріоние органічні осмоліти

Гідроксіектоін

Halomonas elongata; Chromohalobacter salexigens; Nocardiopsis halophila;

N. dassonvillei; Micrococcus halobius; Marinococcus halophilus,

Marinococcus sp. M52; Brevibacterium casei, B. iodinum, B. linens,

Streptomyces chrysomallus, S. griseolus; Salibacillus salexigens

Roberts, 2004

Frings et al., 1993

Severin et al., 1992

Ектоін як осмоактівное речовина вперше виявлений Галинским Е. Галінським у фототрофних пурпурової По химической структуре эктоин может быть классифицирован как частично гидратированная иминокислота (1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пиримидин карбоксилат). бактерії Ectothiorhodospira halochloris (Galinski et al., 1985). По хімічній структурі ектоін може бути класифікований як частково гідратованих імінокіслота (1,4,5,6-тетрагідро-2-метил-4-піримідин карбоксилат).

Накопичення ектоіна показано для різних галофільних і галотолерантних Г ⁺ і Г ^- , Brevibacterium и Marinococcus , а также Halomonas , Pseudomonas и Vibrio (табл.1). еубактерій, включаючи види Nocardiopsis, Brevibacterium і Marinococcus, а також Halomonas, Pseudomonas та Vibrio (табл.1). ., 1992, 2005; Peter et al ., 1998, Malin and Lapidot , 1996). Цікаво відзначити, що негалофільние еубактеріі накопичують ектоін, транспортуючи його з середовища в гіперосмотичним умовах (Jebbar et al., 1992, 2005; Peter et al., 1998, Malin and Lapidot, 1996).

2.1 Гени і ферменти біосинтезу ектоіна і гідроксіектоіна

Шлях біосинтезу ектоіна, є відгалуженням у шляхи синтезу амінокислот аспартатного сімейства. -полуальдегид ( A П A ) превращается в L -2,4-диаминобутират (ДАБ) с участием ДАБ-аминотрансферазы, ДАБ ацетилируется в N g -ацетил-2,4-диаминобутират (АДАБ) при участии ДАБ-ацетилтрансферазы. У цьому шляху аспартат-b-полуальдегід (A П A) перетворюється в L -2,4-діамінобутірат (даб) за участю даб-амінотрансферази, даб ацетилюється в N g-ацетил-2 ,4-діамінобутірат (Адаб) за участю даб -ацетилтрансферази. ., 1990). Циклизация Адаб в ектоін каталізується ектоінсінтазой (Peters et al., 1990). ( Peters et al ., 1990), гетеротрофов Halomonas elongata ( Canovas et al ., 1998), Halobacillus dabanensis ( Zhao et al ., 2006), Bacillus pasteurii (Kuhlmann and Bremer, 2002) и морской бактерии Marinococcus halophilus (Louis and Galinski, 1997) (Рис. 1). Даний шлях підтверджений ензиматичних для фототрофи Ectothiorhodospira halochloris (Peters et al., 1990), гетеротрофів Halomonas elongata (Canovas et al., 1998), Halobacillus dabanensis (Zhao et al., 2006), Bacillus pasteurii (Kuhlmann and Bremer, 2002) та морський бактерії Marinococcus halophilus (Louis and Galinski, 1997) (Мал. 1).

У Brevibacterium linens (Bernard et al., 1993), Brevibacterium epidermis DSM 20659 (Onraedt et al., 2004), Brevibacterium sp. путь (Nagata et al., 1998), Streptomyces parvulus (Inbar and Lapidot, 1988) шлях біосинтезу ектоіна починається з Кроме глутамату. Крім аспартату і в глутамату, в як попередника може використовуватися как аспарагін, як показано и Streptomyces clavuligerus (Malin and Lapidot, 1996). для Streptomyces griseus і Streptomyces clavuligerus (Malin and Lapidot, 1996).

Гени біосинтезу ектоіна охарактеризовано у грампозитивних помірно галофільних Zhao бактерії Marinococcus halophilus (Louis and Galinski, 1997), Bacillus pasteurii (Kuhlmann and Bremer, 2002), Halobacillus dabanensis (Zhao et ., 2006), грамотрицательных al., 2006), грамнегативних ранее Halomonas elongata DSM 3043) (Canovas et al., 1997) и Halomonas elongata (Canovas et al., 1998) и бактерій Chromohalobacter salexigens (раніше Halomonas elongata DSM 3043) (Canovas et al., 1997) та Halomonas elongata (Canovas et al., 1998) та розташовані в одному где оперон ectABC, де А ген ect А ДАБ - ацетилтрансферазу , а кодує L-2, 4 - даб - ацетилтрансфераза, а В гени ect У С і ect З ДАБ - аминотрансферазу кодують L-2, 4 - даб - амінотрансферазу эктоинсинтазу , соответственно . Таким образом, путь биосинтеза эктоина достаточно консервативен в отношении ферментов и организации ect -генов. і L-ектоінсінтазу, відповідно. Таким чином, шлях біосинтезу ектоіна досить консервативний у відношенні ферментів і організації ect-генів.

Рис. 1. Шлях біосинтезу ектоіна і гідроксіектоіна у галотолерантних бактерій (за Peters et al., 1990; Galinski, 1995; Ventosa et al., 1998). EctA - ДAБ-ацетилтрансфераза, EctB - ДAБ-амінотрансфераза, EctC - ектоінсінтаза і EctD - ектоінгідроксілаза.

). Біосинтез гідроксіектоіна здійснюється безпосереднім гідроксилюванням ектоіна ектоінгідроксілазой (EctD). идентифицирован у Streptomyces До справжнього моменту ген ectD ідентифікований у Streptomyces ( Prabhu chrysomallus (Prabhu et ., 2004), Chromohalobacter salexigens (Garc í a-Estepa et al., 2004), Chromohalobacter salexigens (Garc í a-Estepa et ., 2006 ) и Salibacillus al., 2006) та Salibacillus (Bursy et salexigens (Bursy et ., al., 2007).

g -ацетил-ДАБ превращается в гидроксиэктоин через 3-гидрокси- N g -ацетил-ДАБ без участия эктоина ( Canovas Можливо, існує також альтернативний шлях, в якому N g-ацетил-даб перетворюється на гідроксіектоін через 3-гідрокси-N g-ацетил-даб без участі ектоіна (Canovas et ., 1999). al., 1999). Але цей шлях ензиматичних не підтверджений.

Ферменти біосинтезу ектоіна. . elongata и частично охарактеризованы ( Ono Ферменти біосинтезу ектоіна були очищені з H. Elongata і частково охарактеризовано (Ono et ., 1999). al., 1999). Б-аминотрансфераза является гомогексамером с молекулярной массой субъединицы 44 кДа. 2,4-Д A Б-амінотрансфераза є гомогексамером з молекулярною масою субодиниці 44 кДа. Б-аминотрансфераза является пиридоксальфосфат-зависимым ферментом, и требует присутствия ионов К ⁺ для активности и стабильности, что обусловлено возможным наличием в белке специфических связывающих участков для этого иона. Д A Б-амінотрансфераза є піридоксальфосфат-залежним ферментом, і вимагає присутності іонів К ⁺ для активності і стабільності, що зумовлено можливою наявністю в білку специфічних зв'язуючих ділянок для цього іона. Залежність від калію встановлена ​​для багатьох ферментів галофільних архей і еубактерій (Toney et ., 1995). al., 1995). . elongata специфична к L -глутамату как донору аминогрупп, рН _opt - 8.6-8.7, К _м для L -глутамата 9.1 мМ, для D , L -аспартатполуальдегида 4.5 мМ. Даб-амінотрансфераза H. Elongata специфічна до L-глутамату як донору аміногруп, рН _opt - 8.6-8.7, К _м для L-глутамату 9.1 мМ, для D, L-аспартатполуальдегіда 4.5 мМ. = 6.2. Ізоелектрична точка р I = 6.2.

В даний час перетворення аспартатполуальдегіда в даб відомо у кількох не синтезують ектоін бактерій - Xanthomonas . sp. і Acinetobacter ( Ikai baumannii (Ikai and , 1997; Rao Yamamoto, 1997; Rao et ., 1969). al., 1969). участвует в биосинтезе компонента клеточной стенки -1,3-диаминопропана. Даб-амінотрансфераза з А. baumannii бере участь у біосинтезі компонента клітинної стінки -1,3-діамінопропана. -глутамату как донору аминогрупп, обладает сходными с ферментом из H . elongata значениями рН оптимума, Км для ДАБ и 2-оксоглутарата ( Ikai Цей фермент також специфічний до аспартатполуальдегіду як акцептор аміногруп і L-глутамату як донору аміногруп, має подібними з ферментом з H. Elongata значеннями рН оптимуму, Км для даб і 2-оксоглутарата (Ikai and , 1997). Yamamoto, 1997). . elongate и А. baumannii , ДАБ-аминотрансфераза из Xanthomonas Однак, на відміну від ферментів з H. Elongate і А. baumannii, даб-амінотрансфераза з Xanthomonas ., использует L -аланин как донор аминогрупп ( Rao sp., використовує L-аланін як донор аміногруп (Rao et ., 1969). al., 1969).

. elongata была очищена в 400 раз, однако в гомогенном состоянии фермент получить не удалось вследствие его нестабильности. Даб-ацетилтрансфераза з H. Elongata була очищена в 400 разів, однак у гомогенному стані фермент отримати не вдалося внаслідок його нестабільності. Кінетичні константи також не визначені. Молекулярна маса ферменту, певна гель фільтрацією, склала близько 45 кДа (Ono et ., 1999). al., 1999).

в качестве стабилизаторов. Ектоінсінтаза була очищена до гомогенного стану в присутності 1 мМ даб і 2 М NaCl, як стабілізатори. ), использовавшемся при гель-фильтрации, активность фермента не найдена. Фермент є гомодимера з молекулярною масою субодиниці 19 кДа, але в буфері з високою осмолярністю (0.5 М NaCl), що використався при гель-фільтрації, активність ферменту не знайдена. Тому неясно, чи дійсно нативна ектоінсінтаза має молекулярну масу 35 кДа і є гомодимера, або мала місце неспецифічна агрегація мономерів у присутності високої концентрації солі. -аспартата и L -глутамина. Аналіз амінокислотного складу ектоінсінтази виявив підвищений вміст L-аспартату і L-глутаміну. Д A Б, по-видимому, N -ацетильная группа в a -положении не участвует в циклизации молекулы. Фермент вельми специфічний до A Д A Б, мабуть, N-ацетільная група в a-положенні не бере участь в циклізації молекули. ) составила 4.2 - 4.4. Ізоелектрична точка ферменту (р I) склала 4.2 - 4.4. Передбачається, що лімітуючим ланкою биосинтетической послідовності ектоіна є синтез даб за участю даб-амінотрансферази. . elongata Це підтверджує факт відсутності даб в клітинах H. Elongata 3 ( Ono KS 3 (Ono et ., 1998). al., 1998).

. elongat а имеют близкие параметры для проявления максимальной активности: рН 8.2 - 9.0, t = 15 - 20 º С и 0.4 - 0.5 М NaCl . Всі три ферменти шляхи синтезу ектоіна у H. Elongat а мають близькі параметри для прояву максимальної активності: рН 8.2 - 9.0, t = 15 - 20 º С і 0.4 - 0.5 М NaCl. , чем при тех же концентрациях NaCl ( Ono Тим не менш, даб-амінотрансфераза більш активна в присутності 0.01 - 0.5 М KCl, ніж при тих самих концентраціях NaCl (Ono et ., 1999). al., 1999). . elongata Оптимальні концентрації солі для активності трьох ферментів нижче, ніж передбачалося виходячи з галотолерантності H. Elongata 2581, что, очевидно, связано с относительно низкой внутриклеточной концентрацией свободных ионов. DSM 2581, що, очевидно, пов'язано з відносно низькою внутрішньоклітинної концентрацією вільних іонів. ⁺ в клетках галофильных эубактерий Vibrio Так, внутрішньоклітинний рівень Na ⁺ в клітинах галофільних еубактерій Vibrio и Brevibacterium costicola і Brevibacterium ., растущих в присутствии высокой концентрации NaCl , составлял 0.04 - 0.2 М ( Gilboa sp., що ростуть у присутності високої концентрації NaCl, становив 0.04 - 0.2 М (Gilboa et ., 1991; Nagata al., 1991; Nagata et ., 1995). al., 1995).

и частично охарактеризована (Bursy et al ., 2007). Нещодавно ектоінгідроксілаза була очищена з Salibacillus salexigens і частково охарактеризована (Bursy et al., 2007). , соответственно. Фермент являє собою мономер (М. М. 34 кДа) з оптимумом рН і температури 7.5 і 32 ° C, відповідно. . salexigens является 2-оксоглутарат-зависимым ферментом и требует присутствия молекулярного кислорода в реакционной смеси. Ектоінгідроксілаза S. Salexigens є 2-оксоглутарат-залежним ферментом і вимагає присутності молекулярного кисню в реакційній суміші. ( II ), поэтому авторы отнесли данный белок к суперсемейству негемсодержащих Fe ( II )- и 2-оксоглутарат-зависимых диоксигеназ ( EC 1.14.11). В активний центр ектоінгідроксілази входить одна молекула Fe (II), тому автори віднесли даний білок до суперсімейство негемсодержащіх Fe (II) - і 2-оксоглутарат-залежних диоксигеназа (EC 1.14.11). _м для эктоина и 2-оксоглутарата составили 3.5 ± 0.2 и 5.2 ± 0.2 м M , соответственно (Bursy et al ., 2007). Максимальна активність ферменту склала 13.8 Е / мг, K _м для ектоіна і 2-оксоглутарата склали 3.5 ± 0.2 та 5.2 ± 0.2 м M, відповідно (Bursy et al., 2007).

Глава 3 Осмоадаптація аеробних метилотрофних бактерій

Аеробні метилотрофних бактерій використовують метан (метанотрофами), його окислені або заміщені похідні (метілобактеріі) як джерела вуглецю і енергії. Більшість колекційних культур метанотрофами до кінця 80-х років були представлені нейтрофільними негалофільнимі штамами, що ростуть при pH 6.5-7.5 і низької солоності (менше 0.5% NaCl). Виняток становили морські метанотрофами, ростуть при солоності до 3% NaCl (Гальченко та ін, 1986).

., 1987), но вскоре утерян, п озднее, и з образцов ила щелочных озер Тувы удалось выделить галотолерантный алкалофильный метанотроф Methylo microbium alcaliphilu m 20Z, оптимально растущий при рН 9.0 в присутствии 4% NaCl с верхней границей галотолерантности при 9% NaCl (Хмеленина и др., 1996). Перший солезавісімий метанотрофами Methylomicrobium pelagicum був виділений з Саргасового моря (Sieburth et al., 1987), але незабаром загублений, п озднее, та з зразків мулу лужних озер Туви вдалося виділити галотолерантний алкалофільний метанотрофами Methylo microbium alcaliphilu m 20Z, оптимально зростаючий при рН 9.0 в присутності 4% NaCl з верхньою межею галотолерантності при 9% NaCl (Хмеленіна та ін, 1996). ) озера Сасык-Сиваш был выделен умеренно галофильный нейтрофильный метанотроф Methylo microbium modestohalophilum 10 S , растущий при pH 5.5-8.5 и солености от 0.2 до 9% (Калюжная и др., 1998), а также Methylohalobius crimeensis , устойчивый к 15% NaCl (Heyer et al., 2005), из содовых озер Южного Забайкалья были выделены пять штаммов облигатных метанотрофов Methylo microbium buryatense , которые являются алкалотолерантыми галофилами (штаммы 4 G , 5 G и 6 G ) или галотолерантными факультативными алкалофилами (штаммы 7 G и 5 B ) (Калюжная и др., 1999; Kalyuzhnaya et al ., 2001; 2008). З гіперсолоного (14% NaCl) озера Сасик-Сиваш був виділений помірно галофільних нейтрофільний метанотрофами Methylo microbium modestohalophilum 10 S, зростаючий при pH 5.5-8.5 і солоності від 0.2 до 9% (Калюжна та ін, 1998), а також Methylohalobius crimeensis, стійкий до 15% NaCl (Heyer et al., 2005), з содових озер Південного Забайкалля були виділені п'ять штамів облігатних метанотрофами Methylo microbium buryatense, які є алкалотолерантимі галофили (штами 4 G, 5 G і 6 G) або галотолерантнимі факультативними алкалофіламі (штами 7 G та 5 B) (Калюжна та ін, 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001; 2008).

Перші галофільні метілобактеріі були виділені з морських проб і представлені видами роду Methylophaga: М. marina, M. et al ., 1985), M. thalassica (Janvier et al., 1985), M. et al ., 1996), M . limanica (Доронина и др., 1997). sulfidovorans (de Zwart et al., 1996), M. limanica (Дороніна і ін, 1997). et al ., 2003). Методом in situ гібридизації було показано широке поширення бактерій роду Methylophaga в морських зразках (Janvier et al., 2003). , и рН 7.5-8.5 и классифицированные как виды нового рода Methylarcula: M. З лиману Азовського моря і засоленого грунту м. Алушта були виділені в чисті культури помірно галофільні метілобактеріі, оптимально ростуть у присутності 3-6% NaCl, і рН 7.5-8.5 і класифіковані як види нового роду Methylarcula: M. marina та M. et al ., 2000). terricola (Doronina et al., 2000). , рН 7.0-11.0 и температуре 25-29°С, идентифицированых как новые алкалофильные виды рода Methylophaga: М. alcalica и M. З содових озер Південного Забайкалля та Монголії було також виділено два В _{12-залежних} ізоляту метілобактерій, оптимально ростуть в присутності 3-6% NaCl, рН 7.0-11.0 і температурі 25-29 ° С, ідентифіковані як нові алкалофільние види роду Methylophaga: М. alcalica та M. , 2003 a , b ). natronica (Doronina et al, 2003 a, b).

Дослідження цітобіохіміческіх особливостей солезавісімих метанотрофами і метілобактерій показали, що у них реалізуються різні механізми осмоадаптаціі. ., 1999). У гало (алкани) фильной метілотрофов при підвищенні осмолярності змінам хімічний склад мембран, зокрема, зростає відносний вміст негативно зарядженого фосфатіділгліцеріна і зниження частки ФЕА (Khmelenina et al., 1999). Вфосфоліпідну пулі клітин метілобактерій у відповідь на підвищення солоності зростають рівні фосфатіділгліцеріна і кардіоліпіну на тлі зниження частки фосфатидилетаноламін (Троценко та ін, 2007). and Thiemann , 1991). Подібний солезавісімий відповідь на підвищення солоності типовий для багатьох грамнегативних галофільних і галотолерантних еубактерій (Imhoff and Thiemann, 1991). Відомо, що негативно заряджений фосфатіділгліцерін, а також цвіттеріонний фосфатидилхолін володіють стабілізуючою дією на мембрани, формуючи мембранний бішар, сприяє виборчої дифузії катіонів. Таким чином, у метілотрофов реалізується спільний для бактерій «пасивний» механізм підтримки іонного гомеостазу. , кроме того, выявлены дополнительные поверхностные гликопротеиновые слои ( S -слои), полностью покрывающие клеточную стенку бактерий. У солезавісімих метанотрофами роду Methylomicrobium, крім того, виявлені додаткові поверхневі глікопротеїнові шари (S-шари), повністю покривають клітинну стінку бактерій. Надаючи клітинному конверту бактерій додаткову міцність, що особливо актуально у випадку змінюється осмотичного тиску середовища, ці регулярні поверхневі структури, можливо, також беруть участь в осмоадаптаціі. Поряд з підвищенням ригідності клітинних конвертів всі вивчені солезавісімие метілотрофи синтезують низькомолекулярні осмопротекторние з'єднання.

., 1999; Троценко и др., 2007) . П ул этих соединений увеличивался с повышением солености среды культивирования, причем внутриклеточная концентрация эктоина у Mm . al с aliphilum 20Z достигала 1.4 М, глутамата - 0.4 М в пересчете на внутриклеточную воду. Очевидно, противоионом для глутамата служит К ⁺ , поскольку их концентрации в цитоплазме были эквимолярны. Методом ЯМР в клітинах досліджених галофільних і галотолерантних метанотрофами і метілобактерій виявлено присутність ектоіна, сахарози та глутамату (Khmelenina et al., 1999; Троценко та ін, 2007). П вул цих сполук збільшувався з підвищенням солоності середовища культивування, причому внутрішньоклітинна концентрація ектоіна у Mm. al з aliphilum 20Z досягала 1.4 М, глутамату - 0.4 М в перерахунку на внутрішньоклітинну воду. Очевидно, протиіонів для глутамату служить К ^+, оскільки їх концентрації в цитоплазмі були еквімолярної. ., 2003 a , b ). Сумарне внутрішньоклітинний вміст всіх осмопротекторов у досліджених штамів повністю врівноважила осмолярність середовища (Doronina et al., 2003 a, b).

при росте на средах с низкими концентрациями NaCl (2-3%) накапливают только глутамат, а при увеличении солености среды до 10-12% основным осмопротектором является эктоин. Метілобактеріі роду Methylophaga при зростанні на середовищах з низькими концентраціями NaCl (2-3%) накопичують тільки глутамат, а при збільшенні солоності середовища до 10-12% основним осмопротектором є ектоін. Крім того, у M. murata внутрішньоклітинні концентрації глутамату і ектоіна зростали при зниженні температури культивування.

-аспартилполуальдегида с последующим ацетилированием образующегося L -2,4-диаминобутирата (ДАБ) и завершается циклизацией N -ацетил- L -2,4-ДАБ в эктоин. Встановлено, що послідовність реакцій біосинтезу ектоіна у метілотрофов ідентична такої у галофільних гетеротрофів і починається реакцією трансамінування L-аспартілполуальдегіда з наступним ацетилюванням утворюється L -2,4-діамінобутірата (даб) і завершується циклізації N-ацетил-L -2,4-даб в ектоін. Ці реакції катализируются даб-ацетилтрансферазою, даб-амінотрансферази, ектоінсінтазой (Рис.2). . Повна нуклеотидна послідовність генів біосинтезу ектоіна була визначена у M m. 20Z, M . alcalica и M . thalassica . alcaliphilu m 20Z, M. alcalica і M. thalassica. , в состав которого входит дополнительный ген аспартаткиназы (ask) (Reshetnikov et Показано, що в даних бактерій гени синтезу ектоіна організовані в четирехгенний оперон ectABCask, до складу якого входить додатковий ген аспартаткінази (ask) (Reshetnikov et ., 2006; Решетников, 2006 ). al., 2006; Решетніков, 2006). метанотрофа M m . Гени ectABC метанотрофами M m. 20Z были амплифицированы и клонированы в плазмиду pHSG575. alcaliphilu m 20Z були ампліфікувати і клоновані в плазміду pHSG575. . coli , трансформированные полученной плазмидой, накапливали эктоин и росли в присутствии 4% NaCl , что доказывает участие генов ectABC в биосинтезе эктоина (Reshetnikov et Клітини E. Coli, трансформовані отриманої плазмидой, накопичували ектоін і росли в присутності 4% NaCl, що доводить участь генів ectABC в біосинтезі ектоіна (Reshetnikov et ., 2006). al., 2006).

Рис. 2. and Galinski , 1997) Шлях біосинтезу ектоіна і амінокислот аспартатного сімейства у бактерій (Louis and Galinski, 1997)

. У Mm. . alcalica и M . thalassica гены биосинтеза эктоина сцеплены и составляют оперон ectABC-ask, в состав которого входит дополнительный ген аспартаткиназы (ask) (Рис З.). аlcaliphilum 20Z, M. alcalica і M. thalassica гени біосинтезу ектоіна зчеплені і складають оперон ectABC-ask, до складу якого входить додатковий ген аспартаткінази (ask) (Рис З.). ., 2006; Троценко и др., 2007). Наявність додаткового гена ask, можливо, забезпечує відносно незалежний від основного метаболізму контроль синтезу попередника ектоіна - аспартілфосфата (Reshetnikov et al., 2006; Троценко та ін, 2007).

А, EctB и Ect С показало, что у метанотрофа Mm . alcaliphilum 20 Z эти белки имеют больше e сходство с соответствующими белками из метилобактерий M . alcalica и M . thalassica (75-85% гомологии) и низкое сходство (36-63%) с соответствующими ферментами из других галофильных бактерий. Порівняння трансльовані амінокислотних послідовностей білків Ect А, EctB і Ect С показало, що у метанотрофами Mm. Alcaliphilum 20 Z ці білки мають більше e схожість з відповідними білками з метілобактерій M. Alcalica і M. Thalassica (75-85% гомології) і низький схожість (36-63%) з відповідними ферментами з інших галофільних бактерій. Причому ферменти біосинтезу ектоіна метилотрофних бактерій формують єдині кластери на відповідних філогенетичних деревах, що включають ферменти гетеротрофних галлофілов (Решетніков, 2006).

Рис. 3. – ДАБ-ацетилтрансфераза, ectB – ДАБ-аминотрансфераза, ectC – эктоинсинтаза, ectD – эктоингидроксилаза и ask – аспартаткиназа. Організація генів біосинтезу ектоіна. EctA - даб-ацетилтрансфераза, ectB - даб-амінотрансфераза, ectC - ектоінсінтаза, ectD - ектоінгідроксілаза і ask - аспартаткіназа.

А, ectB и ect С позволило выдвинуть гипотезу о высокой консервативности пути биосинтеза эктоина и распространении ect -генов среди бактерий посредством латерального переноса ( Kuhlman and Bremer , 2002). Досить висока подібність нуклеотидних послідовностей генів ect А, ectB і ect З дозволило висунути гіпотезу про високу консервативності шляху біосинтезу ектоіна та розповсюдженні ect-генів серед бактерій за допомогою латерального переносу (Kuhlman and Bremer, 2002).

» (Германия) с использованием гетеротрофной бактерии Halomonas elongata на среде с глюкозой, L -аминокислотами и 12%-ным NaCl . Спосіб отримання ектоіна реалізований фірмою «Biomol» (Німеччина) з використанням гетеротрофною бактерії Halomonas elongata на середовищі з глюкозою, L-амінокислотами і 12%-ним NaCl. способны накапливать до 20% эктоина, т.е. Помірно галофільні метанотрофами при зростанні на середовищі з 6% NaCl здатні накопичувати до 20% ектоіна, тобто (Хмеленина с соавт., 2000; Khmelenina et al ., 1999). вище, ніж у гетеротрофних продуцентів, що ростуть при 12% NaCl (Хмеленіна з співавт., 2000; Khmelenina et al., 1999). Це дозволяє розглядати галофільні метілотрофи як потенційні продуценти ектоіна. Причини розходжень у рівнях осмопротектора можуть бути в генетично детермінованих регуляторних механізмах біосинтезу ектоіна. ., 2006). Так, синтез ектоіна у галофільних метанотрофами відбувається через біохімічний шлях, близький до такого у гетеротрофних галофільних бактерій (Решетніков та ін, 2004; Reshetnikov et al., 2006). . alcaliphilum 20Z организация генов биосинтеза эктоина существенно отличается, поскольку они составляют четырехгенный кластер, включающий дополнительный ген аспартаткиназы. У Mm. Alcaliphilum 20Z організація генів біосинтезу ектоіна істотно відрізняється, оскільки вони становлять четирехгенний кластер, що включає додатковий ген аспартаткінази. Це передбачає присутність у облигатного метанотрофами специфічної ізоформи аспартаткінази, яка, мабуть, забезпечує відносно незалежний від основного конструктивного метаболізму синтез попередників ектоіна - аспартілфосфата і аспартілполульдегіда.

. marina . З вищевикладеного логічно випливає необхідність розшифровки повної нуклеотидної послідовності і порівняльне вивчення генів синтезу ектоіна у M. Marina. -генов у различных изолятов и проследить эволюцию этого биосинтетического пути. Це дозволить оцінити ступінь дивергенції ect-генів у різних ізолятів і простежити еволюцію цього биосинтетического шляху. Крім того, необхідність розуміння принципів організації і регуляції генів і ферментів біосинтезу ектоіна у аеробних метілотрофов диктується практичними завданнями отримання цього біопротектора, все більш активно використовується в медицині, косметиці і науковій практиці в якості водоудерживающей кошти, стабілізатора біомолекул і клітин.

Експериментальна частина

Глава 4 Матеріали та методи дослідження

4.1 Культивування бактерій

arcula ma r ina из коллекции лаборатории метилотрофии ИБФМ РАН. Methyl arcula ma r ina выращивали на среде “ K ” (табл. 2). У роботі використовували чисту культуру аеробної метилотрофних бактерій Methyl arcula ma r ina з колекції лабораторії метілотрофіі ІБФМ РАН. Methyl arcula ma r ina вирощували на середовищі "K" (табл. 2). Середу і розчин мікроелементів стерилізували при 1 атм, 30 хв. Безпосередньо перед засівом у якості джерела вуглецю вносили метиламін в кінцевій концентрації 1%. Культивування проводили в колбах об'ємом 750 мл, що містять 200 мл середовища. . Інокулят додавали в середу в співвідношенні 1:10 і струшували на роторної гойдалці (140 об / хв) при 26 ° C.

1- Blue , BL 21( DE 3) или S 17-1 (штммы E . coli любезно предоставлены к.б.н. Ивашиной Т.В. ИБФМ РАН) выращивали при 37 ^o С на жидкой или агаризованной (1.5% агара “ Difco ”) средах “ LB ” (табл. 2) с разными концентрациями соли (0-5% NaCl ) с добавлением при необходимости селективных антибиотиков: канамицина ( Km ) - 50 мкг/мл, ампициллина ( Amp ) - 100 мкг/мл или хлорамфеникола ( Cm ) - 25 мкг/мл. Escherichia coli XL 1 - Blue, BL 21 (DE 3) або S 17-1 (штмми E. Coli люб'язно надані к.б.н. Івашиної Т. В. ІБФМ РАН) вирощували при 37 ^o С на рідкому або агаризованому (1.5 % агару "Difco") середовищах "LB" (табл. 2) з різними концентраціями солі (0-5% NaCl) з додаванням при необхідності селективних антибіотиків: канаміцину (Km) - 50 мкг / мл, ампіциліну (Amp) - 100 мкг / мл або хлорамфеніколу (Cm) - 25 мкг / мл.

Таблиця 2. Живильні середовища, використані в роботі.

	Компонент середовища	Концентрація
"К"	РО 4 КН 2 РО 4 (NH 4) 2 SO 4 MgSO 4 × 7H 2 O FeSO 4 × 7H 2 O NaCl рН доводили до 7.4 Агар *	2.0 г / л 2.0 г / л 0.025 г / л 0.002 г / л 0.5 г / л 2%
” "LB"	Бакто-тріптон Дріжджовий екстракт NaCl КС l 2 × 6 H 2 O MgCl 2 × 6 H 2 O 4 × 7 H 2 O М gSO 4 × 7 H 2 O Глюкоза	20 г / л 5 г / л 0.584 г / л 0.186 г / л 2.03 г / л 2.463 г / л 3.6 г / л

4.2 Отримання безклітинних екстрактів і визначення концентрації білка

, рН 8.0, содержащий 2.5 мМ MgCl ₂ и 1.5% KCl ) и ресуспендировали в том же буфере. Клітини в експоненційної фазі росту центрифугували (30 хв при 6000 об / хв), двічі відмивали в буфері А (100 мМ трис-Н Cl, рН 8.0, що містить 2.5 мМ MgCl ₂ і 1.5% KCl) і ресуспендували в тому ж буфері. (Англия) мощностью 150 Вт при 20 Гц (3 × 1 мин с минутными перерывами) при охлаждении. Клітини руйнували на ультразвуковому дезінтеграторі MSE (Англія) потужністю 150 Вт при 20 Гц (3 × 1 хв з хвилинними перервами) при охолодженні. С (14000 об/мин в течение 30 мин). Незруйнована клітини відокремлювали центрифугуванням при 4 ^o З (14000 об / хв протягом 30 хв).

, Pollack , 1973) с использованием БСА в качестве стандарта. Концентрацію білка визначали модифікованим методом Лоурі (Schacterle, Pollack, 1973) з використанням БСА як стандарт.

4.3 Визначення активності диаминобутиратацетилтрансферазы

Диаминобутиратацетилтрансферазу (ДАБАцТ) (НФ 2.3.1 .-). , образующимися в ходе реакции ( Srere , 1969). Активність ферменту визначали при 20 ° С за освітою 5-тіо-2-нітробензойною кислоти (ε ₄₁₂ = 13,6 мМ ^-1 × см ^-1) в результаті взаємодії 5,5 '-дітіобіс-(2-нітробензойною кислоти) (ДТНБ ) з сульфгідрильними групами Ко ASH, що утворюються в ході реакції (Srere, 1969). - HCl буфер - 100, рН 8.0, ДТНБ -0.1, ацетил-КоА - 1, К Cl - 200 и L -2,4-диаминобутират (ДАБ) – 10. Реакційна суміш (1 мл) містила (мкмоль): Т ris - HCl буфер - 100, рН 8.0, ДТНБ -0.1, ацетил-КоА - 1, К Cl - 200 і L -2,4-діамінобутірат (даб) - 10. за 1 мин. За одиницю активності (Е) ДАБАцТ брали кількість ферменту, що каталізує утворення 1 мкмоль До oASH за 1 хв. Активність ферменту визначали на реєструючому спектрофотометрі "Shimadzu UV-160" (Японія) в кварцовою кюветі з довжиною оптичного шляху 10 мм. Активність ферменту виражали як число наномолей утворень 5-тіо-2-нітробензойною кислоти на 1 мг білка за хв.

4.4 Виділення та аналіз осмопротекторов

). Низькомолекулярні органічні сполуки екстрагували з клітин, що виросли при різній солоності середовища (0 - 8% NaCl). 100-200 мг клітин (вага сирої біомаси) ресуспендували у 2 мл метанолу, витримували 1 год при струшуванні. Суспензію центрифугували 5 хв при 10000 об / хв. ₂ О (или в дионизованной воде, для анализа на ВЭЖХ) и анализировали методом протонного резонанса, используя ЯМР-спектрометр высокого разрешения WP 80 SY (“ Bruker Spectrospin ”, Швейцария) с рабочей частотой 80 Мгц. Супернатант висушували у вакуумному випарнику, ресуспендували в 0.5 мл 0.01 М розчину малеїнової кислоти в D ₂ О (або в діонізованной воді, для аналізу на ВЕРХ) і аналізували методом протонного резонансу, використовуючи ЯМР-спектрометр високої роздільної здатності WP 80 SY ("Bruker Spectrospin" , Швейцарія) з робочою частотою 80 Мгц. ., 1999). Зміст внутрішньоклітинних метаболітів у зразках визначали порівнянням інтенсивності сигналів протонів метаболітів з інтенсивністю сигналів протонів малеїнової кислоти як внутрішнього кількісного стандарту (Khmelenina et al., 1999).

Екстракція та кількісне визначення ектоіна. ) и при разной солёности среды (0 – 8% NaCl ), когда анализировали накопление эктоина у Methylarcula marina . Ектоін екстрагували з клітин, які виросли без солі (Methylobacterium extorquens) і при різній солоності середовища (0 - 8% NaCl), коли аналізували накопичення ектоіна у Methylarcula marina. 100-200 мг клітин (вага сирої біомаси) ресуспендували у 2 мл метанолу, витримували 1 год при струшуванні. Суспензію центрифугували 5 хв при 10000 об / хв. Супернатант висушували у вакуумному випарнику, ресуспендували в діонізованной воді, для аналізу на ВЕРХ. , 2002). Для кількісного визначення ектоіна використовували модифікований метод ВЕРХ (Kuhlmann and Bremer, 2002). ₂ (3 × 150 мм, 5мкм; Чехия) и элюировали 80% ацетонитрилом (вода/ацетонитрил) со скоростью 1мл/мин. 20 мкл водного розчину зразка наносили на колонку SGX NH ₂ (3 × 150 мм, 5мкм; Чехія) і елюіровалі 80% ацетонітрилом (вода / ацетонітрил) зі швидкістю 1мл/мін. 200”, США) при 190 нм. Реєстрацію піків проводили на УФ-детекторі ("LINEAR UVIS 200", США) при 190 нм. ”. В якості стандарту використовували ектоін фірми "Sigma".

4.5 Молекулярно-біологічні методи

Виділення геномної ДНК

Очищення хромосомної ДНК проводили модифікованим методом (Marmur, 1961). -буфера (табл.3). 1 г сирих клітин ресуспендували в 9 мл TE-буфера (табл. 3). До суспензії додавали лізоцим до кінцевої концентрації 1 мг / мл. Ретельно перемішували і инкубировали 30 хв при 37 ° С. Потім додавали 50 мкл протеїнази К (концентрація 20 мг / мл) і інкубували 30 хв при 37 ° С. ) и инкубировали 60 мин при 65 °С. До суспензії додавали 250 мкл 20% розчину додецилсульфат натрію (SDS) і інкубували 60 хв при 65 ° С. Далі до розчину додавали 1.8 мл 5М NaCl і 1.5 мл 10% цетилтриметиламмонийбромида (ЦТАБ) в 0.7 М NaCl. Лізат витримували 20 хв при 65 ^о С.

У лізат додавали рівний об'єм хлороформу (використовується суміш хлороформу і ізоамілового спирту - 24:1). Ретельно перемішували і центрифугували при 10000 об / хв, 15 хв. Верхню фазу переносили в нову пробірку. Додавали рівний обсяг фенолу, ретельно перемішували і повторно центрифугували для поділу фаз. Верхню фазу, не зачіпаючи інтерфази, переносили в нову пробірку. До розчину додавали рівний об'єм суміші фенолу та хлороформу, перемішували, центрифугували і відбирали верхню фазу. Додавали рівний обсяг хлороформу, розчин перемішували і центрифугували 15 хв при 10000 об / хв. Верхню фазу переносили в нову пробірку і додавали рівний об'єм хлороформу, перемішували і центрифугували. Екстракцію хлороформом проводили кілька разів до просвітління верхньої фази.

Для осадження ДНК з верхньої фази додавали 2.5 обсягу охолодженого 96% етанолу і 0.1 обсягу 3 М ацетату калію, ретельно перемішували і центрифугували 15 хв при 8000 об / хв. Осад ДНК промивали послідовно 80% і 96%-ним розчинами етанолу і підсушували на повітрі. ДНК розчиняли в 0.5 мл ТІ-буфера. Додавали 10 мкл РНК-ази (10мг/мл) і інкубували 1 год при 37 ^о С. Повторювали екстракцію сумішшю фенолу-хлороформу. ДНК з розчину облягали додаванням 2.5 обсягу 96% етанолу і 0.1 обсяг 3 М ацетат калію, перемішували і центрифугували 15 хв при 8000 об / хв. Осад ДНК промивали послідовно 80% і 96% розчинами етанолу і підсушували на повітрі. Отриманий осад ДНК розчиняли в 1 мл ТІ-буфера. Концентрацію ДНК визначали на спектрофотометрі "Shimadzu UV-160" (Японія) при 260/280 нм. Розчини ДНК зберігали при -20 ^о С

Розщеплення ДНК Рестриктази.

” (Литва), используя для каждой эндонуклеазы рекомендованный буфер и соответствующий температурный режим. Гідроліз ДНК різними Рестриктази проводили, згідно з інструкціями фірм "СібЕнзім" (Росія) і "Fermentas" (Литва), використовуючи для кожної ендонуклеази рекомендований буфер і відповідний температурний режим.

ДНК поділяли і візуалізували за допомогою електрофорезу в агарозному гелі, використовуючи в залежності від довжини поділюваних ДНК 0.75% - 1%-ную агарози і 1 × ТВЕ буфер (табл. 3). ^™ 100 bp DNA Ladder ” (“ Fermentas ”). Для оцінки розмірів фрагментів ДНК використовували ДНК-маркери молекулярної ваги "GeneRuler ^™ 100 bp DNA Ladder" ("Fermentas").

Очищення фрагментів ДНК.

Звільнення фрагментів ДНК від компонентів реакції проводили двома способами: безпосередньо з реакційної суміші або з агарозного гелю після електрофорезу.

-НС1 (рН 7.0) и 15 мкл суспензии кварцевого порошка “ Silica ” (100 мг/мл). Для цього до реакційної суміші або вирізаної смужці гелю, що містить потрібний фрагмент ДНК, додавали 5 обсягів 5 М гуанідінтіоціаната, 0.1 М Tris-НС1 (рН 7.0) і 15 мкл суспензії кварцового порошку "Silica" (100 мг / мл). ” добавляли после полного растворения геля. При використанні смужки гелю суспензію "Silica" додавали після повного розчинення гелю. Отриману суміш центрифугували 2 хв при 5000 об / хв. , 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Tris -НС1 рН 7.0) и высушивали. Осад тричі промивали 750 мкл промивного буферу (60% етанол, 80 мМ NaCl, 1 мМ ЕДТА, 10 мМ Tris-НС1 рН 7.0) і висушували. - HCl , рН 8.5). Елюції ДНК проводили в 50 мкл буфера (10 мМ Tris - HCl, рН 8.5). - Up System ” (“ Promega ”, США), согласно рекомендациям фирмы-производителя. В окремих випадках фрагменти ДНК виділяли з агарози і очищали з використанням набору "Wizard SV Gel and PCR Clean - Up System" ("Promega", США), відповідно до рекомендацій фірми-виробника.

Лігированіє фрагментів ДНК.

-2, предварительно раскрытая по сайту Ecor V . Фрагменти ДНК після обробки відповідної рестриктазою клонували у вектор, розкритий за тими ж рестріктаза, або ПЛР-фрагменти клонували у вектор pZero -2, попередньо розкрита по сайту Ecor V.

Реакцію лігування проводили в об'ємі 10 мкл, який містив 1 × буфер для лігування, 50-100 нг ДНК вектора і 3-5-кратний молярний надлишок клонованого фрагмента ДНК, 5 од. ДНК-лігази фага Т4 ("СібЕнзім"). Лігированіє по липким кінців проводили протягом 4-16 год при 14 ° С. Після закінчення реакції ДНК-лігази інактивувати прогріванням при 70 ° С 15 хв. . coli . Лігазну суміш використовували для трансформації в клітини E. Coli.

Лігированіє в кільця фрагментів хромосомної ДНК. . marina , полученные в результате гидролиза эндонуклеазами, лигировали сами на себя в объеме 0.5 мл. Фрагменти хромосомної ДНК M. Marina, отримані в результаті гідролізу ендонуклеаза, лігувати самі на себе в обсязі 0.5 мл. Лігированіє проводили при 16 ° С протягом ночі з разведениями субстратної ДНК 0.1-0.5 мкг / мл та 5 од. ДНК лігази фага Т4. ДНК облягали з лігазну суміші додаванням 2.5 обсягу етанолу і 0.1 обсягу 3М ацетату натрію, центрифугували 30 хв при 14000 об / хв, осад промивали 80% і 96%-ним етанолом і розчиняли в ТЕ-буфері. Отриману ДНК використовували в інвертованій ПЛР.

Отримання компетентних клітин і їх трансформація.

₂ .Ночную культуру клеток (0.1 мл) вносили в 10 мл среды LB и выращивали при интенсивном перемешивании при 37°С до середины логарифмической фазы (А ₆₀₀ = 0.4 – 0.6), охлаждали во льду 10 мин и центрифугировали (5000 об/мин, 5 мин при 4°С). Отримання компетентних клітин із застосуванням CaCl _2. Нічну культуру клітин (0.1 мл) вносили в 10 мл середовища LB і вирощували при інтенсивному перемішуванні при 37 ° С до середини логарифмічної фази (А ₆₀₀ = 0.4 - 0.6), охолоджували в льоду 10 мін та центрифугували (5000 об / хв, 5 хв при 4 ° С). ₂ , выдерживали на ледяной бане 20 мин, центрифугировали в тех же условиях. Обережно видаляли надосадову рідину, осад ресуспендували в 750 мкл 100 мМ Сас l _2, витримували на крижаній бані 20 хв, центрифугували в тих же умовах. ₂ и распределяли по 10 мкл в предварительно охлажденные пробирки. Після видалення супернатанту обложені клітини ресуспендували в 75 мкл 100 мМ Сас l ₂ і розподіляли по 10 мкл в попередньо охолоджені пробірки. Отримані компетентні клітини використовували для трансформації відразу, або після зберігання при 4 ° С не більше 12-24 ч.

Трансформація компетентних клітин. До компетентним клітинам (10 мкл) додавали лігазну суміш або розчин ДНК обсягом 1-5 мкл, поміщали пробірки в лід на 30 хв, а потім швидко переносили у водяну баню 42 ​​° С на 2 хв і охолоджували в льоду 10 хв. и инкубировали при 37°С 1 ч. Клетки осаждали центрифугированием(14000 об/мин, 4°С, 15-30 сек), сливали надосадочную жидкость, ресуспендировали клетки в её остатках (50-100 мкл) и высевали на чашки Петри с агаризованной средой LB, содержащей антибиотики, необходимые для селекции трансформированных клонов. Додавали в кожну пробірку 800 мкл середовища LB і инкубировали при 37 ° С 1 ч. Клітини осаджували центрифугуванням (14000 об / хв, 4 ° С, 15-30 сек), зливали надосадову рідину, ресуспендували клітини в її залишках (50-100 мкл ) і висівали на чашки Петрі з агаризованому середовищем LB, яка містить антибіотики, необхідні для селекції трансформованих клонів.

Виділення плазмід з рекомбінантних клонів.

, 2001). Виділення плазмідної ДНК проводили методом лужного лізису (Sambrook and Russell, 2001). . coli , содержащей плазмиду, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин, ресуспендировали в 250 мкл раствора I (табл. 8) и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. 3-4 мл нічний культури E. Coli, що містить плазміду, центрифугували при 5000 об / хв протягом 5 хв, ресуспендували в 250 мкл розчину I (табл. 8) і інкубували 5 хв при кімнатній температурі. Потім додавали 250 мкл свіжоприготованого розчину II (табл. 8), обережно перемішували до повного просвітлення лізата. До лізат додавали 250 мкл 3 М ацетату калію, перемішували, залишали в льоду на 20 хв і центрифугували (14000 об / хв, 30 хв) при 4 ° С. Надосадову рідину переносили в пробірки, додавали рівний об'єм фенолу, ретельно перемішували і повторно центрифугували, водну фазу відбирали в нову пробірку. Додавали рівний об'єм суміші фенол: хлороформ: ізоаміловий спирт (25:24:1), ретельно перемішували і центрифугували (14000 об / хв, 5 хв), водну фазу відбирали в нову пробірку. Потім додавали рівний об'єм суміші хлороформ: ізоаміловий спирт (24:1), ретельно перемішували і центрифугували (14 500 об / хв, 5 хв). Водну фазу переносили в нову пробірку та додавали 0.7 обсягу ізопропанолу, инкубировали протягом 0.5-1 год при -20 º С. Після центрифугування осад послідовно промивали 70% - і 96%-ним етанолом, висушували і розчиняли в 50 мкл ТЕ-буфера. Додавали РНКаза, вільну від ДНКази, до кінцевої концентрації 10 мкг / мл і инкубировали 15 хв при кімнатній температурі. Потім у розчин додавали 50 мкл суміші фенол: хлороформ (1:1), центрифугували (14 500 об / хв, 5 хв), відбирали верхню фазу, додавали рівний об'єм хлороформу, повторно центрифугували. Верхню фазу переносили в нову пробірку, доливали 2.5 обсягу етанолу та 5 мкл 3 М ацетату натрію. Для повного осадження плазмідної ДНК проби витримували 10 хв при -20 ° С і центрифугували (14000 об / хв, 10 хв). Осад двічі промивали 80% і 96%-ним етанолом і розчиняли в 30 мкл води. Вихід плазмідної ДНК оцінювали за допомогою електрофорезу в 1%-ном агарозному гелі.

Створення праймерів і ПЛР.

^® Advance v .9.0” и “ OLIGO v .4.0”. Конструювання праймерів здійснювали за допомогою програмного пакету "VectorNTI ^® Advance v .9.0" і "OLIGO v .4.0". Олігонуклеотиди синтезовані фірмою "синтол" (Москва).

(Англия) или Eppendorf (Германия). а) ПЛР з геномної ДНК проводили в термоциклер Hybaid (Англія) або Eppendorf (Німеччина). каждого из четырёх дНТФ, 1 × ПЦР буфер (табл. 8), БСА 0.1 мг/мл, 40 пмоль каждого праймера (табл. 10) и до 3 ед. Реакційна суміш (30 мкл) містила 50-100 нг ДНК, по 0.2 м M кожного з чотирьох дНТФ, 1 × ПЛР буфер (табл. 8), БСА 0.1 мг / мл, 40 пмоль кожного праймера (табл. 10) і до 3 од. -ДНК-полимеразы (“СибЭнзим”). Ta q-ДНК-полімерази ("СібЕнзім"). Цикл ампліфікації складався з денатурації ДНК при 94 ° С - 2 хв, наступні 30 циклів: денатурації 94 ° С - 30 с, відпалу праймерів при 46-54 ° С (у залежності від праймера) - 30 с, і елонгації ДНК при 72 ° С - 2 хв. Завершували ампліфікацію додатковим синтезом ДНК при 72 ° С, 4 хв.

б) Інвертована ПЛР.

. marina , полученные в результате гидролиза эндонуклеазами, замкнутые в кольцо в предварительной реакции лигирования. Для цієї реакції в якості матриці використовували фрагменти хромосомної ДНК M. Marina, отримані в результаті гідролізу ендонуклеаза, замкнуті в кільце в попередньої реакції лігування. Перед ПЛР отриману кільцеву ДНК прогрівали 15 хв при 95 ° С. -полимеразу, остальные компоненты реакции были те же, что в стандартной ПЦР. В реакції використовували праймери (по 20 пмоль кожен) і Taq-полімеразу, інші компоненти реакції були ті ж, що в стандартній ПЛР. Реакцію (30 циклів) проводили в наступному режимі: при температура плавлення 94 ° С - 30 с; при температурі відпалу 54 ° С - 40 с; при температурі синтезу 72 ° С - 4 хв. Завершували ампліфікацію додатковим синтезом ДНК при 72 ° С - 8 хв.

в) Векторетная ПЛР

тратегия векторетного ПЦР заключается в создании адаптеров (двухцепочечных молекул ДНК) используя комплементарные олигонуклеотиды (вектореты), с последующим отжигом друг с другом. C тратегія векторетного ПЛР полягає у створенні адаптерів (дволанцюжкові молекул ДНК) використовуючи комплементарні олігонуклеотиди (векторети), з наступним відпалом один з одним. 57 и vect 53 (табл. 5) проводили при температуре 65°С в течении 5 мин с последующим охлаждением во льду. Відпал комплементарних послідовностей vect 57 і vect 53 (табл. 5) проводили при температурі 65 ° С протягом 5 хв з наступним охолодженням в льоду. 2 до концентрации 25 мМ и инкубировали при 65°С в течении 5 мин, затем охлаждали в течении 1 ч при комнатной температуре. Для стабілізізаціі отриманого адаптера в реакційну суміш додали MgCI 2 до концентрації 25 мМ і инкубировали при 65 ° С протягом 5 хв, потім охолоджували протягом 1 год при кімнатній температурі.

Для векторетной ПЛР хромосомну ДНК (10 нг) инкубировали в присутності 20 од. при 37°С с последующей инактивацией рестриктазы при 65°С 20 мин. рестріктази BamHI при 37 ° С з наступною інактивацією рестріктази при 65 ° С 20 хв. 4 Ligase при 16°С 12-16 ч. Праймер C 20 и специфичный для гена ask праймер AskF использовали в ПЦР для амплификации гена ask . Лігированіє розрізаної хромасомной ДНК і адаптерів проводили у присутності 50 од. T 4 Ligase при 16 ° С 12-16 ч. Праймер C 20 і специфічний для гена ask праймер AskF використовували в ПЛР для ампліфікації гена ask. 20 и специфичный для гена ectA праймер ectF использовали в ПЦР для амплификации гена ectA . Праймер C 20 і специфічний для гена ectA праймер ectF використовували в ПЛР для ампліфікації гена ectA.

г) ампліфікація генів біосинтезу ектоіна з хромосомної ДНК (10 нг) проводили з використанням прямого і зворотного праймерів (15 пмоль кожного) (табл. 10). из M . marina использовали праймеры EAN и EA С, для гена ectB - ectBN и ectBC , для гена ect С - ect С N и ect С C и для гена ask – AskN и PET 19 Z или AskN и BglII . Для ампліфікації повного гена ectA з M. Marina використовували праймери EAN і EA С, для гена ectB - ectBN і ectBC, для гена ect С - ect З N і ect С C і для гена ask - AskN і PET 19 Z або AskN і BglII . АВС, использовали праймеры Opr 1 и Opr 2. Для ампліфікації фрагмента ДНК, що містить гени ect АВС, використовували праймери Opr 1 і Opr 2. / Pfu в соотношении активностей 20:1. Реакцію проводили, використовуючи суміш ДНК-полімераз Tag / Pfu у співвідношенні активностей 20:1. Інші компоненти реакції були ті ж, що і в стандартній ПЛР.

Кон'югація.

. coli S 17- λ pir , который предварительно трансформировали коньюгативной плазмидой pBSL -180: Pmax : ectABC (полученной на основе р BSL -180). Для коньюгации використовували штам-донор E. Coli S 17 - λ pir, який попередньо трансформували коньюгатівной плазмидой pBSL -180: Pmax: ectABC (отриманої на основі р BSL -180). . coli центрифугировали 3 мин при 5000 об/мин и промывали 5 мл стерильной среды “ K ”. 10 мл нічний культури E. Coli центрифугували 3 хв при 5000 об / хв і промивали 5 мл стерильної середовища "K". ”. Клітини ресуспендували в 0.5 мл середовища "K". М1. В якості реципієнта використовували штам Methylobacterium extorquens A М1. ”. 50 мл культури, вирощеної до ВП ₆₀₀ = 0.4, центрифугували і промивали середовищем "K". ” и смешивали с 0.5 мл суспензии клеток E . coli . Клітини метілобактерій ресуспендували в 0.5 мл середовища "K" і змішували з 0.5 мл суспензії клітин E. Coli. (“ USBiological ”, США), чашки инкубировали 24 ч при 28 °С. Суміш переносили на агаризованому середу "К", що містить 0.2% Proteose peptone ("USBiological", США), чашки інкубували 24 год при 28 ° С. Після інкубації клітини змивали з поверхні агару 2 мл стерильної середовища "К". Аліквотах суспензії 10-20 мкл розтирали на селективної агаризованому середовищі "К", що містить 0.5% метанолу і 30 мкг / мл канаміцину. Чашки інкубували до утворення колоній (зазвичай 6 днів). . coli , трансконьюганты пересевали на агаризованную среду “К”, содержащую 20 мкг/мл налидиксовой кислоты и 30 мкг/мл канамицина. Для видалення (присутніх) клітин E. Coli, трансконьюганти пересівали на агаризованому середу "К", що містить 20 мкг / мл налідиксової кислоти та 30 мкг / мл канаміцину.

4.6 Визначення та аналіз послідовностей нуклеотидів

еквенирование ДНК проводилось на фирме “Силекс” (Москва) с помощью “Big Dye Terminator Ready Reaction Kit” (“Applied Biosystems”, США) на автоматическом ДНК секвенаторе “DNA S equencer ABI PRISM 310” (“Applied Biosystems”, США), в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. C еквенірованіе ДНК проводилося на фірмі "Сілекс" (Москва) за допомогою "Big Dye Terminator Ready Reaction Kit" ("Applied Biosystems", США) на автоматичному ДНК секвенатори "DNA S equencer ABI PRISM 310" ("Applied Biosystems", США) , відповідно до інструкцій фірми-виробника. Використовували 0.3-0.5 мкг ПЛР-фрагмента і відповідний праймер. Для визначення повної послідовності нуклеотидів в ДНК фрагментах, довжина яких перевищувала 1000 пар основ, на основі отриманих послідовностей конструювали нові праймери. Ці праймери використовували потім для реакцій секвенування.

- BLAST , доступной с сервера ( http :// www . ncbi . nlm . nih . gov ). Порівняльний аналіз послідовностей ДНК та білків проводили за допомогою програми PSI - BLAST, доступної з сервера (http: / / www. Ncbi. Nlm. Nih. Gov). 3.00, пакета программ VectorNTI ^® Advance v .9.0, DNAStar v .4.04 и Clone Manager 5. Аналіз нуклеотидних послідовностей та їх трансляцію в амінокислотні, визначення сайтів рестрикції і відкритих рамок зчитування здійснювали за допомогою програм GeneRuner 3.00, пакету програм VectorNTI ^® Advance v .9.0, DNAStar v .4.04 і Clone Manager 5. ( v 1.62 b ) ( Thompson et al ., 1997) и GeneDoc . Вирівнювання амінокислотних послідовностей здійснювали за допомогою програми ClustalX (v 1.62 b) (Thompson et al., 1997) та GeneDoc. .3.6, используя программы SEQBOOT , PROTPARS и CONSENSE ( Felsenstein , 2004). Філогенетичний аналіз здійснювали за допомогою пакету програм PHYLIP v .3.6, використовуючи програми SEQBOOT, PROTPARS і CONSENSE (Felsenstein, 2004).

4.7 Клонування та експресія гена ectA

, содержащий сайт для рестриктазы Nco при инициирующем кодоне и сайт на 3' конце фрагмента для HindIII , амплифицировали из геномной ДНК M . marina с использованием праймеров EctA ( halN - N ) и EctA ( hal - C ) (табл. 10). Ген ectA, що містить сайт для рестриктаз Nco при ініціюванні кодоні і сайт на 3 'кінці фрагмента для HindIII, ампліфікувати з геномної ДНК M. Marina з використанням праймерів EctA (halN - N) і EctA (hal - C) (табл. 10). и HindIII , содержащий ген ectA , лигировали в вектор pET 28, с образованием вектора pETectA . Фрагмент після обробки рестріктазами Nco і HindIII, що містить ген ectA, лігувати у вектор pET 28, з утворенням вектора pETectA.

4.8 Виділення та очищення рекомбінантних даб-ацетилтрансферази

. coli BL 21( DE 3), трансформированные плазмидой pETectA , выращивали в 0.5 л среды LB c А mp (50 мкг/мл для pETectA ) при 37 º С до оптической плотности А ₆₀₀ = 0.6-0.7, добавляли Изопропил- β -D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали при 25 °С в течение 3 ч. Белок выделяли из суперпродуцента E . coli , как описано в протоколах фирмы “ Quaigen ” (Германия) с небольшими изменениями. Клітини E. Coli BL 21 (DE 3), трансформовані плазмидой pETectA, вирощували в 0.5 л середовища LB c А mp (50 мкг / мл для pETectA) при 37 º С до оптичної щільності А ₆₀₀ = 0.6-0.7, додавали ізопропіл-β -D-1-тіогалактопіранозід (ІПТГ) до кінцевої концентрації 1 мМ і инкубировали при 25 ° С протягом 3 год Білок виділяли з суперпродуцента E. coli, як описано у протоколах фірми "Quaigen" (Німеччина) з невеликими змінами. рН 8.0, 150 мМ К Cl , 20 мМ имидазола, 1 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), 10 мг/мл лизоцима) и разрушали ультразвуком (3 × 0.5 мин с минутными перерывами). Клітини осаджували центрифугуванням, ресуспендували в 5 мл лізісного буфера (20 мМ Тріс-Н Cl рН 8.0, 150 мМ К Cl, 20 мМ імідазолу, 1 мМ фенілметансульфонілфторід (ФМСФ), 10 мг / мл лізоциму) і руйнували ультразвуком (3 × 0.5 хв з хвилинними перервами). ²⁺ -нитроацетат агарозу (“ Quiagen ”), объемом 5 мл. Лізат клітин центрифугували 30 хв при 14000 об / хв і 4 ° С, супернатант наносили на колонку, що містить Ni ^{2 +-нітроацетат} агарози ("Quiagen"), об'ємом 5 мл. рН 8.0, 150 мМ К Cl , 60 мМ имидазол) связанный белок элюировали с колонки тем же буфером, содержащим 150 мМ имидазола. Після промивання буфером (20 мМ Тріс-Н Cl рН 8.0, 150 мМ К Cl, 60 мМ імідазол) пов'язаний білок елюіровалі з колонки тим же буфером, що містить 150 мМ імідазолу. электрофореза по Лэммли. Білковий спектр відібраних фракцій, об'ємом 0.5 мл, ідентифікували методом SDS електрофорезу по Леммлі. - His ₆ - tag ), объединяли, диализовали против 50 мМ Трис-Н Cl буфера, рН 8,0 (содержащий 50 мМ К Cl для ДАБ-ацетилтрансферазы и концентрировали с помощью Microcon YM -10 (“ Millipore ”, США). Фракція, яка містить цільовий білок (EctA - His ₆ - tag), об'єднували, діалізовалі проти 50 мМ Тріс-Н Cl буфера, рН 8,0 (що містить 50 мМ К Cl для даб-ацетилтрансферази і концентрували за допомогою Microcon YM -10 (" Millipore ", США).

₁ - His ₆ , проводили на колонке c Ultr о gel AcA 54 (1.5 × 90 см), уравновешенной буфером, содержащим 50 мМ Трис-НС l , pH 8.0, 0.2 M NaCl . Гель-фільтрацію білка EctA _{hal 1} - His _6, проводили на колонці c Ultr про gel AcA 54 (1.5 × 90 см), врівноваженою буфером, що містить 50 мМ Тріс-НС l, pH 8.0, 0.2 M NaCl. Швидкість елюції - 15 мл / год ” и “ Pharmacia ”): ферритин (450 кДа), БСА (66 кДа), ОВА (45 кДа), ДНКаза (31 кДа), лизоцим (14 кДа), цитохром с (12 кДа). В якості маркерів молекулярної маси використовували набір стандартних білків ("Sigma" і "Pharmacia"): феритин (450 кДа), БСА (66 кДа), ОВА (45 кДа), ДНКаза (31 кДа), лізоцим (14 кДа), цитохром з (12 кДа). 200”, США). Вихід білка визначали по поглинанню при 280 нм на УФ-детекторі ("LINEAR UVIS 200", США).

4.9 Визначення фізико-хімічних властивостей ферментів

Визначення рН-і температурних оптимумів даб-ацетилтрансферази.

При визначенні рН-оптимуму застосовували буферні системи рН 6.0-9.0. буфер, рН 7.0 -9.0. Використовували такі буферні розчини: 100 мМ натрій-фосфатний буфер, рН 6.0-8.0, 100 мМ Тріс-HCl буфер, рН 7.0 -9.0. UV-160” (Япония). Температурні оптимуми визначали в інтервалі температур від 5 до 35 º С з використанням термоконтроллера "Shimadzu UV-160" (Японія).

Таблиця 3. Буфери і розчини, використані в роботі.

Таблиця 4. Плазміди, використані в роботі.

Таблиця 5. Праймери, використані в роботі.

Результати та обговорення

Глава 5 Ідентифікація і характеристика генів біосинтезу ектоіна у метилотрофних бактерій Methylarcula marina

5.1 Накопичення ектоіна галотолерантним метілотрофом Methylarcula marina

анализировали методом ВЭЖХ на содержание эктоина. Метанольних екстракти клітин галотолерантного метілотрофа Methylarcula marina аналізували методом ВЕРХ на утримання ектоіна. . marina возрастает содержание эктоина, причем максимальное содержание эктоина наблюдали при 8% NaCl (рис. 4). При збільшенні солоності середовища в клітинах M. Marina зростає вміст ектоіна, причому максимальний вміст ектоіна спостерігали при 8% NaCl (рис. 4). . marina замедляется при концентрации выше 6% NaCl . Зростання M. Marina сповільнюється при концентрації вище 6% NaCl. Зниження рівня ектоіна в клітинах, що ростуть при солоності вище 8%, очевидно, пов'язано з накопиченням інших осмолітов.

Рис 4. Накопичення ектоіна клітинами M. marina у відповідь на сольовий стрес NaCl,%

. marina эктоин является осмопротектором, т.е. Отже, у M. Marina ектоін є осмопротектором, тобто з'єднанням, відповідальним за підтримання осмотичного балансу між цитоплазмою і зовнішнім середовищем. Далі являло інтересс вивчити організацію генів біосинтезу даного осмоліта у метілобактеріі.

. marina 5 .2 Ідентифікація генів, що кодують ферменти біосинтезу ектоіна у M. Marina

. marina был использован подход, основанный на ПЦР методологии. Для ідентифікації генів синтезу ектоіна у M. Marina був використаний підхід, заснований на ПЛР методології. данных свидетельствовал о том, что у исследованных видов галофильных и галотолерантных бактерий гены, кодирующие ДАБ-ацетилтрансферазу, ДАБ-аминотрансферазу и эктоинсинтазу, расположены в одном кластере в последовательности ectABC . Проведений ранньо аналіз опублікованих і представлених у GenBank даних свідчив про те, що у досліджених видів галофільних і галотолерантних бактерій гени, що кодують даб-ацетилтрансфераза, даб-амінотрансферазу і ектоінсінтазу, розташовані в одному кластері в послідовності ectABC. ense AMO1, M. alcalica M8 и M. thalassica MT), и анализа найденных гомологичных участков были выбраны наиболее консервативные последовательности. У результаті порівняння амінокислотних послідовностей цих білків у галофільних гетеротрофних бактерій Marinococcus halofilus DSMт20408, Halomonas elongatа DSM 2581, Cromohalobacter salexigens (раніше Halomonas elongatа DSM 3043), Bacillus pasteurii, Vibrio cholerae, Bacillus haldurans, Oceanobacillus iheyensis (GenBnk AP004594), Streptomyces coelincolor (GenBank AL591322), а також ectABC кластерів у метилотрофних бактерій (Mm. alcaliphilium 20Z, Mm. ken y ense AMO1, M. alcalica M8 і M. thalassica MT), та аналіз знайдених гомологічних ділянок були обрані найбільш консервативні послідовності. З урахуванням виродження і зустрічальності кодонів в генах, що кодують ці білки, ми використовували раніше розроблені і створені нові вироджені праймери для їх ампліфікації (Мал. 5). При конструюванні праймерів передбачалося, що у M. marina гени біосинтезу ектоіна знаходяться в одному кластері і розташовані послідовно: ectA, ectB і ectC (Мал. 5).

Рис. 5. Схема розташування генів біосинтезу ектоіна у M. marina і розроблених вироджених праймерів (ectHal, Tra3, CR).

3- C _R представлены в табл. Нуклеотидні послідовності праймерів ectHal і Tra 3 - C _R представлені в табл. 5.

использованием пары праймеров Tra 3- C _R были получены ПЦР-фрагменты генов ectB и ectC общей длиной ~1000 п.н. C використанням пари праймерів Tra 3 - C _R були отримані ПЛР-фрагменти генів ectB і ectC загальною довжиною ~ 1000 пар основ (Мал. 5а). и секвенировали. ПЛР-продукт клонували у вектор р Zero і секвенували. , комплементарный этой последовательности. На основі виявленої нуклеотидної послідовності був синтезований праймер HalR, комплементарний цієї послідовності. и HalR был получен ПЦР-продукт длиной ~1150 п.н. З використанням виродженого праймера ectHal і HalR був отриманий ПЛР-продукт довжиною ~ 1150 пар основ и 5'-конец гена ectB (Рис. 5б). містить 3'-кінець гена ectA і 5'-кінець гена ectB (Мал. 5б). . Це вказувало на сумісний розташування генів в кластері в спочатку намічену послідовності - ectABC. Допускаючи, що, аналогічно до інших метілотрофам - Mm. alcaliphilium 20Z, M. alcalica M8 і M. расположен ген, кодирующий специфическую аспартаткиназу, был сконструирован и синтезирован вырожденный праймер Rtn на ген ask . thalassica MT (Решетніков, 2006), слідом за геном ectC розташований ген, що кодує специфічну аспартаткіназу, був сконструйований і синтезований вироджений праймер Rtn на ген ask. на ген ectB и вырожденного праймера Rtn был амплифицирован фрагмент ДНК длиной ~1250 п.н. З використанням комплементарного праймера HalF на ген ectB і виродженого праймера Rtn був ампліфікувати фрагмент ДНК довжиною ~ 1250 пар основ і секвенований (Мал. 6с)

и ectC , а также ~100 п.н. Таким чином, ми отримали повні послідовності генів ectB і ectC, а також ~ 100 пар основ и ~180 п.н. гена ectA і ~ 180 пар основ . гена ask.

Рис. 6. Електрофорез ПЛР продуктів отриманих з використанням праймерів:

a) Tra3-CR; б) ectHal-HalR і c) HalF-Rtn. M - маркер "Gene RulerTM 100bp DNA Ladder plus".

и ask , были неполными. Секвенування ПЛР-продуктів і аналіз нуклеотидних послідовностей дозволили об'єднати їх в один фрагмент довжиною ~ 2100 пар основ, в якому виявлено чотири відкриті рамки зчитування, серед яких ОРС, відповідні генам ectA і ask, були неповними.

Рис. 7. Схема розташування ect-генів у M. marina і положення праймерів. Послідовності праймерів наведено в табл. 5.

была применена стратегия инвертированной ПЦР. Для ідентифікації відсутньої послідовності гена ask була застосована стратегія інвертованою ПЛР. ”), или обратная, ПЦР применяется для клонирования областей ДНК, непосредственно прилегающих к области с известной последовательностью. Інвертована (від англ. "Inverse"), або зворотна, ПЛР застосовується для клонування областей ДНК, безпосередньо прилеглих до області з відомою послідовністю. Даний підхід зручний тим, що усувається необхідність створення геномних бібліотек та їх подальшого скринінгу, що досить трудомістким. Суть методу полягає в наступному: геномної ДНК фрагментують розщепленням ендонуклеаза, що не мають сайтів всередині відомої послідовності. Отримані фрагменти лигируют при низькій концентрації ДНК в умовах, коли утворюються кільцеві молекули. , Russell , 2001). Отримані кільцеві молекули ДНК використовують в якості матриці в ПЛР, яку проводять з праймерами (Мал. 8, праймери 1 і 2), відповідними кінцевим областям відомої послідовності, синтез з яких спрямований в сторони з невідомою послідовністю (Sambrook, Russell, 2001).

Рис. 8. Схема клонування ділянок ДНК, прилеглих до фрагментів з відомою послідовністю.

. marina была выбрана рестриктаза Apo I . Для розщеплення хромосомної ДНК M. Marina була обрана рестріктаза Apo I. и Askg (комплементарные гену ask ) и кольцевых молекул ДНК был получен фрагмент ~690 п.н. У результаті ПЛР з використанням праймерів Askn і Askg (комплементарні гену ask) і кільцевих молекул ДНК був отриманий фрагмент ~ 690 пар основ (Рис. 9)

M

Рис. 9. . marina и праймеров: Електрофорез продуктів інвертованою ПЛР, отриманих з використанням кільцевих молекул ДНК M. Marina і праймерів:

Hal-askR (inv) і Hal (inv)-askF, M - маркер "Gene RuleTM 100bp DNA Ladder plus".

. Аналіз нуклеотидної послідовності отриманого фрагмента виявив внутренную область гена ask.

, нами была использована стратегия векторетного ПЦР . Для того, щоб виявити повну послідовність гена ask, нами була використана стратегія векторетного ПЛР. Ця стратегія грунтується на створенні адаптора з відомою послідовністю і з сайтом рестрикції. ), был получен из двух комплементарных олигонуклеотидов vect 57 и vect 53. Створений адаптор з виступаючим 5 'кінцем (GATC), була отримана з двох комплементарних олігонуклеотидів vect 57 і vect 53. тотальная ДНК M . marina (обладающая комплементарной последовательностью к липкому 5' концу адаптора) была лигирована с адаптором, с последующей амплифицированией используя праймер на адаптор С20 и комплементароного праймера на тотальную ДНК (рис 10). Гідролізованная по рестріктази Bam HI тотальна ДНК M. Marina (володіє комплементарної послідовністю до липкого 5 'кінця адаптора) була лігувати з адаптори, з подальшою ампліфіцірованіей використовуючи праймер на адаптор С20 і комплементароного праймера на тотальну ДНК (рис 10).

Рис. 10. Схема векторетного ПЛР-аналізу

на ген ask и праймер C 20 на адаптор, был амплифицирован фрагмент ДНК ~1400 п.н. Використовуючи комплементарний праймер AskF на ген ask та праймер C 20 на адаптор, був ампліфікувати фрагмент ДНК ~ 1400 пар основ і севенірован (Рис 11а). . У результаті секвенування ПЛР-фрагмента та аналізу нуклеотидних послідовностей отримали фрагмент ДНК, що кодує повну послідовність гена ask.

была использована векторетная ПЦР. Для ідентифікації відсутньої 5 'обасті гена ectA була використана векторетная ПЛР. на ген ectA и С20 на адаптор, был получен ПЦР-продукт длиной ~1300 п. н. Використовуючи комплементарний праймер ectF на ген ectA і С20 на адаптор, був отриманий ПЛР-продукт довжиною ~ 1300 п. н. (Рис 11б) і секвенований. . Аналіз нуклеотидної послідовності виявив відсутню область гена ectA.

М М

А) ~ 1400 П.М. б) ~ 1300п.н.

Рис. 11. Електрофорез продуктів векторетной ПЛР, отриманих з використанням тотальної ДНК M. marina і праймерів: a) на ген ask і праймери AskF і C 20, б) на ген ectA і праймери ectF і C 20, M - маркер "Gene RuleTM 100bp DNA Ladder plus".

, выявил ОРС, кодирующую белок из 184 аминокислотных остатка, проявляющий гомологию (36% идентичности) с транскрипционным белком-репрессором биосинтеза эктоина EctR из Mm. Аналіз нуклеотидної послідовності, вгору у напрямку від гена ectA, виявив ОРС, що кодує білок з 184 амінокислотних залишку, що виявляє гомологію (36% ідентичності) з транскрипції білком-репрессором біосинтезу ектоіна EctR з Mm. ., 2010). alcaliphilium 20Z (Mustakhimov et al., 2010). семейства. Аналіз трансльовану амінокислотної послідовності виявленої ОРС виявив поворот спіраль поворот (НТН) мотив, характерний для білків регуляторів MarR сімейства. . marina участвует в регуляции транскрипции генов биосинтеза эктоина, по механизму, аналогичному у галотолерантного метанотрофа M m . Можливо, даний білок з M. Marina бере участь в регуляції транскрипції генів біосинтезу ектоіна, за механізмом, аналогічного у галотолерантного метанотрофами M m. ., 2010). alcaliphilium 20Z (Mustakhimov et al., 2010).

, ectB , ectC и ask . Таким чином, в результаті секвенування ПЛР-фрагментів і аналізу нуклеотидних послідовностей був отриманий фрагмент ДНК (3304 пар основ), в якому виявлені ОРС, відповідні генам ectA, ectB, ectC і ask. . marina транскрибируются в составе одной полицистронной матричной РНК. Оскільки відстані між цими генами невеликі (18, 5 і 7 пар основ, відповідно), можна припустити, що гени біосинтезу ектоіна у M. Marina транскрибуються у складі однієї Поліцистронна матричної РНК.

кодирует полипептид из 131 аминокислотных остатков с рассчитанной молекулярной массой 14.8 кДа. Аналіз транслювання отриманих нуклеотидних послідовностей показав, що ген ectC кодує поліпептид з 131 амінокислотних залишків з розрахованою молекулярної масою 14.8 кДа. оказалась на 40-64% идентичной последовательностям эктоинсинтаз из других галофильных бактерий. Амінокислотна послідовність EctC опинилася на 40-64% ідентичною послідовностей ектоінсінтаз з інших галофільних бактерій. кодирует полипептид из 430 аминокислот с рассчитаной молекулярой массой 45.2 кДа и на 36-71% идентичен ДАБ-аминотрансферазам из галофильных бактерий. Ген кодує ectB поліпептид з 430 амінокислот з розрахованим молекуляр масою 45.2 кДа і на 36-71% ідентичний даб-амінотрансферази з галофільних бактерій. кодирует полипептид из 181 аминокислот с расчитанной молекулярной массой 20,2 кДа c идентичный на 23-63%. Ген кодує ectA поліпептид з 181 амінокислот з розрахованою молекулярної масою 20,2 кДа c ідентичний на 23-63%.

Рис. 12. , основанное на сравнении транслированных аминокислотных последовательностей генов Філогенетичне дерево білків E ctABC, засноване на порівнянні трансльовані амінокислотних послідовностей генів у метилотрофных (подчеркнуты) и гетеротрофных галофильных бактерий. ectABC у метилотрофних (підкреслені) і гетеротрофних галофільних бактерій. Дерево побудовано методом мінімальної еволюції. У дужках вказані номери відповідних генів у повних геномах бактерій, представлених в базі даних.

Рис 13. Філогенетичне дерево аспартаткіназ, засноване на порівнянні трансльовані амінокислотних послідовностях ask-генів, розташованих у ектоіновом кластері метілотрофов (підкреслені), і ask-генів, пов'язаних з кластером ectABC, в інших галофільних бактерій.

. marina в негалофильный штамм Methylobacterium extorquens AM 1 5.3 Інтеграція генів біосинтезу ектоіна з M. Marina в негалофільний штам Methylobacterium extorquens AM 1

. marina в хромосому Methylobacterium extorquens АМ1 был выбран вектор, мини-транспозон pBSL -180. Для інтеграції генів біосинтезу ектоіна з M. Marina в хромосому Methylobacterium extorquens АМ1 був обраний вектор, міні-транспозон pBSL -180. -180, содержала конститутивный промотор метанолдегидрогеназы Pmax и ectABC гены. Касета для інтеграції, що входить до складу pBSL -180, містила конститутивний промотор метанолдегидрогенази Pmax і ectABC гени. Цей вектор був сконструйований таким чином. , амплифицировали с плазмиды pCM -160, используя праймеры PmaxF - PmaxR , и клонировали по сайтам EcoR I и Bam HI в pBSL -180 с образованием вектора pBSL / Pmax . ПЛР-фрагмент, що містить промоторних область Pmax, ампліфікованих за плазміди pCM -160, використовуючи праймери PmaxF - PmaxR, і клонували по сайтах EcoR I і Bam HI в pBSL 180 з утворенням вектора pBSL / Pmax. , был амплифицирован из M . marina с использованием праймеров Ect - operC ( hal ) и Ect - operN ( hal ). ДНК-фрагмент, який кодує гени біосинтезу ектоіна ectABC, був ампліфікувати з M. Marina з використанням праймерів Ect - operC (hal) і Ect - operN (hal). и Hin dIII в плазмиду pBSL / Pmax c образованием pBSL / Pmax / ectABC размером около 9 т.п.н. ПЛР-фрагмент клонували по сайтах рестрикції Eco RI і Hin dIII в плазміду pBSL / Pmax c освітою pBSL / Pmax / ectABC розміром близько 9 т.п.н. (Рис 14)

Рис. 14. Схема клонування генів біосинтезу ектоіна (ectABC) з M. marina під промотором метанолдегидрогенази (Pmax) в міні-транспозон pBSL-180.

/ Pmax / ectABC трансформировали в клетки E . coli S-17( ג pir ). Конструкцію pBSL / Pmax / ectABC трансформували в клітини E. Coli S-17 (ג pir). . coli использовали для конъюгации в дикий штамм M . extorquens AM 1. Отримані трансформанта E. Coli використовували для кон'югації в дикий штам M. Extorquens AM 1. . extorquens , содержащие плазмиду pBSL 180/ Pmax / ectABC , выращивали на агаризованой минеральной среде К с метанолом и канамицином. Трансформанта M. Extorquens, що містять плазміду pBSL 180 / Pmax / ectABC, вирощували на агарізованой мінеральному середовищі К з метанолом і канаміцин.

/ ectABC в хромосоме M . extorquens AM 1 оценивали ПЦР с праймерами PmaxF и ectArev на Pmax и ectA (Рис 15). Наявність інтегрованої касети Pmax / ectABC в хромосомі M. Extorquens AM 1 оцінювали ПЛР з праймерами PmaxF і ectArev на Pmax і ectA (Рис 15).

M

~ 700 пар основ

и ectA с использованием праймеров: Рис.15 Електрофорез ПЛР продуктів генів Pmax і ectA з використанням праймерів:

PmaxF і ectARev, M - маркер "Gene RuleTM 100bp DNA Ladder plus".

. extorquens Трансформанта M. Extorquens 1 ( Pmax / ectABC ) выращивали на среде К с канамицином, клетки собирали центрифугированием. AM 1 (Pmax / ectABC) вирощували на середовищі К з канамицином, клітини збирали центрифугуванням. , оснащенным детектором SPD -20 A ( Shimadzu , Япония). Екстракцію ектоіна з клітин метанолом проводили протягом 2 год В отриманих метанольних екстрактах кількість ектоіна аналізували методом ВЕРХ на хроматографі високого тиску Prominence, оснащеним детектором SPD -20 A (Shimadzu, Японія).

. extorquens В отриманих трансформанта M. Extorquens 1 ( Pmax / ectABC ) был обнаружен эктоин в концентрации 75 мкг на 100 мг сухих клеток (Рис. 16с), что свидетельствует об экспрессии генов ectABC с промотора Pmax . AM 1 (Pmax / ectABC) був виявлений ектоін в концентрації 75 мкг на 100 мг сухих клітин (Мал. 16с), що свідчить про експресії генів ectABC з промотора Pmax.

А)

Б)

С)

Рис. 16 Аналіз накопичення ектоіна використовуючи метод ВЕРХ: а) контроль ектоіна ("Sigma"), б) дикий штам M. extorquens AM1, с) рекомбінантний штам M. extorquens AM1.

Глава 6 Клонування, очищення та первинна характеристика рекомбінантної даб-ацетилтрансферази

А из M. 6.1 Клонування та експресія генa ect А з M. marin a

А клонировали в экспрессирующий вектор pET 28, определяющий синтез рекомбинантного белка с дополнительными 6 His на С-конце. Для конструювання продуцента даб-ацетилтрансферази ген ect А клонували в експресують вектор pET 28, що визначає синтез рекомбінантного білка з додатковими 6 His на С-кінці. трансформировали E . coli BL 21( DE 3). Отриманою плазмидой pETectA трансформували E. Coli BL 21 (DE 3). . У розчинній фракції лізата клітин E. , после индукции ИПТГ, методом денатурирующего гель-электрофореза в присутствии SDS обнаружен белок с электрофоретической подвижностью, соответствующей молекулярной массе около 20 кДа (Рис. 17), которая согласуется c рассчитанной на основе аминокислотной последовательности (18.88 кДа). з oli, після індукції ІПТГ, методом денатуруючого гель-електрофорезу в присутності SDS виявлений білок з електрофоретичною рухливістю, відповідної молекулярної маси близько 20 кДа (Мал. 17), яка узгоджується c розрахованої на основі амінокислотної послідовності (18.88 кДа).

Рис. 17. Електрофорез у 12.5%-ном SDS-ПААГ: 1 - маркерні білки; 2 - даб-ацетилтрансфераза

. coli (выращенных без индуктора) соответствующая белковая полоса отсутствовала. У контрольних клітинах E. Coli (вирощених без індуктора) відповідна білкова смуга була відсутня. ²⁺ - NTA агарозе. Очищення білка проводили методом афінної хроматографії на Ni ^{2 +} - NTA агарози. - His ₆ - tag (Рис. 16). У результаті був отриманий гомогенний препарат EctA - His ₆ - tag (Мал. 16). . marina соответствует молекулярной массе около 20 кДа, которая согласуется c теоретически рассчитанным значением 20.0 кДа. Електрофоретична рухливість білка EctA з M. Marina відповідає молекулярній масі близько 20 кДа, яка узгоджується c теоретично розрахованим значенням 20.0 кДа. AcA54 пик активности белков соответствовал молекулярной массе 40 кДа, что соответствует молекулярной массе гомодимерной формы данного фермента. При гель-фільтрації отриманого препарату на Ultrogel AcA54 пік активності білків відповідав молекулярної масі 40 кДа, що відповідає молекулярній масі гомодимерних форми даного ферменту.

Фізико-хімічні властивості даб-ацетилтрансферази. (Рис. 18). Температурний оптимум ферменту склав +15 ° C (Мал. 18). Фермент активний в діапазоні рН від 7 до 9 з оптимумом при рН 8 (Мал. 19).

Рис.18 Залежність активності даб-ацетилтрансферази від температури.

Рис.19 Залежність активності даб-ацетилтрансферази від pH.

. elongata ( Ono Раніше даб-ацетилтрансфераза була частково охарактеризована в H. Elongata (Ono et ., 1999), Mm . alcaliphilum 20 Z ( Reshetnikov al., 1999), Mm. alcaliphilum 20 Z (Reshetnikov et ., 2006), M . alcalica и M . talassica ( Mustakhimov al., 2006), M. alcalica і M. talassica (Mustakhimov et ., 2008). al., 2008). . marina Незвично низький температурний оптимум - близько 15 º С є головною відмітною особливістю цього фермета у M. Marina . alcaliphilum 20 Z , M. в порівнянні з даб-ацетілтрнсферазамі з виділеними з Mm. alcaliphilum 20 Z, M. thalassica та M. alcalica. . marina является близкая электофоретическая подвижность, соответствующая ~20 кДа (табл. 6). Загальною властивістю ферментів з перерахованих вище метілотрофов і M. Marina є близька електофоретіческая рухливість, відповідна ~ 20 кДа (табл. 6). . marina отличается от ферментов из Mm . alcaliphilum 20 Z , M . alcalica и M . thalassica , имеющих максимальные активности при температурах, соответственно, 20, 35, 30° C и рН 9.5, 9.0 и 8.5. Однак, за деякими властивостями даб-ацетилтрансфераза з M. Marina відрізняється від ферментів з Mm. Alcaliphilum 20 Z, M. Alcalica і M. Thalassica, що мають максимальні активності при температурах, відповідно, 20, 35, 30 ° C і рН 9.5, 9.0 і 8.5.

Таблиця 6. Властивості даб-ацетилтрансфераза галофільних бактерій.

Як показав аналіз трансльованого амінокислотних послідовностей, з ферментів синтезу ектоіна (EctA, EctB, EctC), EctA має найбільш високий ступінь дивергенції (25-80%), що корелює з відмінностями у властивостях цього ферменту. . marina к соответствующим условиям среды обитания ферменты биосинтеза эктоина, возможно, подвергались «вертикальной» эволюции, адаптируясь к экофизиологическим особенностям вида. Це також свідчить про те, що в процесі тривалої адаптації M. Marina до відповідних умов середовища проживання ферменти біосинтезу ектоіна, можливо, піддавалися «вертикальної» еволюції, адаптуючись до екофізіологіческім особливостям виду.

-генов и свойствах кодируемых ими ферментов. Отже, дана робота суттєво доповнює уявлення про різноманітність генів і ферментів біосинтезу ектоіна, демонструючи на прикладі аеробних метілотрофов, що, поряд з високою консервативністю шляху біосинтезу ектоіна у різних галофільних бактерій є відмінності в організації єс t-генів і властивості кодованих ними ферментів. Подальше вивчення шляху біосинтезу ектоіна у галофільних метилотрофних бактерій на біохімічному і генетичному рівнях перспективно в плані розширення та поглиблення теоретичних уявлень про механізми галоадаптаціі, а також для розробки біотехнологічного процесу отримання цього мультифункціонального біопротектора.

Висновки

1. , ectB , ectC , ask и предполагаемого гена-регулятора ectR . Використовуючи методологію ПЛР (включаючи інвертовану і векторетную ПЛР), у галотолерантной метилотрофних альфа-протеобактерій Methylarcula marina визначені нуклеотидні послідовності генів ectA, ectB, ectC, ask і передбачуваного гена-регулятора ectR. - ask . Виявлено, що гени синтезу ектоіна у Methylarcula marina локалізовані в четирехгенном оперон ectABC - ask.

2. из M . marina в Escherichia coli получен элетрофоретически гомогенный препарат рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы. Клонуванням і експресією гена ectA з M. Marina в Escherichia coli отриманий елетрофоретіческі гомогенний препарат рекомбінантної даб-ацетилтрансферази. Визначено деякі фізико-хімічні властивості рекомбінантної даб-ацетилтрансферази. Фермент є гомодимера з м.м. и рН 8.0 . субодиниці 20 кДа і проявляє максимальну активність при температурі 15 ° C і рН 8.0.

3. 1, трансформированный плазмидой, содержащей гены ectABC из M . marina , синтезирует эктоин (75 мкг в 100 мг сухих клеток). Показано, що рекомбінантний негалофільний метилотрофних штам Methylobacterium extorquens AM 1, трансформований плазмидой, що містить гени ectABC з M. Marina, синтезує ектоін (75 мкг на 100 мг сухих клітин).

З писок літератури

1. Гальченко В.Ф., Абрамочкіна Ф.Н., Безрукова Л.В., Соколов Є.М., Іванов М.В. (1988) Видовий склад аеробної метанотрофних мікрофлори Чорного моря. / / Мікробіологія. 57 (2) :305-311.

2. Дороніна Н.В., Краузова В.І., Троценко Ю.А. Methylophaga limanica - новий вид помірно галофільних аеробних метілобактерій / / Мікробіологія. 1997. Т. 66. № 4. С. 528-533.

3. Калюжна М.Г., Хмеленіна В.М., Сузін Н.Є., Лисенко О.М., Троценко Ю.А. Нові метанотрофних ізоляти з содових озер Південного Забайкалля / / Мікробіологія. 1999. Т. 68. № 5. С. 689-697.

4. Решетніков А.С., Хмеленіна В.М., Троценко Ю.А. Виявлення генів біосинтезу ектоіна у галотолерантних аеробних метилотрофних бактерій / / Доповіді Академії Наук. 2004. Т. 396. № 6. С. 831-834.

5. Решетніков А.С. (2006) Синтез ектоіна аеробними метилотрофних бактерій: біохімічні та генетичні аспекти. Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук. ІБФМ РАН, Пущино.

6. Хмеленіна В.М., Старостіна Н.Г., Цвєткова М.Г., Соколов А.П., Сузін Н.Є., Троценко Ю.А. Метанотрофних бактерії солоних водойм Україна і Туви / / Мікробіологія. 1996. Т. 65. № 5. С. 736-743.

7. Хмеленіна В.М., Сахаровський В.Г., Решетніков А.С., Троценко Ю.А. Синтез органічних осмопротекторов галофільнимі і алкалофільнимі метанотрофами / / Мікробіологія. 2000. Т. 69. № 4. С. 465-470.

8. Троценко Ю.А., Дороніна Н.В., Лі Ц.Д., Решетніков А.С. Помірно галоалкалофільние аеробні метілобактеріі. Мікробіологія, 2007, Т. 76, № 3, С. 293-305.

9. Bayles DO and Wilkinson BJ (2000) Osmoprotectants and cryoprotectants for Listeria monocytogenes. / / Letters Appl. Microbiol. 30:23-27

10. Bernard T., Jebbar M., Rassouli Y., Himidi-Kabbab S., Hamelin J., and Blanco C. (1993) Ectoine accumulation and osmotic regulation in Brevibacterium linens. / / J. Gen. Microbiol. 139 (1) :129-136.

11. Boch J., Kempf B., and Bremer E. (1996) Synthesis of osmoprotectant glycine betaine in Bacillus subtilis: characterization of the gbsAB genes. / / J. Bacteriol. 178 (17) :5121-5129.

12. Brown AD (1976) Microbial water stress. / / Bacteriol. Rev. 40 (4) :803-846.

13. Bursy J., Pierik AJ., Pica N., And Bremer E. (2007) Osmotically induced synthesis of the compatible solute hydroxyectoine is mediated by an evolutionarily conserved ectoine hydroxylase. / / J. Biol. Chem. 282 (43) :31147-31155.

14. Canovas D., Borges N., Vargas C., Ventosa A., Nieto JJ, and Santos H. (1999) Role of N g-acetyldiaminobutyrate as an enzyme stabilizer and an intermediate in the biosynthesis of hydroxyectoine. / / Appl. Environ. Microbiol. 65 (9) :3774-3779.

15. Canovas D., Vargas C., Calderon MI, Ventosa A., and Nieto JJ (1998) Characterization of the genes for the biosynthesis of the compatible solute ectoine in the moderately halophilic bacterium Halomonas elongata DSM 3043. / / Syst. Appl. Microbiol. 21 (4) :487-497.

16. Canovas D., Vargas C., Iglesias-Guerra F., Csonka LN, Rhodes D., Ventosa A., and Nieto JJ (1997) Isolation and characterization of salt-sensitive mutants of the moderate halophile Halomonas elongata and cloning of the ectoine synthesis gene. / / J. Biol. Chem. 272 (41) :25794-25801.

17. Canovas D., Vargas C., Kneip S., Moron MJ., Ventosa A., Bremer E., and Nieto JJ (2000) Genes for the synthesis of the osmoprotectant glycine betaine from choline in the moderately halophilic bacterium Halomonas elongata DSM 3043 . / / Microbiology (UK) 146 (2) :455-463.

18. Cosquer A., Pichereau V., Pocard J., Minet J., Cormer M., and Bernard T. (1999) Nanomolar levels of dimethylsulfoniopropionate, dimethylsulfonioacetate, and glycine betaine are sufficient to confer osmoprotection to Escherichia coli. / / Appl. Environ. Microbiol. 65 (8) :3304-3311.

19. D'Souza-Ault MR, Smith LT, and Smith GM (1993) Roles of N-acetylglutaminylglutamine amide and glycine betaine in adaptation of Pseudomonas aeruginosa to osmotic stress. / / Appl. Environ. Microbiol. 59 (2) :473-478.

20. da Costa MS, Santos H., and Galinski EA (1998) An overview of the role and diversity of compatible solutes in Bacteria and Archaea. / / Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 61:117-153.

21. de Zwart JMM, Nelisse PN, and Kuenen JG (1996) Isolation and characterization of Methylophaga sulfidovorans sp.nov.: an obligately methylotrophic, aerobic, dimethylsulfide oxidizing bacterium from a microbial mat / / FEMS Microbiol. Ecol. 20 (3) :261-270.

22. Desmarais D., Jablonski PG, Fedarko NS, and Roberts MI (1997) 2-sulfotrehalose, a novel osmolyte in haloalkaliphilic archaea. / / J. Bacteriol. 179 (10) :3146-3153.

23. Desplats P., Folco E., and Salerno GL (2005) Sucrose may play an additional role to that of an osmolyte in Synechocystis sp. PCC 6803 salt-shocked cells. / / Plant Physiol. Biochem. 43:133-138

24. Doronina NV, Darmaeva TD, and Trotsenko YA (2003a) Methylophaga alcalica sp. nov., a novel alkaliphilic and moderately halophilic, obligately methylotrophic bacterium from an East Mongolian saline soda lake. / / Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53 (1) :223-229.

25. Doronina NV, Darmaeva TD, and Trotsenko YA (2003b) Methylophaga natronica sp. nov., a new alkaliphilic and moderately halophilic, restricted-facultatively methylotrophic bacterium from soda lake of the Southern Transbaikal region. / / Syst. Appl. Microbiol. 26:382-389.

26. Doronina NV, Trotsenko YA, and Tourova TP (2000) Methylarcula marina gen. nov., sp. nov. and Methylarcula terricola sp. nov.: novel aerobic, moderately halophilic, facultatively methylotrophic bacteria from coastal saline environments. / / Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50 (5) :1849-1859.

27. Empadinhas N., Albuquerque L., Costa J., Zinder SH, Santos MAS, Santos H., and da Costa MS (2004) A gene from the mesophilic bacterium Dehalococcoides ethenogenes encodes a novel mannosylglycerate synthase. / / J. Bacteriol. 186 (13) :4075-4084.

28. Felsenstein J. (2004) PHYLIP: Phylogeny inference Package Version 3.6.: University of Washington, Seattle.

29. Frings E., Kunte HJ, and Galinski EA (1993) Compatible solutes in representative of the genera Brevibacterium and Corynebacterium: occurrence of tetrahydropyrimidines and glutamine. / / FEMS Microbiol. Lett. 109 (1) :25-32.

30. Galinski EA (1995) Osmoadaptation in bacteria. / / Adv. Microb. Physiol. 37:273-328.

31. Galinski EA and Tr ü per HG (1994) Microbial behaviour in salt-stressed ecosystems. / / FEMS Microbiol. Rev. 15 (2-3) :95-108.

32. Galinski EA, Pfeiffer HP, and Tr ü per HG (1985) 1,4,5,6,-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid, a novel cyclic acid from halophilic phototrophic bacteria of the genus Ectothiorhodospira. / / Eur.J.Biochem. 149 (1) :135-139.

33. García-Estepa R., Argandona M., Reina-Bueno M., Capote N., Iglesias-Guerra F., Nieto JJ., And (2006) The ectD gene, which is involved in the synthesis of the compatible solute hydroxyectoine, is essential for thermoprotection of the halophilic bacterium Chromohalobacter salexigens. Vargas C. (2006) The ectD gene, which is involved in the synthesis of the compatible solute hydroxyectoine, is essential for thermoprotection of the halophilic bacterium Chromohalobacter salexigens. / / J. Bacteriol. 188:3774-3784.

1. Oren A. (1999) Bioenergetic aspects of halophilism. / / Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63 (2) :334-348.

2. Ø ster å s M., Boncompagni E., Vincent N., Poggi M.-C., and Le Rudulier D. (1998) Presence of a gene encoding choline sulfatase in Sinorhizobium meliloti bet operon: choline-O-sulfate is metabolized into glycine betaine. / / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95 (19) :11394-11399.

3. Page-Sharp M., Behm CA, and Smith GD (1999) Involvement of the compatible solutes trehalose and sucrose in the response to salt stress of a cyanobacterial Scytonema species isolated from desert soils. / / Biochem. Biophys. Acta. 1472 (3) :519-528.

4. Peter H., Weil B., Burkovski A., Kr ä mer R., and Morbach S. (1998) Corynebacterium glutamicum is equipped with four secondary carriers for compatible solutes: identification, sequencing, and characterization of the proline / ectoine uptake system, ProP, and the ectoine / proline / glycine betaine carrier, EctP. / / J. Bacteriol. 180 (22) :6005-6012.

5. Peters R., Galinski EA and Tr ü per HG (1990) The biosynthesis of ectoine. / / FEMS Microbiol. Lett. 71 (1-2) :157-162.

6. Pfl ü ger K., Baumann S., Gottschalk G., Lin W., Santos H., and M ü ller V. (2003) Lysine-2 ,3-aminomutase and β-lysine acetyltransferase genes of methanogenic archaea are salt induced and are essential for the biosynthesis of N ^{ε-acetyl-β-lysine} and growth at high salinity. / / Appl. Environ. Microbiol. 69 (10) :6047-6055.

7. Pichereau V., Pocard JA, Hamelin J., Blanco C., and Bernard T. (1998) Differential effects of dimethylsulfoniopropionate, dimethylsulfonioacetate, and other S-methylated compounds on the growth of Sinorhizobium meliloti at low and high osmolarities. / / Appl. Environ. Microbiol. 64: 1420-1429.

8. Poolman B. and Glaasker E. 1998) Regulation of compatible solutes accumulation in bacteria. (1998) Regulation of compatible solutes accumulation in bacteria. Mol. / / Mol. Microbiol. 29 (2) :397-407.

9. Prabhu J., Schauwecker F., Grammel N., Keller U., and Bernhard M. (2004) Functional expression of the ectoine hydroxylase gene (thpD) from Streptomyces chrysomallus in Halomonas elongata. / / Appl. . Microbiol . Environ. Microbiol. 70 (5) :3130-3132.

10. Rao DR, Hariharan K., and Vijayalakshmi KR (1969) A study of the metabolism of L-αγ-diaminobutyric acid in a Xanthomonas species. / / J. Biochem. 114 (1) :107-115.

11. Reed . H ., Borowitzka R. H., Borowitzka . J ., Mackay L. J., Mackay . A ., Chudek M. A., Chudek . A ., Foster J. A., Foster ., Warr R., Warr . R . C ., Moore S. R. C., Moore . J ., and D. J., And Stewart . D . P . (1986) Organic W. D. P. (1986) Organic solute accumulation in osmotically stressed . cyanobacteria. FEMS / / FEMS . Rev . 39(1-2): 51-56. Microbiol. Rev. 39 (1-2): 51-56.

12. Reed RH, Richardson DL, Warr SRC, and Stewart WDP (1984) Carbohydrate accumulation and osmotic stress in cyanobacteria. / / J. Gen. Microbiol. 130:1-4.

13. Reshetnikov AS, Khmelenina VN, and Trotsenko YA (2006) Characterization of the ectoine biosynthesis genes of haloalkalotolerant obligate methanotroph''Methylomicrobium alcaliphilum20Z''/ / Arch. Microbiol. 184:286-297

14. Roberts MF (2004) Osmoadaptation and osmoregulation in archaea: update. / / Front. Biosci. 9:1999-2019.

15. Roberts MF (2005) Organic compatible solutes of halotolerant and halophilic microorganisms. / / Saline Systems. V1: 5.

16. Santos H. and da Costa MS (2002) Compatible solutes of organisms that live in hot saline environments. / / Environ. Microbiol. 4 (9) :501-509.

17. Severin J., Wohlfarth A., and Galinski EA (1992) The predominant role of recently discovered tetrahydropyrimidines for the osmoadaptation of halophilic eubacteria. / / J. Gen. Microbiol. 138 (8) :1629-1638.

18. Sieburth JN, Johnson PW, Eberhardt MA, Sieracki ME, Lidstrom ME, and Laux D. 1987) The first methane-oxidizing bacterium from the upper mixing layer of the deep ocean: Methylomonas pelagica sp.nov. (1987) The first methane-oxidizing bacterium from the upper mixing layer of the deep ocean: Methylomonas pelagica sp.nov. / / Curr. . Microbiol. 14 (5) :285-293.

19. Silva Z., Borges N., Martins LO, Wait R., da Costa MS and Santos H. (1999) Combined effect of the growth temperature and salinity of the medium on the accumulation of compatible solutes by Rhodothermus marinus and Rhodothermus obamensis. / / Extremophiles. V3, № 2. p.163-172.

20. Sleator RD and Hill C. 2001) Bacterial osmoadaptation: the role of osmolytes in bacterial stress and virulence. (2001) Bacterial osmoadaptation: the role of osmolytes in bacterial stress and virulence. FEMS Microbiol. / / FEMS Microbiol. Rev. 1): 49-71. 26 (1): 49-71.

21. Smith LT and Smith GM (1989) An osmoregulated dipeptide in stressed Rhizobium meliloti. / / J. Bacteriol. 171 (9) :4717-4717.

22. Smith LT, Smith GM, and Madkour MA (1990) Osmoregulation in Agrobacterium tumefaciens: accumulation of a novel disaccharide is controlled by osmotic strength and glycine betaine. / / J. Bacteriol. 172 (12) :6849-6855.

23. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F., Jeanmaugin F., Higgins DG (1997) The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. / / Nucleic Acids Res. V.25, № 24. p.4876-4882.

24. Toney MD, Hohenester E., Keller JW, and Jansonius N. (1995) Structural and mechanistic analysis of two refined crystal structures of the pyridoxal phosphate-dependent enzyme dialkylglycine decarboxylase. / / J. Mol. Biol. 245 (2) :151-179.

25. Tr ü per HG and Galinski EA (1986) Concentrated brines as habitats for microorganisms. / / Experientia. 42:1182-1187.

26. Ventosa A. and Nieto JJ (1995) Biotechological applications and potentialities of halophilic microorganisms. / / World J. Microbiol. Biotechnol. 11 (1) :85-94.

27. Waditee R., Tanaka Y., Aoki K., Hibino T., Jikuya H., Takano J., Takabe T., and Takabe T. (2003) Isolation and functional characterization of N-methyltransferases that catalyze betaine synthesis from glycine in a halotolerant photosynthetic organism Aphanothece halophytica. / / J. Biol. Chem. 278 (7) :4932-4942.

28. Welsh DT (2000) Ecological significance of compatible solute accumulation by micro-organisms: from single cells to global climate. / / FEMS Microbiol. Rev. 24 (3) :263-290.

29. Wohlfarth A., Severin J., and Galinski EA (1990) The spectrum of compatible solutes in heterotrophic halophilic eubacteria of the family Halomonadaceae. / / J. Gen. Microbiol. 136:705-712.

30. Curr. Zhao B., Lu W., Yang L., Zhang B., Wang L., and Yang SS (2006) Cloning and characterization of the genes for biosynthesis of the compatible solute ectoine in the moderately halophilic bacterium Halobacillus dabanensis D-8T / / Curr. . Microbiol. 53:183-188.

31. Zhilina TN and Zavarzin GA (1990) Extremely halophilic, methylotrophic, anaerobic bacteria. / / FEMS Microbiol. Rev. 87 (3-4) :315-322.

    Додати в блог або на сайт
    
    
    Цей текст може містити помилки.
    
    Біологія | Дисертація
    346.8кб. | скачати
    

    ---

    Схожі роботи:
    Метилотрофних бактерій - джерела ізотопно-мічених Н-2 і С-13 амінокислот
    Метилотрофних бактерій джерела ізотопно мічених Н 2 і З 13 амінокі
    Фізіологічна адаптація нового RuMP штаму факультативних метилотрофних бактерій Brevibacterium
    Технологія біосинтезу амінокислот
    Регуляція біосинтезу білків на етапі трансляції
    Регуляція біосинтезу білків на етапі транскрипції
    Вивчення біосинтезу амінокислот штамом Вrevibacterium methylicum при зростанні на
    Вивчення біосинтезу амінокислот штамом Вrevibacterium methylicum при зростанні на середовищах містять
    Експресія генів