Сергій Львович Кисельов, проф., Д.б.н., зав. лаб. молекулярної генетики раку Ін-ту біології гена РАН. Марія Андріївна Лагарькова, к.б.н., рук. групи біології стовбурових клітин в тому ж інституті.
Мабуть, самим молодим напрямком сучасної медицини можна вважати клітинні технології, в яких клітини служать джерелом тих чи інших необхідних чинників, наприклад пухлинних антигенів при вакцинотерапії. Але використовувати клітину можна не тільки як джерело будь-яких субстанцій, а й для регенеративної медицини. Тут особливий інтерес викликають технології, засновані на стовбурових клітинах. Здатність до необмеженого поділу і до перетворення в різні типи клітин (так звана плюрипотентні) робить їх ідеальним матеріалом для трансплантаційних методів терапії. Найбільш доступними вважаються стовбурові клітини дорослого організму. Однак реальний потенціал їх диференціювання ще слабо вивчений.
Надзвичайно привабливі в цьому відношенні ембріональні стовбурові клітини (ЕСК) людини: з них можна отримувати будь-які типи клітин організму. Але багато властивостей і клітинні механізми, пов'язані з наявністю у клітини так званої «стволовости», ставлять її дуже близько до трансформованої, ракової клітки. Саме тому так важливо сьогодні вивчати характеристики самих ембріональних клітин. За вісім років, що минули з моменту отримання перших ліній ЕСК людини, вдалося з'ясувати лише невелику частину механізмів, що забезпечують в культурі самопідтримка недиференційованих клітин або їх диференціювання.
Ще недавно кількість ліній ЕСК людини, доступних для вивчення, було невелике. В даний час їх стало набагато більше, але методологічні труднощі і висока вартість роботи з ними ще обмежують коло дослідників. Не менші обмеження на дослідження в області ембріональних клітин людини накладає етична сторона. Незважаючи на дебати про етичність чи неетичність роботи з ЕСК людини, очевидно, що питання вже не в тому, чи проводити дослідження в області ЕСК людини, а в тому, як будуть проводитися дослідження в цій області. За останні два роки у великому числі країн вже були прийняті закони, які дозволяють дослідження ембріональних стовбурових клітин людини.
Ембріональні стовбурові клітини отримують з внутрішньої клітинної маси бластоцисти на самих ранніх стадіях розвитку ембріона, коли вона ще не імплантувався у стінку матки. Саме з клітин внутрішньої клітинної маси в подальшому розвивається цілий організм. Досить часто, особливо в російськомовній літературі, ембріональними стволовими клітинами називають клітини післяімплантаційному ембріона різних строків розвитку вагітності, які за своїми властивостями швидше схожі з дорослими стовбуровими клітинами. Ми ж будемо говорити тільки про справжні ембріональних стовбурових клітинах, що походять з бластоцисти, - на тій стадії, коли ембріон складається з 150-200 клітин трофоектодерми і внутрішньої клітинної маси приблизно в рівному співвідношенні.
Стабільні лінії
Стабільні клітинні лінії ЕСК людини вперше отримав американський дослідник Дж.Томсон в 1998 р. [1]. Цьому досягненню передували роботи М. Еванса і М. Кауфмана. У 1981 р. вони вперше показали принципову можливість отримання стабільних культур клітин ссавців, що мають властивість плюрипотентні. Лінії ЕСК миші залишалися в культурі in vitro в недиференційованому стані протягом більше сотні подвоєнь, а потім in vivo могли брати участь у формуванні спеціальних тканин тварини. У 1995 р. Томсон з колегами, модифікувавши технологію виділення мишачих клітин, отримав лінію ЕСК приматів, а в 1998 р. - і лінію клітин людини.
Для отримання стабільних ліній ЕСК людини беруть незатребувані після штучного запліднення бластоцисти людини. Зазвичай після такої процедури кількість бластоцист більше, ніж необхідно реципієнту. Їх можна заморозити, знищити або за згодою донорів використовувати для наукових цілей. Краще всього виділяти ембріональні клітини людини на 4-6-й день після запліднення. Спочатку за допомогою ферменту пронази розчиняють прозору оболонку бластоцисти, а потім методом комплемент-залежного лізису видаляють трофобласта. Внутрішню клітинну масу поміщають у культуральне середовище на підкладку з інактивованих мишачих ембріональних фібробластів, які служать джерелом ростових факторів. Пересаджуючи клітини, можна отримати клітинну лінію, здатну до практично необмеженого поділу. Сьогодні в лабораторіях світу виділено близько 150 ліній ЕСК. У нашій країні ембріональні стовбурові клітини отримані в 2003 р. в Інституті біології гена РАН та в Інституті цитології РАН.
Рис. 1. Три колонії ЕСК людини.
На відміну від ЕСК миші, людські клітини дуже погано ростуть у вигляді поодиноких клітин,
а виживають тільки в колонії. Повів. 100. Тут і далі фото авторів Ембріональні стовбурові клітини ростуть щільними колоніями клітин на підкладці з мітотично інактивованих ембріональних фібробластів миші (рис.1). Успішність отримання ліній ЕСК людини досить висока при використанні морфологічно нормальних бластоцист з видимою внутрішньої клітинної масою, майже половина яких може дати каріотіпіческі нормальні клітини. Ці результати відповідають рівню імплантації ембріонів після пересадки реципієнтам. Нарощувати клітинну масу досить складно. Мишачі клітини чудово ростуть після ферментативної обробки до одиничних клітин, але клітини людини, позбавлені міжклітинних контактів, зазвичай гинуть. Тому їх розділяють до окремих фрагментів по 50-500 кліток (або ферментативної обробкою, або механічно, розрізаючи на шматочки мікроінструменту).
Маніпуляції з ооцитами in vitro дозволяють отримувати лінії ЕСК людини з заданим генотипом і, відповідно, імунологічно сумісні з потенційним донором. Тут можна кілька підходів: перенесення ядер соматичних клітин, партеногенез чи злиття клітин. Перенесення ядер соматичних клітин досить часто не зовсім коректно називають клонуванням. В останні місяці 2005 р. розгорнулася детективна історія навколо робіт вчених з Сеульського національного університету під керівництвом В. Хванга. У 2004-2005 рр.. в журналі «Science» вони опублікували дві роботи з описом методики отримання лінії ЕСК людини із внутрішньої клітинної маси, отриманої після пересадки ядра соматичної клітини в ооцит. На жаль, роботи виявилися грандіозної фальсифікацією, причини якої до цих пір не з'ясовані. Не виключено, що все могло бути заздалегідь організовано третіми особами в комерційних або політичних цілях. Однак ці події не тільки не знизили інтерес до проблеми, а й активізували роботи в цьому напрямку.
Основні характеристики
Як і всі клітинні культури, ембріональні стовбурові клітини потребують чіткої характеристиці [2]. Найпростіше - це зовнішнє опис, але воно дає дуже обмежену інформацію про властивості клітин. Останнім часом прийнято розрізняти клітини по поверхневих антигенів, які більш повно описують той чи інший тип. Ембріональні стовбурові клітини людини мають поверхневі імунологічні маркери, наприклад: SSEA-3, SSEA-4 - антигенні детермінатів (епітопи) гликолипидов і TRA-1-60, TRA-1-81 - різні епітопи одного протеоглікану клітинної поверхні.
Наявність набору певних маркерів свідчить про приналежність клітин до ЕСК людини, але не про їхню здатність до тривалої проліферації. Вона визначається активністю ферменту теломерази і довжиною теломерна повторів. У соматичних клітин з обмеженим числом розподілів довжина теломер мала, а теломеразной активність зазвичай дуже невисока. Навпаки, у пухлинних клітин активність ферменту залишається дуже високою, а довжина теломерна повторів зберігається. Цим же властивістю володіють і ембріональні стовбурові клітини.
І імунологічні маркери ЕСК, і висока теломеразной активність притаманні трансформованим клітинам, тобто клітинам, в яких відбулися генетичні зміни. Значить, для точної характеристики ліній ЕСК людини обов'язковий аналіз каріотипу. Нормальний набір хромосом і відсутність хромосомних аномалій - це ознаки нормального каріотипу, який, проте, в процесі культивування клітин може бути порушений. Так, при тривалому культивуванні (приблизно через два роки) ми відзначили суттєва зміна у швидкості росту клітин, а також в їх здатності до диференціювання. Каріотіпіческій аналіз показав порушення в хромосомі 18 і тенденцію до нестабільності каріотипу. Не виключено, що це і стало причиною аномального поведінки клітин в культурі. Згодом ми не раз виявляли субклони інших ліній ЕСК з різними хромосомними абераціями. Зовсім недавно з'явилася публікація, що підтверджує наші спостереження. Отже, при тривалому культивуванні ЕСК людини необхідний суворий контроль їх каріотипу.
Молекулярно-генетичні механізми самопідтримки
Одна з чудових властивостей ембріональних стовбурових клітин - їх здатність зберігати плюрипотентні в культурі. На мишачих клітинах це легко перевірити експериментально: з однієї клітини, яка культивується in vitro, можна відтворити цілий організм. Саме так отримують тварин з генетичним «нокаутом». Суть технології полягає в тому, що генетично модифіковані in vitro ембріональні клітини миші вводять в бластоцисту, яку імплантують псевдобеременності мишці. У результаті народжуються так звані химерні миші, у яких частина клітин - від бластоцисти реципієнта, а частина генетично модифікована. Якщо такі клітини потраплять в зародковий шлях, у другому поколінні можна отримати тварина, всі клітини якого будуть нащадками однієї генетично модифікованої ембріональної клітини.
Ця технологія не тільки дозволяє «вимикати» певні гени в строго детермінованих тканинах, але «включати» дефектні, створюючи модельні системи захворювань. Зі зрозумілих причин така процедура з клітинами людини неможлива. Тут для перевірки плюрипотентні ембріональні клітини людини вводять імунодефіцитним мишам. В результаті у тварин формуються доброякісні пухлини - тератоми, в яких можна знайти кілька видів сформувалися тканин [3]. Однак для постійного моніторингу стану ЕСК і для забезпечення оптимальних умов культивування такий метод видається нераціональним. Тут дуже важливо з'ясувати молекулярні механізми, що визначають специфіку ембріональних стовбурових клітин, а саме їх здатність залишатися в культурі в недиференційованому стані. Деякі механізми - загальні для ЕСК миші і людини, а деякі - різні.
У самопідтримки ЕСК бере участь Фактор транскрипції OCT4, який виявляється з восьміклеточной стадії ембріона миші. Він необхідний для формування внутрішньої клітинної маси бластоцист (у клітках трофоектодерми він відсутній). Відповідна активність гена oct4 підтримує недиференційований стан ембріональних клітин, а її підвищення або відсутність викликає їх перетворення в клітини ентодерми і мезодерми або трофобласта відповідно [4]. У клітинах соматичних тканин експресія гена oct4, характерна для ЕСК людини, не виявлена, хоча останнім часом з'явилися повідомлення про його низьку активність в стовбурових клітинах дорослого організму. Навіть на початку диференціювання ЕСК в ембріоідние тільця активність гена оct4 знижується.
У підтримці плюрипотентні ЕСК миші і людини бере участь також гомеобоксний Фактор транскрипції NANOG. Якщо ген nanog заблокований, ембріональні клітини перетворюються на примітивну ентодерми. У відсутність ростового фактора LIF підвищена активність гена nanog забезпечує плюрипотентні стан ЕСК миші. Подібно гену oct4, в клітинах соматичних тканин ген nanog не виявляється, за винятком фетального мозку, репродуктивних органів (сім'яників і яєчників) і клітин ембріональної карциноми. У міру спонтанної диференціювання ЕСК людини в ембріоідние тільця активність гена nanog знижується.
Окрім генетичних механізмів, долю клітини визначають і так звані епігенетичні механізми (тобто успадковані клітиною зміни у функціонуванні генів, які пов'язані зі зміною послідовності ДНК). Яскравим прикладом їх дії може служити інактивація одній з Х-хромосом у жіночих ХХ-клітинах. Епігенетичні механізми відіграють істотну роль у процесах раннього ембріонального розвитку, контролюючи роботу генів. Епігенетична модифікація регуляторних районів генів забезпечує вимикання їх функцій на наступних етапах розвитку. Це надзвичайно важливо, оскільки несвоєчасна або нескоординована робота генів може призводити до загибелі клітин або до їх трансформації. Наприклад, регуляторний район гена oct4 епігенетичні модифікований практично у всіх клітинах дорослого організму. Така зміна і становить одну з основних проблем переносу ядер соматичних клітин дорослого організму в ооцит. У нашій лабораторії показано, що і регуляторний район гена nanog в клітинах дорослого організму епігенетичні модифікований, що ще більше ускладнює перенесення ядер.
Сучасні методи аналізу, такі як мікрочіпи, дозволяють досить швидко визначати активність декількох тисяч генів, що створює більш точну картину молекулярно-генетичного стану клітини. Це особливо важливо для довгостроково культивованих клітин, призначених для терапії.
Кажучи про підтримку плюрипотентні ембріональних стовбурових клітин ссавців, не можна не відзначити роль зовнішніх ростових факторів, у тому числі і фібробластів в якості підкладки-фідера (від англ. Feed - годування, харчування). Перші клітинні лінії ЕСК миші і людини отримували з використанням первинних мишачих ембріональних фібробластів, що забезпечують не тільки кращий ріст клітин, але і їх недиференційований стан. Пізніше їх замінили безсмертної клітинної лінією. Проте вважається, що ці клітинні лінії не можна застосовувати в регенеративної медицини або генної терапії, оскільки від мишачих клітин можливе перенесення патогенних мікроорганізмів і вірусів. Крім цього, клітини людини починають представляти мишачі антигени, що може викликати відторгнення трансплантата. Сьогодні для культивування ліній ЕСК людини іноді використовуються фібробласти крайньої плоті людини. В літературі з'явилися окремі публікації про отримання таких ліній і в бесфідерних умовах.
Диференціація in vitro
In vitro спонтанна диференціювання ЕСК відбувається при тривалому культивуванні прикріплених колоній і в суспензії в міру зростання ембріоідних тілець, які до певної міри служать моделлю ранніх подій ембріогенезу. У разі мишачих ЕСК ембріоідние тільця виходять аггрегірованіем окремих клітин або груп клітин в сферичні структури. На відміну від мишачих клітин, не всі лінії людини легко утворюють ембріоідние тільця, і ніколи із поодиноких клітин. У ембріоідних тільцях короткого культивування спостерігаються групи клітин, що несуть маркери, специфічні для всіх трьох зародкових листків (рис.2), але далі розвиток зупиняється. Сьогодні чіткої відповіді про причини гальмування органогенезу немає; найімовірніше, для цього потрібна поляризація ембріона, що диктується ззовні.
Рис. 2. Ембріоідние тільця, сформовані ЕСК людини.
У міру дозрівання всередині щільних клітинних кульок з'являються порожнини, і через деякий час ембріоідное тільце перетворюється на сферу. Праворуч показано імуногістохімічне фарбування зрізів ембріоідних тілець антитілами до клітин епітелію (червоний), мезодермальних клітинам (зелений), синім пофарбовані ядра клітин. Повів. 50.
Ембріональні стовбурові клітини in vitro здатні перетворитися на різні клітини, що мають специфічні маркери нейронів і глії, ендотелію, кератиноцитів, трофобласта, кардіоміоцитів, остеобластів, клітин крові, гепатоцитів, інсулін-продукуючих клітин і деяких інших [2]. Однак функціональність більшості носіїв маркерів ще мало доведена.
У 2001 р. вперше описали диференціювання ЕСК людини в нейрони і астроцити [5]. Клітини нейроектодерми, що формуються в ембріоідних тільцях, механічно витягували, поміщали у відповідні умови культивування (фактори, що забезпечують проліферацію клітин), де формувалися нейросфер. Hейральние попередники після пересадки в мозок новонароджених мишей могли утворювати три типи нейтральні клітин і не давали тератом.
З тих пір зроблено дуже багато. Знайдені фактори, що збільшують кількість нейтральні попередників (ретиноєва кислота, блокатор cігнального шляху BMP та ін); показана диференціювання функціональних нейрональних клітин певної спеціалізації (наприклад, дофамінергічних нейронів). Нещодавно отримано дані про можливість тривалого (більше 100 пасажів) культивування нейроектодермальні попередників у бессивороточной середовищі в присутності ростових факторів.
Нейрональні попередники отримують через стадію ембріоідних тілець або безпосередньо з недиференційованих колоній ліній ЕСК людини. Нейрональні попередники можна культивувати в суспензії до 25 пасажів у вигляді нейросфер у присутності епідермального фактору росту та фактора росту фібробластів. При перекладі нейросфер на культуральний пластик, покритий компонентами позаклітинного матриксу, вони прикріплюються і перетворюються в нейрони і астроцити. При додаванні в середу тріїодтіроніна і певних ростових факторів у нейросфер з'являються попередники олигодендроцитов. Ймовірно, саме олігодендроцити і будуть першими клітинами, отриманими з ЕСК людини, які пройдуть апробацію при клінічних випробуваннях лікування травми спинного мозку. Ці клітини, що секретують основний білок мієліну, необхідні для відновлення пошкодженої ділянки нервової тканини спинного мозку. У США ці випробування планують розпочати вже в 2006 р.
Спонтанне диференціювання ЕСК в кератиноцити з ембріоідних тілець описали в 2003 р. Автори відзначили зміни активності трьох маркерів, характерних для формуються кератиноцитів (p63, кератин 14, інволюкрін).
Ембріональні клітини миші легко диференціюються в кардіоміоцити. Всього через кілька днів після видалення живильного шару і фактора LIF, що підтримує недиференційований стан клітин, на культуральних чашках утворюються скорочуються колонії клітин. У певних умовах вони мають електрофізіологію нормальних дорослих кардіоміоцитів і, більше того, можуть функціонально інтегруватися в м'яз міокарда. На відміну від мишачих клітин, спонтанна диференціювання клітин людини спостерігається у різних ліній ЕСК - від скорочуються ділянок в 70% ембріоідних тілець до повної відсутності диференціювання. Попередники кардіоміоцитів, отримані з ЕСЬК людини, синтезують транскрипційні фактори Nkx 2.5, GATA4, а потім і специфічні маркери кардіоміоцитів (тропонин 1 і важкий ланцюг -міозину). Ми спостерігали спонтанну диференціювання ЕСК в кардіоміоцити у двох лініях з трьох, причому скорочуються ділянки відзначалися в дуже невеликому відсотку ембріоідних тілець.
Клітини гемопоетичної ряду вперше отримали при спільному культивуванні ЕСК людини з лініями стромальних фібробластів, а також використовуючи фактори росту гематопоетичних клітин. У ембріоідних тільцях виявлена також популяція клітин, що володіють властивостями попередників гематопоетичних клітин та ендотеліальних (гемангіобласт).
У нашій лабораторії ведуться роботи по прямій (тобто минаючи стадію ембріоідних тілець) диференціювання ЕСК людини в клітини ендотелію і розробляються методи їх селекції. Використовуючи колагени в якості матриксу, спеціальне середовище і ростові фактори, ми отримали клітинні популяції, в яких ендотеліальні клітини складають близько 50%. На колагенові матриксі вони утворюють капілляроподобние структури, що несуть специфічні маркери судинного ендотелію (рис.3). Ми успішно застосовували метод іммуномагнітной селекції СD31-позитивних ендотеліальних попередників на ранніх (4-5-й день) етапах диференціювання, оскільки на пізніх етапах міжклітинні контакти в капілляроподобних структурах з працею піддаються ензиматичного розщеплення і клітини втрачають життєздатність. У результаті селекції нам вдавалося виділити гомогенну популяцію ендотеліальних клітин, in vitro формують капілляроподобние структури.
Рис. 3. Ендоваскулярна мережа, утворена in vitro чистої виділеної популяцією клітин ендотелію,
отриманих методом іммуномагнітной сепарації з ЕСК людини (пофарбовано на маркер CD31). Повів. 200.
Найважче виявилося з похідними ентодерми. Незважаючи на опубліковані повідомлення про диференціювання ЕСК людини в інсулін-секретирующие клітини і гепатоцити, їх функціональність не показана. Більш того, за білковим і генетичними маркерами вони не повністю збігаються з зрілими інсулін-секретуючими клітинами або гепатоцитами. Поки невідомі фактори, що визначають перетворення в ентодерми, і маркери ранньої ентодермальний диференціювання.
Отже, сьогодні зрозуміло, що для напрацювання маси клітин різних типів вже є розроблена модель диференціювання, яка повинна відповідати певним вимогам:
- Ембріональні стовбурові клітини потрібно культивувати в стандартизованих умовах з відпрацюванням генетичних маніпуляцій і дотриманням технології клонального зростання;
- Індуковану диференціювання необхідно вести переважно до бажаного клітинному фенотипом і мати можливість селекції потрібних популяцій клітин;
- Всі етапи диференціювання повинні бути відтворені які контролю, а дія факторів, її індукують, добре відомо;
- Бажано також уникати багатокомпонентних нестандартизованих факторів, таких як сироватка, кондиціонованих середа, клітинні екстракти і т.д.
Такі науково-технологічні аспекти розробки клітинних технологій на основі ЕСК людини. Одночасно з цим існує цілий ряд етичних проблем, пов'язаних з дослідженням і застосуванням людських ЕСК.
Навколо ліній ЕСК людини тривають нескінченні дебати, що стосуються моральної сторони проблеми, а саме можливого використання незатребуваних бластоцист для виділення ЕСК. Відповіді на це питання до цих пір немає. Тут хочеться навести висловлювання відомого вченого в галузі раннього ембріонального розвитку професора В. Рейка: «Поки що з допомогою цієї технології кого-небудь не врятують, розмови про етичність і заборони на дослідження не припиняться».
Стрімкий розвиток досліджень в області стволових клітин людини стимулювало штат Каліфорнія прийняти Пропозиція 71 про виділення 3 млрд дол на 10 років для отримання нових клітинних ліній ЕСК. У травні 2005 р. Національна академія наук США закликала до добровільного прийняття етичних правил у галузі дослідження ЕСК людини. Ці правила стосуються інформованої згоди донорів, заборони оплати донорського матеріалу, роботи банків ЕСК, створення спостережних комітетів. Усі 23 запропонованих правила прийняті до виконання академічними та науковими організаціями штату Каліфорнія, що долучені до роботи з ЕСК людини. Трохи пізніше FDA (Food and Drug Administration) видала посібник зі скринінгу та тестування донорів людських клітин, тканин і продуктів, заснованих на клітинах. У деяких країнах Європейського співтовариства протягом 2004-2005 рр.. прийнято низку законів, які дозволяють дослідження в області ЕСК людини.
Вже активно обговорюються правила проведення першої фази клінічних випробувань на основі клітин, отриманих з ЕСК людини. При цьому переслідується основна мета - не зашкодити майбутньому реципієнту, оскільки ці трансплантати істотно відрізняються від традиційних. По-перше, значний період проходить між отриманням біологічного матеріалу та його застосуванням. За цей час можуть виявитися нові захворювання донорів або ті, які не змогли визначити при отриманні біологічного матеріалу. Крім інфекційних, з плином часу у донорів клітинного матеріалу можуть проявитися генетичні захворювання, в тому числі такі, як спадкова схильність до раку. Більше того, застосування імуносупресорів при трансплантації реципієнтам алогенного матеріалу підвищує ризик онкологічних та інфекційних захворювань. І, нарешті, якщо пересадка матеріалу, отриманого на основі ЕСК людини, виявиться ефективною, то матеріал одиничних ліній буде застосовуватися для великої кількості пацієнтів. Тому одним з основних етичних проблем, які очікують клітинну терапію на основі ЕСК людини, буде проблема повторного контакту та обстеження донорів біологічного матеріалу. Таким чином, розвиток клітинних технологій на основі алогенного матеріалу, в тому числі і ЕСК, призводить до нових питань етичного характеру, розв'язати які необхідно до початку клінічних випробувань.
Отже, сьогодні рано говорити про застосування клітинних імплантатів, отриманих на основі ЕСК людини. Залишається дуже багато невирішених завдань, головні з яких полягають в безпеці використання таких імплантатів. Їх реальну ефективність і безпеку можна буде оцінити лише після проведення тривалих і ретельних клінічних випробувань. Тим не менш, за оцінкою багатьох зарубіжних консалтингових компаній, технології на основі ЕСК будуть застосовуватися в клініці вже на рубежі 2012-2015 рр..
Список літератури
1. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J., Shapiro SS et al. / / Science. 1998. V.282. № 5391. P.1145-1147.
2. Pera MF, Trounson AO / / Development. 2004. V.131. № 22. P.515-525.
3. Reubinoff BE, Pera MF, Fong CY et al. / / Nat. Biotechnol. 2000. V.18. № 4. P.399-400.
4. Niwa H., Miyazaki J., Smith AG / / Nat. Genet. 2000. V.24. № 4. P.328-330.
5. Reubinoff BE, Itsykson P., Turetsky T. et al. / / Nat. Biotechnol. 2001. V.19. № 12. P.1134-1140.