Вплив гіпотермії на експресію генів
Введення
Кількісні і якісні перетворення білків рослин при зниженні температури припускають індукцію або репресію їх синтезу. Необхідні докази правомірності такого висновку були отримані при вивченні окремих стадій білкового синтезу. Перша з них - транскрипція.
1. Зміни у змісті нуклеїнових кислот при гіпотермії
Наявні дані свідчать про те, що, в порівнянні з нормальними умовами, вміст ДНК при гіпотермії змінюється незначно. Дослідження можливості синтезу нуклеїнових кислот у ядрах клітин скерди волокнистої і Трілліум під час охолодження до температур, близьких до 0 ° С, показало, що в цих умовах йде активне включення мічених сполук. Включення мітки ставало значно інтенсивніше при невеликому підвищенні температури, або при збільшенні експозиції. Цітофотометріческій аналіз вмісту ДНК-фуксину в кореневій меристемі насіння озимих злаків показав, що охолодження знижує реплікативну і метаболічної активності хроматину. Здатність хроматину підтримувати синтез РНК навіть у присутності ендогенного джерела РНК-полімерази помітно пригнічується при охолодженні бобів. Можливо, це пов'язано з тим, що при зниженні температури зменшується доступність матриці ДНК для полімерази.
У дальнешіх дослідженнях було підтверджено положення про те, що вміст ДНК при гіпотермії змінюється мало, а всі зміни у метаболізмі нуклеїнових кислот стосуються, в основному, РНК. Показано, що низькотемпературна акліматизація супроводжується збільшенням вмісту РНК, розбіжності у даних про метаболізм ДНК, мабуть, залежать від того, обчислюється чи вміст ДНК на одиницю сирого або сухої ваги. У деяких випадках відзначаються пов'язані з гіпотермією зміни у змісті транспортних РНК, однак ці зміни спостерігалися не всіма авторами. Крім того, є дані про зміну активності тРНК і аміноацил-тРНК-синтетази під час загартовування рослини, що свідчить про регуляцію в цих умовах синтезу білка на рівні трансляції.
2. Зміни експресії генів при гіпотермії
Як відомо, в клітинах рослин, комах, ссавців як теплової, так і холодовий шок викликає зміни в активності генів. При цьому починається синтез невеликого числа «білків теплового шоку» і припиняється синтез всіх інших білків. Якщо продовжити аналогію між тепловим і холодовим шоками, то слід очікувати, що при зниженні температури в певних межах почнуть функціонувати специфічні гени. У зв'язку з цим стає зрозумілою суперечливість даних про зміну змісту РНК при гіпотермії. Значна частина авторів вказує, що під час охолодження і холодового загартовування у рослин підвищується загальний вміст РНК, але є і протилежні результати. Вивчення специфічних видів РНК після фракціонування показало відносне підвищення вмісту РНК, діючого на рівні трансляції. Низькотемпературне загартовування рослини призводить до структурних змін в рибосомах.
Ч. Гай з співавторами призвели прямий доказ того, що гіпотермія індукує зміни в експресії генів. Використовуючи трансляцію в безклітинну системі, вони показали, що під дією низьких позитивних температур відбувається швидке і стабільне зміна набору полі + мРНК, що виражається в появі специфічних РНК холодового стресу. Зміна набору полі + мРНК відбувалося вже в першу добу загартовування, при цьому починався розвиток холодоусточівості,. З початком розвитку стійкості корелювало поява двох мРНК, які в безклітинну системі визначають синтез білків холодового шоку з молекулярними масами 82 і 180 кДа. У наступні 8 днів триває зміна складу мРНК: зміст чотирьох мРНК збільшується, а трьох - значно зменшується. Більшість білків, синтез яких индуцировали гіпотермії, не ідентична з молекулярним масам і pI білків теплового шоку. Таким чином, це повідомлення є одним з перших свідчень існування в рослинах білків холодового шоку, відмінних від білків теплового шоку.
Швидка зміна набору мРНК з початком холодового загартовування було згодом підтверджено іншими дослідниками. Так, було показано, що дводенна експозиція проростків люцерни при 4 0 С призводить до різкого збільшення змісту загальної кількості РНК і до зміни складу трансльованих мРНК. Трансляція in vitro полі + мРНК, з подальшим електрофорезом мічених поліпептидів, показала індукцію синтезу низько-і високомолекулярних білків холодового шоку. При перенесенні рослин в умови з «нормальною» температурою відбувалося зворотне зміна спектру поліпептидів і, отже, набору мРНК. Показано, що мРНК, індуковані охолодженням, накопичуються з різною швидкістю. При трансляції in vitro знайшли групи білків з різною індукцією синтезу de novo-від 6 до 12 годин, а також білки, зміст яких при холодовому загартовуванні знижується.
У наступні роки вивчення змін у синтезі РНК при низькотемпературному стресі привернуло особливу увагу дослідника. До теперішнього часу виділено і охарактеризовано значне число мРНК, експресується при низькотемпературному стресі і в процесі адаптації рослини до низьких температур. Зокрема, встановлено, що, наприклад, в люцерні під час холодової акліматизації накопичуються два мРНК, MsaCiA і MsaCiB, які кодують білки, що містять багаті гліцином мотиви. Злиті поліпептиди, що містять амінокислотні послідовності, виведені на підставі цих мРНК, продукувалися в E. coli і були використані для отримання антитіл. Отримані антитіла мали крос-реактивно специфічністю з розчинними поліпептидами MsaCiA і MsaCiB, відповідно. Ці поліпептиди виявлялися тільки в верхівках загартованих рослин, хоча під час холодової акліматизації мРНК для
MsaCiA накопичувалася як у верхівках, так і в стеблах. Аналіз білків за допомогою вестерн-блотів показав, що MsaCiA-подібні білки з молекулярними масами 32, 41 і 68 кДа накопичувалися в клітинних стінках стеблі, і один, з молекулярно масою 59 кДа, - в клітинних стінках пагонів. Показано, що ця диференційна експресія включає як транскрипційних, так і посттрансляційної регуляцію. Порівняння, проведене між шістьма сортами люцерни з контрастно морозостійкістю, підтверджує те, що здатність накопичувати до значного рівня білки, подібні MsaCiA і MsaCiB, може бути пов'язана зі стійкістю рослини до низьких температур.
У ході досліджень експресії генів при низьких температурах було виявлено кілька груп генів, експресія яких індукується холодовим шоком і адаптацією рослини до низьких температур. Далі будуть розглянуті основні сімейства таких генів.
3. Сімейство генів Wcs 120
Озимі, в порівнянні з яровими злаками, володіють ефективними механізмами акліматизації, які дозволяють їм перезимовувати і виживати при температурі замерзання грунту. Це відмінність генетично запрограмовано і включає в себе складну генетичну систему. Щоб зрозуміти характер даної системи та її регуляцію низькими температурами, були ідентифіковані і охарактеризовано гени пшениці, стійкої до замерзання грунту. У ході цих досліджень встановлено, що сімейство гена wcs120 кодує групу білків з молекулярними масами від 12 до 200 кД. Як показано за допомогою біохімічних, імуногістохімічних і молекулярно-генетичних аналізів, дане сімейство генів, специфічне у Poaceae, дуже численна й координованої регулюється низькими температурами. Більше того, накопичення білків WCS прямо корелює з рівнем стійкості рослин до замерзання грунту. Ці аналізи виявили також регуляторного контролю процесу яровизації при експресії генів низької температури в озимих злаків.
Індуковані низько температурою у пшениці гени сімейства wcs120 були картування з використанням вестерн-і Саузерн-блотів на дітелоцентріческіх серіях сорти Chines Spring. Ідентифіковані гени були локалізовані в довгих ділянках гомологічних груп 6-х хромосом всіх трьох геномів гексаплоїдної пшениці. Близькі види, які також мають A, АВ або D геноми також досліджувалися з використанням вестерн-і Саузерн-блотів з wcs120-зондами і WCS120-антитілами. Всі близькоспоріднені види несли один або більше геномів гексаплоїдної пшениці і продукували 50 кДа білок, реагірующі з антитілами і обумовлений за допомогою вестерн-блотів, і wcs120-гомологи, які визначалися за допомогою Саузерн-блотів у всіх видах. Відсутність ділянки 6DL хромосоми в гексаплоїдної пшениці сорту Chines Spring викликало відсутність синтезу 50 кДа білка, що не тільки вказувало на локалізацію wcs120 в даній ділянці 6DL-хромосоми, але також і підтвердило мовчання wcs120-гомологів в 6А хромосомі. Були також досліджені вміст білків, що реагують з антитілами на WCS120, та рівні холодостійкості в серіях лини з заміною хромосом сорти Chines Spring на хромосоми сорти Cheyenne. У ході експериментів було встановлено, що 5А хромосома сорти Cheyenne збільшувала холодостійкість пшениці сорту Chines Spring. Денситометрія вестерн-блот для визначення вмісту білка показала, що хромосома 5А має регуляторний ефект на експресію гена сімейства wcs120, розташованого на хромосомах 6-про групи всіх трьох геномів гексаплоїдної пшениці.
4 Специфічні для низької температури і генних багатих гліцином білків
Специфічна для низько температури кДНК пшениці pTACR7, представляє ген, визначений як tacr7 з озимої пшениці. Термін низькотемпературної-специфічний використовується авторами, оскільки експресія гена tacr7 не викликається обробкою екзогенно абсцизової кислотою або іншими типами стресу, такими, як сольовий стрес, зневоднення і тепловий стрес. PTACR7 був виділений за допомогою олігонуклеотидно зонда, схожого з pHVCR8 з ячменю за допомогою RT-PCR з мРНК з тканини пагонів пшениці. На підставі передвіщеної амінокислотної послідовності були визначені характеристики цього білка. Встановлено, що TACR7 дуже гідрофобний білок, з єдино трансмембранно областю і багатий лейцином. Вивчення рівні змісту копальні tacr7 показало їх накопичення в проростках пшениці, верхівкової тканини і калюсних культур після перенесення об'єктів з контрольних умов на холод. У ході експериментів спостерігалася відсутність виявляються Нозерн-гібридизації транскриптів pTACR7 в проростках або калюсах, оброблених екзогенно абсцизової кислото, після сольового стресу, обезводнення або теплового стресу. Транскрипти tacr7 накопичувалися в тканини меристеми під час експонування при 2 0 C в більшій мірі в холодостійка озимій пшениці 16029), ніж холодочувствітельной 16169) з найбільшою відмінністю між генотипами на третьому тижні загартовування. Таким чином, кодованих tacr7 білок за своїми характеристиками унікальний серед описаних в літературі індукованих низько температурою білків пшениці.
При вивченні мутації серцевини пентамера CCGAC двох передбачуваних індукованих низько температурою елементів в 5'-області индуцируемого холодом гена BN115 озимого ріпаку за допомогою аналізу нерезидентної експресії равнодействующих мутованих злиттів BN115-промотор-GUS було встановлено зменшення низькотемпературного регулювання промотора. Це вказує на те, що послідовність CCGAC в гені BN115 є надзвичайно важливо для його відповіді на низьку температуру. Навпаки, мутація двох G-боксів CACGTG, що знаходяться між індукованим низько температурою елементами в той же області промотора, не змінила індуковану холодом експресію гена. Заміна можливо області енхансера промотора BN115 на енхансери з промотора CaMV 35S виразилася в збільшенні рівня низькотемпературної індукції експресії GUS.
При вивченні кДНК ячменю були отримані ген-специфічні зонди, що кодують два типи гліцин-багатих білків: HvGRP2, що характеризується цитокератин-подібно і цистеїн-багато областями, і HVGRP3, чия основна особливість - наявність РНК-зв'язує області. У ході дослідження було встановлено, що експресія генів HvGRP2 і HVGRP3, які присутні в одне або двох копіях на кожен гаплоїдний геном, була повсюдно, і було показано, що ген HVGRP3 модулюється зміні умов освітлення. Холодовий пов ствие також збільшувало рівні вмісту мРНК HvGRP2 і HVGRP3.
При вивченні дії навколишнього середовища на експресію індукованих холодом генів на рівні зміни вмісту мРНК і тестуванні взаємозв'язку експресії генів і холодно акліматизації рослин ячменю у фазі третього і четвертого листа було проведено кілька варіантів досліду. У першому варіанті рослини були вирощені в різних температурних умовах між 20/15 0 C і +4 / -4 0 С, у другому варіанті рослини були перенесені з температури 20/15 0 C на температуру 6 / 2 0 C і в третьому варіанті досвіду рослини були вирощені в умовах посухи або нестачі поживних речовин. У ході експериментів вимірювалися за допомогою методу відростання морозостійкість рослин і рівні вмісту мРНК для трьох індукованих холодом генів: blt4.9, blt14 і blt101 з меристематичних тканин пагонів. Результати експериментів показують, що загартовані рослини та рівні експресії мРНК генів blt4.9, blt14 і blt101 підвищувалися при більш низьких температурах росту. У ході експериментів було також встановлено, що на ступінь зміни змісту мРНК цих генів у відповідь на зміну температури середовища значний вплив надавали попередні температурні умови і вік рослини. При цьому рівень загартованості рослин сильно корелював з рівнями вмісту мРНК цих генів у рослинах, вирощених у різних температурних умовах. Ця кореляція не поширювалася на рослини, піддані дії нестачі поживних речовин або посухи.
При вивченні впливу низько температури на експресію генів у Poncirus trifoliata із загартованих до холоду рослин були клоновані шість кДНК, що представляють унікальні індуковані холодом послідовності. У ході експериментів було виявлено, що гени pbcorc115 і pbcorc119 належать до одного сімейства генів. Дані сиквенсу вказують на те, що pbcorc115 і pbcorc119 містять відкриту рамку зчитування, що кодує поліпептид з молекулярно масою 19.8 кДа і поліпептид з меншою молекулярною масою 11.4 кДа, відповідно. Аналіз передвіщеної амінокислотної послідовності виявив три великих повтору в COR19 і тільки один повтор у COR11. У кожному повторі були виявлені два елементи-Q-кластерізованний тракт і K-багатий мотив. K-багатий мотив був схожий з подібними мотивами у білків класу D-II з бавовни і групи 2 білків LEA. Серинові кластер, характерний для багатьох схожих з групою 2 LEA білків, також був знайдений у цих білках. У той же час було виявлено, що в них він перебував у незвичайному становищі щодо карбокси-кінця. У COR19 і COR11 також був присутній двосторонні мотив основних залишків, схожих з відомими ядерними маркерними послідовностями, що дозволяє припустити, що члени даного семі ства білків можуть мати ядерну маркерну функцію. У ході експериментів авторами було досліджено експресія мРНК COR19 у відповідь на холодову акліматизацію, посуху, затоплення і засолення. Результати показали, що експресія COR19 в тканині листа індукувати у відповідь на холодову акліматизацію, але придушувалася під час посухи та затоплення.
W. Goodwin з співавторами при вивченні озимого ріпаку ізолювали кДНК і виділили ген, що кодує гібридний багаті пролином білок. Предполагаеми білок за структурою є модульним. При аналізі його амінокислотної послідовності встановлено, що N-термінальна область даного білка має властивості сигнального пептиду, який може направляти білок в ендоплазматичний ретикулум. Послідовність амінокислот від 27 до 287 має три області, які містять високі рівні вмісту проліну та кількох інших амінокислот, часто зустрічаються в багатих пролином білках клітинної стінки. Ці області характеризуються повторюваним амінокислотним мотивом. З-термінальна область містить три передбачуваних мембранно-зв'язуючих ділянки і має високу ступінь подібності з амінокислотами деяких різновидів гібридних багатих пролином білків. На основі цих даних автори роблять висновок, що даний білок секретується з клітки, розміщується в клітинній стінці і заякориваются в плазматичній мембрані за допомогою С-термінально області. У ході експериментів встановлено, що транскрипти, що кодують даний білок, індукуються в тканині листа протягом 8 год обробки холодом і їх зміст швидко знижується при поверненні рослини до нормальних температур. У той же час встановлено, що транскрипти НЕ індукуються тепловим шоком, зневодненням, екзогенно абсцизової кислотою або раневого стресом, тоді як транскрипти контрольного гена B. napus індукуються зневодненням та екзогенно абсцизової кислотою.
При вивченні експресії генів кукурудзи були виділені кДНК і відповідний геномний клон члена сімейства генів, що кодують a-субодиницю фактора елонгації трансляції 1. Передбачена амінокислотна послідовність з 447 залишків переривається в гені одним інтронів. Саузерн-блот аналіз показав, що клонований ген ef1a - один із сімейства, що складається, по менше мірою, з шести генів. Як показав Нозерн-блот аналіз, зміст мРНК даного білка в листках кукурудзи збільшується при низько температурі, в той час як у коренях рівень мРНК ef1 про різко зменшується. Ці результати показують, що експресія EF1 про диференційовано регулюється в листках і коренях під час холодового стресу. Введення
Кількісні і якісні перетворення білків рослин при зниженні температури припускають індукцію або репресію їх синтезу. Необхідні докази правомірності такого висновку були отримані при вивченні окремих стадій білкового синтезу. Перша з них - транскрипція.
1. Зміни у змісті нуклеїнових кислот при гіпотермії
Наявні дані свідчать про те, що, в порівнянні з нормальними умовами, вміст ДНК при гіпотермії змінюється незначно. Дослідження можливості синтезу нуклеїнових кислот у ядрах клітин скерди волокнистої і Трілліум під час охолодження до температур, близьких до 0 ° С, показало, що в цих умовах йде активне включення мічених сполук. Включення мітки ставало значно інтенсивніше при невеликому підвищенні температури, або при збільшенні експозиції. Цітофотометріческій аналіз вмісту ДНК-фуксину в кореневій меристемі насіння озимих злаків показав, що охолодження знижує реплікативну і метаболічної активності хроматину. Здатність хроматину підтримувати синтез РНК навіть у присутності ендогенного джерела РНК-полімерази помітно пригнічується при охолодженні бобів. Можливо, це пов'язано з тим, що при зниженні температури зменшується доступність матриці ДНК для полімерази.
У дальнешіх дослідженнях було підтверджено положення про те, що вміст ДНК при гіпотермії змінюється мало, а всі зміни у метаболізмі нуклеїнових кислот стосуються, в основному, РНК. Показано, що низькотемпературна акліматизація супроводжується збільшенням вмісту РНК, розбіжності у даних про метаболізм ДНК, мабуть, залежать від того, обчислюється чи вміст ДНК на одиницю сирого або сухої ваги. У деяких випадках відзначаються пов'язані з гіпотермією зміни у змісті транспортних РНК, однак ці зміни спостерігалися не всіма авторами. Крім того, є дані про зміну активності тРНК і аміноацил-тРНК-синтетази під час загартовування рослини, що свідчить про регуляцію в цих умовах синтезу білка на рівні трансляції.
2. Зміни експресії генів при гіпотермії
Як відомо, в клітинах рослин, комах, ссавців як теплової, так і холодовий шок викликає зміни в активності генів. При цьому починається синтез невеликого числа «білків теплового шоку» і припиняється синтез всіх інших білків. Якщо продовжити аналогію між тепловим і холодовим шоками, то слід очікувати, що при зниженні температури в певних межах почнуть функціонувати специфічні гени. У зв'язку з цим стає зрозумілою суперечливість даних про зміну змісту РНК при гіпотермії. Значна частина авторів вказує, що під час охолодження і холодового загартовування у рослин підвищується загальний вміст РНК, але є і протилежні результати. Вивчення специфічних видів РНК після фракціонування показало відносне підвищення вмісту РНК, діючого на рівні трансляції. Низькотемпературне загартовування рослини призводить до структурних змін в рибосомах.
Ч. Гай з співавторами призвели прямий доказ того, що гіпотермія індукує зміни в експресії генів. Використовуючи трансляцію в безклітинну системі, вони показали, що під дією низьких позитивних температур відбувається швидке і стабільне зміна набору полі + мРНК, що виражається в появі специфічних РНК холодового стресу. Зміна набору полі + мРНК відбувалося вже в першу добу загартовування, при цьому починався розвиток холодоусточівості,. З початком розвитку стійкості корелювало поява двох мРНК, які в безклітинну системі визначають синтез білків холодового шоку з молекулярними масами 82 і 180 кДа. У наступні 8 днів триває зміна складу мРНК: зміст чотирьох мРНК збільшується, а трьох - значно зменшується. Більшість білків, синтез яких индуцировали гіпотермії, не ідентична з молекулярним масам і pI білків теплового шоку. Таким чином, це повідомлення є одним з перших свідчень існування в рослинах білків холодового шоку, відмінних від білків теплового шоку.
Швидка зміна набору мРНК з початком холодового загартовування було згодом підтверджено іншими дослідниками. Так, було показано, що дводенна експозиція проростків люцерни при 4 0 С призводить до різкого збільшення змісту загальної кількості РНК і до зміни складу трансльованих мРНК. Трансляція in vitro полі + мРНК, з подальшим електрофорезом мічених поліпептидів, показала індукцію синтезу низько-і високомолекулярних білків холодового шоку. При перенесенні рослин в умови з «нормальною» температурою відбувалося зворотне зміна спектру поліпептидів і, отже, набору мРНК. Показано, що мРНК, індуковані охолодженням, накопичуються з різною швидкістю. При трансляції in vitro знайшли групи білків з різною індукцією синтезу de novo-від 6 до 12 годин, а також білки, зміст яких при холодовому загартовуванні знижується.
У наступні роки вивчення змін у синтезі РНК при низькотемпературному стресі привернуло особливу увагу дослідника. До теперішнього часу виділено і охарактеризовано значне число мРНК, експресується при низькотемпературному стресі і в процесі адаптації рослини до низьких температур. Зокрема, встановлено, що, наприклад, в люцерні під час холодової акліматизації накопичуються два мРНК, MsaCiA і MsaCiB, які кодують білки, що містять багаті гліцином мотиви. Злиті поліпептиди, що містять амінокислотні послідовності, виведені на підставі цих мРНК, продукувалися в E. coli і були використані для отримання антитіл. Отримані антитіла мали крос-реактивно специфічністю з розчинними поліпептидами MsaCiA і MsaCiB, відповідно. Ці поліпептиди виявлялися тільки в верхівках загартованих рослин, хоча під час холодової акліматизації мРНК для
MsaCiA накопичувалася як у верхівках, так і в стеблах. Аналіз білків за допомогою вестерн-блотів показав, що MsaCiA-подібні білки з молекулярними масами 32, 41 і 68 кДа накопичувалися в клітинних стінках стеблі, і один, з молекулярно масою 59 кДа, - в клітинних стінках пагонів. Показано, що ця диференційна експресія включає як транскрипційних, так і посттрансляційної регуляцію. Порівняння, проведене між шістьма сортами люцерни з контрастно морозостійкістю, підтверджує те, що здатність накопичувати до значного рівня білки, подібні MsaCiA і MsaCiB, може бути пов'язана зі стійкістю рослини до низьких температур.
У ході досліджень експресії генів при низьких температурах було виявлено кілька груп генів, експресія яких індукується холодовим шоком і адаптацією рослини до низьких температур. Далі будуть розглянуті основні сімейства таких генів.
3. Сімейство генів Wcs 120
Озимі, в порівнянні з яровими злаками, володіють ефективними механізмами акліматизації, які дозволяють їм перезимовувати і виживати при температурі замерзання грунту. Це відмінність генетично запрограмовано і включає в себе складну генетичну систему. Щоб зрозуміти характер даної системи та її регуляцію низькими температурами, були ідентифіковані і охарактеризовано гени пшениці, стійкої до замерзання грунту. У ході цих досліджень встановлено, що сімейство гена wcs120 кодує групу білків з молекулярними масами від 12 до 200 кД. Як показано за допомогою біохімічних, імуногістохімічних і молекулярно-генетичних аналізів, дане сімейство генів, специфічне у Poaceae, дуже численна й координованої регулюється низькими температурами. Більше того, накопичення білків WCS прямо корелює з рівнем стійкості рослин до замерзання грунту. Ці аналізи виявили також регуляторного контролю процесу яровизації при експресії генів низької температури в озимих злаків.
Індуковані низько температурою у пшениці гени сімейства wcs120 були картування з використанням вестерн-і Саузерн-блотів на дітелоцентріческіх серіях сорти Chines Spring. Ідентифіковані гени були локалізовані в довгих ділянках гомологічних груп 6-х хромосом всіх трьох геномів гексаплоїдної пшениці. Близькі види, які також мають A, АВ або D геноми також досліджувалися з використанням вестерн-і Саузерн-блотів з wcs120-зондами і WCS120-антитілами. Всі близькоспоріднені види несли один або більше геномів гексаплоїдної пшениці і продукували 50 кДа білок, реагірующі з антитілами і обумовлений за допомогою вестерн-блотів, і wcs120-гомологи, які визначалися за допомогою Саузерн-блотів у всіх видах. Відсутність ділянки 6DL хромосоми в гексаплоїдної пшениці сорту Chines Spring викликало відсутність синтезу 50 кДа білка, що не тільки вказувало на локалізацію wcs120 в даній ділянці 6DL-хромосоми, але також і підтвердило мовчання wcs120-гомологів в 6А хромосомі. Були також досліджені вміст білків, що реагують з антитілами на WCS120, та рівні холодостійкості в серіях лини з заміною хромосом сорти Chines Spring на хромосоми сорти Cheyenne. У ході експериментів було встановлено, що 5А хромосома сорти Cheyenne збільшувала холодостійкість пшениці сорту Chines Spring. Денситометрія вестерн-блот для визначення вмісту білка показала, що хромосома 5А має регуляторний ефект на експресію гена сімейства wcs120, розташованого на хромосомах 6-про групи всіх трьох геномів гексаплоїдної пшениці.
4 Специфічні для низької температури і генних багатих гліцином білків
Специфічна для низько температури кДНК пшениці pTACR7, представляє ген, визначений як tacr7 з озимої пшениці. Термін низькотемпературної-специфічний використовується авторами, оскільки експресія гена tacr7 не викликається обробкою екзогенно абсцизової кислотою або іншими типами стресу, такими, як сольовий стрес, зневоднення і тепловий стрес. PTACR7 був виділений за допомогою олігонуклеотидно зонда, схожого з pHVCR8 з ячменю за допомогою RT-PCR з мРНК з тканини пагонів пшениці. На підставі передвіщеної амінокислотної послідовності були визначені характеристики цього білка. Встановлено, що TACR7 дуже гідрофобний білок, з єдино трансмембранно областю і багатий лейцином. Вивчення рівні змісту копальні tacr7 показало їх накопичення в проростках пшениці, верхівкової тканини і калюсних культур після перенесення об'єктів з контрольних умов на холод. У ході експериментів спостерігалася відсутність виявляються Нозерн-гібридизації транскриптів pTACR7 в проростках або калюсах, оброблених екзогенно абсцизової кислото, після сольового стресу, обезводнення або теплового стресу. Транскрипти tacr7 накопичувалися в тканини меристеми під час експонування при 2 0 C в більшій мірі в холодостійка озимій пшениці 16029), ніж холодочувствітельной 16169) з найбільшою відмінністю між генотипами на третьому тижні загартовування. Таким чином, кодованих tacr7 білок за своїми характеристиками унікальний серед описаних в літературі індукованих низько температурою білків пшениці.
При вивченні мутації серцевини пентамера CCGAC двох передбачуваних індукованих низько температурою елементів в 5'-області индуцируемого холодом гена BN115 озимого ріпаку за допомогою аналізу нерезидентної експресії равнодействующих мутованих злиттів BN115-промотор-GUS було встановлено зменшення низькотемпературного регулювання промотора. Це вказує на те, що послідовність CCGAC в гені BN115 є надзвичайно важливо для його відповіді на низьку температуру. Навпаки, мутація двох G-боксів CACGTG, що знаходяться між індукованим низько температурою елементами в той же області промотора, не змінила індуковану холодом експресію гена. Заміна можливо області енхансера промотора BN115 на енхансери з промотора CaMV 35S виразилася в збільшенні рівня низькотемпературної індукції експресії GUS.
При вивченні кДНК ячменю були отримані ген-специфічні зонди, що кодують два типи гліцин-багатих білків: HvGRP2, що характеризується цитокератин-подібно і цистеїн-багато областями, і HVGRP3, чия основна особливість - наявність РНК-зв'язує області. У ході дослідження було встановлено, що експресія генів HvGRP2 і HVGRP3, які присутні в одне або двох копіях на кожен гаплоїдний геном, була повсюдно, і було показано, що ген HVGRP3 модулюється зміні умов освітлення. Холодовий пов ствие також збільшувало рівні вмісту мРНК HvGRP2 і HVGRP3.
При вивченні дії навколишнього середовища на експресію індукованих холодом генів на рівні зміни вмісту мРНК і тестуванні взаємозв'язку експресії генів і холодно акліматизації рослин ячменю у фазі третього і четвертого листа було проведено кілька варіантів досліду. У першому варіанті рослини були вирощені в різних температурних умовах між 20/15 0 C і +4 / -4 0 С, у другому варіанті рослини були перенесені з температури 20/15 0 C на температуру 6 / 2 0 C і в третьому варіанті досвіду рослини були вирощені в умовах посухи або нестачі поживних речовин. У ході експериментів вимірювалися за допомогою методу відростання морозостійкість рослин і рівні вмісту мРНК для трьох індукованих холодом генів: blt4.9, blt14 і blt101 з меристематичних тканин пагонів. Результати експериментів показують, що загартовані рослини та рівні експресії мРНК генів blt4.9, blt14 і blt101 підвищувалися при більш низьких температурах росту. У ході експериментів було також встановлено, що на ступінь зміни змісту мРНК цих генів у відповідь на зміну температури середовища значний вплив надавали попередні температурні умови і вік рослини. При цьому рівень загартованості рослин сильно корелював з рівнями вмісту мРНК цих генів у рослинах, вирощених у різних температурних умовах. Ця кореляція не поширювалася на рослини, піддані дії нестачі поживних речовин або посухи.
При вивченні впливу низько температури на експресію генів у Poncirus trifoliata із загартованих до холоду рослин були клоновані шість кДНК, що представляють унікальні індуковані холодом послідовності. У ході експериментів було виявлено, що гени pbcorc115 і pbcorc119 належать до одного сімейства генів. Дані сиквенсу вказують на те, що pbcorc115 і pbcorc119 містять відкриту рамку зчитування, що кодує поліпептид з молекулярно масою 19.8 кДа і поліпептид з меншою молекулярною масою 11.4 кДа, відповідно. Аналіз передвіщеної амінокислотної послідовності виявив три великих повтору в COR19 і тільки один повтор у COR11. У кожному повторі були виявлені два елементи-Q-кластерізованний тракт і K-багатий мотив. K-багатий мотив був схожий з подібними мотивами у білків класу D-II з бавовни і групи 2 білків LEA. Серинові кластер, характерний для багатьох схожих з групою 2 LEA білків, також був знайдений у цих білках. У той же час було виявлено, що в них він перебував у незвичайному становищі щодо карбокси-кінця. У COR19 і COR11 також був присутній двосторонні мотив основних залишків, схожих з відомими ядерними маркерними послідовностями, що дозволяє припустити, що члени даного семі ства білків можуть мати ядерну маркерну функцію. У ході експериментів авторами було досліджено експресія мРНК COR19 у відповідь на холодову акліматизацію, посуху, затоплення і засолення. Результати показали, що експресія COR19 в тканині листа індукувати у відповідь на холодову акліматизацію, але придушувалася під час посухи та затоплення.
W. Goodwin з співавторами при вивченні озимого ріпаку ізолювали кДНК і виділили ген, що кодує гібридний багаті пролином білок. Предполагаеми білок за структурою є модульним. При аналізі його амінокислотної послідовності встановлено, що N-термінальна область даного білка має властивості сигнального пептиду, який може направляти білок в ендоплазматичний ретикулум. Послідовність амінокислот від 27 до 287 має три області, які містять високі рівні вмісту проліну та кількох інших амінокислот, часто зустрічаються в багатих пролином білках клітинної стінки. Ці області характеризуються повторюваним амінокислотним мотивом. З-термінальна область містить три передбачуваних мембранно-зв'язуючих ділянки і має високу ступінь подібності з амінокислотами деяких різновидів гібридних багатих пролином білків. На основі цих даних автори роблять висновок, що даний білок секретується з клітки, розміщується в клітинній стінці і заякориваются в плазматичній мембрані за допомогою С-термінально області. У ході експериментів встановлено, що транскрипти, що кодують даний білок, індукуються в тканині листа протягом 8 год обробки холодом і їх зміст швидко знижується при поверненні рослини до нормальних температур. У той же час встановлено, що транскрипти НЕ індукуються тепловим шоком, зневодненням, екзогенно абсцизової кислотою або раневого стресом, тоді як транскрипти контрольного гена B. napus індукуються зневодненням та екзогенно абсцизової кислотою.
5. Гени дегідрінов і гени індуковані екзогенної абсцизової кислотою
Одними з найбільш вивчених родин генів, індукованих низько температурою, є гени дегідрінов і гени, індуковані екзогенно абсцизової кислотою. Гени даних сімейств до теперішнього часу виявлено практично в усіх вивчених видах рослин - як трав'янистих, так і деревних.
При селективному дослідженні з використанням первинних антитіл проти багато лізином області дегідрінов бібліотеки кДНК, створеної з загартованих тканин кори персика, було виявлено, що деякі клони мають високо ступенем подібності з дегідрінамі. Нозерн-блот з використанням клону 5А показав, що 1,8 kb ділянку експресуватися сезонно і в листопадних, і в вічнозелених генотипах, а також індукувати водним дефіцитом. Вічнозелені і листопадні генотипи значно різнилися як за їх здатності до холодової акліматизації, так і за сезонно експресії транскриптів та білків дегідрінов. В обох генотипів максимум експресії транскриптів був відзначений зимо і вони не виявлялися в травні - липні. Експресія білків була схожа з експресією транскриптів, в той же час експресія білка в вічнозеленому генотипі значно збільшувалася після накопичення транскриптів. Отримані дані вказують на те, що під час холодової акліматизації можуть існувати різні рівні регуляції дегідрінов. У ході досліджень авторами також був ізольований клон G10a, що містить повні ген дегідріна, позначений ppdhn1. Цей ген кодував білок з 472 амінокислот з передбаченим розміром 50020 Так. Кодований білок містить дев'ять багатих на лізин повторів, характерних для дегідрінов і два DEYGNP мотиву. Генний блот з використанням зонда до клону 5а показав, що в персику є один або два високогомологічних гена.
При вивченні білків, експресують у відповідь на низькі температури у Brassica napus, був очищений до майже гомогенного стану рекомбінантів з білка BN28 і була визначена його структура. Антітетела, отримані проти rBN28, були використані для характеристики рекомбінантного і нативного білків. Схожі на багато інших індуковані низько температурою білки, BN28 надзвичайно гідрофіліі і термостабілен настільки, що залишається в розчині після кип'ятіння. Імуноблот-аналіз клітинних фракцій показав, що BN28 не був асоційований з клітинними мембранами і знаходився виключно в розчинній фракції клітини. Хоча раніше передбачалося, що BN28-подібні білки з Arabidopsis thaliana повинні володіти антифризного активністю, така антифризного активність не була визначена при рекрісталізаціі льоду з rBN28.
З бібліотеки кДНК, виготовленої з акліматизованих до холоду етіолірованних проростків ріпаку був ізольований клон, відповідний регульованим холодом гену. Аналіз послідовності і пошуки гомологи показали, що цей ген кодує білок, гомологічний з ATP-залежної фосфоенолпіруват карбоксікіназой з Saccharomyces cerevisiae,
Trypanosoma, Rhizobium sp., І Escherichia coli. Аналог з B. napus був позначений як BnPEPCK. Потенційний ATP-зв'язуючий сайт, існуючими у всіх білках PEPCK, також виявлявся і в BnPEPCK. Хоча в ході досліджень і була встановлена конститутивні експресія BnPEPCK в контрольних проростках при кімнатній температурі, було також встановлено, що рівень вмісту копальні його мРНК статистично достовірно підвищувався при 4 0 C і зменшувався до контрольного рівня, коли проростки поверталися на контрольну температуру. Використання антитіл, отриманих проти рекомбінантного гістидин-BnPEPCK злитого білка, продемонструвало, що рівень вмісту білка BnPEPCK корелює з накопиченням транскриптів Bnpepck.
Для експериментів, що мають на меті зрозуміти механізми розвитку морозостійкості, індукованої екзогенно абсцизової кислотою, були використані культивовані клітини ембріонів озимої пшениці. Культивовані клітини оброблялися 50 M абсцизової кислоти протягом 5 дні при 23 0 С для досягнення максимального рівня морозостійкості. Зросла морозостійкість оброблених екзогенно абсцизової кислотою клітин була тісно асоційована із значним накопиченням у плазматичної мембрани поліпептиду з молекулярно масою 19 кДа. 19-кДа поліпептидних компонент був виділений шляхом препаративного гель-електрофорезу і далі розділений на мажорну і мінорну полипептидную компоненту за допомогою Тріцін-SDS-PAGE. Була визначена N-кінцева амінокислотна послідовність AWPM-19 і за допомогою PCR з бібліотеки, виділеної з оброблених екзогенно абсцизової кислотою культивованих клітин, був виділений клон кДНК, що кодує 18.9 кДа гідрофобний поліпептид AWPM-19, з чотирма мембранно-зв'язуваними доменами і лужної точки pI . Експресія мРНК wpm-1 сильно індукується обробкою протягом кількох годин 50 мМ абсцизової кислоти. Ці результати показують, що AWPM-19 повинен бути тісно пов'язаний з індукованим екзогенно абсцизової кислотою збільшенням морозостійкості у культивованих клітин пшениці.
6. Гени білків, пов'язаних з процесом льодоутворення
Встановлено, що бактеріальний ген, пов'язані з утворенням льоду, inaZ при переміщенні в трансгенні рослини викликає утворення ядер льоду. Попередня інкубація перетвореної тканини рослини при температурах близько 0 0 C істотно підвищила активність нуклеації льоду в рослинах, хоча максимальна активність нуклеації льоду була досягнута тільки після низькотемпературної обробки тривалістю близько 48 годин. Хоча трансгенні рослини містять подібні кількості мРНК inaZ як при «нормальних», так і при низьких температурах, встановлено, що низькі температури необхідні для накопичення білка INAZ. Пропонується, що стійкість INAZ білка і, таким чином, активність нуклеації льоду в трансгенних рослинах посилюється при низькотемпературній обробці.
7. Гени, що кодують білки, пов'язані з передачею кальцієвих сигналів
Питання про механізм сприйняття і трансформації сигналу в клітинах рослин до цього часу все ще вивчений недостатньо. Встановлено, що роль вторинного посередника у передачі стресових сигналів в різних організмів, у тому числі і у рослин, відіграють іони Ca 2 +. У клітинах рослин, не підданих дії стресу, рівень вмісту Ca 2 + за допомогою активних Ca 2 +-транспортуючих систем підтримується на низькому, наномолярного рівні. Холодовий шок викликає різке збільшення концентрації Ca 2 + в цитоплазмі. На тваринних клітинах під час стресу були показані активації іонами Ca 2 + протеїнкінази С і Ca 2 +-кальмодулінзавісімо протеїнкінази, що викликають зміни експресії генів. Для з'ясування ролі Ca 2 ^ процесах відповіді рослини на низькотемпературного стресу і адаптації до низько температурі були проведені експерименти з вивчення впливу хелатора Ca 2 + - ЕГТА та блокаторів кальцієвих каналів - La 3 + і верапамілу - на процеси адаптації рослин люцерни до холоду. Результати експериментів показують, що ЕГТА інгібує низькотемпературну адаптацію на 70%, а La 3 + і верапаміл повністю блокують розвиток процесу низькотемпературної адаптації у люцерни.
Щоб надалі досліджувати шлях передачі сигналу, який стимулює відповідь на холодовий шок у кукурудзи, був виділений кодує низькотемпературної-індуковану кальцій-залежну протеинкиназу клон кДНК. Експерименти з вивчення динаміки відповіді на стрес показали, що низькотемпературна індукція Zmcdpk1 передує аналогічного показника для mlip15, іншого холодоіндуціруемого гена, що кодує ДНК-зв'язуючий білок типу ле цин-зіпер, що вказує на те, що Zmcdpk1 може розміщуватися раніше mlip15 в дорозі передачі викликаного холодним стресом сигналу. При цьому було відзначено, що рівень mlip15 мРНК в конститутивний стані у великій мірі зріс після обробки циклогексимід. Крім гена mlip15, циклогексимід збільшує рівні транскрипції двох інших індукованих низько температуро генів-Zmcdpk1 і Adh1, що кодує алкогольдегідрогеназу 1. Навпаки, експресія гена хальконсінтетази індукувати тільки низько температуро. Акумуляція транскриптів mlip15 при низьких температурах і у відповідь на циклогексимід значно зменшувалася після попередньо обробки хелатор кальцію, що дозволяє припускати, що кальцій залучений в обох випадках індукції гена mlip15.
Після холодового шоку посилюється експресія TCH-генів з Arabidopsis, які кодують калмодулін-зв'язані білки і ксілоглюкан ендотрансглюканазу. Була досліджена можлива роль коливань у внутрішньоклітинних концентраціях іона кальцію Ca 2 + у завданої холодовим шоком експресії гена TCH. Для цього у трансгенних рослин, що несуть ген апоекворіна, був проведений моніторинг вмісту Ca 2 + з тим, щоб дослідити необхідність индуцируемого холодом збільшення вмісту Ca 2 + для експресії TCH. Індуковане холодовим шоком збільшення вмісту Ca 2 + може бути заблоковано La 3 + і Gd 3 +, передбачуваними інгібіторами Ca 2 +-каналу в плазматичної мембрани, і 1.2-біс етан-н, н-тетраацетіловой кислотою, позаклітинним хелатор Ca 2 +. У ході експериментів було встановлено, що індукована холодовимшоком експресія TCH генів загальмовується високими рівнями вмісту всіх цих агентів, що, як було показано, блокує збільшення вмісту Ca 2 +. Ці дані підтверджують те, що внутрішньоклітинне збільшення вмісту Ca 2 +, наступне за холодовим шоком, вимагає позаклітинного Ca 2 + і може отримати необхідні приплив Ca 2 + опосередковано через Ca 2 + канали плазмалеми. По-друге, результати експериментів свідчать, що індукована холодом експресія хоча б підкласу TCH-генів вимагає збільшення вмісту внутрішньоклітинного Ca 2 +.
8. Гени білків холодового шоку
Встановлено, що у бактерій є чисельне сімейство генів, експресуються тільки у відповідь на різке зниження температури. Гени цього сімейства позначені як гени білків холодового шоку. Показано, що для початку експресії деяких з цих білків холодового шоку бактерій достатньо зниження температури на 10 - 15 0 С.
Відомо, що експресія гена CspA, найважливішого білка холодового шоку Escherichia coli, дуже сильно індукується під час різкого зниження температури. Встановлено, що заміна трьох підстав близько послідовності Shine-Dalgarno розміром в 159-основ у 5'-нетрансльованій області мРНК cspA стабілізує мРНК, приводячи до конститутивним синтезу CspA при 37 0 С. Як виявилася, ця стабілізація, принаймні частково, відбувається через опір деградації РНКаза E. Холодова індукція cspA також досягалася шляхом заміни його промотора промотором Ipp, не індукованим-холодовим шоком. Таким чином, отримані дані вказують на те, що ген CspA ефективно транскрибується навіть при 37 0 C. У той же час трансляція мРНК білка CSPA заблокована внаслідок її гранично нестабільності при 37 0 C. Представлені результати також демонструють, що ген cspA конститутивний транскрибується при всіх температурах, а проте його експресія при 37 0 C запобігли через дестабілізацію його мРНК.
З метою оцінити ефективність промоторів білків холодового шоку для їх низькотемпературної експресії, було сконструйовано транскрипционной злиття генів між промотором гена cspA і геном бета-галактозидази lacZ. Показано, що в такому злитім гені синтез бета-галактозидази ефективно пригнічувався при 37 0 C, але швидко индуцировали при перенесенні в 15 0 C, приводячи до трьох-п'ятиразовому збільшенню в специфічної активності білка щодо контрольно бактеріально культури. Тільки продовження інкубації культури при 20 0 C, але не при 15 0 C, призводило до ослаблення активності через поділу клітини і репресії промотора, хоча вихідні показники накопичення бета-галактозидази при 20 0 C були в два рази вище виміряних при 15 0 C .
З двох штамів Lactobacillus plantarum були клоновані два гени білків холодового шоку, cspL і cspP. Ці гени, які є неалельних, були присутні у всіх досліджених штамах. Дані гени кодують поліпептиди з 66-амінокислотних залишків, родинні один одному і належать до сімейства CSP - «білків холодового шоку». Транскрипція гена cspP закінчується єдиною мРНК, у той час як для гена cspL були знайдені дві cspL мРНК із загальними 5 'кінцями. Зміст цих транскриптів помірно зростала у відповідь на обробку культур холодом.
При вивченні відповіді лактозною-кислих бактерій на заморожування було встановлено, що при заморожуванні культури лактозною-кислих бактерій життєздатність клітин в значно мірою знижувалася. У той же час, коли культури бактерій перед заморожуванням були заздалегідь піддані протягом 2 годин холодового шоку при 10 0 C, значно поліпшувалася життєздатність у штамів Lactococcus lactis subsp.lactis і Pediococcus pentosaceus PO2, але вона не змінювалася у штаму Lactococcus lactis subsp. cremoris і у штамів Lactobacillus helveticus LB1 і Streptococcus thermophilus TS2. Життєздатність клітин зросла ще більше, коли період холодового шоку був продовжений до 5 годин. Використання дегенерованих PCR пра рів, отриманих як з гена найважливішого білка холодового шоку Escherichia coli, так і Bacillus subtilis призводить до утворення PCR продуктів у всіх вивчених штамів. PCR продукт з Lactococcus lactis ssp. Lactis M474 був клонований і секвенований. Обчислена для цього білка послідовність амінокислот показала високу гомологію з амінокислотними послідовностями інших білків семі ства CSP. Використання PCR праймерів, заснованих на послідовність M474, призводило до утворення PCR продуктів тільки у вивчених штамів лактококков, але не у вивчених штамів Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus або Pediococcus pentosaceus.
9. Гени протеїнкіназ
Клон кДНК для гена рецептора-подібно протеїнкінази був виділений з Arabidopsis thaliana. Цей клон довжиною 1952 bp з відкритою рамкою зчитування розміром 1623 bp кодує пептид із 540 амінокислот, які містить чотири області, характерних для рецепторній кінази. По-перше, вона містить характерну для кіназ передбачувану амінотермінальную сигнальну область послідовності. По-друге, він містить область з п'ятьма екстрацелюлярного багатими ле ціном повторюваними послідовностями. По-третє, він має мембрано-зв'язує область і, по-четверте, домен цитоплазматичної протеїнкінази, який містить всі 11 субдоменів, характерних для протеїнкіназ. Ген RPK1 експресується у кольорах, пагонах, листках і коренях. Показано, що експресія гена RPK1 індукується протягом 1 години після обробки екзогенно абсцизової кислотою. Ген також швидко індукується різними іншими абіотичними стресами, такими, як зневоднення, висока концентрація солей і низька температура. Пропонується, що даний ген залучений до загального відповідь клітини на стрес. Викликана зневодненням індукція гена rpk1 не порушується в дефіцитних по ендогенно абсцизової кислоти мутантів aba-1, abi1-1, abi2-1, abi3-1 і, внаслідок цього, передбачається, що ця індукція не залежить від обробки абсцизової кислотою.
10. Гени картоплі, індуковані зберіганням на холоду
Зберігання бульбі картоплі на холоду при 4 0 C пов'язано з
накопиченням декількох індукованих холодом транскриптів генів. Шляхом використання в якості зонда раніше охарактеризованою кДНК було виділено і секвенований відповідний ген ci7.
Предполагаеми промотор ci7 містить послідовність елементів, яка, як було показано, регулює експресію індукованих холодом генів у Arabidopsis thaliana. Транскрипти CI7 диференціальної експресуються в бульбах і листі картоплі у відповідь на холодовий стрес, посуху, високу концентрацію солей або обробку екзогенно абсцизової кислотою. У той час як накопичення транскриптів CI7 під час зберігання на холоду відбувається протягом декількох дні, індукція транскриптів CI7 у відповідь на посуху, екзогенну абсцизової кислоти і сольовий стрес відбувається швидко, протягом декількох годин. Накопичення білка CI7 у відповідь на абіотичні стреси і обробку екзогенно абсцизової кислотою в бульбах було невеликим, особливо в порівнянні з рівнем вмісту транскриптів. У листі білок CI7 був відсутній після всіх досліджених впливів. У ході експериментів рослини S. tuberosum були трансформовані злитим з репортерний GUS-геном 5'-фланкирующие промоторні регіоном ci7 розміром 3 kb. Аналіз бульбі незалежних трансгенних лини не виявив значно індукції ензиматичною активності GUS у відповідь на низькотемпературне вплив. У той же час, коли для аналізу рівня індукції гена GUS з введеним ci7 промотором був використаний РНК-блот, гетерологічние злиття GUS сильно індукованої в відповідь на низькі температури. У порівнянні з РНК блот-аналізом трансгенних рослин, вивчення ядерної «run-on» транскрипції ci7 гена показало, що велика частина температурно-регульовано експресії гена ci7 в бульбах може бути пов'язана з посттрансляційними механізмами контролю.
Аналіз послідовності кДНК клону CI21, який відповідає іншому індукують холодом транскрипт, виявляє високу гомологію з транскрипту томата та дикої картоплі, індуковані дозріванням і водним стресом. Два гомологічних, неалельних гена, ci21A і ci21B, були виділені і секвенований. Нозерн-блот аналіз показав, що найвищі рівні вмісту транскриптів ci21 виявлені в збережених в холоді бульбах. Більш низькі рівні транскриптів містяться у стеблах та коренях, і найнижчі рівні відзначені в листі і бульбах, збережених при кімнатній температурі. Обробка рослин абсцизової кислотою, висока концентрація солі і тепловий шок не чинили значного впливу на рівні вмісту транскрипту ci21 в бульбах і листі. Підсушування було єдиним стресом, що викликало транскрипцію CI21 на листках, але воно не викликало її в бульбах. Вестерн-блот аналіз виявив білок CI21 тільки в бульбах. Химерний ген, створений шляхом злиття предполагаемо області промотора ci21A і репортер-геном uidA, тестувався на індукцію бета-глюкуронідази низько температуро у трансгенних картопляних рослинах, при цьому у відповідь на зберігання бульбі при 4 0 C у трансгенних рослин спостерігалося двократне збільшення активності бета-глюкуронідази .
11. Гени Y-box білків і білків, що регулюють процеси транскрипції і трансляції
У ході досліджень експресії генів сімейства Y-бокс білків, що регулюють процеси транскрипції в клітинах, було встановлено, що висококонсервативний елемент основи промотора grp78 грає важливу роль в індукції grp78 під різноманітними стресовими сигналами. Попереднє вивчення встановило функціональну область у 3 'кінці основи промотора, яка проявляє стрес-індуковані зміни в стресованих ядрах. У ході експериментів показано, що людськи чинник транскрипції YY1 пов'язує SICR і трансактіваторний елемент основи промотора в умовах стресу. Скринінг бібліотек з даним елементом промотора виявив два нових зв'язують цю область промотора білка, YB-1 і DBPA. Обидва білка належать до сімейства Y-бокс білків, для яких характерний еволюційно-стійкі ДНК-прив'язки мотив - домен холодового шоку. У ході досліджень в експериментах по ко-переносу було встановлено, що Y-бокс білки виступають в стресованих клітинах антагоністами WI-опосередкованого керованого grp78 посилення транскрипції. Таким чином, білки, що мають домен холодового шоку, можуть бути частиною механізму передачі сигналу стресу у ссавців.
У той же час проблематично існування особливих факторів транскрипції для специфічних функци в елементах промотора, особливо в таких системах, як G-бокс, оскільки існують численні синергічні специфічні для G-боксу фактори, зокрема, промотора алкогольдегідрогенази у Arabidopsis, який регулює експресію у відповідь на холодовий пов ствие і зневоднення.
12. Гени, пов'язані з низькотемпературної акліматизацією
У ході досліджень з вивчення впливу низькотемпературної акліматизації на експресію генів у рослинах виявлено та охарактеризовано значне число генів, експресія яких індукується під час цього процесу як в трав'янистих, так і в деревних рослинах. Значна кількість цих генів індукується також екзогенно абсцизової кислоти і посухо. У той же час виявлені гени, які специфічні для процесу акліматизації рослини до низьких температур і не індукуються іншими типами абіотичного стресу.
Для встановлення молекулярних основ холодової акліматизації у суниці було проведено виявлення генів, асоційованих з низькотемпературної акліматизації.
Диференціальний скринінг бібліотеки кДНК, виготовлене з акліматизованих до холоду рослин полуниці, дозволив ізолювати різні кДНК, диференційно експресується при низькотемпературної акліматизації. Нозерн-блот аналіз показав, що рівень транскриптів Fcor1 зростав після 2 дні низькотемпературної акліматизації, в той час як аналогічні показник Fcor2 збільшувався тільки після 2 тижнів низькотемпературної акліматизації. З друго боку, рівень вмісту транскриптів Fcor3 знижувався протягом 24 годин впливу низькотемпературної акліматизації і залишався на низькому рівні протягом 8 тижнів періоду акліматизації. Гени Fcor1 і Fcor2 експресуються в усіх тканинах, у той час як ген Fcor3 специфічний для листів. Кодується геном Fcor1 білок має високий вміст ле цина, ізолейцин, гліцину, проліну і серину. Даний білок має гомологію з білками, кодованими геном ячменю blt101, індукованим низькотемпературної акліматизацію, і геном Lophopyrum esi3, індукованим сольовим стресом. Білок FCOR2 багатий на лізин, лейцином, валіном, аланином і аргініном і не має гомології ні з яким із продуктів відомих генів. Часткові клон кДНК Fcor3 кодує поліпептид, що має дуже високу ідентичність з субодиниці V PSI зі шпинату і з поліпептидом PSI Psag з ячменю. Рівень накопичення транскриптів Fcor1 корелює зі стійкістю до заморожування у досліджених сортів суниці.
Клон кДНК pbn59 був ізольований шляхом диференціального скринінгу бібліотеки кДНК акліматизовані до холоду озимого ріпаку. Нуклеотидна послідовність BN59 виявилася гомологічною послідовності, що кодує 70 кДа субодиницю вакуолярної Н +-АТФази в рослинах. Транскрипти, гибрідизуючою з BN59, акумулюються під час впливу низько температури і впливу екзогенно абсцизової кислоти. Вестерн-блот білків також показав збільшення вмісту 70 кДа субодиниці під час акліматизації до холоду. Накопичення ендомембранной Н +-АТФази випливає також з спостережень за осмотичним регулюванням, збільшенням вмісту ендогенно абсцизової кислоти і проліферації ендомембран впродовж холодної акліматизації.
Дванадцять клонів індукованих холодом кДНК були ізольовані шляхом диференціального скринінгу бібліотеки кДНК, підготовленої з мРНК холодостійка картоплі. За допомогою Нозерн-блот гібридизації було проаналізовано накопичення мРНК, відповідної кожному клону. Ізольовані в даному дослідженні клони кДНК позначені як Ssci. Всі клони чітко індукованої в відповідь на холод-накопичення відповідних транскриптів було відмічено вже після одного дня загартовування до холоду. Максимальна акумуляція мРНК, відповідних клонам Ssci1, Ssci2, Ssci6 і Ssci8, була відзначена в перший день холодового загартовування, тоді як для клонів Ssci3, Ssci4, Ssci5, Ssci7, Ssci9, Ssci10, Ssci11 і Ssci12 - після 8 дні загартовування. Часткова послідовність ДНК була визначена для 5 'і 3' решт клонів і був проведений пошук гомології з послідовностями в базах даних. Результати пошуку показали, що виділені клони кДНК відповідають відомим генам і кодують мРНК для наступних білків: мРНК для двох різних S-аденозом-L-метіонін декарбоксилаз, два хлоропластних шапероніна, білок циклу поділу клітини CDC48, малатдегідрогенази, міо-інозитол-1-фосфат синтетазу, протопорфирином IX: Mg хелатазу, фактор елонгації EF-1a, хлоропластних фактор елонгації трансляції EF-G, рибосомальної білок L-3 і мРНК для білка томата TAS14, індукованого екзогенно абсцизової кислото. Виявлені гени можуть брати участь у двох різних механізмах, що відносяться до холодостійкості. Одна група може оберігати хлоропласти і клітинні структури під час стресу, в той час як інша може бути залучена в механізми пристосування рослинної клітини до холоду
Були вивчені деякі з відповідей мутантів Arabidopsis thaliana L., не розвивають максимальної холодостійкості після холодової акліматизації, на холодовий вплив. У ході експериментів були вивчені холодова індукція трьох білків, рівні вмісту сахарози і глюкози, жирнокислотний склад ліпідів, а також накопичення антоцианінів в листі. Чотири мутації знижували або усували накопичення антоцианіни під час холодно акліматизації. Одна мутація запобігала індуковані холодом в нормі підвищення рівня вмісту сахарози і глюкози. Мутації sfr4 і sfr7 впливали на жирнокислотний склад ліпідів після холодової акліматизації. З іншого боку, оскільки всі досліджені параметри у мутацій sfr1, sfr2 і sfr5 не відрізнялися від таких у дикого типу, то передбачається, що вони мають іншу, цілком можливо, високоспецифічні дію у відповідь на низькотемпературне вплив.
Регульований холодом оперон rbpA1-rpsU кодує РНК-зв'язуючий білок і рибосомних білок M3 у Anabaena variabilis. Рівень експресії цієї групи генів приблизно в десять разів вище при температурах нижче 30 0 C, ніж при 38 0 C. З метою вивчення функцій білка RbpA1 in vivo був створений порушений вставкою ген rbpA1. Ці мутанти були повністю позбавлені білка RbpA1, але містили нормальні рівень продукту гена rpsU - рибосомальному білка S21. При 38 0 C мутанти були морфологічно нормальними, але при 22 0 C вони з невеликою частотою виробляли незвичайні клітини. Мабуть, ці клітини були на початковому етапі освіти прогетероціст. У присутності нітрату при 22 0 C у мутантів на молекулярному рівні також відбувалися різноманітні події, які обумовлюють ініціацією перетворення в Гетероцисти, а саме, висічення 11-kbp елемента ДНК у nifD і накопиченні копальні xisA і hetR, але в той же час ці події не відбувалися у присутності амонію або при 38 0 C. Отримані результати дозволяють вважати, що RbpA1 необхідний для повно репресії ініціації освіти гетероцистах при низьких температурах у присутності нітрату.
У ході вивчення низькотемпературного відповіді геному Arabidopsis thaliana були охарактеризовані дві пов'язані кДНК, відповідні генам, експресія яких тимчасово індукується низькими температурами. RCI2A і RCI2B кодують невеликі сильно гідрофобні білки, які несуть два потенційних трансмембранних домену. Аналіз їх амінокислотної послідовності показав спорідненість з регульованими різними стресовими умовами білками, кодованими генами з ячменю і Lophophyrom elongatum. Їх високі рівень гомології послідовностей та їх геномна локалізація в окремому рестрикційних фрагментів підтверджують те, що обидва гени з'явилися в результаті тандемною дуплікації. У той же час їх регулюють послідовності досить розрізняються для того, щоб вважати їх різними генами. Подібно до більшості охарактеризованих індукованих холодом генів рослин, експресія RCI2A і RCI2B також посилюється екзогенно абсцизової кислотою і дегідратацією, але не загально реакцією рослини на стресові умови, оскільки вона не індукується сольовим стресом або анаеробіозом. Більше того, низька температура здатна викликати експресію RCI2A і RCI2B в ABA-дефіцитною і нечутливою генетичної середовищі, що свідчить про те, що низькотемпературних відповідь цих двох генів регулює і залежні від абсцизової кислоти, і незалежні від неї шляху.
Для вивчення генетичного регулювання морозостійкості ріпаку у популяції F2 Brassica rapa і подвійний гаплоидном популяції Brassica napus in vitro визначалася відносна морозостійкість акліматизованих і неаккліматізірованних рослин. Для ідентифікації передбачуваних локусів кількісних ознак використовувалися розроблені раніше карту зв'язків. У популяції B. napus області геному зі значним впливом на морозостійкість не були виявлені, але у B. rapa чотири області асоціювалися зі пов'язано з акліматизацією морозостійкістю і здатністю до акліматизації, але дві інші області зв'язувалися з морозостійкістю, не пов'язане з акліматизацією. Здатність до акліматизації регулювалася генами з дуже невеликими як позитивними, так і негативними ефектами домінування. Аллель озимих батьку мала позитивні додаткові ефекти, але негативні домінантні ефекти в локусах кількісних ознак FTN. RFLP локуси виявлялися за допомогою индуцируемой холодом і зв'язано зі стресом кДНК з Arabidopsis thaliana, картіровано близько двох локусів кількісних ознак для FTA / FTB.
Недавні дослідження визначили в рослинах cis-діючий ДНК-регулюючий елемент, «C-повтор/отвечающій на зневоднення елемент», який стимулює транскрипцію у відповідь на де ствие низько температури та водного дефіциту. З Arabidopsis thaliana була виділена кДНК, що кодує «C-repeat/DRE» зв'язує фактор, CBF1. Аналіз виведеної амінокислотної послідовності CBF1 показує, що білок має молекулярну масу 24 кДа, потенційну ядерну локалізацію послідовності і можливу активність в кисло області. CBF1 також має область AP2, яка є ДНК-прив'язки мотивом з 60 амінокислот, які є в білках Arabidopsis APETALA2, AINTEGUMENTA, і TINY і в інших рослинних білках з невідомими функціями. Рівні вмісту транскриптів CBF1, які конститутивний є поодинокими або низькими, незначно змінювалися в рослинах, підданих низькотемпературної обробки, або в окремих листах, підданих дефіциту води. Зв'язування CBF1 до «C-repeat/DRE» продемонстровано за допомогою аналізу із зсувом гелю при використанні рекомбінантного білка CBF1, експресувати в Escherichia coli. Крім того, виявлено, що експресія CBF1 в дріжджах активізує транскрипцію репортер-генів, які містять «C-repeat/DRE» як активізатор, розташований вище послідовності, але не активізує транскрипцію мутантно версії елемента ДНК. Вважається, що CBF1 може функціонувати як активізатор транскрипції, який пов'язують із «C-repeat/DRE» відповідальним елементом ДНК і, ймовірно, грає роль в індукованій холодом і зневодненням експресії гена у Arabidopsis.
З оброблених холодом проростків холодостійка сорти сої за допомогою диференціального секвенування були виділені дві регульовані холодом кДНК - src1 і src2. Рівень вмісту транскриптів src1 збільшується після впливу низькою або високою температурою, посухою, пораненням і інфекції вірусом мозаїки соєвого боба. Транслюватиметься з кДНК src1 поліпептид має 102 амінокислоти, гідрофіліі і має дев'ять амінокислотних повторів, багатих глютамінової кислотою, гистидином, лізином і гліцином. SRC1 має гомологію з білком водного стресу рису і регульованим холодом білком люцерни. Рівень вмісту транскриптів src2 збільшувався тільки після зниження температури до 5 0 C, що вказує на те, що цей ген індукується тільки охолодженням. Транслювання з кДНК src2 поліпептид складається з 290 амінокислот і містить сім повторів послідовностей амінокислот, багатих пролином, гліцином, тирозином амінокіслот і гідрофобну область у карбокси-кінця, яка може зв'язуватися з мембраною. Рівень транскриптів src2 при 5 0 C продовжував збільшуватися аж до 48 годин де ствия низько температури в холодостійка сорті Kitamusume, в той час як він досягав максимуму через 12 годин і потім знижувався в чутливому до холоду сорті Koganejiro.
З Arabidopsis thaliana був ізольований геномний фрагмент EcoRI розміром 7 kb, який містить два тісно пов'язаних dhn / lea / rab-подібних гена - lti29 і cor47 в тандемною оформленні. Для обох транскриптів показана акумуляція у відповідь на низькотемпературного стресу, обробку екзогенно абсцизової кислоти і зневоднення. Порівняння послідовності амінокислот трансльовані поліпептидів показало, що вони на 67% ідентичні. Розраховані молекулярні маси цих поліпептидів були 29 кДа для
LTI29 і 30 кДа для COR47. Обидва поліпептиду містять один консервативні серинові домен і три багатих на лізин повтору, як у DHN / LEA / RAB-подібних білків. Крім того, як LTI29, так і COR47 мають N-термінальний кислий повтор, виявляється тільки в кількох серед DHN / LEA / RAB білків. Близьке відстань між двома генами та їх тандемна організація в геномі A. thaliana, а також загальна гомологія послідовності області кодування на нуклеотидном рівні дозволяють припустити, що два гени розвинулися шляхом дублювання. Це, мабуть, являє собою спільну рису серед залежних від низькотемпературного стресу генів A. thaliana.
Paldi з співавторами був вивчений ефект низько температури на процесинг рРНК у пшениці. Дві лінії пшениці, використані в цей роботі, відрізнялися один від одного тільки морозостійкістю. У ході експериментів було показано, що у разі слабоморозоустойчіво лінії кількісні і якісні зміни в процесі дозрівання рРНК відбулися як результат де ствия низько температури. Протягом холодової обробки останні попередники двох стабільних цитоплазматичних рРНК накопичувалися в якості стабільних фракцій рРНК. Це нагромадження збільшувалася в міру збільшення тривалості холодової обробки. У той же час це зміна не було виявлено у лінії з хороше морозостійкістю. Результати свідчать, що в слабоморозоустойчівих лініях холодова обробка мала інгібірующі ефект на останню стадію процесу дозрівання рРНК, тобто при низько температурі цей процес не може завершитися.
Відомо, що теплова обробка плодів помідора індукує також і стійкість до пошкодження від охолодження. Раніше було показано, що специфічні білки теплового шоку експресуються в нагрітих плодах помідора після зберігання на холоді. Для пошуку індукованих теплом генів, експресується при низьких температурах, була виготовлена, а потім піддана диференціальному скринінгу бібліотека кДНК з попередньо прогрітих, а потім охолоджених плодів помідора. У ході цих експериментів було виділено нові клон кДНК, hcit2, що кодує білок з молекулярно масою 16.5 кДа. Кодований їм білок містить три передбачуваних трансмембранних гідрофобних послідовності, що дозволяє припускати, що цей білок локалізований в мембранах. Експресія hcit2 в плодах індукувати високо температурою, але не іншими видами стресу, такими, як, наприклад, низька температура, посуха чи анаеробні умови, і не спостерігалася під час дозрівання плоду. Високий рівень транскриптів hcit2 був виявлений в нагрітих плодах після 2-х тижнів зберігання при 2 0 C. Високі температури також индуцировали експресію hcit2 в листі, квітах і стеблах помідора. Автори припускають, що білок HCIT2 може бути залучений в процес придбання рослиною стійкості до пошкодження охолодженням.
У ряду лини дикої картоплі були проаналізовані динаміка холодового загартовування і зміни до трансльованих мРНК під час холодової акліматизації. Перед низькотемпературної обробки всі лінії були повністю загартовані протягом восьми дні при 4 0 C. Найбільш холодостійка лінія 1 посилила холодостійкість від -3,2 0 C до - 8,9 0 C, а найменш холодостійка лінія 10 збільшила свою холодостійкість від -2,5 0 C до -6,5 0 C. У ході досліджень були ізольовані полі-РНК з загартованих і незагартованих рослин лини 1 і 10 та продукти їх трансляції in vitro були розділені двовимірним-PAGE-електрофорезом. Аналіз профілів продуктів трансляції in vitro загартованих рослин лінії 1 виявив зміни у змісті приблизно 31 продукту в області молекулярних ваг від 14 до 69 кДа і pI в районі від 6,7 до 5,0. Зміст 26 продуктів під час холодно акліматизації підвищувався, а двох інших білків - зменшувалося. У час, коли рослини піддавалися низькотемпературного стресу, було можливо ідентифікувати знову утворюються продукти трансляції - три з мовляв. масами близько 18 кДа і два з мовляв. масами близько 45 кДа. Більшість продуктів, вміст яких змінювалося протягом холодової акліматизації, було виявлено в групі низькомолекулярних білків з молекулярними масами від 14 до 21 кДа та від 24 до 35 кДа. У менш стійко лінії 10 протягом холодової акліматизації змінювалося зміст тільки 19 продуктів трансляції, і в ній не було зазначено знову утворюються продуктів. Всі зміни в продуктах трансляції в обох лініях з'являлися після двох дні холодової обробки, коли морозостійкість ліній ще підвищувалася.
Таким чином, до теперішнього часу накопичено велику кількість даних про окремі індукованих низькою температурою генах у різних видів рослин. Особливо великий обсяг даних в даний час отримано у зв'язку з проведеним повним сиквенсу геному Arabidopsis thaliana. У той же час необхідно відзначити, що, незважаючи на велику кількість даних про вплив низько температури на експресію генів у рослинах, ці дослідження проводяться уривками і безсистемно. В основному, отримані дані говорять про індукції експресії певних генів низько температурою. У той же час дані про взаємозв'язок експресії різних генів при низькотемпературному стресі вкрай обмежені. Все ж таки з розглянутих вище даних можна зробити висновок, що, хоча в порівнянні з «нормальними» температурними умовами утримання ДНК при гіпотермії змінюється незначно, в той же час гіпотермія викликає значні зміни в експресії генів на рівні транскрипції. При низькотемпературному стресі і в процесі низькотемпературної адаптації у різних досліджених видів індукується експресія ряду генів, деякі з яких є видоспецифічними. У той же час виділено кілька сімейств генів, які індукуються у відповідь на низькотемпературного стресу у багатьох з досліджених видів. Встановлено, що багато хто з експресується при низько температурі генів індукуються також у відповідь на обробку екзогенно абсцизової кислоти і засуху. Індукція деяких генів є загальним неспецифічним відповіддю організму на стрес, так як вони індукуються усіма вивченими видами абіотичного і біотичного стресу. Оскільки встановлено, що низькотемпературний стрес викликає зміни експресії генів на рівні транскрипції, можна пере ти до розгляду результатів, отриманих при вивченні його впливу на рівні трансляції.
11. Гени Y-box білків і білків, що регулюють процеси транскрипції і трансляції
У ході досліджень експресії генів сімейства Y-бокс білків, що регулюють процеси транскрипції в клітинах, було встановлено, що висококонсервативний елемент основи промотора grp78 грає важливу роль в індукції grp78 під різноманітними стресовими сигналами. Попереднє вивчення встановило функціональну область у 3 'кінці основи промотора, яка проявляє стрес-індуковані зміни в стресованих ядрах. У ході експериментів показано, що людськи чинник транскрипції YY1 пов'язує SICR і трансактіваторний елемент основи промотора в умовах стресу. Скринінг бібліотек з даним елементом промотора виявив два нових зв'язують цю область промотора білка, YB-1 і DBPA. Обидва білка належать до сімейства Y-бокс білків, для яких характерний еволюційно-стійкі ДНК-прив'язки мотив - домен холодового шоку. У ході досліджень в експериментах по ко-переносу було встановлено, що Y-бокс білки виступають в стресованих клітинах антагоністами WI-опосередкованого керованого grp78 посилення транскрипції. Таким чином, білки, що мають домен холодового шоку, можуть бути частиною механізму передачі сигналу стресу у ссавців.
У той же час проблематично існування особливих факторів транскрипції для специфічних функци в елементах промотора, особливо в таких системах, як G-бокс, оскільки існують численні синергічні специфічні для G-боксу фактори, зокрема, промотора алкогольдегідрогенази у Arabidopsis, який регулює експресію у відповідь на холодовий пов ствие і зневоднення.
12. Гени, пов'язані з низькотемпературної акліматизацією
У ході досліджень з вивчення впливу низькотемпературної акліматизації на експресію генів у рослинах виявлено та охарактеризовано значне число генів, експресія яких індукується під час цього процесу як в трав'янистих, так і в деревних рослинах. Значна кількість цих генів індукується також екзогенно абсцизової кислоти і посухо. У той же час виявлені гени, які специфічні для процесу акліматизації рослини до низьких температур і не індукуються іншими типами абіотичного стресу.
Для встановлення молекулярних основ холодової акліматизації у суниці було проведено виявлення генів, асоційованих з низькотемпературної акліматизації.
Диференціальний скринінг бібліотеки кДНК, виготовлене з акліматизованих до холоду рослин полуниці, дозволив ізолювати різні кДНК, диференційно експресується при низькотемпературної акліматизації. Нозерн-блот аналіз показав, що рівень транскриптів Fcor1 зростав після 2 дні низькотемпературної акліматизації, в той час як аналогічні показник Fcor2 збільшувався тільки після 2 тижнів низькотемпературної акліматизації. З друго боку, рівень вмісту транскриптів Fcor3 знижувався протягом 24 годин впливу низькотемпературної акліматизації і залишався на низькому рівні протягом 8 тижнів періоду акліматизації. Гени Fcor1 і Fcor2 експресуються в усіх тканинах, у той час як ген Fcor3 специфічний для листів. Кодується геном Fcor1 білок має високий вміст ле цина, ізолейцин, гліцину, проліну і серину. Даний білок має гомологію з білками, кодованими геном ячменю blt101, індукованим низькотемпературної акліматизацію, і геном Lophopyrum esi3, індукованим сольовим стресом. Білок FCOR2 багатий на лізин, лейцином, валіном, аланином і аргініном і не має гомології ні з яким із продуктів відомих генів. Часткові клон кДНК Fcor3 кодує поліпептид, що має дуже високу ідентичність з субодиниці V PSI зі шпинату і з поліпептидом PSI Psag з ячменю. Рівень накопичення транскриптів Fcor1 корелює зі стійкістю до заморожування у досліджених сортів суниці.
Клон кДНК pbn59 був ізольований шляхом диференціального скринінгу бібліотеки кДНК акліматизовані до холоду озимого ріпаку. Нуклеотидна послідовність BN59 виявилася гомологічною послідовності, що кодує 70 кДа субодиницю вакуолярної Н +-АТФази в рослинах. Транскрипти, гибрідизуючою з BN59, акумулюються під час впливу низько температури і впливу екзогенно абсцизової кислоти. Вестерн-блот білків також показав збільшення вмісту 70 кДа субодиниці під час акліматизації до холоду. Накопичення ендомембранной Н +-АТФази випливає також з спостережень за осмотичним регулюванням, збільшенням вмісту ендогенно абсцизової кислоти і проліферації ендомембран впродовж холодної акліматизації.
Дванадцять клонів індукованих холодом кДНК були ізольовані шляхом диференціального скринінгу бібліотеки кДНК, підготовленої з мРНК холодостійка картоплі. За допомогою Нозерн-блот гібридизації було проаналізовано накопичення мРНК, відповідної кожному клону. Ізольовані в даному дослідженні клони кДНК позначені як Ssci. Всі клони чітко індукованої в відповідь на холод-накопичення відповідних транскриптів було відмічено вже після одного дня загартовування до холоду. Максимальна акумуляція мРНК, відповідних клонам Ssci1, Ssci2, Ssci6 і Ssci8, була відзначена в перший день холодового загартовування, тоді як для клонів Ssci3, Ssci4, Ssci5, Ssci7, Ssci9, Ssci10, Ssci11 і Ssci12 - після 8 дні загартовування. Часткова послідовність ДНК була визначена для 5 'і 3' решт клонів і був проведений пошук гомології з послідовностями в базах даних. Результати пошуку показали, що виділені клони кДНК відповідають відомим генам і кодують мРНК для наступних білків: мРНК для двох різних S-аденозом-L-метіонін декарбоксилаз, два хлоропластних шапероніна, білок циклу поділу клітини CDC48, малатдегідрогенази, міо-інозитол-1-фосфат синтетазу, протопорфирином IX: Mg хелатазу, фактор елонгації EF-1a, хлоропластних фактор елонгації трансляції EF-G, рибосомальної білок L-3 і мРНК для білка томата TAS14, індукованого екзогенно абсцизової кислото. Виявлені гени можуть брати участь у двох різних механізмах, що відносяться до холодостійкості. Одна група може оберігати хлоропласти і клітинні структури під час стресу, в той час як інша може бути залучена в механізми пристосування рослинної клітини до холоду
Були вивчені деякі з відповідей мутантів Arabidopsis thaliana L., не розвивають максимальної холодостійкості після холодової акліматизації, на холодовий вплив. У ході експериментів були вивчені холодова індукція трьох білків, рівні вмісту сахарози і глюкози, жирнокислотний склад ліпідів, а також накопичення антоцианінів в листі. Чотири мутації знижували або усували накопичення антоцианіни під час холодно акліматизації. Одна мутація запобігала індуковані холодом в нормі підвищення рівня вмісту сахарози і глюкози. Мутації sfr4 і sfr7 впливали на жирнокислотний склад ліпідів після холодової акліматизації. З іншого боку, оскільки всі досліджені параметри у мутацій sfr1, sfr2 і sfr5 не відрізнялися від таких у дикого типу, то передбачається, що вони мають іншу, цілком можливо, високоспецифічні дію у відповідь на низькотемпературне вплив.
Регульований холодом оперон rbpA1-rpsU кодує РНК-зв'язуючий білок і рибосомних білок M3 у Anabaena variabilis. Рівень експресії цієї групи генів приблизно в десять разів вище при температурах нижче 30 0 C, ніж при 38 0 C. З метою вивчення функцій білка RbpA1 in vivo був створений порушений вставкою ген rbpA1. Ці мутанти були повністю позбавлені білка RbpA1, але містили нормальні рівень продукту гена rpsU - рибосомальному білка S21. При 38 0 C мутанти були морфологічно нормальними, але при 22 0 C вони з невеликою частотою виробляли незвичайні клітини. Мабуть, ці клітини були на початковому етапі освіти прогетероціст. У присутності нітрату при 22 0 C у мутантів на молекулярному рівні також відбувалися різноманітні події, які обумовлюють ініціацією перетворення в Гетероцисти, а саме, висічення 11-kbp елемента ДНК у nifD і накопиченні копальні xisA і hetR, але в той же час ці події не відбувалися у присутності амонію або при 38 0 C. Отримані результати дозволяють вважати, що RbpA1 необхідний для повно репресії ініціації освіти гетероцистах при низьких температурах у присутності нітрату.
У ході вивчення низькотемпературного відповіді геному Arabidopsis thaliana були охарактеризовані дві пов'язані кДНК, відповідні генам, експресія яких тимчасово індукується низькими температурами. RCI2A і RCI2B кодують невеликі сильно гідрофобні білки, які несуть два потенційних трансмембранних домену. Аналіз їх амінокислотної послідовності показав спорідненість з регульованими різними стресовими умовами білками, кодованими генами з ячменю і Lophophyrom elongatum. Їх високі рівень гомології послідовностей та їх геномна локалізація в окремому рестрикційних фрагментів підтверджують те, що обидва гени з'явилися в результаті тандемною дуплікації. У той же час їх регулюють послідовності досить розрізняються для того, щоб вважати їх різними генами. Подібно до більшості охарактеризованих індукованих холодом генів рослин, експресія RCI2A і RCI2B також посилюється екзогенно абсцизової кислотою і дегідратацією, але не загально реакцією рослини на стресові умови, оскільки вона не індукується сольовим стресом або анаеробіозом. Більше того, низька температура здатна викликати експресію RCI2A і RCI2B в ABA-дефіцитною і нечутливою генетичної середовищі, що свідчить про те, що низькотемпературних відповідь цих двох генів регулює і залежні від абсцизової кислоти, і незалежні від неї шляху.
Для вивчення генетичного регулювання морозостійкості ріпаку у популяції F2 Brassica rapa і подвійний гаплоидном популяції Brassica napus in vitro визначалася відносна морозостійкість акліматизованих і неаккліматізірованних рослин. Для ідентифікації передбачуваних локусів кількісних ознак використовувалися розроблені раніше карту зв'язків. У популяції B. napus області геному зі значним впливом на морозостійкість не були виявлені, але у B. rapa чотири області асоціювалися зі пов'язано з акліматизацією морозостійкістю і здатністю до акліматизації, але дві інші області зв'язувалися з морозостійкістю, не пов'язане з акліматизацією. Здатність до акліматизації регулювалася генами з дуже невеликими як позитивними, так і негативними ефектами домінування. Аллель озимих батьку мала позитивні додаткові ефекти, але негативні домінантні ефекти в локусах кількісних ознак FTN. RFLP локуси виявлялися за допомогою индуцируемой холодом і зв'язано зі стресом кДНК з Arabidopsis thaliana, картіровано близько двох локусів кількісних ознак для FTA / FTB.
Недавні дослідження визначили в рослинах cis-діючий ДНК-регулюючий елемент, «C-повтор/отвечающій на зневоднення елемент», який стимулює транскрипцію у відповідь на де ствие низько температури та водного дефіциту. З Arabidopsis thaliana була виділена кДНК, що кодує «C-repeat/DRE» зв'язує фактор, CBF1. Аналіз виведеної амінокислотної послідовності CBF1 показує, що білок має молекулярну масу 24 кДа, потенційну ядерну локалізацію послідовності і можливу активність в кисло області. CBF1 також має область AP2, яка є ДНК-прив'язки мотивом з 60 амінокислот, які є в білках Arabidopsis APETALA2, AINTEGUMENTA, і TINY і в інших рослинних білках з невідомими функціями. Рівні вмісту транскриптів CBF1, які конститутивний є поодинокими або низькими, незначно змінювалися в рослинах, підданих низькотемпературної обробки, або в окремих листах, підданих дефіциту води. Зв'язування CBF1 до «C-repeat/DRE» продемонстровано за допомогою аналізу із зсувом гелю при використанні рекомбінантного білка CBF1, експресувати в Escherichia coli. Крім того, виявлено, що експресія CBF1 в дріжджах активізує транскрипцію репортер-генів, які містять «C-repeat/DRE» як активізатор, розташований вище послідовності, але не активізує транскрипцію мутантно версії елемента ДНК. Вважається, що CBF1 може функціонувати як активізатор транскрипції, який пов'язують із «C-repeat/DRE» відповідальним елементом ДНК і, ймовірно, грає роль в індукованій холодом і зневодненням експресії гена у Arabidopsis.
З оброблених холодом проростків холодостійка сорти сої за допомогою диференціального секвенування були виділені дві регульовані холодом кДНК - src1 і src2. Рівень вмісту транскриптів src1 збільшується після впливу низькою або високою температурою, посухою, пораненням і інфекції вірусом мозаїки соєвого боба. Транслюватиметься з кДНК src1 поліпептид має 102 амінокислоти, гідрофіліі і має дев'ять амінокислотних повторів, багатих глютамінової кислотою, гистидином, лізином і гліцином. SRC1 має гомологію з білком водного стресу рису і регульованим холодом білком люцерни. Рівень вмісту транскриптів src2 збільшувався тільки після зниження температури до 5 0 C, що вказує на те, що цей ген індукується тільки охолодженням. Транслювання з кДНК src2 поліпептид складається з 290 амінокислот і містить сім повторів послідовностей амінокислот, багатих пролином, гліцином, тирозином амінокіслот і гідрофобну область у карбокси-кінця, яка може зв'язуватися з мембраною. Рівень транскриптів src2 при 5 0 C продовжував збільшуватися аж до 48 годин де ствия низько температури в холодостійка сорті Kitamusume, в той час як він досягав максимуму через 12 годин і потім знижувався в чутливому до холоду сорті Koganejiro.
З Arabidopsis thaliana був ізольований геномний фрагмент EcoRI розміром 7 kb, який містить два тісно пов'язаних dhn / lea / rab-подібних гена - lti29 і cor47 в тандемною оформленні. Для обох транскриптів показана акумуляція у відповідь на низькотемпературного стресу, обробку екзогенно абсцизової кислоти і зневоднення. Порівняння послідовності амінокислот трансльовані поліпептидів показало, що вони на 67% ідентичні. Розраховані молекулярні маси цих поліпептидів були 29 кДа для
LTI29 і 30 кДа для COR47. Обидва поліпептиду містять один консервативні серинові домен і три багатих на лізин повтору, як у DHN / LEA / RAB-подібних білків. Крім того, як LTI29, так і COR47 мають N-термінальний кислий повтор, виявляється тільки в кількох серед DHN / LEA / RAB білків. Близьке відстань між двома генами та їх тандемна організація в геномі A. thaliana, а також загальна гомологія послідовності області кодування на нуклеотидном рівні дозволяють припустити, що два гени розвинулися шляхом дублювання. Це, мабуть, являє собою спільну рису серед залежних від низькотемпературного стресу генів A. thaliana.
Paldi з співавторами був вивчений ефект низько температури на процесинг рРНК у пшениці. Дві лінії пшениці, використані в цей роботі, відрізнялися один від одного тільки морозостійкістю. У ході експериментів було показано, що у разі слабоморозоустойчіво лінії кількісні і якісні зміни в процесі дозрівання рРНК відбулися як результат де ствия низько температури. Протягом холодової обробки останні попередники двох стабільних цитоплазматичних рРНК накопичувалися в якості стабільних фракцій рРНК. Це нагромадження збільшувалася в міру збільшення тривалості холодової обробки. У той же час це зміна не було виявлено у лінії з хороше морозостійкістю. Результати свідчать, що в слабоморозоустойчівих лініях холодова обробка мала інгібірующі ефект на останню стадію процесу дозрівання рРНК, тобто при низько температурі цей процес не може завершитися.
Відомо, що теплова обробка плодів помідора індукує також і стійкість до пошкодження від охолодження. Раніше було показано, що специфічні білки теплового шоку експресуються в нагрітих плодах помідора після зберігання на холоді. Для пошуку індукованих теплом генів, експресується при низьких температурах, була виготовлена, а потім піддана диференціальному скринінгу бібліотека кДНК з попередньо прогрітих, а потім охолоджених плодів помідора. У ході цих експериментів було виділено нові клон кДНК, hcit2, що кодує білок з молекулярно масою 16.5 кДа. Кодований їм білок містить три передбачуваних трансмембранних гідрофобних послідовності, що дозволяє припускати, що цей білок локалізований в мембранах. Експресія hcit2 в плодах індукувати високо температурою, але не іншими видами стресу, такими, як, наприклад, низька температура, посуха чи анаеробні умови, і не спостерігалася під час дозрівання плоду. Високий рівень транскриптів hcit2 був виявлений в нагрітих плодах після 2-х тижнів зберігання при 2 0 C. Високі температури також индуцировали експресію hcit2 в листі, квітах і стеблах помідора. Автори припускають, що білок HCIT2 може бути залучений в процес придбання рослиною стійкості до пошкодження охолодженням.
У ряду лини дикої картоплі були проаналізовані динаміка холодового загартовування і зміни до трансльованих мРНК під час холодової акліматизації. Перед низькотемпературної обробки всі лінії були повністю загартовані протягом восьми дні при 4 0 C. Найбільш холодостійка лінія 1 посилила холодостійкість від -3,2 0 C до - 8,9 0 C, а найменш холодостійка лінія 10 збільшила свою холодостійкість від -2,5 0 C до -6,5 0 C. У ході досліджень були ізольовані полі-РНК з загартованих і незагартованих рослин лини 1 і 10 та продукти їх трансляції in vitro були розділені двовимірним-PAGE-електрофорезом. Аналіз профілів продуктів трансляції in vitro загартованих рослин лінії 1 виявив зміни у змісті приблизно 31 продукту в області молекулярних ваг від 14 до 69 кДа і pI в районі від 6,7 до 5,0. Зміст 26 продуктів під час холодно акліматизації підвищувався, а двох інших білків - зменшувалося. У час, коли рослини піддавалися низькотемпературного стресу, було можливо ідентифікувати знову утворюються продукти трансляції - три з мовляв. масами близько 18 кДа і два з мовляв. масами близько 45 кДа. Більшість продуктів, вміст яких змінювалося протягом холодової акліматизації, було виявлено в групі низькомолекулярних білків з молекулярними масами від 14 до 21 кДа та від 24 до 35 кДа. У менш стійко лінії 10 протягом холодової акліматизації змінювалося зміст тільки 19 продуктів трансляції, і в ній не було зазначено знову утворюються продуктів. Всі зміни в продуктах трансляції в обох лініях з'являлися після двох дні холодової обробки, коли морозостійкість ліній ще підвищувалася.
Таким чином, до теперішнього часу накопичено велику кількість даних про окремі індукованих низькою температурою генах у різних видів рослин. Особливо великий обсяг даних в даний час отримано у зв'язку з проведеним повним сиквенсу геному Arabidopsis thaliana. У той же час необхідно відзначити, що, незважаючи на велику кількість даних про вплив низько температури на експресію генів у рослинах, ці дослідження проводяться уривками і безсистемно. В основному, отримані дані говорять про індукції експресії певних генів низько температурою. У той же час дані про взаємозв'язок експресії різних генів при низькотемпературному стресі вкрай обмежені. Все ж таки з розглянутих вище даних можна зробити висновок, що, хоча в порівнянні з «нормальними» температурними умовами утримання ДНК при гіпотермії змінюється незначно, в той же час гіпотермія викликає значні зміни в експресії генів на рівні транскрипції. При низькотемпературному стресі і в процесі низькотемпературної адаптації у різних досліджених видів індукується експресія ряду генів, деякі з яких є видоспецифічними. У той же час виділено кілька сімейств генів, які індукуються у відповідь на низькотемпературного стресу у багатьох з досліджених видів. Встановлено, що багато хто з експресується при низько температурі генів індукуються також у відповідь на обробку екзогенно абсцизової кислоти і засуху. Індукція деяких генів є загальним неспецифічним відповіддю організму на стрес, так як вони індукуються усіма вивченими видами абіотичного і біотичного стресу. Оскільки встановлено, що низькотемпературний стрес викликає зміни експресії генів на рівні транскрипції, можна пере ти до розгляду результатів, отриманих при вивченні його впливу на рівні трансляції.