Нокаут генів

4. 57 BL / MUC 2 C 57 BL / MUC 2

4.5 C57BL/6Kaiso

5. Приклади використання нокаутованим мишей для вивчення функцій генів і спадкових захворювань людини

Висновки

Список літератури

Тези

Нокаут гена (gene knockout) - це метод молекулярної генетики, при якому з організму видаляють або роблять непрацездатними задані гени. Таким чином отримують організм, нокаутний по непрацюючим генам. Нокаутние організми допомагають дізнатися функції генів, нуклеотидна послідовність яких відома. Відмінності між нокаутним і нормальним організмом свідчать про функції виключеного гена.

Ця методика полягає в цілеспрямованому внесення зміненого, мутованого гена в спадкову інформацію клітин. Новий ген вноситься до одержувані з ембріонів стовбурні клітини, а результат оцінюється в дорослому тварину, тому поки не йде мова про застосування даної технології у людей: багато роботи зі стовбуровими клітинами людини майже повсюдно заборонені, та й вирощування мутантних особин Homo sapiens в експериментальних цілях представляється малореальним.

Стандартної біологічної моделлю, для якої розроблено методику, є лабораторні миші.

Лауреатами Нобелівської премії 2007 року в області медицини і фізіології стали Маріо Капеккі, Олівер Смітіс і сер Мартін Еванс - розробники технології gene targeting - способу змінити окремі гени у ссавців. Мова йде про передній межі сучасної науки про живу, справжньою генетичної інженерії, про яку мріяв ще Уеллс в "Острові доктора Моро".

Вступ

З перших днів виникнення генетики як науки, вчені мріяли отримувати спрямовані мутації, що зачіпають гени досліджуваних ними ознак. Першим кроком до здійснення цієї мрії було відкриття радіаційного та хімічного мутагенезу. Закінчення секвенування генома людини в 2001 р. [28,12] вивело на новий рівень дослідження з виявлення нових генів і функціонально значущих послідовностей геному. В даний час біотехнологія та біоінформатика в комбінації з класичною біохімією і генетикою є потужним інструментом для аналізу вже наявної послідовності генома людини та модельних організмів. Але справжній прорив в області спрямованих мутацій був здійснений завдяки використанню феномена гомологічною рекомбінації між порівняно невеликою ділянкою екзогенної і клітинної ДНК. Даний метод отримав назву спрямованої інактивації гена або нокаут гена (від англ. Knockout, синонім - gene targeting). Знаючи послідовність досліджуваного гена людини, стало можливо за допомогою інактивації гомологічного гена у модельного організму визначити біохімічну та фізіологічну роль його продукту. Оскільки значне число хвороб людини у своїй основі має спадковий компонент, моделі захворювань, створені з використанням цієї стратегії, дозволяють розширити наше розуміння біохімії та фізіології спадкових патологій і призведуть до створення нових підходів до лікування.

Лауреатами Нобелівської премії 2007 року в області медицини і фізіології стали Маріо Капеккі, Олівер Смітіс і сер Мартін Еванс - розробники технології gene targeting - способу змінити окремі гени у ссавців. Мова йде про передній межі сучасної науки про живу, справжньою генетичної інженерії, про яку мріяв ще Уеллс в "Острові доктора Моро".

1. Метод генетичного нокауту

Нокаут гена - це молекулярно-генетичний метод, в ході якого задумані дослідником зміни вносяться в нуклеотидну послідовність досліджуваного гена або його регуляторних елементів. Миша є найбільш адекватним модельною твариною для використання технології інактивації генів. Це обумовлено наступними причинами:

а) миша - добре вивчений і доступний об'єкт;

б) геном миші і людини містить приблизно однакове число генів;

в) схожість амінокислотних послідовностей всіх білків людини і миші становить близько 90%.

Однак основною причиною використання миші в якості моделі для інактивації гена є можливість ізолювання ембріональних стовбурових клітин, в яких будь-ген може бути модифікований [29]. Клітинні лінії, що містять модифікований ген, можуть бути привнесені в розвивається зародок, що дозволяє отримати химерне тварина, яка несе штучно створену мутацію (рис. 1).

Рис. 1. Стратегія отримання лінії нокаутованим мишей [5].

Молекулярно-генетичним механізмом, що дозволяє здійснювати інактивацію гена, є гомологичная рекомбінація між екзогенної ДНК, що несе задумані дослідником зміни, і геномної ДНК об'єкта.

Класична схема отримання нокаутованим мишей включає кілька етапів: отримання векторної конструкції, з подальшим внесенням її в культуру ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) і відбір трансформантів. Трансформовані ЕСК вносять у зародок, та отриманих химерних тварин схрещують для отримання лінії мишей, гомозиготних за отриманою мутації (див. рис. 1).

1.1 Особливості векторних конструкцій

У залежності від поставленої задачі використовуються два типи векторів: замісник і вставний. Перший тип векторів дозволяє замінити ділянку гена мішені, в той час як другий інтегрує в досліджувану послідовність. Будова обох типів векторів однаково, крім орієнтації фланкують послідовностей (рис. 2). Найбільш часто використовуються заміщають вектора.

Рис. 2. Два типи векторів - замісник (А) і вставний (Б) - та їх механізми інтеграції в геном [5].

Вектор для трансформації несе клоновану послідовність досліджуваного гена, з внесеними до неї необхідними змінами. Це може бути: внесення стоп-кодону, що приводить до синтезу короткого неактивного пептиду; делеція одного або декількох екзонів; делеція промоторної області; вставка, яка веде до порушення нормального функціонування гена і будь-які інші зміни, що призводять до відсутності функціонального продукту досліджуваного гена або значно знижують його активність. Також в цю послідовність вноситься позитивний селективний маркер (МПС), яким є ген neo. Продукт цього гена дає несучим його клітинам стійкість до антибіотиків неоміцину та канаміцину. Модифікована послідовність повинна бути фланковані незміненими ділянками, за якими буде проходити рекомбінація. Ефективність рекомбінації залежить від довжини фланкують послідовностей [22], що в свою чергу залежить від можливостей вектора (рис. 3). При довжині гомологічного плеча близько 5 тис. пар основ відсоток рекомбінації складає 0,001.

Рис. 3. Залежність частоти інтеграції вектора від довжини гомологічних плечей [22].

В якості вектора можна використовувати бактеріальні штучні хромосоми (BAC), зі вставками фрагментів геному миші. У цьому випадку розмір одного плеча може складати до 150 тис. пар основ, а розмір делеції до 25 тис. пар основ Найкращий відсоток рекомбінації (8,3%) отримано авторами з використанням довжини плеча 110 тис. пар основ [26].

Існує ймовірність, що рекомбінація пройде не з досліджуваних нами ділянках геному, а в будь-який інший подібною області. До того ж ген neo (МПС) збережеться, і у відібраному пулі ЕСК будуть присутні рекомбінантні клітини, що не несуть необхідних змін. Ця проблема вирішується внесенням у векторну конструкцію маркера негативної селекції (МОС). Їм може служити ген тимідин-кінази простого вірусу герпесу (HSV-tk) або ген дифтерійного токсину А (DT-A), продукти яких вбивають еукаріотичні клітини. Положення МОС з зовнішнього боку гомологічного плеча вектора дозволяє елімінувати його після проходження гомологічної рекомбінації (рис. 4). У разі ж негомологичностью рекомбінації, МОС виявляється інтегрованим в геном трансформованої клітини, що призводить до її елімінації. Наявність двох маркерів селекції (позитивного і негативного) дозволяє швидко і ефективно проводити відбір потрібних трансформантів [23,19].

Рис. 4. Дія системи позитивною - негативної селекції: А) інтеграція вектора в потрібну ділянку геному, що приводить до нокауту гена, Б) випадкова інтеграція (синтез тимідин-кінази і загибель клітин) [19].

1.2 Внесення вектора в ембріональні стовбурові клітини

Для трансформації використовують ембріональні стовбурові клітини мишей. Крім того, що культура ЕС клітин здатна рости in vitro, при пересадці в доросле миша або ембріон клітини мають властивість приживатися. ЕС клітини, на відміну від спеціалізованих соматичних клітин, зберігають генетичні потенції без тканинної спеціалізації. Ці клітини мають "мінімальний" фенотип: мінімум рецепторів і програм для взаємодії з мікрооточення, оскільки лише 5% з 500 генів транссігналізаціі експресувати в проліферуючих ЕСК. Другою найважливішою характеристикою ЕСК у культурі є практично необмежений потенціал проліферації, обумовлений особливостями фенотипу незрілих клітин. Третьою особливістю ЕСК є зростання суспензійним клонами без будь-якої домішки просунутих клітин, прикріплених до підкладки. Кожен клон в такій культурі є похідним однієї прабатьківській ЕСК [1].

Ембріональні стовбурові клітини миші вперше отримані в 1981 році [8], що дало можливість для розвитку робіт з інактивації генів. Внесення лінеалізірованного вектора в ЕС клітини можливо кількома методами: мікроін'єкція, трансфекція (електропорація), трансдукція (вірусна інфекція). Перераховані методи мають свої переваги і недоліки.

Мікроін'єкція дозволяє з частотою до 100 відсотків вносити екзогенну ДНК у клітину, а частота гомологічною рекомбінації складає близько 0,67%. Цей метод, безсумнівно, є найбільш ефективним. Однак для здійснення мікроін'єкції потрібно дороге обладнання і висока кваліфікація експериментатора. Крім цього, сам метод дуже трудомісткий і займає багато часу. Векторні конструкції мікроін'єкцій можна вносити і до зиготу, але відібрати потрібні трансформанта в цьому випадку неможливо.

Найбільш економічними і досить ефективними методами внесення екзогенної ДНК у клітину є електропорація і ретровірусна інфекція. До їх переваг, в першу чергу, слід віднести можливість одноразово обробити сотні тисяч клітин, які завдяки системі позитивної-негативної селекції досить швидко проходять відбір. Це істотно спрощує і робить економічно вигідним, у порівнянні з мікроін'єкцій, процедуру отримання трансформованих клітин. Обидва методи мають свої недоліки: більший відсоток негомологичностью рекомбінації при внесенні векторних систем електропорація в порівнянні з іншими методами, обмеження розмірів ретровірусних векторів і т.д. [21]. Найбільш часто внесення векторів у клітку проводять за допомогою електропорації. У той же час ретровірусна інфекція дозволяє вносити екзогенну ДНК не тільки в ЕС клітини, але і в ембріони. Отже, лінія трансформованих клітин отримана і підтримується. Наступний етап - внесення клітин в ембріон миші (як правило, на стадії бластули). Химерний зародок підсаджують в матку помилково вагітної самки. Отриману таким чином химеру схрещують з нормальним, але мають відмінності (наприклад, колір) тваринам. Якщо отримані в першому поколінні миші мають фенотип лінії, з якої отримані ЕС клітини, то їх можна використовувати для насичує схрещування. Результатом буде отримання лінії тварин, гомозиготних по створеній мутації.

2. Роль метилювання ДНК у контролі геному

Одним із способів видозміни гена є його заміна на безглузду послідовність ДНК - тоді ген "вимикається". Дослідники систематично "виключають" гени і спостерігають, до яких наслідків на рівні організму призводить це "виключення". Така методика називається "генетичний нокаут" (gene knockout).

Вона дозволяє докладно вивчити функцію конкретного гена під час ембріонального розвитку і після народження тварини. Можна простежити, як кожен ген впливає на розвиток організму і виникнення тієї чи іншої патології. У зв'язку з цим, метод ще отримав назву "генетичне планування". До справжнього моменту вже проведені досліди по "виключення" десяти тисяч генів миші, це половина всього мишачого геному.

Для розвитку організму досить однієї клітини з одиничною (звичайно ж, диплоїдної) копією ДНК, яка при розподілі точно відтворюється від клітини до клітини. Це відноситься практично до всіх живих багатоклітинним істотам. У людини всі його клітини містять ідентичну ДНК. Клітини крові, печінки, мозку, стовбурові клітини - всі вони однакові по ДНК. Чим же визначається різноманіття наявних у людини високоспеціалізованих клітин і тканин? Це досягається за рахунок включення або виключення генів, відповідальних за спеціалізацію клітини. Саме механізми контролю роботи, або як прийнято говорити, експресії генів є основною темою досліджень нашої групи. Одним з таких механізмів є метилювання генів - ковалентное приєднання метильної групи в 5 положенні піримідинового кільця цитозину. ДНК, що містить метиловані цитозин, є транскрипційно неактивною, і гени, розташовані поблизу метильованих районів, мовчать.

Роль метилювання ДНК і механізм його негативного впливу на роботу генів в процесі життєдіяльності хребетних організмів (на моделях жаби, миші і клітинних ліній людини).

Метилювання ДНК у хребетних набуває смислове навантаження у вигляді придушення транскрипції прилеглих генів двома основними способами: (А) за рахунок прямого впливу на ДНК, у складі якої метильований цитозин інгібує зв'язування транскрипційного фактора зі своєю ділянкою, і (Б) за рахунок специфічного зв'язування з етиловому районом спеціалізованих метил-ДНК котрі дізнаються білків, які, у свою чергу, залучають складні механізми пригнічення транскрипції шляхом модифікації прилеглих гістонів.

Як приклад охарактеризований білок Каізо. Каізо, з одного боку, зв'язується з Катенін р120, а з іншого - здатний придушувати транскрипційних активність метильованих генів. Каізо має доменну структуру і складається з N-кінцевого BTB / POZ домену та C-кінцевих цинкових пальців типу C2H2. Цинкові пальці специфічно пов'язують 5-метил цитозин містить ДНК.

Нокаут гена Каізо призводить до часткової резистентності тварин до раку кишечника. Крива виживання тварин з нокаутом гена Каізо (червона лінія) в моделі спонтанного раку кишечника APC (Min). Чорною лінією показана крива виживання контрольних тварин

Проведено генетичний нокаут гена Каізо у мишей. Показано, що тварини без Каізо (Каізо-КО) розвиваються нормально і не мають виражених патологій. За переведення Каізо-КО тварин на генетичний фон з високим відсотком спонтанних пухлин кишечника відбувається збільшення терміну життя тварин, зменшується середній розмір поліпів у кишечнику. Таким чином, встановлено, що без Каізо відбувається уповільнення зростання пухлин кишечника в APC (Min) моделях Навпаки, при вимиканні гена Каізо в зигота жаби відбувається апоптотичних смерть клітин ембріонів на стадії нейрули. На відміну від миші, ген Каізо є необхідним для життєдіяльності земноводних. Ці дані були підтверджені й на рибах Danio Rerio. Отримано лінії клітин з множинними генетичними нокаутами генів MBD2, MeCP2 і Каізо. Показано, що білки MBD2, MeCP2 і Каізо надають синергетичне дію (репресують) метильований промотор гена Xist. Показано, що мутації в гені Каізо не є ключовими в ініціюванні синдрому Ретта (нейродегенратівное захворювання у дівчаток), хоча інший метил ДНК зв'язуючий білок MeCP2 безпосередньо залучений в цю патологію.

У геномі хребетних знайдені і охарактеризовано два гени, що кодують білки ZBTB4 і ZBTB38, які за своєю амінокислотної послідовності і розташуванню консервативних доменів є родичами Каізо. Показано, що ці два білки є метил ДНК залежними транскрипційними репрессором.

Каізо подібний білок ZBTB4 розташований в метильованих ділянках гетерохроматину. Клітини без метилювання - мишачі ембріональні фібробласти з генетичною делецій генів dnmt1-/ - і p53-/ -. Клітини з нормальним рівнем метилювання - мишачі ембріональні фібробласти p53-/ -. У разі dnmt1-/ - p53-/ - клітин видно відсутність кореляції між локалізацією ZBTB4 в гетерохроматин (DAPI), в той час, як в p53-/ - клітинах бачимо повну ко-локалізація ZBTB4 і гетерохроматину.

3. "Програмований нокаут генів"

Слід зазначити, що не всі гени можна інактивувати на стадії зародка. І, природно, не можна отримати клітки або тварин, нокаутувавши за так званим генам домашнього господарства. Однак для генів, що беруть участь в ембріональному розвитку, розроблено підхід, що дозволяє проводити їх інактивацію після розвитку організму. Дана стратегія дозволяє "вимикати" гени в певних умовах ("програмований нокаут генів", англ. Conditional knockout), а саме в необхідній досліднику тканини або групі клітин та / або під впливом індукуючого речовини.

Це можна здійснити за допомогою методики, що поєднує гомологичную рекомбінацію, як у випадку класичного нокауту генів, і системи сайт-специфічної рекомбінації. Сайт-специфічні рекомбіназами - це ферменти, узнающие особливі ділянки ДНК і що здійснюють обмін між ними. Найбільш часто використовуються Cre рекомбіназа бактеріофага P1 і Flp рекомбіназа (фліпаза) дріжджів. Ці ферменти розпізнають нуклеотидні послідовності в 34 підстави, звані, відповідно, loxP і frt сайти [16]. Якщо ці послідовності розташовані в одній орієнтації, рекомбінація по них призведе до делеції фланкованому ділянки. Якщо ж орієнтація послідовностей різна, то це призведе до інверсії фрагмента між ними (рис. 5).

Рис. 5. Схема механізму сайт-специфічної рекомбінації. Залежно від орієнтації loxP-сайтів відбувається або делеція, або інверсія фланкування фрагмента [20].

Використання стратегії "програмованого нокауту гена" вимагає створення двох ліній мишей. Лінія А несе інтегровану в геном послідовність гена Cre під контролем ткане-специфічного або індуцибельних промотора. Лінія У містить два loxP сайту, фланкують підлягає видаленню послідовність досліджуваного гена (екзон, промотор і т.д.) [25]. Слід зазначити, що вставки в геномної послідовність loxP сайтів і гена Cre здійснюються з використанням тих же прийомів, що і при класичному нокауті генів, але не повинні зачіпати функціональні послідовності (рис. 6).

Рис. 6. Схема використання тканеспеціфічной Cre-loxP рекомбінації для отримання мишей з програмованим нокаутом гена [25].

Отримані таким чином гомозиготні лінії мишей схрещують. У нащадків від цього схрещування досліджуваний ген буде інактивовані в тканини або групі клітин, де буде активний промотор, контролюючий активність гена Cre [25]. Використовуючи стратегію "програмованої інактивації гена", можна досягти результатів, недоступних при використанні стандартної процедури нокауту генів.

4. Лінії нок-аутних мишей

4.1 ФНП / ЛТ панель

Забарвлення шерсті: чорні.

Походження: лінії виведені в лабораторії молекулярної імунології ІМБ ім. В. А. Енгельгардта РАН методом генетичного нокауту і переведені на генетичну основу C57BL / 6 шляхом зворотного схрещування. Панель містить лінії мишей з модифікованим геном фактора некрозу пухлин (ФНП) і лимфотоксинов (ПТ), підготовлені до тканиноспецифічною делеції гена, а також лінії мишей з делецій гена ФНП або ЛТ специфічно в макрофагах / нейтрофілах, або в Т-або В-лімфоцитах, або в клітинах зародкової лінії.

Характеристика лінії:

у мишей з повною делецій гена ФНП порушена захист від ряду патогенів;

у мишей з повною делецій гена ЛТ-бета порушена структура вторинних лімфоїдних органів та антиген-специфічна продукція деяких класів імуноглобулінів.

Основні галузі використання: дані миші являють собою унікальну панель для вивчення ролі тканиноспецифічною продукції цитокінів сімейства ФНП при природженому і набутою імунодефіцит.

Ключові публікації: