ВИКОРИСТАННЯ поліелектролітний мікрокапсул З МЕТОЮ РОЗРОБКИ СИСТЕМ АДРЕСНОЇ ДОСТАВКИ біологічекі-АКТИВНИХ РЕЧОВИН НА ПРИКЛАДІ ІММОБІЛІЗАЦІЇ Хімотрипсин
Т.М. Бородіна, Е.А. Марквічева, Л.Д. Румш, С.М. Куніжев, Г.Б. Сухоруков
ВСТУП
Розробка рецептурних форм для лікарських засобів, в яких якості активних інгредієнтів зберігаються тривалий час - важливе завдання, оскільки багато БАР не розраховані на тривале перебування в організмі - вони швидко виводяться або метаболізують. Також їх корисні властивості втрачаються під впливом кисню, УФ - опромінення і перепадів температури. Крім того, деякі дуже важливі компоненти можуть нейтралізувати оздоровчу дію інших компонентів, а в деяких випадках утворювати з ними принципово шкідливі для організму продукти. У зв'язку з цим БАР використовуються з недостатньою ефективністю, що призводить до зниження лікувального властивості кінцевого лікарського засобу.
Саме тому, все більше вченим доводиться замислюватися не тільки над пошуком нових біорегуляторів, а й над створенням більш досконалих форм вже відомих біологічно активних препаратів і завданням доставки цих препаратів в організм, регулювання швидкості їх дії і часу перебування в організмі. Природні полімери, з цієї точки зору, представляють унікальну можливість для створення нових засобів доставки БАР. Широке застосування природних полімерів обумовлено їх біосумісність, здатністю до біодеградації, низькою токсичністю. В даний час до перспективних форм доставки різних біорегуляторів (ферментів, гормонів, вітамінів, активаторів та інгібіторів різної природи) до тканин і органів відносять ліпосоми, вектори, наночастинки, такі як поліелектролітний мікрокапсули.
Включення білків в полімерні сфери та капсули представляє великий науковий і практичний інтерес [3]. На увагу заслуговують публікації з капсулювання білків у поліелектролітний (ПЕ) частинки. Ступенева нанесення протилежно заряджених поліелектролітів на матрицю, у якості якої можуть виступати тверді частинки різного розміру, дозволяє проводити іммобілізацію в м'яких умовах і у водних розчинах [4].
На основі поліелектролітних комплексів (ПК) можуть бути створені ефективні системи з іммобілізованим ферментом, що володіє властивістю саморегулювання [5]. Раніше було запропоновано [6] використовувати ПК як депо антігепарінових речовин. Антігепаріновие речовини, що представляють собою розчинні катіонні поліелектроліти, є надзвичайно токсичними. Їх токсичність не проявляється на тлі гепарину завдяки освіті ПК гепарин-полікатіона. Тому передозування антігепарінових препаратів становить значну небезпеку. Використання цих речовин у складі ПК дозволяє уникнути даного побічного ефекту.
В якості матриць для ПК використовуються колоїдні частинки з діаметром від десятків нанометрів [7] до десятків мікрон [8, 9]. Коло використаних колоїдних частинок різноманітний. Серед них латексні полістирольні і меламінформальдегідні частки [10; 11], неорганічні карбонатні матриці [12], кристали органічних барвників [13; 14], мікрочастинки з полігідроксікарбонових кислот [8], інтактні клітини [15], білкові агрегати [16], мікроагрегати ДНК [17]. У даній роботі були використані CaCO 3 ядра, які, на наш погляд, є оптимальними при роботі з БАР, тому що розчинювальним агентом для них служить ЕДТА і процес розчинення відбувається в м'яких умовах при фізіологічних значеннях рН.
Для формування поліелектролітний оболонки на колоїдних частинках методом ПЕ адсорбції використовуються як синтетичні, так і природні поліелектроліти. В якості останніх застосовувалися хітозан і хітозансульфат [18; 19], протамін і декстран сульфат [20] та інші. - лизин, которые являются биосовместимыми и биодеградируемыми полимерами.
У даній роботі були використані альгінат натрію та полі - L - лізин, які є біосумісними і біодеградіруемимі полімерами. Основним чинником, що визначає ефективність мікрокапсул, є проникність їх оболонок для травних соків та інших біологічних рідин, а також для містяться в них лікарських речовин. З цією метою було досліджено вплив протеолитического ферменту - трипсину на отримані мікрочастинки.ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА
, Biochemika » (Германия); поли- L -лизин ( PLL )(150-300 кДа), « Fluka », США; альгинат натрия средней вязкости ( Alg ), « Sigma » (Германия); трипсин (ТР) " Sigma " (Германия); N - Бензоил- L -тирозин (ВТЕЕ), " Sigma " (Германия); этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), « Sigma » (Германия), ТРИС-буфер, " Sigma " (Германия); хлорид натрия, соляная кислота, гидроксид натрия.
У роботі використовували α-хімотрипсин, «Fluka, Biochemika» (Німеччина); полі-L-лізин (PLL) (150-300 кДа), «Fluka», США; альгінат натрію середньої в'язкості (Alg), «Sigma» (Німеччина ); трипсин (ТР) "Sigma" (Німеччина); N - Бензоїл-L-тирозин (ВТЕЕ), "Sigma" (Німеччина); етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА), «Sigma» (Німеччина), ТРІС-буфер, "Sigma "(Німеччина); хлорид натрію, соляна кислота, гідроксид натрію.1. Отримання мікрочастинок карбонату кальцію
водного раствора Na 2 CO 3 быстро приливали при перемешивании (400-900 об/мин) к 0,33 N водному раствору CaCl 2. .
Еквівалентний об'єм (15 мл) 0,33 N водного розчину Na 2 CO 3 швидко доливали при перемішуванні (400-900 об / хв) до 0,33 N водного розчину CaCl 2.. Після перемішування протягом 60 сек, суспензію утворилися частинок залишали на 5-7 хвилин до повної кристалізації карбонату кальцію. 3 промывали 50 мл воды и фильтровали. Далі осад CaCO 3 промивали 50 мл води і фільтрували. Відмивання повторювали 3 рази. Останній раз мікрочастинки промивали спиртом або ацетоном, після чого фільтр поміщали під нагрівальну лампу і сушили 1,5 год при 50-60 о С. 3 хранили в закупоренной емкости при комнатной температуре. Сухі мікрочастинки CaCO 3 зберігали в закупореній ємності при кімнатній температурі.2. 3 микрочастицы методом адсорбции в порах
Включення ХТР в CaCO 3 мікрочастинки методом адсорбції в порах3 микрочастиц диаметром 3-5 микрон суспендировали в 1 мл раствора фермента (5-10 мг/мл) в воде.
50-100 мг CaCO 3 мікрочастинок діаметром 3-5 мікрон суспендованих в 1 мл розчину ферменту (5-10 мг / мл) у воді. Після інкубації на шейкері або гойдалці протягом 2 годин, мікрочастинки облягали центрифугуванням (1000 об / хв, 5 хв) і відокремлювали супернатант. Далі частки залишали на 10 годин у холодильнику, центрифугували (1000 об / хв, 5 хв), відбирали супернатант. Після цього, частки двічі промивали водою (1мл), використовуючи центрифугування (1000 об / хв, 5 хв) / ресупендірованіе.3. Отримання поліелектролітних мікрокапсул
3 частицах с диаметром 3-5 мкм последовательной адсорбцией Alg (2 мг/мл) и PLL (2 мг/мл) в 0,02 N NaCl .
Капсули отримували на CaCO 3 частинках з діаметром 3-5 мкм послідовної адсорбцією Alg (2 мг / мл) і PLL (2 мг / мл) в 0,02 N NaCl. . Нанесення кожного шару поліелектролітів проводили протягом 15 хвилин, потім частки центрифугували і двічі промивали в 0,02 N NaCl. При агрегації частинок між собою в процесі адсорбції ПЕ, суспензію мікрочастинок піддавали обробці ультразвуком (максимальна потужність) протягом 1-3 сек. , CaCO 3 - частицы растворяли 0,2М раствором ЭДТА, рН 7,0. Після нанесення 3-ох шарів Alg та 3-ох шарів PLL, CaCO 3 - частинки розчиняли 0,2 М розчином ЕДТА, рН 7,0. Після повного розчинення карбонатної матриці, мікросфери промивали у воді 3 рази (час інкубації 3-5 хвилин) і зберігали у вигляді суспензії при 4 о С.4. Визначення вмісту білка в мікрочастинках і розчинах
Визначення концентрації білка в розчинах проводили спектрофотометрично. Для цього в кювету на 1,5 мл вводили 1 мл розчину білка і вимірювали оптичну щільність при 280 нм. Досліджувані розчини були розбавлені, з урахуванням коефіцієнта екстинкції для кожного білка, таким чином, щоб значення оптичної щільності не перевищувало 2. Калібрувальну криву будували з використанням того ж білка, який використовували для отримання мікрочастинок. исх ) к значению в супернатанте после сорбции( D сорб ). Ефективність включення (іммобілізації) білка визначали як відношення оптичної щільності у вихідному розчині (D вих) до значення в супернатанті після сорбції (D сорб).
5. Вимірювання протеолітичної активності ХТР
2 ), использовали следующую методику. Для вивчення протеолітичної активності іммобілізованого ХТР у водному середовищі (0,08 М ТРІС-буфер, рН 7,8, що містить 0,1 М CaCl 2), використовували таку методику. 40 мкл розчину ХТР або суспензії мікросфер з ХТР додавали в кювету на 1,5 мл, що містить 0,15 мл 0,08 М ТРІС-буфера, рН 7,8 і 0,14 мл 0,00107 М BTEE в 50% розчині метанолу (63 мл абсолютного метанолу в 50 мл води). Приріст оптичної щільності реєстрували спектрофотометрично при довжині хвилі 256 нм протягом 5 хвилин. При цьому кожну хвилину кювету струшували, щоб уникнути осадження мікросфер з включеним білком. Таким чином, приріст оптичної щільності був обумовлений накопиченням продукту ферментативного гідролізу.
ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
1. CaCO 3 -частиц Отримання мікрокапсул з ХТР на основі CaCO 3-частинок
на твердых CaCO 3 -частицах. Поліелектролітний мікрокапсули були отримані ступінчастою адсорбцією [5] протилежно заряджених Alg і PLL на твердих CaCO 3-частинках. Вперше мікрочастинки з карбонату кальцію були отримані і застосовані в якості деградіруемой матриці для отримання ПЕ мікрочастинок у роботі [10]. Безпосередня взаємодія еквімолярних розчинів карбонату натрію і хлориду кальцію при перемішуванні призводить до кристалізації малорастворимой солі CaCO 3. Утворені в результаті мікрочастинки мають сферичну форму і розмір кілька мікрон (мікрометрів?). Мікрофотографії таких частинок, отримані за допомогою скануючого електронного мікроскопа, представлені на малюнку 1. На фотографії можна бачити внутрішню канало-подібну структуру частинок. Формування такого роду архітектури викликано специфічним процесом зростання частинок [21].
/ PLL ) 3 , в качестве агента для растворения CaCO 3 матрицы, была использована ЭДТА (рН 7,0). Для отримання мікросфер (Alg / PLL) 3, в якості агента для розчинення CaCO 3 матриці, була використана ЕДТА (рН 7,0). Використання CaCO 3 часток дозволяє проводити процес микрокапсулирование у фізіологічно оптимальних значеннях рН, що особливо важливо для іммобілізації БАР, зокрема - білків. в силу отрицательного заряда CaCO 3 микрочастиц ( ξ- потенциал поверхности составил –12,2±2,5 мВ). Першим ПЕ наносився Alg чинності негативного заряду CaCO 3 мікрочастинок (ξ-потенціал поверхні склав -12,2 ± 2,5 мВ). У процесі послідовної адсорбції макромолекули ПЕ проникають в пори CaCO 3 мікрочастинок, так як розмір пор (30-90 нм) у кілька разів більше розміру макромолекул ПЕ. Таким чином, у внутрішніх каналах мікрочастинок відбувається формування інтерполіелектролітного комплексу. Після розчинення CaCO 3 матриці ПЕ комплекс залишається стабільним [21].
Розмір мікросфер у розчині відповідав розміру вихідної матриці - CaCO 3 мікрочастинок. Даний факт підтверджується спостереженнями за мікрочастинками в процесі видалення карбонатної матриці (оптична мікроскопія). На малюнку 2 представлені фотографії CaCO 3 мікрочастинок (А) і ПЕ мікросфер, отриманих на їх основі (Б). Збереження мікросферами форми і розміру, використаних для їх отримання матриць, говорить про надання поліелектролітний «каркасом» істотної міцності ПЕ мікросфера, в тому числі по відношенню до осмотичного тиску, що виникає при розчиненні твердої CaCO 3 матриці. Це особливо цінно, так як «осмотичний шок» при розчиненні матриці, покритої оболонкою з ПЕ комплексу, викликає збільшення розміру утворюються мікросфер, що складаються з ПЕ оболонки, або навіть деформацію і руйнування таких ПЕ мікрокапсул [22].
Відомо, що адсорбція білків з розчину на твердій поверхні є результатом кількох основних процесів [23]: а) електростатичної взаємодії між білком і поверхнею, б) взаємодії між молекулами білків; в) зміни структури білка. Таким чином, контакт білка з твердою поверхнею визначається як міжмолекулярними, так і внутрішньомолекулярними силами.
У процесі отримання мікрокапсул наносилося по 3 шару кожного ПЕ, вихідна концентрація ХТР становила 5 мг / мл і 10 мг / мл. Аналіз отриманих результатів показав, що відсоток сорбції на 100 мг частинок при початковій концентрації 5 мг / мл склав 80% (4 мг / мл ХТР), 10 мг / мл - 41% (4,1 мг / мл ХТР). ? Включення ХТР в CaCO 3 мікрочастинки проводили методом адсорбції в порах (АП). Про рівномірному розподілі ферменту ....
2. Вивчення активності іммобілізованого ХТР і біодеградації мікрокапсул
Іммобілізований в ПЕ мікрокапсули, ХТР практично повністю зберігає свою активність (86 ± 9% в порівнянні з нативним ферментом). Дані, отримані в результаті порівняння гідролізу субстрату нативним ХТР і ХТР, включеним в ПЕ мікрокапсули, представлені у вигляді графіка на малюнку 3. Зміна оптичної щільності в часі зумовлено накопиченням продукту ферментативного гідролізу. Отримані дані дозволяють зробити наступні висновки: а) в процесі гідролізу відсутні стеричні утруднення при дифузії субстрату через оболонку до молекул іммобілізованого ХТР, б) рівномірний розподіл ферменту в частинках при адсорбції, сприяє практично повного гідролізу субстрату молекулами ХТР, в) при іммобілізації не відбувається зміни конформації активного центру молекул ферменту.
Комлексообразованіе ферментів з ПЕ призводить до зниження активність або не впливає, яке залежить від природи реагуючих речовин та умов. Так, автори роботи [16] по іммобілізації лактатдегідрогенази в сітку ПЕ комплексу, відзначають семикратне падіння активності іммобілізованого ферменту. У нашому випадку, включення білків в ПЕ мікрокапсули, сприяє збереженню їх активності та отримання стабільних при зберіганні препаратів.
З метою вивчення проникності оболонок до дії протеолітичних ферментів було досліджено вплив розчинів ТР на ПЕ мікрокапсули. Як відомо, ТР входить до складу секрету підшлункової залози і є ендопептидаз, тобто він розщеплює пептидні зв'язки, утворені основними амінокислотами, такими, як лізин [24]. Були використані такі концентрації ТР: 0,05%, 0,1% і 0,2%. Результати показали, що мікрокапсули розчинилися протягом години (оптична мікроскопія). З метою докази збереження активності ХТР, після біодеградації мікрокапсул був проведений гідроліз субстрату отриманими розчинами. Спектрофотометричне вивчення показало, що ХТР зберіг активність після руйнування ТР. Результати цього дослідження представлені на малюнку 4. Приріст оптичної щільності, обумовлений накопиченням продукту ферментативного гідролізу, свідчить про збереження активності ХТР після руйнування ПЕ мікрокапсул.
ВИСНОВОК
Проведені експерименти дозволяють зробити висновок, що в якості вихідної матриці для отримання ПЕ мікрокапсул, що містять ХТР, найбільш прийнятними є CaCO 3 мікрочастинки. Використання останніх дозволяє проводити процес микрокапсулирование у фізіологічно оптимальних значеннях рН на всіх етапах. Це відкриває великі можливості для іммобілізації широкого спектру білків із збереженням їх активності. Крім того, при розчиненні твердої CaCO 3 матриці, мікросфери зберігають розмір і форму, що свідчить про їх істотною міцності, в тому числі по відношенню до осмотичного тиску. Отримані мікрочастинки з вузьким розподілом за розмірами (3-5 мкм) мають пористу структуру, що дозволяє іммобілізувати на їх основі різні білки методомі фізичної сорбції. Високий вміст по білку (80% у випадку вихідної концентрації ХТР 5 мг / мл), а також біосумісність і біодеградація отриманих ПЕ мікросфер, дозволяють використовувати їх в якості систем доставки включеного препарату.
Експериментальні дані, отримані при вивченні активності іммобілізованого ХТР, свідчать про відсутність стеричних утруднень при дифузії субстрату до молекул ферменту, рівномірному розподілі білка в частинках при адсорбції, збереженні конформації молекул ферменту при іммобілізації. Результати дозволяють зробити висновок про збереження активності та отриманні стабільних при зберіганні препаратів БАР, включених в ПЕ мікрокапсули.
и Alg на CaCO 3 микрочастицах, под действием фермента поджелудочной железы – ТР, открывает широкие возможности использования полученных препаратов в медицинской биотехнологии. Руйнування мікрокапсул, отриманих послідовної адсорбцією PLL і Alg на CaCO 3 мікрочастинках, під дією ферменту підшлункової залози - ТР, відкриває широкі можливості використання отриманих препаратів в медичній біотехнології. Використання природних і біодеградіруемих ПЕ дозволить створити мікрокапсули, що володіють такими властивостями, як виборча проникність, контрольована доставка і вивільнення ув'язнених у них БАР, біодеградація, біосумісність, що дозволить розширити тим самим область їх потенційного застосування.
Отримані результати будуть використані у подальшій роботі з дослідження моделі поведінки мікрокапсул при переході через біологічні бар'єри для забезпечення адресної доставки БАР до окремих органів і клітин-мішеней.
ЛІТЕРАТУРА
1. Kraut J., (1967) Serine proteases: structure and mechanism of catalysis, Ann. . Biochem , 242(24) : 5777-5781. Rev. Biochem, 242 (24): 5777-5781.
2. Машковский М.Д,. (1993) Лікарські засоби, М., Медицина, 2: 685.
3. Arshady R., (1999) Microspheres. Microcapsules & Liposomes, London, 1.2.
4. Lvov YM, Sukhorukov GB, (1997) Protein architecture: Assembly of ordered films by means alternated adsorption of opposite charged macromolecules, Membr. . Biol ., 11 , 277-303. Cell. Biol., 11, 277-303.
5. Кабанов В.А., Зезина А.Б, (1984) Водорозчинні нестехіометричних поліелектролітний комплекси - новий клас синтетичних поліелектролітів, Підсумки науки і техніки, М.,. Сер. Органічна хімія, 5: 131-189.
6. Кабанов В.А, (1994) Фізико-хімічні основи і перспективи застосування розчинних інтерполіелектролітних комплексів, Високомолекулярні сполуки, 36 (2): 183-197.
7. Mayya S., Schoeler B., Caruso F., (2003) Preparation and organization of nanoscale polyalactrolyte-coated gold nanoparticles, Adv. Funct. Mater., 13 (3): 183-188.
8. Shenoy DB, Antipov AA, Sukhorukov GB, Mohwald H., (2003) Layer-by-Layer Engineering of Biocompatible, Decomposable Core-Shell Structures, Biomacromolecules, 4 (2): 265-272.
9. Qiu XP, Leporatti S., Donath E., Mohwald H., (2001) Studies on the drug release properties of polysaccharide multilayers encapsulated ibuprofen microparticles, Langmuir, 17 (17): 5375-5380.
10. Sukhorukov GB, Donath E., Davis S., Lichtenfeld H., Caruso F., Popov VI, Mohwald H., (1998) Stepwise polyalectrolyte assembly on particles surface: a novel approach to colloid design, Polym. Adv. Technol., 9 (10-11): 759-767.
11. Sukhorukov GB, Donath E., Lichtenfeld H., Knippel E., Knippel M., Budde A., Mohwald H., (1998) Layer-by-Layer self assembly of polyelectrolytes on colloidal particles, Colloid. Surf.: Physicochem. Ang. Aspects, 137 (1-3): 253-266.
12. Antipov AA, Shchukin D., Fedutik Y., Petrov AI, Sukhorukov GB, Mohwald H., (2003) Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication, Colloid. Surf.: Physicochem. Ang. Aspects, 224: 175-184.
13. Caruso F., Yang WJ, Trau D., Renneberg R., (2000) Microencapsulating of uncharged low molecular weight materials by polyelectrolyte multilayer self-assembly, Langmuir, 16 (23): 8932-8936.
14. Antipov AA, Sukhorukov GB, Donath E., Mohwald H., (2001) Sustained release properties of polyelecyrolyte multiplayer capsules, J. Phys. Chem. B, 105 (12): 2281-2284.
15. Donath E., Sukhorukov GB, Mohwald H., (1999) Submicrometric and micrometric polyelectrolyte capsules, Nachrichten Aus Chemie Technik Und Laboratorium, 47 (4): 400-405.
16. Бобрешова М, Сухоруков Г.Б., Сабурова Е.А., Єлфімова Л.І., Шабарчіна Л.І., Сухоруков Б.І. (1999) Лактатдегідрогеназа в інтерполіелектролітном комплексі. Функція і стабільність, Біофізика, 44 (5): 813-820.
17. Trubetskoy VS, Loomis A., Hangstrom JE, Budker VG, Wolff JA, (1999) Layer-by-Layer deposition of oppositely charged polyelectrolytes on the surface of condensed DNA particles, Nucl. Acid Res., 27 (15): 3090-3095.
18. Sukhorukov GB, Donath E., Moy S., Susha AS, (2000) Microencapsulation by means of step-wise adsorbtion of polyelectrolytes, Microencapsulation, 17 (2): 177-185.
19. Berth G., Voigt A., Dautzenberg H., Donath E., Mohwald H., (2002) Polyelectrolyte complex and layer-by-layer capsules from chitosan / chitosan sulfate, Biomacromolecules, 3 (3): 579-590.
20. Balabushevitch NG, Tiorina OP, Volodkin DV, Larionova NI, Sukhorukov GB, (2003) Loading the Multilayer Dextran Sulfate / Protamine Microsized Capsules with Peroxidase, Biomacromolecules, 4 (5): 1191-1197.
21. Volodkin DV, Petrov AI, Prevot M., Sukhorukov GB, (2004) Matrix Polyelectrolyte Microcapsules: New System for Mocromolecule Encapsulation, Langmuir, 20: 3398-3406.
22. Gao C., Leporatti S., Moya S., Donath E., Mohwald H., (2001) Stability and Mechanical Properties of Polyelectrolyte Capsules Obtained by Stepwise Assembly of Poly (styrenesulfonate sodium salt) and Poly (diallyldimethyl ammonium) Chloride onto Melamine Resin Particles, Langmuir, 17: 3491-3495.
23. Haynes CA, Norde W., (1994) Globular proteins at solid / liquid interfaces, Colloid Surf. , 2 : 517-566. B, 2: 517-566.
24. Кольіан Я., Рем К.-Г., (1998) Наочна біохімія, М., Мир, 262-263.