Дейтерій - мічений l-фенілаланін продукується штамом Brevibacterium methylicum для медичної

Дейтерій - мічених L-фенілаланін, Віднайдені ШТАМІВ Brevibacterium methylicum ДЛЯ МЕДИЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ.

О. В. Мосіна

Московська державна академія тонкої хімічної технології ім. М.В. Ломоносова, 117571, м. Москва, просп. Вернадського, д.86.

Представлені дані по біосинтезу ^[2 H _6] - L-фенілаланіну, що продукується екзогенно штамом факультативних метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum, здатного асимілювати метанол (або його дейтерій-мічений аналог) як джерело вуглецю та енергії. Мікробну біоконверсії C ² H ₃ O ² H проводили на мінімальній середовищі, що містить 98 об.% ² Н ₂ O. Вихід L-фенілаланіну при цьому склав 1 г / л. Аналіз ступеня дейтерірованності L-фенілаланіну проводили методом мас-спектрометрії електронного удару після препаративного поділу методом обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) у вигляді метилового ефіру данс - фенілаланіну і карбобензоксі-фенілаланіну. Згідно з отриманими даними, ступінь ізотопного включення дейтерію в фенілаланін склала 75%, що свідчить про високу ефективність мічення L-фенілаланіну в цих умовах. Отриманий ^[2 H _6] - фенілаланін може бути використаний для діагностики спадкової фенілкетонурії.

ВСТУП

Метод мічення стабільними ізотопами є ключовим напрямком у різнопрофільних біомедичних дослідженнях з використанням амінокислот та інших біологічно активних сполук (БАС) [1, 2]. Тенденції до кращого застосування стабільних ізотопів по-порівнянні з радіоактивними аналогами обумовлені відсутністю радіаційної небезпеки і можливістю визначення локалізації мітки в молекулі методами високого дозволу, включаючи спектроскопію ядерного магнітного резонансу (ЯМР) [3], інфрачервону [4] і лазерну спектроскопію [5] і мас-спектрометрії (МС) [6]. Розвиток цих методів детекції стабільних ізотопів за останні роки дозволило значно удосконалити проведення численних біологічних досліджень за участю амінокислот de novo, а також вивчати їх метаболізм, механізм дії, внутрішньоклітинний транспорт і т.п. [7,8]. Амінокислоти, мічені стабільними ізотопами ² Н, ¹³ С, ¹⁵ N широко застосовуються як в лікарській практиці і в медичній діагностиці, так і в біохімічних дослідженнях різноманітного характеру [9, 10], а також в хімічних синтезах широкого кола ізотопно - мічених сполук на їх основі, наприклад, мічений L-фенілаланін в синтезах пептидних гормонів і нейротрансмітерів [11]. Ізотопно-мічені аналоги L-фенілаланіну знаходять все більше застосування в діагностичних цілях, наприклад, для виявлення спадкової фенілкетонурії та інших захворювань, пов'язаних з порушенням метаболізму амінокислот в організмі [12].

В даний час біотехнологічний потенціал метилотрофних бактерій для отримання амінокислот, мічених дейтерієм загальновизнаний [13]. Традиційним підходом при цьому є культивування штамів - продуцентів на середовищах, що містять З ² Н ₃ О ² Н і ² Н ₂ О з наступним фракціонуванням культуральної рідини. Раннє нами була вивчена можливість використання штаму факультативних метилотрофних бактерій B. methylicum для отримання фенілаланіну [14-15]. На відміну від традиційних штамів-продуцентів фенілаланіну, у яких порушені активності префенатдегідратази або дезоксиарабиногептулозофосфатсинтетазы, унікальність цього штаму полягає в тому, що для біосинтезу L-фенілаланіну необхідний L-лейцин.

Метою даної роботи було вивчення принципової можливості отримання дейтерированного L-фенілаланіну з високим ступенем ізотопного збагачення за рахунок використання штаму факультативних метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum.

УМОВИ ЕКСПЕРИМЕНТУ.

Бактеріальні штами. Дослідження проводили з L-лейцин-залежним штамом факультативних метилотрофних бактерій B. methylicum, продуцентом L-фенілаланіну. Штам був отриманий з колекції культур Всеросійської колекції промислових мікроорганізмів (ВКПМ) Державного науково-дослідного інституту генетики та селекції промислових мікроорганізмів.

У роботі використовували ² Н ₂ O (99,9% ² Н), С ² Н ₃ О ² Н (97,5% ² Н), отримані з Російського науково-дослідного центру "Ізотоп" (Санкт-Петербург, РФ), а також N-діметіламінонафталін-5-сульфохлорид (дансілхлорід) (Sigma, CША). Для отримання похідних амінокислот використовували N-діметіламінонафталін-5-сульфохлорид (дансілхлорід) (Sigma, CША), карбобензоксіхлорід (хімзавод ім. Войкова) і діазометан. Діазометан отримували з N-нітрозометілмочевіни (Мerck, Німеччина).

Умови адаптації. Адаптацію штаму до дейтерію проводили на агаризованих середовищах (2%-ний агар), що містять важку воду. При цьому використовували розсівання культур до окремих колоній на середовищах, що містять східчасто збільшуються концентрації важкої води [9].

Культивування бактерій проводили на мінеральному середовищі М9 [16], як описано в роботі [9].

Отримання дансіламінокіслот культуральної рідини. До 200 мг ліофілізованих препаратів культуральної рідини в 5 мл 2 м. NaHCO ₃ (2 10 ^-3 моль) рН 9-10 дробовими порціями при перемішуванні додавали 320 мг (1,2 10 ^-3 моль) дансілхлоріда в 5 мл ацетону. Реакційну суміш витримували при перемішуванні при 40 ⁰ С протягом години, потім підкисляють 2 м. розчином HCL до рН 3,0 і екстрагували етилацетатом (3 рази по 5 мл). Об'єднаний екстракт промивали водою до значення рН 7,0, сушили безводним сульфатом натрію, розчинник видаляли при 10 мм. рт. ст.

Дансіламінокіслоти у складі білкових гідролізатів B. methylicum отримували як описано в роботі [9].

Отримання метилових ефірів дансіламінокіслот. До 20 мл 40%-ного КОН у 40 мл ефіру додавали 3 г вологою нітрозометілмочевіни і перемішували на водяній бані з льодом протягом 15-20 хв. Після інтенсивного газовиділення ефірний шар відокремлювали і промивали крижаною водою до рН 7,0, сушили безводним NaSO ₄ і обробляли їм препарати дансілпроізводних амінокислот у складі культуральної рідини і гідролізатів білка біомаси.

Аналітичне та препаративної поділ Dns-Phe-OMe проводили методом обернено-фазової ВЕРХ на рідинному хроматографі "Knauer" (ФРН), обладнаним насосом "Knauer", УФ-детектором "2563" і інтегратором "С-R 3A" (Shimadzy, Японія). Використовували нерухому фазу: Separon SGX C 18, 7 мкм, 150 x 3,3 мм (Kova, Чехословаччина). Елюювання проводили в системі розчинників: (А) - ацетонітрил-трифторуксусной кислота (20:80 об / об) і (В) - ацетонітрил. Використовували градієнтне елюювання: від 20% В до 100% У протягом 30 хв, при 100% У протягом 5 хв, від 100% В до 20% У протягом 2 хв, при 20% У протягом 10 хв.

Кількісне визначення L-фенілаланіну в культуральній рідині проводили на приладі "Beckman DU-6" (США) при 540 нм, після обробки препаратів культуральної рідини нінгідрином.

Мас-спектри електронного удару отримані на приладі "MB-80A" (Hitachi, Японія) при енергії іонізуючих електронів 70 еВ.

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ.

Отримання дейтерій-міченого ^[2 H _6] - L-фенілаланіну і мас-спектрометричний аналіз. Як відомо, більшість мікроорганізмів, поширених в природі не можуть служити хорошими продуцентами амінокислот, внаслідок наявності ефективних механізмів регуляції біосинтезу цих сполук у клітині, хоча ця здатність проявляється у ряду їх мутантних форм [17]. Активними мікробними продуцентами L-фенілаланіну є, як правило, мутанти, у яких знято негативний контроль з боку таких ключових ферментів біосинтезу цієї амінокислоти, як префенатдегідратаза і дезоксиарабиногептулозофосфатсинтетаза (рис.1) [18, 19].

Певний інтерес у зв'язку з цим становить дослідження здатності продукувати L-фенілаланін лейцінзавісімим метилотрофних мутантом B. methylicum, досить зручним, хоча і маловивченим об'єктом для біотехнологічного використання. Тому початковий етап біохімічних досліджень зі штамом метилотрофних бактерій B. methylicum був пов'язаний з отриманням ауксотрофних мутантів, для яких у більшості випадках характерні обмежений спектр мутантних фенотипів і крім того досить високий рівень реверсі [20]. Вихідний L-лейцінзавісімий штам B. methylicum, продуцент L-фенілаланіну був відібраний в лабораторії генетики метілотрофов "ДержНДІ генетики та селекції промислових мікроорганізмів" на попередньому етапі роботи після обробки батьківського штаму нітрозогуанідіном. Скринінг потрібних клонів проводили за ознакою стійкості до аналогу фенілаланіну - метафторфенілаланіну (50 мкг / мл). Виділені на селективних середовищах аналогорезістентние мутанти конвертували метанол і накопичували при цьому фенілаланін в ферментаційної середовищі. Порівняльні аналізи (ТШХ, МС) показали, що фенілаланін, що продукується даним штамом метилотрофних бактерій повністю ідентичний природному L-фенілаланіну.

З метою збільшення ефективності ізотопного мічення L-фенілаланіну та інтенсифікації росту бактерій на повністю дейтерированного середовищі ми адаптували отриманий мутант B. methylicum до зростання і біосинтезу в повністю дейтерированного середовищах. До даного штаму метилотрофних бактерій був застосований спеціальний підхід щодо адаптації (таблиця), який полягав у серії з п'яти адаптаційних пасажів вихідної культури на агаризованих середовищах (з добавкою 2 об.% C ² HO ² H) при ступінчастому збільшенні концентрації важкої води в них ( від 0; ​​24,5; 49,0; 73,5 про% до 98 об% ² Н ₂ О). При цьому послідовно відбирали окремі колонії, які виросли на середовищах, що містять дейтерій. Потім їх пересівали на середовища з більшим ступенем дейтерірованності, включаючи середовище з 98 об.% ² Н ₂ О (ступінь виживання бактерій на кінцевій повністю дейтерированного середовищі склала 40%).

Таблиця. Ізотопний склад ростових середовищ і біосинтетичні характеристики B. methylicum

Криві, що відображають динаміки зростання вихідного і адаптованого до ² Н ₂ О штаму B. methylicum і максимального рівня накопичення L-фенілаланіну в культуральній рідині на мінімальних середовищах з добавкою 2 об.% СН ₃ ОН / С ² Н ₃ О ² Н і 98 об.% ² Н ₂ О представлені на рис. 2.

Вихід біомаси, час клітинної генерації і максимальний рівень накопичення L-фенілаланіну в культуральній рідині вихідним мутантом (б) і мутантом, адаптованим до високого вмісту дейтерію в середовищі (в) на середовищах, максимально насичених дейтерієм, наведені в гістограмі щодо контрольного мікроорганізму на протоновану середовищі (а). Порівнювали ростові дані адаптованого до дейтерію мікроорганізму і секрецію L-фенілаланіну (б) з вихідним B. methylicum на протоновану середовищі М9 (а) і на полность дейтерированного середовищі (98 об.% ² Н ₂ О) з 2 об.% С ² Н ₃ О ² Н (б). Як видно з представлених даних, у відсутності дейтерій-мічених субстратів тривалість лаг-фази не перевищувала 24 год (рис. 2, а). Зі збільшенням концентрації ² Н ₂ О в середовищі тривалість лаг-фази збільшувалася до 64,4 год на середовищах з 98 об.% ² Н ₂ О і 2 об.% С ² Н ₃ О ² Н (рис. 2, б). Відзначено, що тривалість часу клітинної генерації зі збільшенням ступеня ізотопного насичення середовища дейтерієм поступово збільшується, досягаючи 4,9 годин на максимально дейтерированного середовищі (рис. 2, досвід б). Як видно з рис. 2, досвід б, С ² Н ₃ О ² Н не викликав суттєвого інгібування росту і не впливав на виході мікробної біомаси, в ​​той час як на середовищах з 98 об.% ² Н ₂ О мікробний зростання пригнічувався. Так, на середовищі, що містить 98 об.% ² Н ₂ О і 2 об.% С ² Н ₃ О ² Н, вихід мікробної біомаси був знижений в 3,3 рази по-порівнянні з контролем. Важливо те, що, вихід мікробної біомаси, час клітинної генерації та рівень накопичення L-фенілаланіну в культуральній рідині при зростанні адаптованого до ² H ₂ O штаму B. methylicum на середовищі, що містить 98 об.% ² Н ₂ О і 2 об.% С ² Н ₃ О ² Н змінюються незначно (гіст., досвід б).

Спільною особливістю біосинтезу L-фенілаланіну було значне збільшення його продукції на ранній фазі експоненціального зростання B. methylicum, коли вихід мікробної біомаси був незначний (рис. 3). У всіх експериментах спостерігалося пригнічення біосинтезу фенілаланіну на пізній фазі експоненціального зростання і зниження його концентрації в ростових середовищах. Згідно даним по мікроскопічному дослідженню зростання популяції мікроорганізмів, подібний характер динаміки секреції фенілаланіну не корелював з якісними змінами ростових характеристик культури на різних стадіях росту, що служило підтвердженням морфологічної однорідності мікробної популяції. Ми припустили, що накопичений в процесі росту фенілаланін ингибировал ферменти власного шляху біосинтезу. Крім того, ми не виключаємо можливість, що при ферментації без рН-статірованія може відбуватися зворотне перетворення екзогенного фенілаланіну в інтермедіаторние з'єднання його біосинтезу [21]. При обговоренні механізму біосинтезу L-фенілаланіну слід зазначити, що він синтезується в клітинах мікроорганізмів з префеновой кислоти, яка через стадію утворення фенілпірувата перетворюється на фенілаланін під дією клітинних трансаміназ [22] (схема 1). Дані тонкошарової хроматографії (ТШХ) і мас-спектрометричного аналізу культуральної рідини показали, що крім L-фенілаланіну даний штам B. methylicum синтезує і накопичує екзогенно інші амінокислоти: аланін, валін, лейцин, ізолейцин.

Ефективність використання дансільних і Z-похідних амінокислот для мас-спектрометричних досліджень було показано раннє [10, 16]. У даній роботі рівні включення ізотопу ² Н в L-фенілаланін у складі культуральної рідини визначали методом мас-спектрометрії електронного удару метилового ефіру данс-фенілаланіну або у вигляді Z-похідного фенілаланіну після їх препаративного поділу методом обернено-фазової ВЕРХ.

Похідні амінокислот при цьому отримували прямий обробкою препаратів культуральної рідини дансілхлорідом (DnsCl) або карбобензоксіхлорідом (Zcl). Реакцію проводили в лужному середовищі у водно-органічному розчиннику в співвідношенні карбобензоксіхлорід (дансілхлорід)-амінокислота, рівним 2:1. Летючість дансілпроізводних амінокислот при мас-спектрометричного аналізу підвищували за рахунок додаткової деріватізаціі по карбоксильної групи (етерифікації) діазометаном. Вибір діазометана як етеріфіцірующего реагенту був обумовлений необхідністю проведення реакції в м'яких умовах, що виключають ізотопний ^{(1 Н-2} Н) обмін в ароматичних амінокислотах.

Як приклад на малюнку показано фрагментація метилового ефіру дансілфенілаланіна при електронному ударі. У мас-спектрах цього похідного, як правило, чітко детектується пік молекулярного іона метилового ефіру дансілфенілаланіна М +. з m / z 412. Пік амінного фрагмента А має невисоку інтенсивність, а пік аміноацільного фрагмента У вкрай низьку або взагалі відсутній (див. рис. 1). Крім вищеозначених піків, в мас-спектрах електронного удару Dns-Phe-OMe фіксуються піки з масовим числом m / z 250, 234, 170, які відповідають дансільному фрагменту і продуктів його розпаду до N-діметіламінонафталіна.

Мас-спектр фенілаланіну, виділений з культуральної рідини, що містить 98 об.% ² Н ₂ О зображений на рис. 4, б (спектр наведено щодо контрольних умов (а), де використовували звичайну воду і метанол). З рис.2, б видно, що величина піку молекулярного іона похідного фенілаланіну (М +. З m / z 418,0) збільшується в порівнянні з контрольними умовами (М +. З m / z 412,0) на 6 одиниць, що становить 75% від загальної кількості атомів водню в молекулі. Очевидно, що вишеобозначенние атоми дейтерію включилися в молекулу фенілаланіну за рахунок процесу біосинтезу de novo, тобто з вуглецевого скелету молекули, так як малоймовірно, що вони замістити в в ході виділення амінокислоти з культуральної рідини або при хімічній модифікації фенілаланіну (протони (дейтерони ) при гетероатома в NH ₂ -, і-COOH групах фенілаланіну за рахунок легкості дисоціації не враховувалися). Пік з m / z 432, зафіксований в мас-спектрі культуральної рідини (рис.4, б) найімовірніше відповідає продукту додаткового метилювання фенілаланіну по а-NH ₂ - групі. У мас-спектрі фіксується пік збагаченого дейтерієм бензильного фрагмента з m / z 97 (замість 91 у контролі), що вказує на те, що місцями локалізації атомів дейтерію в молекулі фенілаланіну є положення С1-С6 ароматичних атомів і суміжну з ними положення при вуглецевому атомі b. Причому, як мініум чотири з них можуть бути локалізовані в самому бензольному кільці молекули фенілаланіну. Отриманий результат за ступенем дейтерірованності фенілаланіну важливий для його використання в медичній діагностиці, де необхідно застосовувати сполуки з високими ступенями ізотопного збагачення.

Таким чином, в результаті нескладного селекційного підходу вдалося отримати штам факультативних метилотрофних бактерій B. methylicum, адаптований до високого вмісту ² Н ₂ О в ростовий середовищі. Перевагами даного штаму для отримання ^[2 H _{6]-фенілаланіну} є поліпшені ростові і біосинтетичні здатності цього метілотрофа на максимально дейтерированного середовищі. За рахунок використання штаму B. methylicum вдалося отримати близько 1 грама ^[2 H _{6]-фенілаланіну} з 1 л культуральної рідини (фенілаланін був також виділено з культуральної рідини B. methylicum методом обернено-фазової ВЕРХ у вигляді метилового ефіру данс-L-фенілаланіну зі ступенем хроматографічної чистоти 99% і виходом 89%). На закінчення слід зазначити, що більш висока ефективність мічення фенілаланіну може бути забезпечена за рахунок повної заміни протоновані солей у складі ростової середовища на їх дейтерірование аналоги, а також використовуючи лейцин, уніформно мічений дейтерієм, який в принципі можна виділяти з гідролізатів сумарних білків біомаси даного мікроорганізму .