Біологічна активність гумінової комплексу різного походження та його вплив на ріст і розвиток

Водні екстракти біогумусу отримували додаванням до 20 г сухих зразків вермикомпосту і контрольного зразка (компосту) 100 мл 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,6). Екстракцію проводили при перемішуванні магнітною мішалкою і кімнатній температурі. Ш Германия). Отримані суспензії центрифугували протягом 30 хв при 10000 об / хв (центрифуга - Т-24, ML Ш Німеччина). У супернатантах визначали вміст розчинних речовин.

Спиртові екстракти отримували так само як описано вище, для водної екстракції. Зміст екстрагованих речовин визначали методом висушування до постійної ваги.

Протеолітичну активність екстрактів досліджували по відношенню до гемоглобіну, розчиненому в 50 мМ фосфатному буфері (рН 7,6). Оптичну щільність супернатант інкубіруемой суміші вимірювали спектрофотометрично.

Амилолитические активність екстрактів досліджували по відношенню до 1% суспензії картопляного крохмалю в 50 мМ фосфатному буфері з рН 7,6. Методика заснована на визначенні змісту редукуючих груп шляхом окислення карбонільної групи моно-, ді-, оліго-і полісахаридів до карбоксильної 3,5 - дінітросаліціловой кислотою, що призводить до переходу забарвлення від жовтої до червоно-бурого.

Виділення гумінових кислот та фульвокислот. раствором HCl , затем перемешивали на магнитной мешалке и центрифугировали. Навіски зразків для видалення солей і карбоксігідратов обробляли 0,1 N розчином HCl, потім перемішували на магнітній мішалці і центрифугували. З отриманих опадів методом лужної екстракції витягували гумінові кислоти та фульвокислоти. Процедура екстракції була проведена 11 разів. Повнота екстракції контролювалася методу ВЕРХ.

Виділення гіматомеланових кислот. раствора NaOH при перемешивании магнитной мешалкой. Зважені препарати гумінових кислот поміщали в Віал і розчиняли в мінімальному обсязі 1 N розчину NaOH при перемішуванні магнітною мішалкою. Після повного розчинення проводили спиртову екстракцію (метанол, етанол і пропанол) протягом 12 годин під аргоном. Отримані суспензії центрифугували, супернатант поміщали в Віал. раствор NaOH ). Концентрацію ГМК в розчині визначали методом висушування до постійної ваги за вирахуванням сухої ваги висушеного розчинника (спирт з 0,1 N розчин NaOH). При дослідженнях методом ВЕРХ використовували розчини ГМК з концентрацією 1 мг / мл.

Всі використовувані реактиви мали марку "х.ч." і "ч.д.а.".

Хроматографічні дослідження гумінових кислот проводили на хроматографі "Gilson", оснащеним комп'ютером з програмою прийому і обробки хроматографічних даних. Збір та обробка хроматографічних даних здійснюється через програму Мультіхром або Gilson Unipoint. Вимірювання проводили в ізократіческом, градієнтному і обращеннофазовом режимах. Детектування хроматографічних піків здійснювалося УФ-детектором при 220 і 280 нм. 8 (250 x 4,6 мм; 5 мкм); Macrosphere RP 300 C 8 (250 x 4,6 мм; 5 мкм); Platinum EPS C 18 (250 x 4,6 мм; 5 мкм). Для хроматографування використовували такі колонки: Alltima C 8 (250 x 4,6 мм, 5 мкм); Macrosphere RP 300 C 8 (250 x 4,6 мм, 5 мкм); Platinum EPS C 18 (250 x 4,6 мм; 5 мкм). Всі використовувані реактиви мали марку "Для ВЕРХ".

-75 с непрерывной автоматической регистрацией оптической плотности элюата в проточной кварцевой кювете, колонка TSK G 4000 SW (8 x 300 мм). Дослідження екстрактів біогумусу проводили методом гель-фільтрації на гелі сефадекса G -75 з безперервною автоматичною реєстрацією оптичної щільності елюата в проточній кварцовою кюветі, колонка TSK G 4000 SW (8 x 300 мм). Обсяг аліквотах розчину 100 мкл, швидкість елюювання 0,4 мл / хв. Як елюента використовували 50 мМ фосфатний буфер з рН 7,6. Детектування піків хроматограм здійснювали при 254 нм.

6890 N ", оснащенном масс-спектрометрическим детектором " Agilent 5973 N " и капиллярной колонкой HP – 5 MS 0,25mm × 30m × 0,25 mm . Визначення жирнокислотного складу компостів і вермикомпосту проводилося методом газорідинної хроматографії на хроматографі "Agilent 6890 N", оснащеному мас-спектрометричним детектором "Agilent 5973 N" і капілярної колонкою HP - 5 MS 0,25 mm × 30m × 0,25 mm. . Ідентифікацію жирних кислот проводили за допомогою комп'ютерного пошуку (РВМ) і бібліотеки мас-спектрів Wiley.

/ VIS ( Carl Zeiss , Jena , Германия). Specord сканирующий UV / VIS спектрофотометр, работающий как автономное устройство со встроенным микропроцессором и в системе с внешним компьютером. Спектроскопічні вимірювання проводили на спектрофотометрі Specord UV / VIS (Carl Zeiss, Jena, Німеччина). Specord скануючий UV / VIS спектрофотометр, що працює як автономний пристрій з вбудованим мікропроцесором і в системі з зовнішнім комп'ютером. Діапазон довжин хвиль 190 - 1100 нм, відповідає вимогам стандарту DAB.

Для спектрофотометричного аналізу використовували фотометр фотоелектричний КФК-3-01.

200 при резонансной частоте 50,3 МГц, с использованием cross -поляризации, magic angle spinning техники c spinning speed 6,8 кГц. Спектри ЯМР реєструвалися на твердофазній ЯМР-спектрометрі Bruker DSX 200 при резонансній частоті 50,3 МГц, з використанням cross-поляризації, magic angle spinning техніки c spinning speed 6,8 кГц. 400 мсек. Контактна час 1 мсек, pulse delay 400 мсек.

Мікроколоріметріческіе дослідження гумусових кислот проводили на адіабатно скануючому мікроколоріметре ДАСМ-4А (інститут біологічного приладобудування РАН, м. Пущино Московської області, Росія) з об'ємом робочої осередку 0,4672 см ^3. У кожному експерименті шкалу теплоємності калібрували по ефекту Джоуля-Ленца. Діапазон сканування температур від 20 до 120 º С, швидкість нагріву - 2 º С / хв. Концентрація ГВ в розчинах становила 8 мг / мл в 0,1 М фосфатному буфері, що містить 0,4 М хлорид натрію з рН 7,7, гумінових кислот - 6 мг / мл.

Витяг біологічно активних речовин з біогумусу і компосту (контроль) проводили методом екстракції. Вихід активної речовини становив 3,25 мг на 1 кг біогумусу. Приготований препарат гумінової комплексу вважали як розчин 1:1. Далі готували випробовувані розчини розведенням дистильованою водою до концентрацій 1,5 · 10 ^-2, 1,5 · 10 ^-3, 1,5 · 10 ^-4%.

Для визначення каталази в рослинах була використана методика А.І. Єрмакова з модифікаціями (1987).

При визначенні пероксидазної активності рослин використовували колориметричний метод Бояркіна О.М. з модифікаціями (1981). Метод заснований на визначенні швидкості реакції окислення бензидину до утворення синього продукту окислення певної концентрації, заздалегідь встановлюється на фотоелектроколориметри. Вимірювання проводили з використанням червоного світлофільтру при довжині хвилі λ = 590 нм.

. N ., Ries S . K ., 1977; Гринблат А.И., 2007). Для визначення активності супероксиддисмутази (СОД) застосовувалася модифікована методика з використанням фотореактора (GiannopolitiesC. N., Ries S. K., 1977; Гринблат А.І., 2007).

Для лабораторних досліджень біологічної активності гумінової комплексу використовували сорти гороху, які мають цінними господарськими ознаками, але різним ступенем сприйнятливості до хвороб і шкідників: горох "Норд" на зерно (ГНУ ВНІІЗБК, 1992), горох "Орпела" (ГНУ ВНІІЗБК, 1994).

Для польових досліджень впливу розчинів гумінової комплексу на ураженість хворобами і шкідниками, продуктивність і врожайність використовувався наступні сорти сільськогосподарських рослин: горох "Вега" - овочевий сорт (ГНУ ВНДІ селекції овочевих культур, 1982), горох "Наймит" (ГНУ ВНІІЗБК, 2000), картопля "Жуковський ранній" (селекція ВНДІ КХ), пшеницю сорт "Селянка".

Обробку насіння (бульб) проводили шляхом замочування протягом 2 годин в розчинах гумінової комплексу з концентраціями 1,5 · 10 ^-2, 1,5 · 10 ^-3, 1,5 · 10 ^-4%, витяжці з компосту з концентрацією 1, 5.10 ^-2% і розчині "Гумістар", приготованого промисловим способом (виробництво ВАТ МНПК "ПІК'"), з концентрацією 1,5 · 10 ^-2%. В якості контролю використовували замочування насіння в розчині дистильованої води.

Для лабораторних дослідів насіння перед використанням знезаражували 1% - ним розчином дезолона. Досліджували 7 варіантів. У 3-х варіантах використовували передпосівну обробку насіння (бульб) піддослідними розчинами, і в 3-х поєднували обробку насіння з 2-х разовим обприскуванням рослин. Площа ділянки становила 10 м ² (для гороху і пшениці), 2 м ² (для картоплі) повторність 4 - кратна. Облік поширення та розвитку хвороб проводили за методиками М.М. Кирика і В.В. Котової (1979), В.І. Попова, М.Ю. Степанової (1981). Ураженість кореневої системи гнилями визначали за 4-х бальною шкалою, поразка пятнистостями по 5-ти бальною у фазу бутонізації та цвітіння (Період масового заселення рослин шкідниками) і в фазу плодоутворення (під час масової відкладання яєць) (Котова В.В., 1986).

Досвідчений матеріал вирощували в умовах польового досвіду на ділянках площею 10 м ² в 4-х кратною повторності при нормі висіву 1,2 млн. шт. / га розміщення ділянок ріндомізірованное. Посадку картоплі виробляли за схемою: 0,3 х0, 7 м, густота стояння рослин становила 47619 шт. рослин / га.

Обробку насіння досліджуваними розчинами проводили за 1-2 дні до посіву гороху суспензійним способом, вручну. Обробку посівів проводили двічі на період бутонізації та цвітіння. Аналіз насіння, обробленого препаратами на схожість, зараженість проводили на 4-й, 7-й день після обробки згідно з методиками (Методичні вказівки по державному випробуванню фунгіцидів, антибіотиків та протруйників насіння сільськогосподарських культур, 1985). За Снопове матеріалу визначали структуру врожаю (кількість бобів і насіння на одній рослині та маса 1000 насінин) (Методика Госсортсеті, 1981).

Обробку експериментальних даних проводили методом Б.А. (1985). Доспєхова за допомогою комп'ютерної програми ехе l (1985).

3. Дослідження складу водних та спиртових екстрактів вермикомпосту

Для порівняльного дослідження фізико-хімічних властивостей та ферментативної активності екстрактів вермикомпосту був отриманий біогумус різного періоду дозрівання.

Аналіз біогумусу показав, що його хімічні властивості залежать від часу культивування (табл. 1).

Вермікомпостірованіе призводить до підвищення рН-середовища, рН наближається до нейтральної; загальний азот збільшується.

Вміст обмінного калію К ₂ О незначно знижується, а вміст Р ₂ О ₅ збільшується в міру біокомпостірованіе і знаходиться в межах величин світового стандарту. Вміст золи, навпаки, значно зростає (на 10 - 15%), що збагачує грунт необхідними макро-і мікроелементами. Ключовим показником при оцінці швидкості біоконверсії органічних відходів і ступеня зрілості вермикомпосту, за даними міжнародного стандарту, є співвідношення С / N. За нашими даними, цей показник знижується при біокомпостірованіе, що вказує на його зрілість.

Таблиця 1 Агрохімічний склад біогумусу різного періоду дозрівання

Аналіз мікробіологічних властивостей вермикомпосту показав, що це - продукт з досить стабільним мікробним спільнотою. При природній вологості (близько 74%) він характеризується певною пропорцією мікробної біомаси: 63-71% - грибний міцелій; 21-28% - спори грибів та дріжджоподібні організми; 5,6-6,7% - бактерії; 2,3-3 , 2% - міцелій актиноміцетів. На відміну від вихідного субстрату в вермикомпосту знижується частка грибного міцелію, але зростає частка функціонально-активної міцелію актиноміцетів, у групі бактерій домінують представники актиномицетного лінії; серед грибів переважають активні целлюлозоразрушающіе види, які не токсичні і не патогенні для рослин, а навпаки, мають антагоністичним ефектом по відношенню до фітопатогенних мікроорганізмів.

Дослідження грунтової мікрофлори зразків біогумусу показало (табл. 2), що амоніфікувальні активність значно підвищується в порівнянні з компостом у 2,6 та 1,8 разів відповідно, а нитрифицирующие активність знижується (від 19,2 мг на компості до 17,8 і 17 , 6 - у біогумусі).

Таблиця 2 амоніфікувальні і нитрифицирующие активність біогумусу

Встановлено, що всі зразки мають високу целлюлозоразрушающей активністю, що позитивно позначається на закріпленні азоту в органічній біомасі целлюлозорарушающіх мікроорганізмів.

Дослідження з виділення та ідентифікації грибкових спільнот в компості і вермикомпосту показали, що в компості домінують гриби родів Mucor, Fusarium, Penicilium і Trichoderma. Загальна кількість грунтових грибів становило до 60 тис / г зразка, кількість колоній роду Fusarium становило 9 - 11 тис / г зразка, що становить 15 - 18% від загальної кількості (рис. 1 (а)).

а)

б)

в)

Малюнок 1. Склад грибної мікрофлори в компості (а), біогумусі зимовому (б), біогумусі літньому (в)

У міру компостування біогумусу домінуюче становище займають гриби pода Trichoderma, витісняючи інші види, у тому числі і представників патогенного роду Fusarium (рис. 1 (б, в)). В останньому зразку налічувалося 3 - 5 тис / г зразка представників сапрофітної мікрофлори - грибів роду Penicilium, інше приходилося на колонії pода Trichoderma. Біогумус у міру дозрівання збагачується грибами - антагоністами (Trichoderma) і тим самим набуває властивостей оздоровлюючого дії.

Знання мікробіологічних властивостей і їх зв'язку з корисними і шкідливими властивостями вермикомпосту необхідні для контролю виробництва та одержання високоякісних продуктів. Методи, засновані на визначенні видового складу співтовариства компосту, ефективні для виявлення фітопатогенної мікрофлори і санітарних мікроорганізмів. Характеристики такого типу необхідні для визначення гігієнічних якостей вермикомпосту. Крім того, зміна функціональної структури мікробіологічних спільнот може бути прийнятним для визначення ступеня зрілості вермикомпосту.

Екстракцію водорозчинних речовин компостів і вермикомпосту проводили 0,1 М фосфатним буфером при рН = 7,6. Показано (рис. 2), що з субстрату, не обробленого хробаками максимально екстрагується 4 мг / мл речовини, в той час як із зразка, отриманого з січня по квітень (зимовий), екстрагується 1,6 мг / мл, а з зразка, отриманого в період з квітня по жовтень (літній) - 1,2 мг / мл.

а)

б)

Малюнок 2. Динаміка екстрагуються водорозчинних речовин (екстракція 0,1 M фосфатним буфером; pH 7,6) - а) з компосту, б) з вермикомпосту: 1 - зимовий зразок вермикомпосту, 2 - річний зразок вермикомпосту.

З вище наведених даних випливає, що не менше половини (4 / 1, 6 = 2,5; 4 / 1, 2 = 3,5) водорозчинних речовин після обробки зразків хробаками, мабуть, гуміфіціруется. Слід також відзначити, що залишилися після обробки компосту хробаками органічні речовини швидше вимиваються водою (3 год), у порівнянні з контролем (16 год). Екстракти компосту та вермикомпосту були досліджені методом гель-хроматографії. При існуючій невизначеності структури ГВ можливість створення універсальних ММ стандартів на сьогоднішній день практично виключена. У цій ситуації видається доцільним оцінити ефективність гель-хроматограми взявши до уваги розподіл в хроматографічному профілі окремих фракцій, що розрізняються за фізико-хімічними властивостями. Площі, займані максимумами, пропорційні кількісним вмістом фракцій. На малюнках 3 (а) та 3 (б) наведені гель - хроматограми для екстрактів зимового і літнього зразків вермикомпосту. Хроматограми містять по одному пику з однаковим часом утримування на колонці, що свідчить про близьких молекулярних масах речовин, що містяться в зразках. Асиметрія піків вказує на присутність двох або декількох речовин з близькою молекулярною масою.

а)

б)

Малюнок 3. Гель - хроматограмма водного екстракту біогумусу: а) зразок - зимовий, б) зразок - річний; детектування-254 нм.

На малюнку 4 наведена гель - хроматограмма для зразка компосту, не обробленого хробаками - контроль.

Час

Малюнок 4. Гель - хроматограмма водного екстракту компосту контрольного зразка, детектування - 254 нм.

Наведена хроматограмма містить, крім основного піку, додатковий пік-1, відповідний більшою молекулярною масою речовини. Цей факт говорить про те, що можлива асоціація молекул гумусових кислот і освіта в розчині статичних клубків. При різних значеннях рН конформація молекул може змінюватися внаслідок електростатичного відштовхування іонізованих карбоксильних груп, приводячи до збільшення лінійних розмірів молекул.

Збільшення частки високомолекулярної фракції в екстрактах вермикомпосту пояснюється, ймовірно, тим, що за участю черв'яків змінюється природа гумусового речовини, відбувається збагачення новоствореними гуміновими кислотами, що виникають за рахунок перетворення рослинних залишків. Крім того, посилюється мікробіологічна активність, що в свою чергу призводить до посилення процесів гуміфікації та утворення більш зрілих біотермодінаміческі стійких ГК, що мають велику молекулярну масу і забезпечують підвищення родючості грунтів.

Методом гель-фільтрації визначені молекулярні маси білків біогумусу. Молекулярна маса білка з біогумусу обчислена по нижченаведеному рівнянню:

= - 0,3829х + 2,083 исходя из К = 0,65 для белка из биогумуса. Y = - 0,3829 х + 2,083 виходячи з К = 0,65 для білка з біогумусу. Вона дорівнює »27 кДа.

Для визначення жирних кислот у препаратах екстрактів біогумусу та компосту використовували метод газорідинної хроматографії з мас-спектрометричним детектором. У таблиці 3 наведені дані жирнокислотного складу в досліджених препаратах.

Таблиця 3 Вміст жирних кислот у біогумусі

Вміст жирних кислот у контрольному зразку і зразках, оброблених хробаками, неоднаково. Вміст жирних кислот у препаратах річного зразка вище, ніж в зимовому зразку, а в препараті, не обробленому хробаками (контроль) воно найнижче. З літератури відомо, що зі зростанням гуміфікації вміст жирних кислот дійсно зростає.

Протеолітичну активність екстрактів біогумусу та компосту досліджували по відношенню до 1%-ого розчину гемоглобіну. Оптичну щільність супернатант інкубіруемой суміші гемоглобіну і екстрактів біогумусу вимірювали в 10 мм кварцових кюветах при 280 нм проти 10% розчину Тху у фосфатному буфері. / VIS ( Carl Zeiss , Jena , Германия). Вимірювання проводили на спектрофотометрі Specord UV / VIS (Carl Zeiss, Jena, Німеччина). Результати аналізу наведені на рисунку 5.

Кінетика протеаліза

а)

б)

Малюнок 5. Залежність зміни оптичної щільності розчинів Тху (10%) розчинної фракції 1% розчину гемоглобіну від часу інкубування з водними розчинами екстрактів а) компосту, б) біогумусу: 1 - зимовий зразок, 2 - річний зразок.

Визначено, що препарат біогумусу зимовий (1) має більш високу протеолітичної активністю, ніж препарат річний (2) (рис. 5 (б)). Кінетичні криві мають типову форму для кінетики ферментативних гідролітичних процесів.

Результати аналізу зразка компосту, не обробленого хробаками, наведені на малюнку 5 (а). Видно, що контрольний зразок не має протеолітичної активністю, на відміну від зимового і літнього зразків.

При дослідженні амілолітичною активності екстрактів вермикомпосту і компосту по відношенню картопляного крохмалю (50 мМ фосфатний буфер, рН 7,6) протягом 24 годин її виявити не вдалося. Зростання оптичної щільності від часу інкубування отримано не було. Відсутність амілолітичною активності, можливо, пов'язано з низькою кількістю амілаз у вермикомпосту і компості.

4. Виділення і порівняльне дослідження фізико-хімічних властивостей гумусових кислот методами ВЕРХ і спектрофотометрії

Поглиблене вивчення властивостей і природи гумусових речовин можливо із застосуванням сучасних фізико-хімічних методів дослідження. Вони дозволяють розкрити генетичні особливості гумусових речовин, що розвиваються в різних умовах.

Гумінові кислоти є основним гумусовим компонентом. Вони не розчиняються у кислоті й спирті, у них середня молекулярна вага і темне забарвлення. Витягнуті методом екстракції з вермикомпосту різного періоду дозрівання гумінові кислоти були досліджені методами спектрофотометрії та ВЕРХ. На підставі УФ-спектрів встановлено наявність в гумінових кислотах ароматичних груп. ²⁸⁰ / D ²²⁰ , характеризует относительное содержание ароматических групп в гуминовых кислотах. Відношення оптичної щільності при 280 нм до оптичної щільності при 220 нм - D ²⁸⁰ / D ^220, характеризує відносний вміст ароматичних груп у гумінових кислотах. ²⁸⁰ / D ²²⁰ =0,47; гуминовые кислоты вермикомпостов D ²⁸⁰ / D ²²⁰ =0,45). Дані спектрофотометрії не показали значної зміни відносної ароматичності в зразках компосту та вермикомпосту (гумінові кислоти компосту - D ²⁸⁰ / D ²²⁰ = 0,47; гумінові кислоти вермикомпосту D ²⁸⁰ / D ²²⁰ = 0,45). Проте слід врахувати, що при спектрометричному дослідженні гумінові кислоти в розчині знаходяться в агрегованому стані, при хроматографії ці агрегати руйнуються, тому дані хроматографічного дослідження є більш об'єктивними.

Методом ВЕРХ екстракти гумінових кислот розділені на три фракції. Фракції 1 і 2 є гідрофільними, фракція 3 містять гідрофобні функціональні групи, в основному ароматичного ряду, причому зміст цієї фракції зростає приблизно в 3 рази для гумінових кислот, виділених з літнього зразка вермикомпосту в порівнянні з контролем, тобто ступінь гуміфікації річного зразка вища.

Ймовірно, однією з причин фізіологічної активності гумінових кислот є наявність в їх молекулах фрагментів, що володіють властивостями стабільних вільних радикалів, а їх зміст, мабуть, збільшується із зростанням ступеня гуміфікації субстратів.

Фульвокислоти є водорозчинній частиною гумінових речовин і являють собою високомолекулярні азотовмісні оксикарбонових кислоти з еквівалентним вагою близько 300 а.о.м. (Іщенко О.В., 1999). Від гумінових кислот вони відрізняються більш низькою молекулярною масою, більш низьким вмістом вуглецю, світлим забарвленням. Фульвокислоти розчиняються у воді лужних і кислих розчинах, мають схильність до кислотного гідролізу.

Найбільша кількість фульвокислот проекстрагіровано із зразка, не обробленого хробаками (контроль). Всього проекстрагіровано фульвокислот: з компосту (контроль) - 980 мг; із зразка - зимовий - 590 мг; зразка - річний - 660 мг.

Аналіз хроматографічних даних екстрактів вермикомпосту (літній і зимовий) виявив наявність 4 фракцій фульвокислот. Фракції 1 і 2 подібні за складом, містять більше 70% речовини і, ймовірно, найбільш багаті гідрофільними компонентами, цим пояснюється найкраща розчинність фульвокислот при різних значеннях рН. Зміст гідрофобних фракцій 3 і 4 незначно. Виділені фракції екстрактів зимового і літнього зразків вермикомпосту подібні за складом і однаковому відносним вмістом у досліджуваних зразках.

Хроматограмма контрольного зразка істотно відрізняється від вище описаних. На хроматограмі контролю виявляються два додаткових піку, що вказує на більш складний компонентний склад даного зразка. Ця обставина може бути пов'язано з гідротермічними та мікробіологічними особливостями формування фульвокислот під дією вермікультури і без неї.

Для хроматографічної характеристики фульвокислот розроблений і застосований метод ВЕРХ у звернених фазах, оскільки в літературі відсутні дані про характеристику фульвокислот, досліджених методом ВЕРХ у обращеннофазовом режимі. Для отримання інтегральної хроматографічної характеристики фульвокислот з екстрактів 1-8 були відібрані аліквотах по 1 мл і об'єднані, для 3-х зразків (літній, зимовий, контроль) окремо.

При проведенні хроматографічного розділення фульвокислот отримали 3 фракції. У перших двох переважали гідрофільні фрагменти, третя містила гідрофобні радикали. Порівняльний аналіз хроматограм для досліджених зразків показав, що, отримані фракції, аналогічні за складом і відносним вмістом компонентів. Встановлено зростання вмісту аліфатичних вуглеводнів і карбоксильних груп, вміст ароматичних кілець і полісахаридних фрагментів у фульвокислота зменшується із зростанням ступеня гуміфікації.

Оскільки фульвокислоти збагачені кислородсодержащими фрагментами, то вони мають кращу розчинність в воді і міграційну здатність. Високий вміст карбоксильних груп (до 27,1%) обумовлює кислотну агресивність ФК по відношенню до грунтових мінералів і здатність утворювати комплексні сполуки з катіонами заліза, алюмінію, міді та інших металів, переводячи їх у розчинні форми.

Висока рухливість ФК, висока поглинальна здатність дозволяють вважати їх найважливішим чинником, що визначає грунтову родючість.

Оптимізація виділення гумусових кислот. ( Swift R . S ., 1999) Раніше використовувалася стандартна процедура екстракції гумусових кислот, рекомендована IHSS (Swift R. S., 1999)

Її використання дозволяло витягти максимальну кількість екстрагованих речовин, проте ця методика включає 11 процедур екстракції по 24 години для вилучення гумусових кислот (гумінові кислоти та фульвокислоти) і стільки ж процедур по 20 годин для поділу гумінових і фульвокислот. Використовуючи дані по повноті екстракції гумінових кислот за раніше використовуваної методикою, оптимізований одноступінчатий метод виділення гумусових кислот. У таблиці 4 наведені дані по екстрагуються гумусових кислот. З таблиці видно, що при співвідношенні 1 / 100 із зразків практично витягується така ж кількість гумусових кислот як і при 11 екстракціях. ; pH 12,5), время экстракции 24 часа. На цій підставі у подальших роботах можна використовувати для витягання гумусових кислот тільки одну екстракцію при співвідношенні біогумус (компост) / екстрагент (0,1 N NaOH; pH 12,5), час екстракції 24 години.

Таблиця 4 екстрагуються гумусових кислот з компосту і біогумусу в залежності від співвідношення маса біогумусу (компосту) / обсяг екстрагенту

Гіматомелановие кислоти - група гумусових кислот, розчинних у етанолі. Виділяються із свежеосажденная гумінової кислоти розчином етилового спирту. У розчині мають вишнево-червоний колір.

Для порівняльного фізико-хімічного аналізу гіматомеланових кислот компостів і вермикомпосту їх виділяли з сухих препаратів гумусових кислот, отриманих за вище наведеної оптимізованої методикою.

У таблиці 5 наведені дані по екстагіруемості гіматомеланових кислот різними спиртами.

Таблиця 5 екстрагуються гіматомеланових кислот різними спиртами

З таблиці 5 видно, що максимальне вагове кількість гіматомеланових кислот екстрагується етанолом (від 20 до 23%).

Хроматограми для досліджених зразків гіматомеланових кислот істотно відрізняються один від одного, як кількістю піків, так і інтенсивністю поглинання. Для порівняння хроматографічних даних були використані інтегральні характеристики піків, а саме сумарні площі під піками хроматограм.

У таблиці 6 наведено хроматографічні дані по сумарним площами під піками хроматограм при детектуванні 220 і 280 нм, а також дані по відносній ароматичності препаратів з 3-х досліджених зразків (контроль, зимовий, літній).

З таблиці 6 видно, що при екстракції метанолом і етанолом зменшуються площі під піками хроматограм в наступному ряду: контроль>; зразок-зимовий> зразок-річний, як при детектуванні 220 нм, так і - 280 нм, що свідчить про зменшення змісту як карбоксильних і карбонільних груп, так і фенольних груп у гіматомеланових кислотах. ²⁸⁰ /∑ S ²²⁰ остается практически неизменным. У той же час, співвідношення Σ S ²⁸⁰ / Σ S ²²⁰ залишається практично незмінним.

Останній факт свідчить про приблизно однаковою відносної ароматичності досліджених зразків гіматомеланових кислот, або іншими словами, зростання ступеня гуміфікації гумінових кислот різного терміну дозрівання не пов'язано зі зміною відносної ступеня ароматичності гіматомеланових кислот.

При екстракції пропанолом екстрагуються гіматомеланових кислот приблизно в 2 - 3 рази нижче, ніж при екстракції метанолом або етанолом (табл. 6).

Таблиця 6 Хроматографічні дані гіматомеланових кислот при екстракції різними спиртами

Гумінові кислоти та фульвокислоти, виділені з компостів і вермикомпосту різного походження, аналізували методом високоефективної рідинної хроматографії. У ході експерименту були використані такі компости і вермикомпосту: кінський, пташиний, свинячий, осад стічних вод. Вермикомпосту отримані протягом 6 місяців з травня по жовтень 2004 року.

Виділення гумінових і фульвокислот з компостів і вермикомпосту проводили відповідно до вимог Міжнародного гумінової суспільства (Gaffney ., Marley S., Marley . A . and N. A. And Clark . B ., 1996). S. B., 1996).

а)

б)

в)

Малюнок 6. Гумусові кислоти, виділені з вермикомпосту хробака "Старатель": а) гумінові кислоти, б) фульвокислоти, в) гіматомелановие кислоти.

З однакових за масою сухих наважок була визначена вологість препаратів з використанням методу висушування до постійної ваги. Зміст вологи в вермикомпосту істотно вище, ніж у компостах. Різниця у вологоємності між компостами і вермикомпосту склала від 22,6% до 37,9%, таким чином вологоутримуючі здатність вермикомпосту істотно вище, ніж відповідних компостів.

из компостов и вермикомпостов. У таблиці 7 наведені дані по екстрагуються речовин 0,1 N HCl з компостів і вермикомпосту. Слід зазначити, що найбільша кількість екстрагованих речовин отримано з кінського компосту та вермикомпосту. Найменша - з осаду стічних вод і вермикомпосту на його основі. Аналіз даних таблиці показує, що екстрагуються речовин з вермикомпосту нижче в порівнянні з компостами на 4-16%.

Таблиця 7 екстрагуються речовин з компостів і вермикомпосту розчином 0,1 N HCl

Для хроматографічних досліджень використовували розчини гумінових кислот з концентрацією 1мг/мл і фульвокислот з концентрацією 2мг/мл. 8 (300 A ) (250 x 4.6). У роботі використовували колонку - Macrosphere C 8 (300 A) (250 x 4.6). Іон-парну хроматографію проводили у присутності в елюент 6 мМ ТБА (тетрабутіл - амоній бромід). Детектування хроматографічних піків проводили УФ детектором при 280 нм.

Хроматограми гумінових кислот містили по два піки. Речовини піку - 1 гідрофільні, так як елюіровалісь з колонки водою і мали низькі часи утримування. Речовини піку - 2 гідрофобні, елюіровалісь з колонки ацетонітрилом. Хроматографічний пік 1, відповідний гідрофільним гумінових кислот при проведенні іон-парної хроматографії зникає, а площа під піком 2 (гідрофобні гумінові кислоти), відповідно зростає. Така поведінка характерна для всіх зразків гумінових кислот. Отримані результати дають підставу вважати, що різниця між піками 1 і 2 на малюнках 7 (а, б) і 8 (а, б) визначається в основному вмістом в ГК іонізованних груп. Враховуючи, що дослідження було виконане при pH = 7,6 мова йде про карбоксильних групах, що мають для гумінових кислот pK - 3,6-4,6. За даними Пермінова (2000), зміст цих груп для великого масиву гумінових кислот, отриманих з різних джерел, складає 3 -7 мМоль / м. Слід зазначити, що карбоксильні групи присутні і в гідрофобною фракції гумінових кислот (рис. 7, пік 2), тому що при введенні в елюент ТБА час виходу гідрофобною фракції зростає з 28 до 31 хв, а пік стає більш симетричним (рис. 8) , що свідчить про більш високу однорідності гумінових кислот при нівелюванні їх зарядів.

а)

б)

Малюнок 7. Хроматограмма гумінових кислот, виділених з кінського компосту (а) і вермикомпосту (б) без ТБА в елюент. 10 до 30 мин; изократический - 95% В с 30 до 40 мин. детектування - 280 нм, режим: ізократіческій 10 хв елюент А; градієнт від 100% А до 95% У c 10 до 30 хв; ізократіческій - 95% В з 30 до 40 хв. - 100% ацетонитрил. Елюент-А -10 мМ фосфатний буфер з рН = 7,6; елюент - B - 100% ацетонітрил.

а)

б)

Малюнок 8. ТБА в элюенте, детектирование 280нм, режим: изократический 10 мин элюент - А; градиент от 100% А до 95% В c 10 до 30 мин; изократический - 95% В с 30 до 40 мин. Хроматограми гумінових кислот виділених з кінського компосту (а) і вермикомпосту (б) c ТБА в елюент, детектування 280 нм, режим: ізократіческій 10 хв елюент - А; градієнт від 100% А до 95% У c 10 до 30 хв; ізократіческій - 95 % В з 30 до 40 хв. Елюент-А 10 мМ фосфатний буфер з рН = 7,6 містить 6мм ТБА (тетрабутіл-амоній броміду); елюент - В-100% ацетонітрил містить 6мм ТБА.

раствором HCl ; снижение экстрагируемости фульвокислот; возрастание удельной ароматичности суммарных фракций гуминовых кислот; возрастание удельной ароматичности суммарных фракций фульвокислот и существенный рост ароматичности гидрофильной фракции ФК. Таким чином, в процесі вермікомпостірованія спостерігається зростання влагоудерживающей здібності вермикомпосту; зниження екстрагуються гумінових речовин 0,1 N розчином HCl; зниження екстрагуються фульвокислот; зростання питомої ароматичності сумарних фракцій гумінових кислот; зростання питомої ароматичності сумарних фракцій фульвокислот та суттєве зростання ароматичності гідрофільної фракції ФК.

Вміст ароматичних фракцій може служити в якійсь мірі показником ступеня гуміфікації вермикомпосту при їх якісної оцінки. Однак, в даний час не розроблено однозначний параметр для оцінки прийнятних рівнів стабільності та зрілості компосту. Для компетентного укладення про ступінь гуміфікації необхідно розглянути якомога більше можливих показників стабільності вермикомпосту.

5. Термодинамічні властивості гумінових речовин

Для оцінки ступеня завершеності процесу гуміфікації вермикомпосту був використаний метод диференціальної скануючої мікрокалориметрії. На малюнку 9 наведені термограми для розчинів комплексу гумінових речовин, виділених з вермикомпосту різного періоду дозрівання. Термограмми мають загальний вигляд. Температурні залежності теплоємності (С _р) на ділянках А-В термограмм зростають із зростанням температури до ~ 60 ° С. > 0), чем на участке В-С. Починаючи з точки В, температурні залежності теплоємності міняють нахил (ділянка В-С), тобто, температурні залежності теплоємності на ділянці А-В мають більший позитивний температурний інкремент (∂ С / ∂ T> 0), ніж на ділянці В-С. Таким чином, при температурі ~ 60 ° С спостерігається певна зміна в стані гумінових речовин.

Малюнок 9. Термограми розчинів гумінових речовин виділених з вермикомпосту різного періоду дозрівання:

1 - зразок-0, 2 - зимовий зразок, 3 - річний зразок.

_m – температура средины перехода при разрушении мицелл, T _m - температура середини переходу при руйнуванні міцел,

- интервал перехода, Δ T - інтервал переходу,

_р - скачок теплоемкости. Δ C _р - стрибок теплоємності.

) уменьшается. Після точки В при температурі ~ 60 ° С температурний інкремент теплоємності (∂ С / ∂ T) зменшується.

Можливо, злам температурної залежності теплоємності пов'язаний зі зростанням сили гідрофобних взаємодій до температури ~ 70 ° С, а при більш високій температурі вона починають слабшати, що проявляється на ділянці В-С в більш низькому температурним інкремент. На ділянці З-Д теплоємності всіх зразків гумінових речовин стрибкоподібно зростають у вузькому температурному інтервалі.

Враховуючи цей факт і те, що гумінові речовини в розчинах утворюють міцели, спостережуваний термічний перехід можна віднести до руйнування міцел, а стрибок теплоємності (Δ С _р) пов'язати з площею гідрофобних груп, експонованих у водний розчинник при руйнуванні міцел.

Встановлення кореляційної залежності між термодинамічними параметрами руйнування міцел гумінових речовин і спектральними параметрами, отриманими з хроматографічних даних, показало, що зростання відносної ступеня ароматичності призводить до лінійного зростання Δ С _р (R ² = 0,998). Як було зазначено вище, руйнування міцел супроводжується експонуванням у воду гідрофобних груп гумінових речовин раніше не доступних розчинника. Так як ароматичні групи гумінових речовин є гідрофобними, то спостерігалося збільшення стрибка теплоємності із зростанням ароматичності. Іншими словами, міцели гумінових речовин, отримані з вермикомпосту більш високого ступеня зрілості, містять більшу кількість гідрофобних груп не доступних розчинника, які при руйнуванні міцел експонуються у воду і дають більше значення Δ С _р.

Зростання ступеня ароматичності гумінових речовин призводить до лінійного зростання Δ Т (R ² = 0,941). Зростання температурного інтервалу руйнування міцел, ймовірно, пов'язано з зростанням їх гетерогенності.

) Зростання сумарної ступеня ароматичності гумінових речовин призводить до лінійного зниження температури середини переходу (Т _m) (R ² = 0,967).

На підставі проведених досліджень можна розглядати можливість використання термічного аналізу для контролю ступеня гуміфікації та характеристики хімічних змін в органічній речовині компосту.

Методом прецизійної диференціальної скануючої мікроколоріметріі і методом ВЕРХ у звернених фазах досліджували гумінові кислоти, виділених з вермикомпосту різного періоду дозрівання. Концентрація гумінових кислот у розчинах становила 6 мг / мл.

Термограмми трьох зразків гумінових кислот (1-зразок-0 (компост); 2-зимовий зразок; 3 - річний зразок) подібні (рис. 10).

Теплоємності (Ср) на ділянках А-В термограмм зростають із зростанням температури до 58 ° С. >0), а на участке В-С – отрицательный (∂С/∂ T <0). Починаючи з точки В теплоємності знижуються (ділянка В-С), тобто температурні залежності теплоємності на ділянці А-В мають позитивний температурний інкремент (∂ С / ∂ T> 0), а на ділянці В-С - негативний (∂ С / ∂ T <0). - меняет знак). За мабуть, при температурі 58 ° С спостерігається зміна в стані гумінових кислот, яке відповідає термодинамическому переходу 3-го роду (∂ С / ∂ T - міняє знак). На ділянці З-Д теплоємності для зразків гумінових кислот стрибкоподібно зростають у вузькому температурному інтервалі. Визначено термодинамічні характеристики цього переходу: ширина переходу - Δ Т, середина переходу-Т _з і різниця теплоємностей - Δ С _р.

Малюнок 10. Термограми розчинів гумінових кислот, виділених з вермикомпосту різного ступеня зрілості:

1 - зразок-0, 2 - зимовий зразок, 3 - річний зразок.

– температура расстекловывания, T _c - температура расстекловиванія,

- интервал перехода расстекловывания, Δ T - інтервал переходу расстекловиванія,

_р - скачок теплоемкости при расстекловывании ГК. Δ C _р - стрибок теплоємності при расстекловиваніі ГК.

) меняет знак с "+" на "-". У точці В при температурі 58 ° С температурний інкремент теплоємності (ð С / ð T) змінює знак з "+" на "-".

У таблиці 8 наведено термодинамічні характеристики переходів, а також дані для процесів расстекловиванія синтетичних полімерів. Враховуючи цей факт і те, що гумінові кислоти в розчинах утворюють асоціати, можна припустити, що ці надмолекулярні структури знаходяться в розчинах у стеклообразном стані. У ході порівняння термодинамічних параметрів расстекловиванія гумінових кислот виявлено, що значення Δ С _р для зразків практично однакові, проте значення Δ Т і Т _з розрізняються.

Таблиця 8 Термодинамічні параметри расстекловиванія гумінових кислот, отриманих з вермикомпосту різного ступеня зрілості

* Дані взято з монографії: Диференційна скануюча калориметрія в фізикохімії полімерів, Бернштейн В.А., Єгоров В.М., - Ленінград, вид. Хімія, 1990 р, стор 248.

Дані хроматографічного аналізу розчинів гумінових кислот показали наявність двох фракцій - гідрофільної і гідрофобної. Виявлено, що процентний вміст фракції-2 зростає відповідно до зростання зрілості вермикомпосту в ряду: зразок - річний> зразок - зимовий> контроль. ²²⁰ ). Зміст фракції-2 (%) визначено як відношення площі хроматографічного піка-2 до суми площ під піками 1 і 2 при детектуванні піків 220 нм (S ₂ ²²⁰ / Σ S ^220). Зміст фракції-2 в зразках в 2 рази перевищує її вміст в компості.

₂ ²²⁰ / S ₂ ²⁸⁰ ). Відносна аліфатічность визначена як відношення площі під піком при детектуванні при 220 нм до площі при детектуванні при 280 нм (S ₂ ²²⁰ / S ₂ ^280). Показано, що зі зростанням зрілості вермикомпосту відносна аліфатічность фракції-2 в 2 рази зростає. У той же час, процентний вміст фракції-1 падає і її відносна аліфатічность знижується. ²²⁰ /Σ S ²⁸⁰ ). Сумарна аліфатічность визначена як відношення суми площ під піками хроматограм фракцій-1 і 2 при детектуванні 220 нм до суми площ цих фракцій при детектуванні 280 нм (Σ S ²²⁰ / Σ S ^280). Відзначено, що вона зростає з ростом зрілості вермикомпосту.

) в общей сумме гуминовых кислот ( Adani F ., Genevini P . L ., 1997; Chefetz B , Adani F ., 1998). В даний час найбільш об'єктивним критерієм зрілості і стабільності компостів вважається критерій відносного вмісту фракції ядра (core) у загальній сумі гумінових кислот (Adani F., Genevini P. L., 1997; Chefetz B, Adani F., 1998). Ця фракція представляє собою високомолекулярну алифатическую (гідрофобну) фракцію гумінових кислот і накопичується в процесі компостування. В якості критерію зрілості компостів запропоновано індекс стабільності компосту, що представляє собою відношення вуглецю сумарних гумінових кислот до вуглецю фракції ядра. У нашому випадку фракцією ядра є хроматографічна фракція-2 (аліфатична), зростання вмісту якої в гумінових кислотах відображає ступінь зрілості або ступінь гуміфікації вермикомпосту. Однак, найбільш підходящим критерієм ступеня зрілості вермикомпосту є критерій зростання відносної сумарною аліфатічності гумінових кислот, так як в ньому враховані спектральні властивості, як фракції-1, так і фракції-2, крім того відносна сумарна аліфатічность лінійно пов'язана з температурою расстекловиванія гумінових кислот. уменьшается. Збільшення вмісту фракції-2 призводить до експоненціального зростання Т _с, в той же час, температурний інтервал расстекловиванія - ΔT зменшується. Ці дані свідчать про зростання кооперативності процесу расстекловиванія гумінових кислот, що пов'язано з кількісним зростанням фракції-2, яка є більш високомолекулярної і аліфатічной по-порівнянні з фракцією-1.

На підставі експериментальних даних можна зробити висновок, що ступінь гуміфікації вермикомпосту можна контролювати:

1. методом ВЕРХ у звернених фазах, використовуючи як критерій: відносну сумарну аліфатічность гумінових кислот;

2. методом скануючої мікроколоріметріі, використовуючи як критерій температуру расстекловиванія і температурні інтервали расстекловиванія гумінових кислот.

Результати, отримані методом скануючої мікроколоріметріі, підтверджуються даними ЯМР-спектроскопії.

Аналіз молекулярної структури препаратів ГК показав, що зі збільшенням періоду вермікомпостірованія збільшується вміст О-алкільних функціональних груп (з 15% до 33%) і зменшується частка ароматичних молекулярних фрагментів (з 34% до 20%).

6. Випробування біологічної активності гумінової комплексу вермикомпосту

Для виявлення особливостей ферментативної активності вермикомпосту були відібрані та проаналізовані зразки грунту компосту та вермикомпосту. У досліджуваних зразках вивчали ферменти класу оксидоредуктаз. У контрольних зразках (неферментативної активність) ферменти інактивувати стерилізацією сухим жаром при температурі 180 ° С протягом двох годин. За одиницю активності (Е) приймали величину оптичної щільності, віднесену до сухої маси наважки. Аналіз діаграми (рис. 11-а) показав, що найвища каталазна активність спостерігалася у варіанті з вермикомпосту. Слід зазначити що, активність ферменту зростає в міру дозрівання вермикомпосту.

а)

б)

Малюнок 11. Активність каталази (а), пероксидази (б) у зразках грунту, біогумусу і компосту.

Пероксидаза притаманні процеси окислення органічної речовини або непрямого розпаду гумусу, в той час як поліфенолоксидази беруть участь у перетвореннях органічних сполук ароматичного ряду в компоненти гумусу. Обидва процеси взаємопов'язані. Активність пероксидази в контролі становила 5,5, у грунті в повітряно-сухому стані 7, у компості 8,5 умовних одиниць (рис. 11-б). У зразках біогумусу активність пероксидази зросла майже в 2 рази і склала 10,5 умовних одиниць.

Підвищена оксидазного активність вермикомпосту пояснюється, ймовірно, тим, що копроліти є центрами мікробіологічної активності в грунті. У кожному грамі біогумусу міститься понад 50 млрд. мікробних клітин. Поглинаючи грунт і органічні речовини, черв'яки виділяють з копролітами велика кількість власної кишкової мікрофлори, ферментів, вітамінів, які в свою чергу мають стимулюючу дію на активність і біомасу мікроорганізмів, що є продуцентами різних біологічно активних речовин.

Вивчення впливу гумінової комплексу, виділеного з вермикомпосту, на активність пероксидази і каталази на початкових стадіях розвитку гороху проводили на контрастних за стійкістю сортах: сорт "Норд", не стійкий до шкідників і хвороб і сорт "Орпела", що володіє комплексною стійкістю до несприятливих факторів. Раніше встановлено, що біологічно активну основі гумінових комплексу складають гумінові кислоти, фульвокислоти та гіматомелановие кислоти, які надають стимулюючий вплив на рослини.

Активність ферментів досліджували в проростках на третій, п'ятий і п'ятнадцятий день після замочування. Контрольні насіння замочували у воді, препаратами порівняння служили - розчин витяжки з компосту і промисловий препарат "Гумістар".

Дослідження пероксидазної активності на проростках гороху "Норд" (3-ю добу) показало, що в контролі активність найнижча (84 у.о.). У зразках, оброблених препаратом "Гумістар" і розчином гумінової комплексу з концентрацією 1,5 × 10 ^-4%, активність пероксидази висока (245 і 216,46 у.о. відповідно). У варіанті з витяжкою з компосту активність підвищилася незначно в порівнянні з контрольним варіантом (134,44 у.о.). Активність пероксидази в проростках гороху у варіанті з розчином препарату "Гумістар" була дещо вище, ніж у варіанті з розчином гумінової комплексу.

Найнижча активність пероксидази у сорту Норд спостерігалася у контролі і у варіанті з витяжкою з компосту. При обробці насіння розчином гумінової комплексу з концентрацією 1,5 ∙ 10 ^-3%, відмічено значне зростання активності пероксидази до 4500 у.о. Розчин гумінової комплексу з концентрацією 1,5 ∙ 10 ^-4% показав близькі результати. Це свідчить про те, що розчини з низькою концентрацією активної речовини діє так само ефективно при меншій витраті препарату.

Активність пероксидази проростків у сорту "Орпела" майже не відрізняється за варіантами. Причому, в контрольному варіанті ці показники були найнижчими. Більш висока активність спостерігалася у варіанті з розчином "Гумістар". Розчини гумінової комплексу з концентраціями 1,5 × 10 ^-4% і 1,5 × 10 ^-3% показали аналогічні результати. Тенденція щодо закономірностям аналогічна сорту "Норд".

Активність каталази в проростках нестійкого сорту "Норд" (3-ю добу) за варіантами змінювалася від 0,81 до 2,1 у. е. У сорту "Орпела" найбільш низька активність ферменту виявлена ​​в контролі (7,3 у.о.). Відносно висока - у варіанті з витяжкою з компосту (10,5 у.о.). Активність зразків, оброблених розчинами гумінової комплексу і препаратом "Гумістар", розрізнялася незначно.

Таким чином, у сорту "Норд" активність пероксидази у всіх варіантах на кілька порядків більше, ніж у сорту "Орпела". А активність каталази, навпаки, у всіх варіантах нижче в порівнянні з пероксидазою. Зниження активності каталази, можливо, пов'язано з накопиченням активних форм кисню у формі перекисів і конкурентним дією пероксидази, активність якої зросла.

У 5-ти добових проростках простежувалися ті ж закономірності - у сталого сорти активність пероксидази на кілька порядків вище, ніж у нестійкого.

Активність каталази у корінцях у нестійкого сорту "Норд" за варіантами дослідження змінювалася від 2 до 3,62 у.о. У сорту "Орпела" активність ферменту у всіх варіантах вище, ніж у сорту "Норд".

У 15-добових проростках у сорту "Норд" активність пероксидази низька у контролі і у варіанті з витяжкою з компосту. При обробці насіння розчинами гумінової комплексу відзначено значне зростання активності пероксидази до 2423 у.о. для розчину з концентрацією 1,5 ∙ 10 ^-4%. У варіанті з препаратом "Гумістар" активність ферменту була нижчою, ніж у варіантах з розчинами гумінової комплексу. У сорту "Орпела" спостерігалася та ж закономірність. Найнижча активність в контрольному варіанті і варіанті з витяжкою з компосту, а найвища для розчину гумінової комплексу з концентрацією 1,5 ∙ 10 ^-4%. Активність при обробці препаратом "Гумістар" нижче, ніж при обробці розчинами гумінової комплексу.

Аналіз отриманих результатів показав, що при обробці рослин розчином гумінової комплексу вдається індукувати імунітет у рослин; оскільки обробка насіння викликає біохімічні зміни в тканинах; в оброблених гумінових комплексом рослинах активність пероксидази збільшується, а оскільки зростання пероксидазної активності свідчить про підвищення імунного статусу, можна припустити, що гумінових комплекс виступає еліситори індукованого імунітету. Обробка гумінових комплексом зберігає рівень пероксидази в проростках на досить високому рівні, що дозволяє рослині захиститися від хвороб на етапі розвитку, коли імунітет знижений. Пероксідасоми рослинних клітин відіграють фундаментальну роль у захисті від патогенів, посилення їх функції за допомогою гумінової комплексу може з'явитися новою формою біологічного захисту рослин.

Активність супероксиддисмутази (СОД) досліджена на среднеустойчівой сорті гороху "Наймит". Активність ферментів вимірювали в пагонах і корінцях проростків на третій, п'ятий, сьомий і десятий день після замочування насіння.

На підставі проведених досліджень виявлено, що активність СОД у всіх варіантах збільшується на сьомий день розвитку втечі і складає близько 15000 у.о. (Рис. 12-а). На третій день проростання найвища активність відзначена у варіанті з розчином гумінової комплексу. На десятий день розвитку проростка активність СОД знижується в усіх варіантах. Стимуляція гумінових комплексом активності СОД, ймовірно, пов'язана з його високою здатністю до детоксикації активних форм кисню. Дослідження активності СОД у корінцях проростків гороху "Наймит" підтвердили отриману закономірність, що виражається в підвищенні активності антиоксидантних ферментів під впливом гумінової комплексу (рис. 12-б).

а)

б)

Малюнок 12. ) в побегах, б) в корешках проростков гороха сорта "Батрак". Вплив гумінової комплексу на активність СОД: a) у пагонах, б) у корінцях проростків гороху сорту "Наймит". Варіанти: 1 - контроль (вода), 2 - препарат "Нарцис", 3 - препарат "Вінце, СК", 4 - препарат гумінової комплексу, 1,5 · 10 ^-4%.

Застосування гумінових комплексу сприяє підвищенню активності пероксидази і каталази, як індикаторів збільшення стійкості до неспецифічних патогенів, а також підсилює ростові процеси на стадії проростків. При обробці гумінових комплексом індукційний ефект був більш виражений, що робить можливим використання його для створення препарату широкого спектру дії. Одним з найбільш багатообіцяючих способів захисту рослин є індукування їх стійкості.

Гумінові комплекс є одним з препаратів природного походження, біоактивні речовини якого, потрапляючи в клітину, подають сигнал рослині, для активації антиоксидантних ферментів, що допомагають рослині боротися з негативним впливом біотичних факторів.

Подібне посилення імунітету гороху під впливом гумінової комплексу не могло не позначитися на стійкості рослин при випробуванні в польових умовах. Стійкість рослин до хвороб і шкідників один з важливих факторів, що визначають високі врожаї сільськогосподарських культур і його стабільність. Розробка шляхів ефективного вирішення цієї проблеми має велике народногосподарське значення.

У ході експерименту досліджено вплив препарату гумінової комплексу на зараженість насіння, розвиток кореневих гнилей, аскохітозу, а також стійкість до ураження шкідниками. Експеримент проводився в трьох варіантах: обробка витяжкою з компосту, препаратом гумінової комплексу з концентрацією розчину 1,5 × 10 ^-4%, препаратом гумінової комплексу з концентрацією розчину 1,5 × 10 ^-3%, контроль - варіант без обробки.

Сорт "Вега" овочевого використання, на початку вегетації росте повільно, тому сильніше заростає бур'янами, уражається хворобами і шкідниками пошкоджується, не стійкий до кореневих гнилей, середньо стійкий до аскохітозу, не стійкий до попелиці. Результати лабораторного досвіду на бактеріальну зараженість показали, що зараженість насіння в усіх варіантах нижче, ніж у контролі (табл. 9).

Таблиця 9 Вплив обробки препаратом гумінової комплексу гороху сорту "Вега" на зараженість насіння, розвиток кореневих гнилей, розвиток аскохітозу