Коротко розглянуто відомості про програмованої клітинної смерті (апоптозу) у тварин і рослин. Патологічний варіант клітинної загибелі - некроз, супроводжуваний у тварин запальним процесом. У результаті апоптозу клітини тварин і рослин дробляться на мембранні везикули з внутрішньоклітинним вмістом. Ці везикули у тварин поглинаються сусідніми або спеціалізованими клітинами (фагоцитами). У рослин немає таких спеціалізованих клітин, фагоцитозу препятствуетналічіе клітинної стінки. Розглянуто основні молекулярні механізми апоптозу у тварин, шляхи активації каспаз - еволюційно-консервативних цистеїнових протеаз. У особливий розділ виділені процеси програмованої клітинної смерті у мікроорганізмів: 1) загибель клітин слизового гриба Dictyostelium discoideum і паразитичного жгутиконосца Trypanosoma cruzi; 2) програмована загибель генноінженерних штамів дріжджів, експрессірущіх проапоптозних білки Bax та Bak, 3) загибель частини клітинної популяції прокаріотів при вичерпанні поживного субстрату або під впливом стрес-факторів; 4) елімінація клітин Escherichia coli, що позбулися плазмідних систем, що кодують стабільний цитотоксичний агент в поєднанні з лабільним протиотрутою до нього; 5) програмована загибель бактеріальних клітин, заражених фагом. Обговорюється взаємозв'язок програмованої смерті і некультивований стану у мікроорганізмів.
This paper briefly overviews the data on programmed cell death (apoptosis) in animals and plants. Necrosis redivsents a pathological scenario of cell death, which is accompanied by inflammation in animals. Apoptosis results in disintegration of animal and plant cells into membrane vesicles enclosing the intracellular content, which are thereupon absorbed by adjacent cells or specialized cells (phagocytes). Plants lack such specialized cells, and plant cell walls divvent phagocytosis. The paper considers the main molecular mechanisms of apoptosis in animals and the pathways of activation of caspases, highly conserved cysteine proteases. A special section concerns itself with the process of programmed cell death (PCD) in microorganisms including (i) cell death in the myxomycete Dictyostelium discoideum and the parasirtic flagellate Trypanosoma cruzi; (ii) PCD in genetically manipulated yeasts exdivssing the proapoptotic proteins Bax and Bak ; (iii) death of part of a prokaryotic cell population upon depletion of nutrient resources or under stress; (iv) elimination of cells after a loss of plasmids encoding a stable cytotoxic agent in combination with a labile antidote; (v) PCD in phage -infected bacterial cells.
У багатоклітинних організмів - тварин, рослин і грибів - генетично закладена програма загибелі клітин. Формообразовательние процеси в онтогенезі, позитивна і негативна селекція Т-і В-лімфоцитів у тварин, гіперчутливість відповідь рослин на вторгнення патогена, осінній листопад - лише кілька прикладів програмованої клітинної смерті (ПКС). ПКС сприяє збереженню порядку і нормального функціонування біологічної системи, очищаючи від незатребуваних, хворих, які закінчили свій життєвий цикл або з'явилися врезультате мутацій потенційно небезпечних клітин. Кількість наукових робіт в цій області наростає по експоненті. Мета цієї роботи - коротко розглянути відомості про апоптозе у тварин і рослин і потім, базуючись на цих даних, відповісти на питання, чи існує програмована загибель клітин у мікроорганізмів.
Апоптоз і некроз - два варіанти клітинної смерті
Клітинна смерть відома з моменту відкриття самої клітини, ще з 1665 р.: Р. Гук (R. Hooke) (див. [1]) описав формації кори дуба з загиблих клітин. Однак довгий час це спостереження залишалося без уваги. Перші гістологічні опису клітинної смерті опублікували К. Фогт (C. Vogt) в 1842 р. (див. [2]) та Р. Вірхов (R. Virchow) в 1859 р. (див. [3]). У формуванні сучасних уявлень про ПКСважное місце займає робота Kerr et al. [4] про існування двох різних видів клітинної смерті у тварин - апоптозу і некрозу.
Ось приклад апоптозу з області імунології. Віруси, деякі бактерії, гриби та найпростіші є внутрішньоклітинними паразитами. Хоча специфічні до них антитіла виробляються організмом людини або тварини, вони не можуть наздогнати шкідника, що зачаївся в цитоплазмі, під покровом клітинної стінки жертви. І тоді в хід вступають цитотоксичні Т-лімфоцити (Т-кілери). Вони вбивають клітини, які стали жертвами інфекційного збудника, і тим самим припиняють його подальше розмноження. Володіючи апаратом розпізнавання зараженої клітини (клітини-мішені) серед маси здорових клітин, Т-кілер викликає її загибель, включаючи програму самогубства клітини-мішені - генетично запрограмовану клітинну смерть, або апоптоз.
Картина апоптозу у тварин - це перехід фосфатидилсерин з внутрішнього монослоя цитоплазматичної мембрани в зовнішній моношар, зменшення об'єму клітини, зморщування цитоплазматичної мембрани, конденсація ядра, розриви нитки ядерної ДНК і подальший розпад ядра на частини, фрагментація клітини на мембранні везикули з внутрішньоклітинним вмістом (апоптозние тільця ), фагоцитуючі макрофагами і клітинами-сусідами. Така ж доля спіткає клітку, коли в ній відбулася мутація, яка може призвести до опухолевому розростання тканини, коли вона стає непотрібною для організму, наприклад, у процесі онтогенетичного розвитку або, стосовно до лімфоцитів, на заключних етапах інфекційного процесу, коли організм вже не потребує в подальшій вироблення антитіл [5-7].
Є й інша, патологічна, форма клітинної смерті - некроз. Така смерть осягає клітку, коли Т-кілер своєчасно не розпорядився долею інфікованої клітини, наставивши її на шлях апоптозу. Вірус чи іншої паразит, розмножуючись в клітці, руйнує її: клітина лізується, її вміст виливається назовні, у міжклітинний простір. Деякі внутрішньоклітинні паразити, включаючи найпростіше Toxoplasma gondii (збудник токсоплазмозу), здатні до придушення апоптозу [8]. Нове покоління паразитів спрямовується в сусідні клітини, завдаючи все більший і більший шкоди організму. Починається запальний процес, результатом якого може бути як одужання, так і загибель організму. Некротичну загибель можуть викликати фізичні або хімічні пошкодження, наприклад, обмороження або опік, органічні розчинники, гіпоксія, отруєння, гіпотонічний шок та ін [5, 7]. Запалення - найчастіше це катастрофа для оточуючих клітин в організмі тварини.
Симптоми запалення сформульовані ще А. К. Цельсом (ACCelsus) - це "rubor, calor, tumor et dolor" (почервоніння, жар, набрякання і біль) [9]. Все це в кінцевому підсумку може призвести до порушення функції (functio laesae) і навіть до загибелі організму. Галанкін і Токмаков [9] порівнюють запалення з військовими діями на рівні держав: "У мирний час держава ... (три крапки в цитаті означає пропуск слів оригінального тексту) живе в умовах збалансованої економіки ... Його військовий потенціал достатній для виконання доктрини розумного стримування потенційного противника ... Але ось ... виникає військовий конфлікт. Мета звільнення території від ворога досягається ... не без втрат: економіка перебудовується ..., вибухають комунікації і трубопроводи, руйнуються житла і мости, рвуться лінії електропередач, при відступі застосовується тактика випаленої землі ... Припустимо, армія наступає. Далеко не кожна куля, випущена біжить піхотою, точно влучає в ціль, в поспіху моторизовані частини можуть перевернути понтон, оглушений телефоніст може неправильно зрозуміти наказ, авіація - викинути бомбу на власну автоколону і т.д. ". Елементи руйнівного характеру є атрибутами запальної реакції. Налічіеілі відсутність запалення у тварин використовується як ознака, що дозволяє відрізнити апоптоз від некрозу.
Некроз характеризується розривом цитоплазматичної і внутрішньоклітинних мембран, що призводить до руйнування органел, вивільненню лізосомальних ферментів і виходу вмісту цитоплазми в міжклітинний простір (рис. 1). При апоптозе зберігається цілісність мембран, органели виглядають морфологічно інтактними, а продукти дроблення клітини, апоптозние тільця (або везикули) є окремі фрагменти, оточені мембраною (рис. 1).
Форма клітинної загибелі - шляхом апоптозу або некрозу - багато в чому визначається внутрішньоклітинної концентрацією NAD + і АТР. Зниження рівня NAD + [11] та АТР [12-14] веде до індукції некрозу.
У нормальному організмі ПКС - механізм для підтримки гомеостазу. Як гіпофункція, так і гіперфункція апоптозу ведуть до порушення гомеостазу.
Отже, ПКС - природний етап в життєдіяльності клітин тварин. А як справа йде у рослин? З фізіологічної клітинної смертю в житті рослин пов'язані процеси формоутворення в онтогенезі, імунні реакції на впровадження патогена (див. огляди [1, 15-22]).
Ксілогенез і флоемогенез. Клітини, яким належить стати трахеідамі ксилеми, що виконує водопровідну і опорну функцію, зазнають дроблення протопласта на везикули, характерні для апоптозу тварин [1, 17, 19, 20]. Розвиток сітовідние трубок флоеми теж супроводжується дробленням ядра, як при апоптозу. Показано існування генів ted2, відповідальних за реалізацію процесу сосудообразованія [1].
Формоутворення листя. Обриси листків у рослин, мабуть, формуються через механізм ПКС. У представників р. Monstera (сем. Аронніковие), місця пеpфорацій, наявність лопатей визначається зонами загибелі клітин на ранніх стадіях розвитку. Цей процес також знаходиться під генетичним контролем [1, 17].
Аеренхімогенез. Це адаптивна реакція рослин на дефіцит кисню, наприклад, при затопленні, що полягає в утворенні порожнин, заповнених повітрям, за рахунок елімінації деяких клітин з повним руйнуванням клітинних стінок за участю активирующиеся гідролітичних ферментів [15, 17].
Клітини кореневого чохлика. Ці клітини захищають апикальную меристему кореня при проростанні насіння [17]. Програма загибелі цих клітин включається навіть при вирощуванні рослин гідропонних способом.
Опадання листя і дозрілих плодів [1, 17, 22]. Ці процеси супроводжуються виборчої загибеллю клітин видільними зони, розташованої між підставою черешка листа або плоду і стеблом, яка активується завдяки експресії так званих sag-генів (senescence-associated genes). Клітини в видільними шарі секретують ферменти, що руйнують клітинні стінки (пектиназу і целюлази). Локально діючи на певну ділянку, ферменти частково розчиняють клітинну стінку в видільними шарі, а самі клітини видільними шару піддаються автолизу, клітинні полімери розпадаються. Одночасно з цим в шарі клітин з боку стебла відкладається водостійкий суберіном, що захищає оголений ділянку тканини, що виникає після відокремлення аркуша в результаті ферментативного гідролізу полімерів.
Проростання пилкової трубки. Цей процес здійснюється в результаті загибелі клітин на шляху проростає пилкової трубки, залежить від видової приналежності пилку і не включається при дії чужорідної пилку [1].
Алейроновий клітини. У насінні однодольних рослин є алейроновий клітини. При проростанні насіння ці клітини секретують ферменти, що каталізують гідроліз запасних полімерів ендосперму і забезпечують тим самим харчування проростка. Будучи непотрібними для подальшого розвитку, алейроновий клітини гинуть по завершенні проростання. По ряду ознак їх загибель має характер ПКС [17]. Ядерна ДНК розщеплюється на олігонуклеосомальние фрагменти, процес стимулюється гіббереловой і блокується абсцизової кислотою (див. [17]). У розщепленні ДНК беруть участь нуклеази, активність яких регулюється гіббереловой і абсцизової кислотою [23].
Соматичний ембріогенез [17]. У суспензійних культурах клітин деяких видів рослин індукується соматичний ембріогенез: з поодиноких клітин можна виростити дорослі рослини - властивість тотипотентності рослин. Тотипотентність клітини діляться асиметрично на дві клітини, одна з яких зупиняє синтез ДНК і гине спрізнакамі ПКС, тоді як інша, продовжуючи розвиватися, дає проросток.
Імунна реакція на патоген [1, 16-18, 21, 24-26]. Стійкість рослини до патогену визначається здатністю розпізнати і своєчасно включити механізм захисту. Поряд з індукцією синтезу фітоалексинів (рослинних антибіотиків) і гідролітичних ферментів, до таких механізмів відноситься активація в інфікованих клітинах і клітинах, локалізованих поблизу вогнища інфекції, програми власної загибелі - процес, званий гіперчутливою відповіддю (ГО). Утворюється зона мертвих зневоднених клітин, яка служить бар'єром для подальшого розповсюдження патогену. ГО - відповідь рослин на патогенні віруси, бактерії, гриби і нематоди. При цьому загибель клітин рослин викликана не прямим деструктивним дією патогена, а активацією патогеном генетичної програми загибелі рослинної клітини. Процес супроводжується дихальним вибухом - генерацією О2Aпрі участю NADPH-оксидази цитоплазматичної мембрани, подібної такої у макрофагів і нейтрофілів ссавців. Крім NADPH-оксидази, Н2О2 в клітинах рослин утворюється за участю пероксидаз клітинної стінки [27], оксалатоксідази [28], а також при окисленні NAD +-залежних субстратів або сукцинату комплексами I або II дихального ланцюга мітохондрій [29]. ГО на одному або декількох листках рослини веде до розвитку імунітету в інших листах, які не мали контакту з патогеном. Такий імунітет у рослин називають системної набутою стійкістю.
Зміни в морфології клітин рослин, що перетерплюють ПКС, подібні з такими при апоптозу у тварин [16, 23, 30]. Також спостерігається конденсація і дроблення ядра на фрагменти, с'ежіваніе протопласта і складчастість цитоплазматичної мембрани. Відбувається розрив плазмодесми - мембранних містків, повідомляють вміст сусідніх клітин, за якими відбувається поширення інфекції із зараженої клітини в сусідні [31]. Стиснення протопласта призводить до відділення його від клітинної стінки. У кінцевому підсумку протопласт дробиться на окремі везикули, аналогічні апоптозних тельцям.
Тоді як у тварин апоптозние везикули in vivo поглинаються сусідніми або спеціалізованими клітинами, у рослин немає таких спеціалізованих клітин. Більш того, фагоцитозу перешкоджає наявність клітинної стінки. Апоптозние везикули у рослин надалі руйнуються. Така деградація може стимулюватися ферментами, секретується сусідніми клітинами. І в кінцевому підсумку останки зруйнованих клітин утилізуються іншими клітинами, що відзначається при відмиранні листя [22]. При відмирання листа клітинні полімери розпадаються, а мономери знову використовуються рослиною. Однак такий варіант заключного етапу клітинної загибелі неможливий при ГО, оскільки відмерлі клітини несуть в собі патоген. У цьому випадку утворюються так звані демаркаційні, відкидаються, тканини внаслідок придбання здоровими клітинами, розташованими навколо місця ураження, мерістематічеськой активності. Виникає перідерма, відгороджуються вогнище інфекції. Доля ж клітинної стінки, атрибута рослинної клітини, неоднозначна. Існують два можливі шляхи її перетворення, що диктуються прив'язкою до події і різняться кінцевим результатом.
По-перше, клітинна стінка може упрочняться завдяки зшивці білків, утворення целюлозних потовщень і лігніфікації. Зміцнення клітинної стінки утрудняє проникнення патогена в клітку або, навпаки, сприяє замуровування вже проник мікроба всередині клітини. При формуванні жорстких судин провідної системи (трахеіди ксилеми і сітовідние елементів флоеми) на стінках відповідних клітин утворюються потовщення, які потім зміцнюються відкладенням лігніну.
Другий шлях - руйнування клітинної стінки за участю активирующиеся гідролітичних ферментів. Тотальне руйнування клітинних стінок відбувається при аеренхімогенезе [15]. Гідролази діють локально і частково розчиняють клітинну стінку в видільними шарі при листопаді і при відділенні дозрілих плодів [22].
У рослин, як і у тварин, поряд з апоптозом, існує некроз. Так, Н2О2 в малих концентраціях - індуктор апоптозу, у високих концентраціях викликає швидку загибель клітин, без будь-яких морфологічних змін, характерних для апоптозу [24].
Отже, поряд з розподілом, диференціюванням, клітинна смерть є процесом, що сприяє нормальному становленню та функціонуванню організму, необхідним і сприятливим для організму в цілому.
Молекулярні механізми апоптозу
Апоптоз - багатоетапний процес. Перший етап - прийом сигналу, передвісника загибелі у вигляді інформації, що надходить до клітини ззовні або що виникає в надрах самої клітини. Сигнал сприймається рецептором і піддається аналізу. Далі через рецептори або їх поєднання отриманий сигнал послідовно передається молекулам-посередникам (мессенджерам) різного порядку і в кінцевому підсумку достігаетядра, де і відбувається включення програми клітинного самогубства шляхом активації летальних і / або репресії антілетальних генів. Проте існування ПКС у без'ядерних системах (цітопластах - клітинах, позбавлених ядра) показує, що наявність ядра не є обов'язковим для реалізації процесу [32].
Стосовно до клітин тварин і людини апоптоз в більшості випадків пов'язаний з протеолітичної активацією каскаду каспаз - сімейства еволюційно консервативних цистеїнових протеаз, які специфічно розщеплюють білки після залишків аспарагінової кислоти (див. огляди [33-35]). На основі структурної гомології каспаз поділяються на підродини а) каспаз-1 (каспаз 1, 4, 5), б) каспаз-2 (каспаз-2) та в) каспаз-3 (каспаз 3, 6-10) [36]. Цистеїнових протеаз, мабуть, беруть участь також в ПКС у рослин [37]. Однак апоптоз можливий і без участі каспаз: сверхсинтезу білків-промоторів апоптозу Bax та Bak індукує ПКС у присутності інгібіторів каспаз [38, 39].
У результаті дії каспаз відбувається [33-36]:
активація прокаспази з утворенням каспаз;
розщеплення антиапоптозних білків сімейства Bcl-2. Піддається протеолізу інгібітор ДНКази, відповідальний за фрагментації ДНК. У нормальних клітинах апоптозних ДНКаза CAD (caspase-activated DNase) утворює неактивний комплекс з інгібітором CAD, позначається ICAD або DFF (DNA fragmentation factor). При апоптозе інгібітор ICAD за участю каспаз 3 або 7 інактивується [40], і вільна CAD, викликаючи межнуклеосомальние розриви хроматину, веде до утворення фрагментів ДНК з молекулярною масою, кратній молекулярній масі ДНК в нуклеосомних частинках - 180-200 пар нуклеотидів. Ці фрагменти при електрофоретичному поділі в агарозному гелі дають характерну "драбинку ДНК". Апоптоз можливий і без фрагментації ДНК [2]. Виявлено ядерний білок Acinus (apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus), з якого при комбінованій дії каспаз-3 (протеоліз при Asp 1093) і неідентифікованої протеази (протеоліз при Ser 987) утворюється фрагмент Ser 987 - Asp 1093. Цей фрагмент в присутності додаткових неядерних факторів викликає апоптотичних конденсацію хроматину і фрагментації ядра (каріорексис) без фрагментації ДНК [41, 42];
гідроліз білків ламін, армуючих ядерну мембрану. Це веде до конденсації хроматину;
руйнування білків, які беруть участь у регуляції цитоскелету;
інактивація і порушення регуляції білків, що беруть участь у репарації ДНК, сплайсинг мРНК, реплікації ДНК. Мішенню каспаз є полі (ADP-рибоза) полімераза (ПАРП). Цей фермент бере участь у репарації ДНК, каталізує полі (ADP-рібозілірованіе) білків, пов'язаних з ДНК (див. огляди [3,11]). Донором ADP-рибози є NAD +. Активність ПАРП зростає в 500 разів і більше при зв'язуванні з ділянками розриву ДНК. Апоптотичні загибель клітини супроводжується розщепленням ПАРП каспаз. Надмірна активація ПАРП при масованих розривах ДНК, сильно знижуючи вміст внутрішньоклітинного NAD +, веде до придушення гліколізу і мітохондріального дихання і викликає загибель клітини за варіантом некрозу.
Існує декілька шляхів реалізації програми ПКС [2, 34, 43-46].
1. Серед них важливе місце займає шлях, опосередкований фізіологічними індукторами, дія яких реалізується через клітинні рецептори [34, 47-52], спеціально призначені для включення програми апоптозу. Цей шлях передачі сигналу ПКС схематично можна зобразити таким чином: індуктори 'рецептори' адаптери 'каспаз першого ешелону' регулятори 'каспаз другого ешелону. Так, рецептор, що позначається Fas, взаємодіючи з відповідним лігандом (лігандом FasL), трансмембранним білком Т-кілера, активується і запускає програму смерті клітини, інфікованої вірусом. Тим же шляхом при взаємодії з лігандом FasL на поверхні ТН-1-лімфоцитів або з антитілом до Fas-рецептора гинуть стали непотрібними видужалою організму В-лімфоцити, продуценти антитіл, що несуть Fas-рецептор. FasL-ліганд, що відноситься до численного сімейства фактора некрозу пухлин (TNF - tumor necrosis factor). Це сімейство гомотримерних лігандів, крім FasL і TNFa, включає TNFb (лимфотоксинов), TRAIL (Apo2L), CD40L, CD27L, CD30L, OX40L.
Fas - член сімейства рецепторів TNF. Всі вони представлені трансмембранних білків, які позаклітинними ділянками взаємодіють з тримером лігандів-індукторів (рис. 2). Взаємодія рецептора і ліганда призводить до утворення кластерів рецепторних молекул і зв'язування їх внутрішньоклітинних ділянок з адаптерами. Адаптер, зв'язавшись з рецептором, вступає у взаємодію з ефекторами, поки ще неактивними попередниками протеаз з сімейства каспаз першого ешелону (ініціюючих каспаз).
Взаємодія адаптера з рецептором і ефекторів здійснюється через гомофільние білок-білкові взаємодії невеликих доменів: DD (death domain - домен смерті), DED (death-effector domain - домен ефектора смерті), CARD (caspase activation and recruitment domain - домен активації та рекрутування каспаз ). Всі вони мають схожу структуру, містять по шість a-спіральних ділянок [45, 46]. Домени DD беруть участь у взаємодії рецептора Fas c адаптером FADD (Fas-associated DD-protein) і у взаємодії рецепторів TNFR1 і DR3 (death receptor 3) з адаптером TRADD (TNFR1-associated DD-protein). Домени DED беруть участь у взаємодії адаптера FADD з прокаспаза 8 і 10. Адаптер RAIDD (RIP-associated Ich-1/CED-3 homologous protein with a death domain, RIP - receptor interacting protein) зв'язується з прокаспази-2 через CARD-домени [45, 46, 51].
Найбільш докладно охарактеризована прокаспаза-8 (FLICE/MACH/Mch5), рекрутіруемая рецептором Fas через адаптeр FADD. Утворюються агрегати FasL - Fas - FADD - прокаспаза-8. Подібні агрегати, в яких відбувається активація каспаз, названі апоптосомамі [43], апоптозних служать гістони [53], або сигнальними комплексами, індукують смерть (DISC - death-inducing signaling complex) [49].
Прокаспази володіють незначною протеолітичної активністю, що становить 1-2% активності зрілої каспаз [34, 43, 54]. Будучи в мономерної формі, прокаспази, концентрація яких у клітині незначна, знаходяться в латентному стані. Передбачається, що просторове зближення молекул прокaспаз при їх агрегації веде до утворення активних каспаз через механізм протеолитического само-і перехресного розщеплення (ауто-чи транс-процесингу) [34, 43, 54]. У результаті від прокаспази (молекулярна маса 30-50 кДа) відокремлюється регуляторний N-кінцевий домен (продомен), а частина, що залишилася молекули поділяється на велику (~ 20 кДа) і малу (~ 10 кДа) субодиниці (рис. 3). Потім відбувається асоціація великої і малої субодиниць. Два гетеродімер утворюють тетрамер з двома каталітичними ділянками, що діють незалежно один від одного. Таким чином прокаспаза-8 активується і вивільняється в цитоплазму у вигляді каспаз-8.
Існують інші шляхи активації каспаз-8 - за участю рецепторів TNFR1 і DR3 [51]. Однак ці шляхи, включають одним і тим же адаптером TRADD, конкурують з паралельними шляхами активації ядерних факторів транскрипції NF-Єb (nuclear factor kappa B) і JNK/AP-1 (JNK, Jun-N-кінцева кіназа, є компонентом мітоген-активованого кіназного шляху, що веде до активації фактора транскрипції AP-1), залежними від адаптерів RIP і TRAF (TNFR1-associated factor). під контролем цих факторів транскрипції знаходиться синтез білкових регуляторів, які блокують TNF-або Apo3L-індуковану активацію каспаз-8. Передбачаються наступні шляхи передачі про-і антиапоптозних сигналів [51]:
На етапі активації каспаз першого ешелону життя клітини ще можна зберегти. Існують регулятори, які блокують або, навпаки, підсилюють руйнівну дію каспаз першого ешелону (див. огляди [36, 52, 55-58]). До них належать білки Bcl-2 (інгібітори апоптозу: A1, Bcl-2, Bcl-W, Bcl-XL, Brag-1, Mcl-1 і NR13) та Bax (промотори апоптозу: Bad, Bak, Bax, Bcl-XS , Bid, Bik, Bim, Hrk, Mtd). Ці білки еволюційно консервативні: гомолог Bcl-2 виявлений навіть у губок Geodia cydomium і Suberites domuncula, у яких апоптоз необхідний для морфогенезу [59].
Каспаз-8 активує каспаз другого ешелону (ефекторних каспаз): шляхом протеолізу з прокаспази-3 утворюється каспаз-3, після чого процес, запущений програмою смерті, виявляється необоротним. Рис. 4 ілюструє взаємодію між каспаз першого і другого ешелону. Каспаз-3 здатна надалі до самостійної активації (Автокаталіз або автопроцессінгу), активує ряд інших протеаз сімейства каспаз, активує фактор фрагментації ДНК, веде до незворотного розпаду ДНК на нуклеосомальние фрагменти. Так запускається каскад протеолітичних ферментів, що здійснюють апоптоз.
2. У клітинах, які зазнали впливу індуктора апоптозу, різко знижується мембранний потенціал (Dy) мітохондрій [34, 55, 58, 60, 61]. Падіння Dy обумовлено збільшенням проникності внутрішньої мембрани мітохондрій (permeability transition) внаслідок утворення гігантських пор [62]. Різноманітні чинники, що викликають розкриття пір [60]. До них відносяться виснаження клітин відновленим глутатіоном, NAD (P) H, ATP і ADP, утворення активних форм кисню, роз'єднання окисного фосфорелірованія протонофорнимі сполуками, збільшення вмісту Ca2 + в цитоплазмі. Освіта пір в мітохондріях можна викликати церамідів, NO, каспаз, амфіпатіческімі пептидами, жирними кислотами [60]. Пори мають діаметр 2,9 нм, що дозволяє перетинати мембрану речовин з молекулярною масою 1,5 кДа і нижче. Наслідком розкриття пори є набухання мітохондріального матриксу, розрив зовнішньої мембрани мітохондрій і вивільнення розчинних білків міжмембранну обсягу [63]. Серед цих білків - ряд апоптогенних факторів: цитохром с [64-66], прокаспази 2, 3 і 9 [67, 68], білок AIF (apoptosis inducing factor), що представляє собою флавопротеїни з молекулярною масою 57 кДа [69]. Прокаспаза-3 можна знайти як в міжмембранну обсязі мітохондрій, так і в цитоплазмі [67].
Освіта гігантських пір не є єдиним механізмом виходу міжмембранні білків мітохондрій у цитоплазму. Передбачається [61], що розрив зовнішньої мембрани мітохондрій може бути викликаний гіперполяризацією внутрішньої мембрани (пор. з гіпополярізаціей при розкритті гігантських пір). Можливий і альтернативний механізм, без розриву мембрани, - розкриття гігантського білкового каналу в самій зовнішній мембрані, здатного пропускати цитохром с та інші білки з міжмембранну простору [61].
Вивільнюється з мітохондрій цитохром с разом з цитоплазматическим чинником APAF-1 (apoptosis protease activating factor-1) бере участь в активації каспаз-9 [70]. APAF-1 - білок з молекулярною масою 130 кДа, що містить CARD-домен (caspase activation and recruitment domain) на N-кінці та 12 повторюваних амінокислотних WD-40-послідовностей (WD - дипептид з триптофану і аспартату) на С-кінці [71 ], утворює комплекс з прокаспази-9 в присутності цитохрому с і dATP або АТР [70] (концентрація dATP в клітці в 1000 разів нижче концентрації АТР [72]). До найбільш охарактеризованих WD-білків відноситься b-cуб'едініца G-білків. З цих субодиниць збираються жорсткі, симетричні структури, на зразок віяла або пропелера (див. огляд [73]). WD-Повтори властиві білкам, які беруть участь у регуляції поділу та диференціювання еукаріотних клітин, транскрипції генів, модифікації мРНК, трансмембранної передачі сигналів, злиття мембранних везикул. Серед прокаріотів WD-білки виявлені у ціанобактерій [74, 75].
APAF-1 грає роль арматури, на якій відбувається аутокаталітіческій процесинг каспаз-9 [76-78]. Передбачається, що в результаті залежного від гідролізу dATP (або АТР) конформаційного зміни APAF-1 набуває здатність зв'язувати цитохром с (рис. 5). Зв'язавши цитохром с, APAF-1 зазнає подальше конформационное зміна, що сприяє його олігомеризації і відкриває доступ CARD-домену APAF-1 для прокаспази-9, яка теж містить CARD-домен. Так утворюється конструкція, звана теж апоптосомой, з молекулярною масою> 1300 тисяч дальтон, у складі якої - не менше 8 субодиниць APAF-1 [76]. Завдяки гомофільному CARD-CARD-взаємодії з APAF-1 в еквімолярної співвідношенні зв'язується прокаспаза-9, а потім прокаспаза-9 пов'язує прокаспазу-3. Просторове зближення молекул прокаспази-9 на мультімерной арматурі з APAF-1-цитохром-с-комплексів, мабуть, приводить до міжмолекулярних протеолитическому процесингу прокаспази-9 з утворенням активної каспаз-9 [76-78]. Подібний механізм запропонований для активації прокаспази CED-3 у хробака Caenorhabditis elegans [79]-аналога прокаспази-9 ссавців. Альтернативний варіант - прокаспаза-9, зв'язавшись з апоптосомой, може прийняти конформацію, яка приводить до внутрішньомолекулярної процесингу (самоактіваціі) [77]. Зріла каспаз-9 потім розщеплює і активує прокаспазу-3. Мутантний APAF-1, позбавлений WD-40-повторів, активує прокаспазу-9, але не здатний до рекрутування і активації прокаспази-3 [77].
Флавопротеїни AIF, будучи доданим до ізольованих ядер з клітин HeLa, викликає конденсацію хроматину і фрагментації ДНК, а при додаванні до ізольованим мітохондрій печінки щурів - вивільнення цитохрому с і каспаз-9 [69]. Мікроін'єкція AIF в інтактні фібробласти щурів призводить до конденсації хроматину по периферії ядра, розриву ДНК на великі фрагменти завдовжки 50 т.п.н. і більше, дисипації Dy в мітохондріях і переходу фосфатидилсерин з внутрішнього шару цитоплазматичної мембрани в зовнішній. Жоден з цих ефектів AIF не запобігає пептидним інгібітором каспаз N-бензоілоксікарбоніл-Val-Ala-Asp.тріфторметілкетоном (Z-VAD.fmk), який запобігає апоптоз, індукований мікроін'ецірованним цитохромом с. Ці дані показують, що AIF є мітохондріальних ефекторів ПКС у тварин, що діють незалежно від каспаз [69].
Крім розглянутих компонентів, при порушенні зовнішньої мембрани мітохондрій з міжмембранну обсягу виділяється термолабільний фактор, що викликає необоротне перетворення ксантиндегідрогеназа в ксантиноксидазу [80]. Фактор стійкий до ряду випробуваних інгібіторів протеаз, включаючи каспаз, серинові і металопротеаз. Ксантиндегідрогеназа каталізує залежне від NAD + окислення ксантину до гіпоксантину і подальше окислення гіпоксантину до сечової кислоти. Ксантиноксидаза каталізує ті ж реакції, але не з NAD +, а з О2 в якості акцептора електронів. При цьому утворюються О2A, Н2О2, а з них - і інші активні форми кисню (АФК), які руйнують мітохондрії і є потужними індукторами апоптозу. Механізми утворення АФК, звичайно, не обмежуються ксантіноксідазной реакцією. Головним джерелом АФК у клітинах є мітохондрії. Різке збільшення АФК відбувається при зростанні мембранного потенціалу в мітохондріях, коли знижено споживання ATP і швидкість дихання лімітіруетсяADP [81]. Частка електронного потоку через дихальний ланцюг мітохондрій, що йде на освіту О2A, досягає 1-5% (див. [61]). Цитоплазматична мембрана макрофагів і нейтрофілів, як уже зазначалося, містить О2A - генеруючу NADPH-оксидазу.
У залежності від шляху, по якому здійснюється активація каспаз, розрізняють різні типи клітин [82]. Клітини типу I (зокрема, лінія лімфобластоідних В-клітин SKW і T-клітини лінії Н9) піддаються ПКС по шляху, залежному від апоптозних рецепторів плазматичної мембрани без участі мітохондріальних білків. Клітини типу II (наприклад, лінії Т-клітин Jurkat та СЕМ) гинуть по шляху апоптозу, залежному від мітохондріального цитохрома з [82]. ПКС, викликана хіміотерапевтичними сполуками, УФ-або і-опроміненням, мабуть, безпосередньо пов'язана з апоптозної функцією мітохондрій: клітини, позбавлені генів білка APAF-1 або каспаз-9, стійкі до хіміо-та радіаційної обробці, але гинуть при індукції Fas -рецептора [83-86].
Деякі клітини, наприклад, клітини ембріональної нервової системи, включають механізми апоптозу, якщо вони відчувають дефіцит апоптозподавляющіх сигналів (званих також факторами виживання) від інших клітин. Фізіологічний зміст процесу - в елімінації надлишкових нервових клітин, що конкурують за обмежений фонд факторів виживання. Епітеліальні клітини при відділенні від позаклітинного матриксу, який виробляє фактори виживання, теж приречені на ПКС. Фактори виживання зв'язуються відповідними цитоплазматичними рецепторами, активуючи синтез пригнічують апоптоз агентів і блокуючи стимулятори апоптозу [44]. Деякі речовини (наприклад, стероїдні гормони) надають диференційований ефект на різні типи клітин - апоптоз запобігають одних типів клітин і індукують його у інших [2].
Так, за наявності у позаклітинному матриксі чинників зростання PDGF (platelet-derived growth factor - тромбоцитарний фактор росту) або NGF (nerve growth factor - фактор росту нервів) і цитокіну інтерлейкіну-3 (IL-3) проапоптозних білок Bad не активний (див. огляд [58]). Фактори зростання, зв'язавшись зі своїм рецептором на плазматичній мембрані, викликають активацію цитозольної протеїнкінази В, що позначається Akt / PKB / RAC і каталізує фосфорилювання Bad по Ser-136. IL-3 теж зв'язується зі своїм рецептором на плазматичній мембрані і активує мітохондріальну cAMP-залежну протеинкиназу А (РКА), каталізують фосфорилювання Bad по Ser-112. Будучи фосфорілірованним по обох залишках серину, Bad утворює комплекс з білком 14-3-3, розташований в цитоплазмі. Дефіцит факторів росту і IL-3 сприймається клітиною як сигнал до апоптозу: відбувається дефосфорілірованіе Bad, його впровадження в зовнішню мембрану мітохондрій, вихід цитохрому с з мітохондрій і подальша активація каспаз-9 через APAF-1-залежний механізм. Крім цього дефіцит IL-3 викликає переміщення мономерного проапоптозних білка Bax з цитоплазми в зовнішню мембрану мітохондрій, подальша зшивання молекул Bax з утворенням гомодимера теж веде до виходуцітохрома з з мітохондрій та загибелі клітини.
3. У ряді випадків ПКС реалізується внаслідок комбінованої дії двох шляхів - за участю і рецепторів плазматичної мембрани, і мітохондріального цитохрома с. Так, пошкодження ДНК веде до накопичення в клітині білкового продукту гена р53, який може зупиняти поділ клітин та / або індукувати апоптоз (див. огляди [87-89]). У більш ніж 50% вивчених видів пухлинних клітин ген р53 інактивована [44], у них порушена р53-залежна регуляція клітинного гомеостазу.
Білок р53 є чинником транскрипції, що регулює активність деяких генів. Передбачається, що відповідна реакція на утворення білка р53 залежить від ступеня порушення клітинного геному [89]. При помірному порушенні геному відбувається зупинка клітинного ділення, здійснюється репарація ДНК, і клітина продовжує своє існування. При надмірному порушенні геному, коли ДНК вже не піддається репарації, включаються рецепторний і цитохром с-залежний апоптозние каскади активації каспаз.
Різні шляхи апоптозу можуть взаємодіяти між собою. У деяких випадках залежний від рецепторів шлях веде до малоефективною активації прокаспази-8. У цьому випадку підключається залежний від мітохондрій шлях апоптозу: каспаз-8 (утворилася в невеликих кількостях) взаємодіє в цитоплазмі з білком Bid з сімейства Bax, розщеплюючи його надвоє. З-Концевой домен Bid далі впроваджується в мітохондріальну мембрану, індукуючи вихід цитохрому с з мітохондрій та його скріплення з APAF-1 [43, 58].
4. Існує шлях передачі сигналу ПКС за участю ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) [90, 91]. У ЕР локалізована прокаспаза-12. Порушення внутрішньоклітинного Ca2 +-гомеостазу добавкою тапсігаргіна або Ca2 +-іонофорного антибіотика А23187 веде до апоптозу клітин, викликаного перетворенням прокаспази-12 в каспаз-12. ЕР-залежний апоптоз пов'язаний з хворобою Альцгеймера: кортикальні нейрони мишей, дефіцитних по каспаз-12, стійкі до апоптозу, індукованому І-амілоїдних білком, але не до апоптозу за участю рецепторів плазматичної мембрани або мітохондріального цитохрома с.
5. Цитотоксичні лімфоцити, Т-кілери, можуть викликати апоптоз у інфікованих клітин з допомогою білка перфорини. Полімеризуючись, перфорини утворює на цитоплазматичній мембрані клітини-мішені трансмембранні канали, по яких всередину клітини надходять TNFb, гранзіми (фрагментіни) - суміш серинових протеаз. Істотним компонентом цієї суміші є Гранзєє В - протеолітичний фермент, що перетворює прокаспазу-3 в активну каспаз-3 [2, 43].
6. Взаємодія клітин з позаклітинним матриксом здійснюється за допомогою інтегринів. Інтегріни - велике сімейство гетеродімерних мембранних білків, які беруть участь у адгезії клітин, пов'язуючи внутрішньоклітинний цитоскелет з лігандами позаклітинного матриксу. Порушення адгезії клітин індукує апоптоз. Більшість інтегринів специфическивзаимодействует з тріпептідним RGD (аргінін-гліцин-аспартат)-мотивом, що входять до складу білків позаклітинного матриксу. Розчинні низькомолекулярні RGD-містять пептиди є ефективними індукторами апоптозу: проникаючи в клітини, вони активують латентну каспаз-3 [92, 93]. Ряд каспаз, включаючи каспаз-3, містить RGD-послідовність поблизу активного центру ферменту. У молекулі прокаспази ця послідовність, ймовірно, залучена у внутрішньомолекулярних взаємодіях, що додає молекулі проферменту таку конформацію, при якій протеазной активність не може проявитися. Імовірно RGD-послідовність взаємодіє з послідовністю DDM (аспартат-аспартат-метіонін), локалізованої поблизу ділянки протеолітичної активації прокаспази-3. Низькомолекулярний RGD-пептид, проникаючи в клітку і вступаючи в конкурентні взаємовідносини з RGD-послідовністю прокаспази-3, витісняє її зі сфери взаємодії з DDM-послідовністю молекул проферменту та індукує зміна їх конформації, олігомеризації і аутопроцессінг прокаспази-3 з утворенням активної каспаз-3 [92].
7. Особливу форму апоптозу зазнають еритроцити ссавців. Біогенез еритроцитів з плюрипотентні стовбурові клітини в кістковому мозку включає ряд проміжних етапів. На етапі еритробластах ядро виганяється (виштовхується) з клітки і пожирається макрофагом [94, 95]. Альтернативний варіант: каріорексис (деструкція ядра) з утворенням тілець Жолли і їх подальший розпад і лізис всередині клітини [94]. Без'ядерна клітина, звана ретикулоцитів, надалі втрачає мітохондрії і рибосоми і перетворюється в еритроцит. Втрату ядра еритробластів можна розглядати як особливу форму ядерного апоптозу. З'ясування його механізму дозволило б застосувати його для знешкодження пухлинних клітин. Еритроцит людини функціонує близько 4 місяців, а потім, зносилися, зникає в надрах ретикулоендотеліальної системи, не завдаючи незручностей оточуючим клітинам. Позбавлений ядра і мітохондрій еритроцит, виконавши своє призначення, мабуть, включає програму загибелі, щоб після цього вступити до розпорядження макрофагів печінки та селезінки. Однак інгібітор протеїнкінази стауроспорін та інгібітор синтезу білка циклогексимід (індукуючий ПКС у більшості випробуваних типів клітин ссавців) не викликає ПКС у без'ядерних еритроцитів людини [96]. Стауроспорін і циклогексимід, а також відсутність сироватки в середовищі інкубації індукують загибель еритроцитів курчати (що містять транскрипційно неактивне клітинне ядро) з вираженими ознаками апоптозу по шляху, який реалізується без участі каспаз. Сперматозоїди миші, у яких ядра теж не мають активність у транскрипції ДНК, при інкубації в штучних середовищах спонтанно гинуть за 1-2 доби; стауроспорін, циклогексимід і пептидний інгібтор каспаз z-VAD.fmk не прискорюють і не уповільнюють клітинну загибель [97].
Мало відомо про механізм ПКС у рослин. У порівнянні з природними індукторами ПКС хімічні і фізичні впливи методично більш привабливі, оскільки викликають синхронний апоптоз з високим виходом загиблих клітин, що полегшує подальший аналіз результатів. Так, апоптоз у рослин можна викликати обробкою CN-[98-100], менадион [101], тепловим впливом [102].
Показано [100], що NaCN викликає руйнування ядер в епідермальних і устьячкові клітинах листя гороху. Устьячкові клітини значно стійкіше до CN-, ніж епідермальні. Світло прискорює CN.-індуцірованноеразрушеніе ядер в устьячкові клітинах. Ефект світла незначний на епідермальних клітинах, які, на відміну від устьячкові клітин, не містять хлоропластів. Ці дані можуть вказувати на можливу участь хлоропластів у CN - індукованої загибелі устьячкові клітин. Антиоксиданти (іонол і вітамін Е) гальмують CN - індуковане руйнування ядер в епідермальних клітинах. Вітамін Е в значній мірі знімає ефект CN-на устьячкові клітини. Саліцилова кислота-інгібітор каталази і аскорбатпероксидази-індукує 100%-ве руйнування ядер в епідермальних клітинах, але не має значного впливу на стан ядерного апарату у устьячкові клітинах. Передбачається, що CN-, інгібуючи каталазу і пероксидази, призводить до утворення та накопичення АФК, індукують апоптоз. Подібно мітохондрій, що грає важливу роль у апоптозу тварин, можлива участь хлоропластів у апоптозу рослин [100].
Гіперчутливою відповідь на зараження патогенними збудниками теж супроводжується накопиченням АФК у клітинах рослин. Це обумовлено придушенням експресії аскорбатпероксидази і каталази. Трансгенні рослини тютюну, в яких синтез цих ферментів пригнічений, гіперчутливість до патогенів: у них ПКС викликається низькими дозами патогенів, які не мають впливу на контрольні рослини [103].
Дія менадион як індуктора апоптозу, мабуть, теж пов'язано з освітою АФК: відновлюючись компонентами дихального ланцюга мітохондрій, менадион спонтанно окислюється О2 в одноелектронного реакції. Обробка протопластів тютюну менадион веде до виходу цитохрому с з мітохондрій у цитоплазму, деградації полі (ADP-рибоза) полімерази (ПАРП), фрагментації ДНК [101]. Тетрапептідние інгібітори каспаз запобігають розщеплення ПАРП (субстрату каспаз-3 у тварин), але не впливають на вихід цитохрому с з мітохондрій. Вихід цитохрому с у цитоплазму і фрагментація ДНК спостерігаються також при тепловій обробці (55', 10 хв) сім'ядоль етіолірованних проростків огірка [102].
Експресія проапоптозних білка Bax викликає ПКС у рослин тютюну [104]. Bax-індукована ПКС фенотипічно схожа з загибеллю клітин при гіперчутливості відповіді на зараження вірусом тютюнової мозаїки. У рисі і арабідопсис виявлено ген інгібітора білка Bax. Експресія цього гена пригнічує Bax-індуковану загибель дріжджів Saccharomyces cerevisiae [105].
Таким чином, наявні дані свідчать про спільність механізмів ПКС у тварин і рослин.
Програмована загибель у мікроорганізмів
За даними аналізу повністю та частково розшифрованих геномів, у мікроорганізмів ідентифіковані білки, відповідні апоптозних факторів ссавців [46]. Так, у слизового гриба з групи акразіевих, Dictyostelium discoideum міститься адаптер TRAF. У дріжджів виявлено ліганд LRR (leucine-rich repeat), адаптерні домени BIR і MATH, у бактерій - ліганд LRR, адаптерний домен TIR, АТРазною домен фактора APAF-1, гомолог каспаз. Ці мікробні домени, мабуть, залучені в різні регуляторні механізми [46].
Гриб D. discoideum має складний цикл розвитку (рис. 6). У цьому циклі фаза відокремлених амебоідному вегетативних клітин, що розмножуються бінарним поділом, поєднується з формуванням видимих неозброєним оком рухливих клітинних скупчень (мігруючого псевдоплазмодий) і далі з побудовою багатоклітинного плодового тіла, в якому окремі амеби покриваються оболонкою (інцістіруются) і перетворюються на спори, що проростають в сприятливих умовах у амебоідному вегетативні клітини. Освіта псевдоплазмодий - реакція на брак їжі (див. огляди [106-108]). Клітини на передньому кінці псевдоплазмодий гинуть з ознаками ПКС [109]. З загиблих клітин формується ніжка плодового тіла. Процес перебуває під впливом ряду міжклітинних комунікаційних агентів: сАМР і особливо 1 - (3,5-дихлор-2 ,6-гідрокси-4-метоксифеніл)-1-гексанона [107]. Інгібітори каспаз не запобігають загибелі клітин в ніжці плодового тіла D. discoideum, тобто ПКС в даній системі, очевидно, не залежить від класичних механізмів апоптозу [110].
Процес, аналогічний ПКС, у війчастих інфузорій - руйнування макронуклеуса (більшого клітинного ядра) з деградацією його ДНК, що настає в зв'язку з кон'югацією, необхідної для рекомбінації ДНК у малому клітинному ядрі - мікронуклеус [111].
Паразитичний жгутиконосец Trypanosoma cruzi має три основні стадії життєвого циклу: епімастіготи, тріпомастіготи і амастіготи. Епімастіготи інтенсивно діляться, мешкаючи в кишечнику комах. Вони далі диференціюються в неподільних тріпомастігот, які, потрапляючи на шкіру хребетної тварини (або особи) з екскрементами кровосисних комах, впроваджуються в клітини хребетних і перетворюються на активно діляться внутрішньоклітинних паразитів амастігот. Амастіготи продукують нові тріпомастіготи, які виходять із клітин і поширюються з потоком крові, потрапляючи в нові клітини (і даючи амастіготи) або в кишечник комахи-кровососи (перетворюючись в епімастіготи). Встановлено, чтопрі вирощуванні T. cruzi in vitro при 27оС (моделювання умов кишечника комахи) епімастіготи через деякий час утворюють тріпомастіготи, причому поява тріпомастігот пов'язане з масовою (програмованої?) загибеллю епімастігот. Передбачуваний сенс ПКС - неделящиеся тріпомастіготи, необхідні для поширення паразита на хребетного господаря, слід оберігати від конкуренції за ресурси з інтенсивно проліферуючими епімастіготамі [112].
Розглянуті форми клітинної загибелі у Protozoa пов'язані з процесами диференціювання і виявляють функціональну спільність з ПКС при онтогенетичному розвитку тварин і рослин, наприклад, при відмирання хвоста у пуголовка і формуванні листків у рослин.
Дріжджі не містять регуляторних факторів апоптозу, подібних Bcl-2 та Bax. Такі білки відсутні і у рослин [25]. Однак зростання Saccharomyces сerevisiae і Schizosaccharomyces pombe пригнічується при експресії проапоптозних білків Baх і Bak. Дріжджові клітини гинуть з характерною для апоптозу картиною (накопичення фосфатидилсерин в зовнішньому монослое цитоплазматичної мембрани, конденсація хроматину, фрагментація ДНК, розпад клітин на апоптозние везикули). ПКС дріжджів запобігає при соекспрессіі антиапоптозних білків Bcl-2 або Bcl-XL. [57, 113, 114]. Cверхекспрессія Bcl-XL у рослин тютюну не блокує ПКС у відповідь на вірусну і бактеріальну інфекції [115]. Оскільки загибель Вах-експресують клітин у бродять S. cerevisiae (відсутні мітохондрії) виражена слабше, ніж у дихаючих (маються мітохондрії), передбачається, що цитохром с і мітохондріальний переносник аденіннуклеотідов беруть участь у Вах-індукованому ПКС дріжджів [116].
Проапоптозних білки активні у дріжджів, хоча їх клітини не синтезують каспаз. Експресія каспаз-3 гальмує ріст S. сerevisiae, але не викликає їх загибелі [117]. Гальмування знімається при порушенні структури активного центру каспаз-3 в результаті мутації. Соекспрессія вірусного інгібітора каспаз-3 або додавання пептидного інгібітора z-VAD.fmk знижують дію експресувати каспаз-3 на ріст клітин [117]. У тварин Bax індукує ПКС у присутності інгібіторів каспаз. Цей шлях ПКС імовірно пов'язаний з накопиченням у клітині активних форм кисню. Ймовірно, існує загальний для дріжджів і ссавців еволюційно-консервативний бескаспазний шлях ПКС, що залежить від активних форм кисню [118].
Описані приклади ПКС у дріжджів пов'язані з експресією чужорідних генів, що не мають аналогів в геномі дріжджів. Однак ПКС характерна для S. сerevisiae і в ході реалізації програми нормального розвитку. Так, материнська клітина, від якої відгалужуються дочірні клітини S. сerevisiae, мабуть, елімінується після формування на ній 20-30 нирок [2].
Що очікувати від прокаріотів, якщо у них експресувати білки, замішані в механізмі ПКС у ссавців? Такі експерименти проведені на Escherichia coli [119]: клітини бактерії гинуть при експресії внутрішньоклітинної частини рецептора Fas T-лімфоцитів людини.
Прокаріотів аналогом апоптозу можна вважати загибель частини клітинної популяції E. coli і ряду інших бактерій в умовах стазис - зупинки росту бактеріальної популяції (при вичерпанні поживного субстрату, під впливом того чи іншого стресорного чинника). Так, голодуюча популяція E. coli поділяється на дві субпопуляції, одна з яких гине і піддається автолизу, в той час як інша субпопуляція використовує продукти автолізу як живильний субстрат і продовжує рости, синтезувати РНК (судячи по включенню 3Н-урідіновой мітки) і формувати колонієутворюючих одиниць [120]. Розкрито генетіческіймеханізм ПКС в подібних прокаріотичних системах [121, 122]. Геном E. coli містить оперон з двома генами: mazE і mazF (рис. 7). Ген кодує mazF стабільний цитотоксичний білок, а mazE - нестабільне протиотруту до білка MazF, швидко руйнується протеазой. В умовах голодування, коли відбувається вичерпання фонду вільних амінокислот активується оперон rel, чий білковий продукт RelA відповідає за синтез гуанозінтетрафосфата. Гуанозінтетрафосфат блокує експресію обох генів: протиотрута руйнується, і в результаті стабільний білок-отрута MazF викликає загибель і Автоліз частини популяції, тим самим поповнюючи фонд амінокислот і знову активуючи синтез протиотрути MazF у залишилися в живих клітин E. coli [121, 122].
Система mazE-mazF, розташована на хромосомі E. coli, аналогічна численним плазмідних системам, які кодують стабільний цитотоксичний агент в комбінації з лабільним протиотрутою до нього (такі плазмідні системи іменуються модулями залежності, addiction modules). Так, у E. coli виявлена плазміда, содержащаяген стабільної ДНК-рестриктаз і нестабільної ДНК-метилаза, яка охороняє ДНК від рестриктаз (метиловані ДНК не може бути пізнана рестриктазою). Втрата плазміди тягне за собою припинення синтезу метилаза, і стабільна рестріктаза фрагментірует знову снтезіруемую Неметиловані ДНК і викликає загибель втратили плазміду клітин [123]. Тому подібні модулі залежно розглядають як "егоїстичні ДНК" (термін Р. Докінза [124]): гинуть ті клітини, які намагаються позбутися від цієї ДНК; зберігаються ті, які поширюють її.
Ділянки hok / sok і pnd плазмід R1 і R483 [125] кодують токсини, що викликають дисипацію мембранного потенціалу і поряд з цим гени, транскрипція яких дає лабільні антисмислової РНК, що перешкоджають транскрипції плазмідної ДНК. Плазміда F y E. coli несе гени, що відповідають за синтез 1) токсину CcdB, який перетворює ДНК-гіразу в ДНК-пошкоджуючий агент і 2) білка-антидоту CcdA, утворить з CcdB неактивний комплекс [123]. Наведені приклади відносяться до внутрішньоклітинним механізмам ПКС, елімінувальних ту саму клітину, яка втратила плазміду з модулем залежності.
Є й позаклітинні механізми ПКС: що містять плазміду клітини вбивають сусідів, не мають цієї плазміди. Мова йде про бактеріцінах і подібних до них агентів, чиї гени розташовані на плазмідах разом з генами, що визначають стійкість до токсину самої бактеріоцини-продукує клітини. Позаклітинні токсини використовують ті ж механізми елімінування чутливих клітин, що і розглянуті вище внутрішньоклітинні токсини. Так, коліцін Е1 і подібні з ним агенти, подібно плазміда R1 і R483, ведуть до деенергізаціі цитоплазматичної мембрани E. coli, а мікроцін В17 (як і білок CcdB, кодується плазмидой F) трансформує ДНК-гіразу в ДНК-пошкоджуючий агент [123]. Відомі також коліціни (Е9), що руйнують ДНК; розщеплюють рибосомальної РНК і тому перешкоджають синтезу білка; інгібуючі синтез пептидоглікану клітинної стінки [126]. Коліціногенние клітини E. coli захищаються від дії коліцінов шляхом їх комплексування з білковим чинником імунітету Im9 (молекулярна маса 9,5 кДа). Фактор Im9 соекспрессіруется з коліціном і з високою спорідненістю зв'язується з коліціном [126].
ПКС у бактерій спостерігається при зараженні фагом. У цьому плані в найбільшій мірі досліджено систему E. coli - Т-парні фаги. Подібно еукаріотичних інфікованих клітин, що гинуть, щоб локалізувати небезпечний для всього багатоклітинного організму патоген, деякі штами E. coli несуть гени, що викликають загибель клітини після впровадження фага Т4 [123, 127, 128]. Так, ген lit блокує синтез всіх клітинних білків у відповідь на експресію генів фага Т4. Ген кодує lit протеазу, расщепляющую фактор елонгації EF-Tu, необхідний для синтезу білка на рибосомах [129]. Ген кодує prrC нуклеазу, расщепляющую лізіновую тРНК. Нуклеази активується за допомогою пептидного продукту гена stp фага Т4. Гени rex викликають у клітин, інфікованих фагом Т4, формування трансмембранних іонних каналів, прирікають ці клітини на загибель, якщо тільки фаг не закриває канали своїми білками, продуктами генів rII [127, 130].
Гени, що відповідають за загибель клітини у відповідь на впровадження вірулентного фага, локалізуються в плазмідах або в геномі фагів (експрессіруясь в лізогенним клітинах [127]). Тому видається ймовірним, що "альтруїстичні" гени, будучи рухливими і легко втрачаються генетичними елементами, функціонують лише в частини бактеріальної популяції.
ПКС є нормальну складову частину процесу розвитку багатьох прокаріотів. Агрегація клітин миксобактерии з формуванням плодового тіла зі спорами пов'язана з загибеллю значної частини клітинної популяції [118]. При спорообразовании у бацил відмирає вегетативна клітина, всередині якої і дозріває спору [118, 131].
Мікробіологам знайома проблема появи у грам-негативних бактерій життєздатних, але некультівіруемих (покояться) форм [132]. Такі клітини стійкі до впливу пошкоджуючих агентів, малоактивні в метаболічному відношенні і не розмножуються. Однак вони можуть бути виведені зі стану спокою різними способами, специфічними для конкретних видів і штамів бактерій, наприклад, шляхом перевивання через чутливе до патогену тварина або за допомогою сигнальних речовин, виділених активно зростаючими клітинами. Так, некультивований форми переважають у популяції Micrococcus luteus після тривалого голодування. Додавання 20-30% надосадової рідини з клітинної суспензії, вирощеної на багатій середовищі до ранньої стаціонарної фази, забезпечує активне зростання некультівіруемих форм [132, 133].
Питання про фізіолого-біохімічних механізмах формування некультивований, але життєздатного стану у бактеріальних клітин залишається дискусійним, однак звертає на себе увагу подібність некультівіруемих форм бактерій і еукаріотичних клітин на початкових стадіях апоптозу. Подібно до останніх, бактеріальні клітини, переходячи в некультивований стан, зменшуються в розмірах, у них активізуються протеолітичні ферменти, РНК і рибосоми зазнають деградації. Ці процеси гіпотетично розглядаються як проапоптоз, тобто еволюційний попередник апоптозу [118].
Активні форми кисню (АФК) сприяють утворенню некультівіруемих форм в бактеріальних популяціях [118]. Елімінацією АФК відають ферменти супероксиддисмутаза, каталаза і пероксидази. У мутантів E. coli, позбавлених цих ферментів, в умовах нестачі поживних речовин спостерігали підвищені концентрації окислених (карбонілірованних) функціонально важливих білків, що відповідають за елонгацію поліпептидного ланцюга при рибосомальному синтезі білка (фактор EF-G), укладання поліпептидів (DnaK), підтримання архітектури ДНК (лужна форма білка H-NS). Позбавлені супероксиддисмутази мутанти взагалі не можуть бути культивовані після періоду голодування, а позбавлені каталази можуть бути повернуті до життя тільки при культивуванні в анаеробних умовах [134].
Відомо, що АФК індукують апоптоз у тварин, а антиоксиданти інгібують цей процес. Дріжджі гинуть при дії пероксидом водню (у низьких концентраціях) або виснаженні внутрішньоклітинного фонду глутатіону [135]. При ПКС, викликаної інсерцій гена bax, наблюдаетсянакопленіе АФК у клітинах дріжджів; зниження їх концентрації, наприклад, шляхом інкубації клітин в умовах гіпоксії, запобігає bax-індуковану ПКС у Saccharomyces cerevisiae [135]. Bax-Індукована загибель дріжджів виражена більшою мірою в умовах дихання, ніж в умовах бродіння [116]. Ці дані підкріплюють гіпотезу про некультивований стані бактеріальних клітин як еволюційному попереднику апоптозу, який спочатку (на ранніх стадіях еволюції) обходився без каспаз, але реалізувався за участю активних форм кисню.
Як вже зазначалося, процеси диференціювання еукаріот можуть завдавати істотної шкоди клітинам - в якості ілюстрації без'ядерні еритроцити ссавців. Подібні ефекти - при диференціювання прокаріотів, здійснюваної в інтересах всієї клітинної популяції [118]. Так, Гетероцисти ціанобактерій позбавлені фотосистеми II, вони виконують вузькоспеціалізовану функцію - фіксують N2 з атмосфери - і гинуть, як тільки відпадає потреба в азотфіксації. Вузьку спеціалізацію мають і бактероїди, утворені кореневими симбіонтом рослин - бактеріями роду Rhizobium, також фіксують азот атмосфери.
На закінчення напрошується паралель між апоптозом і його аналогом, альтруїстичної загибеллю клітин, і подібними біосоціальна явище, що спостерігаються в популяціях багатоклітинних організмів, включаючи людину. Чи не становить собою програмована клітинна смерть еволюційну предтечу того, що оспівано у багатьох поемах і відображено в словах "Варшав'янки": "У битві великою не будуть забуті полеглі з честю в ім'я ідей"?
Висновок
Програмована клітинна загибель - механізм, широко поширений в різних царствах живого, включаючи прокаріотів. Еволюційно ПКС виникла у прокаріот як механізм противірусної захисту популяцій і була закріплена в одноклітинних еукаріотів. Надалі, з появою багатоклітинних організмів, механізм удосконалювався і був пристосований, поряд із захистом від патогенів, для реалізації важливих життєвих функцій - диференціювання клітин і тканин при ембріогенезі і постембріонального розвитку, елімінування клітин імунної системи, незатребуваних, постарілих клітин або клітин, які зазнали впливу мутагенних факторів. Апоптоз у тварин і людини став невід'ємним інструментом для здійснення спадкового і набутого, гуморального та клітинного відповіді імунної системи. Дослідження в області апоптозу відкривають нові перспективи в клітинної біології та імунології.
Робота підтримана Російським фондом фундаментальних досліджень (грант № 98-04-48226) та фондом "Фундаментальне природознавство" Міносвіти РФ.
Список літератури
Greenberg, JT (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93, 12094-12097.
Vaux, DL and Korsmeyer, SJ (1999) Cell, 96, 245-254.
Новожилова А.П., Плужников М.М., Новіков В.С. (1996) В кн. Програмована клітинна смерть (Під ред. В. С. Новікова.), Наука, Спб., C. 9-29.
Kerr, JFR, Wyllie, A.Н., and Currie, AR (1972) Brit. J. Cancer, 26, 239-257.
Cohen, JJ (1993) Immunol. Today, 14, 126-130.
Thompson, CB (1995) Science, 267, 1456-1462.
Jacobson, MD, Weil, M., and Raff, MC (1997) Cell, 88, 347-354.
Nash, PB, Purner, MB, Leon, RP, Clarke, P., Duke, RC, and Curiel, TJ (1998) J. Immunol., 160, 1824-1830.
Галанкін В.М., Токмаков А.М. (1991) Проблеми запалення з позицій теорії і практики. М., УДН, 120 с.
Male, D., Cooke, A., Owen, M., Trowsdale, J., and Champion, B. (1996) Advanced Immunology. Mosby, London.
Oliver, FJ, Menissier-de Murcia, J., and de Murcia, G. (1999) Am. J. Hum. Genet., 64, 1282-1288.
Tsujimoto Y. (1997) Cell Death Differ., 4, 429-434
Nicotera, P. and Leist, M. (1997) Cell Death Differ., 4, 435-442.
Leist, M., Single, B., Castoldi, AF, Kuhnle, S., and Nicotera, P. (1997) J. Exp. Med., 185, 1481-1486.
He, C.-J., Morgan, PW, and Drew, MC (1996) Plant Physiol., 112, 463-472.
Greenberg, JT (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48, 525-545.
Pennell, RI and Lamb, C. (1997) Plant Cell, 9, 1157-1168.
Wojtaszek, P. (1997) Biochem. J., 322, 681-692.
Fukuda, H. (1997) Plant Cell., 9, 1147-1156.
Groover, A., DeWitt, H., and Jones, A. (1997) Protoplasma, 196, 197-211.
Heath, MC (1998) Eur. J. Plant Physiol., 104, 117-124.
Del Rio, LA, Pastori, GM, Palma, JM, Sandalio, LM, Sevilla, F., Corpas, FJ, Jimenez, A., Lopez-Huertas, E., and Hernandez, JA (1998) Plant Physiol., 116 , 1195-1200.
Fath, A., Bethke, PC, and Jones, RL (1999) Plant J., 20, 305-315.
Levine, A., Pennell, I., Alvarez, ME, Palmer, R., and Lamb, C. (1996) Curr. Biol., 6, 427-437.
Boyes, DC, McDowell, JM, and Dangl, JL (1996) Curr. Biol., 6, 634-637.
Jabs, T. (1999) Biochem. Pharmacol., 57, 231-245.
Bolwell, GP, Butt, VS, Davies, DR, and Zimmerlin A. (1995) Free Rad. Sci., 23, 517-532.
Lane, BG, Dunwell., JM, Ray, JA, Schmitt, MR, and Cuming, AC (1993) J. Biol. Chem., 268, 12239-12242.
Braidot, E., Petrussa, E., Vianello, A., and Macri, F. (1999) FEBS Lett., 451, 347-350.
Mittler, R. and Lam, E. (1996) Trends Microbiol., 4, 10-15.
Deom, CM, Lapidot, M., and Beachy, RN (1992) Cell, 69, 221-224.
Jacobson, MD, Burne, JF, and Raff, MC (1994) EMBO J., 13, 1899-1910.
Cohen, GM (1997) Biochem. J., 326, 1-16.
Thornbery, NA and Lazebnik, Y. (1998) Science, 281, 1312-1316.
Куций М.П., Кузнєцова О.А., Газієв А.І. (1999) Біохімія, 64, 149-163.
Kidd, VJ (1998) Annu. Rev. Physiol., 60, 533-573.
Solomon, M., Belenghi, B., Delledonne, M., Menachem, E., and Levine, A. (1999) Plant Cell, 11, 431-443.
Xiang, J., Chao, DT, and Korsmeyer, SJ (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 14559-14563.
McCarthy, NJ, Whyte, MKB, Gilbert, CS, and Evan, GI (1997) J. Cell. Biol., 136, 215-227.
Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., and Wang, X. (1997) Cell, 89, 175-184.
Sahara, S., Aoto, M., Eguchi, Y., Imamoto, N., Yoneda, Y., and Tsujimota, Y. (1999) Nature, 401, 168-173.
Zamzami, N., and Kroemer, G. (1999) Nature, 401, 127-128.
Green, DS (1998) Cell, 94, 695-698.
Raff, M. (1998) Nature, 396, 119-122.
Kumar, S. and Colussi, PA (1999) Trends Biochem. Sci., 24, 1-4.
Aravind, L., Dixit, VM, and Koonin, EV (1999) Trends Biochem. Sci., 24, 47-53.
Nagata, S. (1997) Cell, 88, 355-365.
Golstein, P. (1997) Curr. Biol., 7, R750-R753.
Peter, ME, Heufelder, AE, and Hengartner, MO (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12736-12737.
Green, DR (1998) Nature, 396, 629-630.
Ashkenazi, A. and Dixit, VM (1998) Science, 281, 1305-1308.
Huppertz, B., Frank, H.-G., and Kaufmann, P. (1999) Anat. Embryol., 200, 1-18.
Hengartner, M. (1998) Science, 281, 1298-1299.
Muzio, M., Stockwell, BR, Stennicke, HR, Salvesen, GS, and Dixit, VN (1998) J. Biol. Chem., 273, 2926-2930.
Kroemer, G. (1997) Nature Med., 3, 614-620.
Adams, JM and Cory, S. (1998) Science, 281, 1322-1326.
Reed, JC, Jurgensmeier, JM, and Matsuyama, S. (1998) Biochim. Biophys. Acta, 1366, 127-137.
Gross, A., McDonnell, JM, and Korsmeyer, SJ (1999) Genes and Dev., 13, 1899-1911.
Mьller, WEG (1999) Biol. Cell, 91, 535-565.
Kroemer, G., Zamzami, N., and Susin, SA (1997) Immunol. Today, 18, 44-51.
Green, DR and Reed, J. (1998) Science, 281, 1309-1312.
Bernardi, P., Basso, E., Colonna, R., Costantini, P., Di Lisa, F., Eriksson, O., Fontaine, E., Forte, M., Ichas, F., Massari, S. , Nicolli, A., Petronilli, V., and Scorrano, L. (1998) Biochim. Biophys. Acta, 1365, 200-206.
Skulachev, VP (1998) FEBS Lett., 423, 275-280.