Апоптоз

Стиснення клітини

Конденсація хроматину

Формування в цитоплазмі порожнин і апоптотичних тілець

Механізм апоптозу

Регулювання апоптозу

Автономний механізм апоптозу

Зниження апоптозу

Прискорення апоптозу

Значення апоптозу у розвитку організму і патологічних процесах

Апоптоз

Джерело інформації:

В організмі здорової людини клітинний гомеостаз визначається балансом між загибеллю і проліферацією клітин. Апоптоз - програмована клітинна загибель, енергетично залежний, генетично контрольований процес, який запускається специфічними сигналами і позбавляє організм від ослаблених, непотрібних або пошкоджених клітин. Щодня, приблизно близько 5% клітин організму піддаються апоптозу, а їх місце займають нові клітини. У процесі апоптозу клітина зникає безслідно протягом 15-120 хвилин.

Апоптоз - це біохімічно специфічний тип загибелі клітини, що характеризується активацією нелізосомних ендогенних ендонуклеаз, які розщеплюють ядерну ДНК на маленькі фрагменти. Морфологічно апоптоз виявляється загибеллю одиничних, безладно розташованих клітин, що супроводжується формуванням округлих, оточених мембраною тілець ("апоптотичні тільця"), які тут же фагоцитуються оточуючими клітинами.

Це енергозалежний процес, за допомогою якого видаляються небажані та дефектні клітини організму. Він відіграє велику роль в морфогенезі і є механізмом постійного контролю розмірів органів. При зниженні апоптозу відбувається накопичення клітин, приклад - пухлинний ріст. При збільшенні апоптозу спостерігається прогресивне зменшення кількості клітин в тканині, приклад - атрофія.

Морфологічні прояви апоптозу

Апоптоз має свої відмітні морфологічні ознаки, як на світлооптичному, так і на ультраструктурному рівні. При фарбуванні гематоксиліном і еозином апоптоз визначається в одиничних клітинах або невеликих групах клітин. Апоптотичні клітини виглядають як округлі або овальні скупчення інтенсивно еозинофільної цитоплазми з щільними фрагментами ядерного хроматину. Оскільки стиск клітини і формування апоптотичних тілець відбувається швидко і також швидко вони фагоцитуються, розпадаються або викидаються в просвіт органа, то на гістологічних препаратах він виявляється у випадках його значної виразності. До того ж апоптоз - на відміну від некрозу - ніколи не супроводжується запальною реакцією, що також ускладнює його гістологічне виявлення.

Таблиця 1. Порівняльна характеристика некрозу та апоптозу

Ознака

Апоптоз

Некроз

Індукція

Активується фізіологічними або патологічними стимулами

Різна в залежності від шкідливого чинника

Поширеність

Одиночна клітина

Група клітин

Біохімічні зміни

Енергозалежна фрагментація ДНК ендогенними ендонуклеаза.

Лізосоми інтактні.

Порушення або припинення іонного обміну.

З лізосом вивільняються ферменти.

Розпад ДНК

Внутрішньоядерні конденсація з розщепленням на фрагменти

Дифузна локалізація в некротизованій клітці

Цілісність клітинної мембрани

Збережено

Порушена

Морфологія

Зморщування клітин і фрагментація з формуванням апоптотичних тілець з ущільненим хроматином

Набухання і лізис клітин

Запальний відповідь

Ні

Звичайно є

Видалення загиблих клітин

Поглинання (фагоцитоз) сусідніми клітинами

Поглинання (фагоцитоз) нейтрофілами і макрофагами

Апоптоз - це механізм загибелі клітин, який має ряд біохімічних і морфологічних відмінностей від некрозу.

Найбільш чітко морфологічні ознаки виявляються при електронній мікроскопії. Для клітин, які піддаються апоптозу характерно (рис.1):

Рис.1. Послідовність ультраструктурних змін при апоптозу (праворуч) і некрозі (зліва): 1 - нормальна клітина; 2 - початок апоптозу; 3 - фрагментація апоптотичній клітини; 4 - фагоцитоз апоптотичних тілець оточуючими клітинами; 5 - загибель внутрішньоклітинних структур при некрозі; 6 - руйнування клітинної мембрани.

Стиснення клітини

Клітина зменшується в розмірах; цитоплазма ущільнюється; органели, які виглядають відносно нормальними, розташовуються більш компактно.

Передбачається, що порушення форми та об'єму клітини відбувається в результаті активації в апоптотичних клітинах трансглютамінази. Цей фермент викликає прогресивне утворення перехресних зв'язків у цитоплазматичних білках, що призводить до формування своєрідної оболонки під клітинною мембраною, подібно зроговілих клітин епітелію.

Конденсація хроматину

Це найбільш характерний прояв апоптозу. Хроматин конденсується по периферії, під мембраною ядра, при цьому утворюються чітко окреслені щільні маси різної форми і розмірів. Ядро ж може розриватися на два чи кілька фрагментів.

Механізм конденсації хроматину вивчений досить добре. Він зумовлений розщепленням ядерної ДНК в місцях, які зв'язують окремі нуклеосоми, що призводить до розвитку великої кількості фрагментів, в яких число пар основ ділиться на 180-200. При електрофорезі фрагменти дають характерну картину сходів. Ця картина відрізняється від такої при некрозі клітин, де довжина фрагментів ДНК варіює. Фрагментація ДНК у нуклеосоми відбувається під дією кальцій чутливої ​​ендонуклеази. Ендонуклеаза в деяких клітинах знаходиться постійно (наприклад, в тимоцитах), де вона активується появою в цитоплазмі вільного кальцію, а в інших клітинах синтезується перед початком апоптозу. Однак ще не встановлено, яким чином після розщеплення ДНК ендонуклеаз відбувається конденсація хроматину.

Формування в цитоплазмі порожнин і апоптотичних тілець

У апоптотичній клітці спочатку формуються глибокі впячивания поверхні з утворенням порожнин, що призводить до фрагментації клітини і формування оточених мембраною апоптотичних тілець, які складаються з цитоплазми і щільно розташованих органел, з або без фрагментів ядра.

Фагоцитоз апоптотичних клітин або тілець

Фагоцитоз апоптотичних клітин або тілець здійснюється оточуючими здоровими клітинами, або паренхіматозними, або макрофагами. Апоптотичні тільця швидко руйнуються в лізосомах, а навколишні клітини або мігрують, або діляться, щоб заповнити звільнилося після загибелі клітини.

Фагоцитоз апоптотичних тілець макрофагами або іншими клітинами активується рецепторами на цих клітинах: вони захоплюють і поглинають апоптотичні клітини. Один з таких рецепторів на макрофагах - рецептор вітронектіна, який є β3-інтегринів і активує фагоцитоз апоптотичних нейтрофілів.

Апоптоз бере участь у наступних фізіологічних і патологічних процесах:

Запрограмованому руйнуванні клітин під час ембріогенезу (включаючи імплантацію, органогенез). Незважаючи на те, що при ембріогенезі апоптоз не завжди є віддзеркаленням "запрограмованої смерті клітини", це визначення апоптозу широко використовують різні дослідники.

Гормон-залежною інволюції органів у дорослих, наприклад, відторгнення ендометрію під час менструального циклу, атрезії фолікулів у яєчниках у менопаузі і регресія молочної залози після припинення лактації.

Видаленні деяких клітин при проліферації клітинної популяції.

Загибелі окремих клітин в пухлинах, в основному при її регресії, але також і в активно зростаючої пухлини.

Загибелі клітин імунної системи, як В-, так і Т-лімфоцитів, після виснаження запасів цитокінів, а також загибелі аутореактивних Т-клітин при розвитку в тимусі.

Патологічної атрофії гормон-залежних органів, наприклад, атрофії передміхурової залози після кастрації та виснаженні лімфоцитів в тимусі при терапії глюкокортикоїдами.

Патологічної атрофії паренхіматозних органів після обтурації вивідних проток, що спостерігається в підшлунковій і слинних залозах, нирках.

Загибелі клітин, викликаних дією цитотоксичних Т-клітин, наприклад, при відторгненні трансплантата і хвороби "трансплантат проти хазяїна".

Пошкодженні клітин при деяких вірусних захворюваннях, наприклад, при вірусному гепатиті, коли фрагменти апоптотичних клітин виявляються в печінці, як тільця Каунсільмана.

Загибелі клітин при дії різних пошкоджуючих факторів, які здатні викликати некроз, але діючих у невеликих дозах, наприклад, при дії високої температури, іонізуючого випромінювання, протипухлинних препаратів.

Механізм апоптозу

TNF-α і Fas-ліганд (CD178) запускають каскад біохімічних реакцій, фінальним етапом яких є дефрагментація хромосом і загибель клітини. На поверхні клітин організму є спеціальні рецептори для TNF-α, це TNF-RI (з молекулярною масою 55-60 кДа) і TNF-RII (з молекулярною масою 75-80 кДа), а для Fas-ліганда рецептор Fas / APO-1 (CD95).

TNF-R і Fas / APO-1 (CD95) мають гомологію в екстрацелюлярний доменах, представлену у вигляді цистеїн багатих доменів і гомологичную послідовність у інтрацелюлярний частини рецептора.

Рис.2. Апоптоз

Зв'язування TNF-α і Fas-лігандів з рецепторами апоптозу активує інтрацеллюлярние "домени смерті" (DED - death effector domain) цих рецепторів: DED, DED1 і DED2 і ряд посередників, включаючи цераміди, ras, SAPK / JNK, протеїнові тирозинкінази, катепсин D і протеази ICE / CED-3 сімейства, які каскадно проводять смертельний сигнал. Цистеїнових протеаз ICE / CED-3 сімейства перебувають у складі інтрацелюлярний частини рецептора апоптозу в неактивній формі, вони відносяться до інтерлейкін-l β расщепляющим ферментам (ICE). Це сімейство включає ряд різних типів протеаз, багато протеази мають кілька позначень. Сімейство цистеїн-аспартат протеаз ще називають каспаз.

Крім сімейства каспаз, у регуляції апоптозу приймає участь сімейство Bcl-2 білків, в якому Bcl-2, Bcl-XL, Ced-9, Bcl-w, і Mcl-1 білки інгібують апоптоз, а Bcl-2 гомологи (BH) 1 -3, Bax подібний білок, Bak, Bok, і складаються тільки з BH3 регіону, Bad подібний білок, Bid, Bik, Bim, і Hrk виконують проапоптозних функцію.

Активація DED, DED1 і DED2 викликає каскадну перебудову і активацію протеаз ICE / CED-3 сімейства. Першим етапом є перетворення не активної про-каспаз-8 в активну каспаз-8. Каспаз-8 активує каспаз-3 і Bid. Bid взаємодіючи з Bax сприяє виходу з мітохондрій цитохрому C, який активізує каспаз-9. У свою чергу активна каспаз-9 призводить до появи активних каспаз-3, - 6, - 7. У свою чергу активні ICE починають взаємодіяти з низкою внутрішньоклітинних субстратів: полі-(АДФ-рибоза) полімеразою (PARP), що бере участь у репарації ДНК та модифікації активності деяких ядерних білків, ламін В1, топоізомеразою I і Р-актином. Всі члени сімейства ICE / CED-3 протеаз містять каталітичний залишок цистеїну і розщеплюють субстрати після аспарагінової кислоти. Специфічне розщеплення PARP, ламіна В1, топоізомерази I і Р-актину під дією ICE-подібних протеаз на великі і малі фрагменти призводить клітку до загибелі, тому що великі фрагменти цих субстратів і є активними нуклеазами, які розрізають хромосоми на фрагменти. Наприклад, PARP розщеплюється CPP32 / Yama на два фрагменти 85 і 24 кДа, з яких апоптоз-специфічним є фрагмент 85 кДа. Активація протеаз ICE / CED-3 сімейства може відбуватися і під дією фосфоліпідів, наприклад, церамідів, які здатні активувати CPP32 / Yama.

Вільний сфингозин утворений з церамідів в результаті його гідролізу церамідазой так само активує ICE-подібні протеази і прискорює апоптоз.

Рис.3. Тироксин

Важлива роль у здійсненні апоптозу належить тироксину (Т4).

Він регулює функціонування протеїнової тирозинкінази, важливого елементу реалізації сигналу смерті. При нестачі цього гормону щитовидної залози відбувається придушення апоптозу.

IL-lβ блокує апоптоз. ICE-подібні протеази взаємодіють з IL-l β, а не з PARP, ламін В1, топоізомеразою I і Р-актином. У результаті чого не відбувається утворення активних нуклеаз, і клітина уникає апоптозу.

На взаємодія TNF-α і Fas-лігандів з TNF-R і Fas / APO-1 (CD95) та проведення апоптотичній сигналу впливають Bcl та Bax білки. Так білки Bcl сімейства: Bcl-2, Bcl-xL та Bcl-xS блокують вихід цитохрому С із мітохондрій і таким чином запобігають перетворення про-каспаз-9 в активну форму, скасовують атоптотіческій сигнал. У свою чергу Bax білки сприяють виходу цитохрому С із мітохондрій і утворення активної каспаз-9, яка ініціює продовження і активацію апоптотіческог каскаду, що почався з приєднання TNF-α або Fas-лігандів до TNF-R і Fas / APO-1 (CD95). Бути чи не бути апоптозу залежить від співвідношення Bcl та Bax білків в мітохондріях. Переважання експресії білків Bcl сімейства блокує запуск апоптозу, а переважання експресії Bax білків сприяє реалізації сигналу смерті.

Регулювання апоптозу

Апоптоз - це генетично контрольована смерть клітини. В даний час виявлено велике число генів, які кодують речовини, необхідні для регуляції апоптозу. Багато з цих генів збереглися в ході еволюції - від круглих червів до комах і ссавців. Деякі з них виявляються також в геномі вірусів. Таким чином, основні біохімічні процеси апоптозу в різних експериментальних системах (дослідження ведуться на круглих хробаків і мухах) є ідентичними, тому результати досліджень можна прямо переносити на інші системи (наприклад, організм людини).

Апоптоз може регулюватися:

зовнішніми чинниками,

автономними механізмами.

Вплив зовнішніх факторів

Апоптоз може регулюватися дією багатьох зовнішніх факторів, які ведуть до пошкодження ДНК. При невідновні пошкодження ДНК шляхом апоптозу відбувається елімінація потенційно небезпечних для організму клітин. У даному процесі велику роль грає ген супресії пухлин р53. До активації апоптозу також призводять вірусні інфекції, порушення регуляції клітинного росту, пошкодження клітини і втрата контакту з оточуючими або основною речовиною тканини. Апоптоз - це захист організму від персистенції пошкоджених клітин, які можуть виявитися потенційно небезпечними для багатоклітинного організму.

При стимуляції тканин яких-небудь мітогеном її клітини переходять у стан підвищеної мітотичної активності, яка обов'язково супроводжується деякою активацією апоптозу. Доля дочірніх клітин (виживуть вони чи піддадуться апоптозу) залежить від співвідношення активаторів та інгібіторів апоптозу:

інгібітори включають фактори росту, клітинний матрикс, статеві стероїди, деякі вірусні білки;

активатори включають нестача факторів зростання, втрату зв'язку з матриксом, глюкокортикоїди, деякі віруси, вільні радикали, іонізуючу радіацію.

При дії активаторів або відсутності інгібіторів відбувається активація ендогенних протеаз і ендонуклеаз. Це призводить до руйнування цитоскелету, фрагментації ДНК і порушення функціонування мітохондрій. Клітка зморщується, але клітинна мембрана залишається інтактною, проте пошкодження її призводить до активації фагоцитозу. Загиблі клітини розпадаються на невеликі, оточені мембраною, фрагменти, які позначаються як апоптотичні тільця. Запальна реакція на апоптотичні клітини не виникає.

Автономний механізм апоптозу

При розвитку ембріона розрізняють три категорії автономного апоптозу: морфогенетический, Гістогенетичний і філогенетичний.

Морфогенетический апоптоз бере участь у руйнуванні різних тканинних зачатків. Прикладами є:

руйнування клітин в міжпальцевих проміжках;

загибель клітин призводить до руйнування зайвого епітелію при злитті піднебінних відростків, коли формується тверде піднебіння.

загибель клітин в дорсальній частині нервової трубки під час змикання, що необхідно для досягнення єдності епітелію двох сторін нервової трубки і пов'язаної з ними мезодерми.

Гістогенетичний апоптоз спостерігається при диференціювання тканин та органів, що спостерігається, наприклад, при гормональнозавісімой диференціювання статевих органів з тканинних зачатків. Так, у чоловіків клітинами Сертолі в яєчках плоду синтезується гормон, який викликає регресію проток Мюллера (з яких у жінок формуються маткові труби, матка і верхня частина піхви) шляхом апоптозу.

Філогенетичний апоптоз бере участь у видаленні рудиментарних структур у ембріона, наприклад, пронефроса.

При різних станах може спостерігатися як прискорення, так і сповільнення апоптозу. Незважаючи на те, що апоптоз можуть активувати різні чинники, характерні для певних типів клітин, проте кінцевий шлях апоптозу регулюється точно встановленими генами і є загальним, незалежно від причини активації апоптозу.

Всі фактори, що підсилюють або ослабляють апоптоз, можуть діяти прямо на механізм загибелі клітини або опосередковано, шляхом впливу на регуляцію транскрипції.

У деяких випадках вплив цих факторів на апоптоз є вирішальним (наприклад, при глюкокортикоїд-залежному апоптозе тимоцитів), а в інших не має особливої ​​важливості (наприклад, при Fas - і TNF-залежному апоптозе). У процесі регулювання бере участь велика кількість речовин. Найбільш вивченими з них є речовини з сімейства bcl-2.

Bcl-2 ген вперше був описаний як ген, який транслоціруется в клітинах фолікулярної лімфоми та інгібує апоптоз. При подальших дослідженнях виявилося, що Bcl-2 є мультігеном, який виявляється навіть у круглих хробаків. Гомологічні гени були також виявлені в деяких вірусах. Всі речовини, що відносяться до даного класу діляться на активатори та інгібітори апоптозу.

До інгібіторів відносяться: bcl-2, bcl-xL, Mcl-1, bcl-w, аденовірусні E1B 19K, Епштейн-Барр-вірусний BHRF1.

До активаторам відносяться bax, bak, Nbk / Bik1, Bad, bcl-xS.

Члени цього сімейства взаємодіють один з одним. Одним з рівнів регуляції апоптозу є взаємодія білок-білок. Білки сімейства bcl-2 формують як гомо - так і гетеродімери. Наприклад, bcl-2-інгібітори можуть утворити димери bcl-2-активаторами. Таким чином, життєздатність клітин залежить від співвідношення активаторів та інгібіторів апоптозу. Наприклад, bcl-2 взаємодіє з bax; при перевазі першого життєздатність клітини підвищується, при надлишку другого - зменшується. До того ж білки сімейства bcl-2 можуть взаємодіяти з білками, що не відносяться до цієї системи. Наприклад, bcl-2 може з'єднаються з R-ras, який активує апоптоз. Інший білок, Bag-1, підсилює здатність bcl-2 інгібувати апоптоз.

В даний час прийнято вважати, що гени, які беруть участь у регуляції росту та розвитку пухлин (онкогени і гени-супресори пухлин), грають регулюючу роль в індукції апоптозу. До них відносяться:

bcl-2 онкоген, який інгібує апоптоз, викликаний гормонами і цитокінами, що призводить до підвищення життєздатності клітини;

Білок bax (також з сімейства bcl-2) формує димери bax-bax, які підсилюють дію активаторів апоптозу. Ставлення bcl-2 і bax визначає чутливість клітин до апоптичних чинників і є "молекулярною перемикачем", який визначає, чи буде відбуватися зростання або атрофія тканини.

c-myc онкоген, чий білковий продукт може стимулювати або апоптоз, або зростання кліток (при наявності інших сигналів виживання, наприклад, bcl-2)

Ген р53, який в нормі активує апоптоз, але при мутації або відсутності (що виявлено в деяких пухлинах) підвищує виживання клітин. Встановлено, що р53 необхідний для апоптозу при пошкодженні клітини іонізуючим випромінюванням, однак при апоптоз, викликаному глюкокортикоїдами і при старінні, він не потрібний.

Зниження апоптозу

Продукт р53 гена стежить за цілісністю геному при мітозі. При порушенні цілісності геному клітина перемикається на апоптоз. Навпаки, білок bcl-2 інгібує апоптоз. Таким чином, недолік р53 або надлишок bcl-2 призводить до накопичення клітин: ці порушення спостерігаються в різних пухлинах. Вивчення факторів регулюють апоптоз має важливе значення в розробці лікарських препаратів, що підсилюють загибель клітин злоякісних новоутворень.

Аутоімунні захворювання можуть відображати порушення в індукції апоптозу лімфоїдних клітин, здатних реагувати з власними антигенами. Наприклад, при системному червоному вовчаку спостерігається порушення Fas-рецепторів на клітинній поверхні лімфоцитів, що веде до активації апоптозу. Деякі віруси підвищують свою виживаність шляхом інгібування апоптозу інфікованих клітин, наприклад, вірус Епштейна-Барра може впливати на обмін bcl-2.

Прискорення апоптозу

Прискорення апоптозу доведено при синдромі набутого імунодефіциту (СНІД), нейротрофічних захворюваннях і деяких захворюваннях крові, при яких спостерігається дефіцит будь-яких формених елементів. При СНІД вірус імунодефіциту може активувати CD4 рецептор на неінфікованих Т-лімфоцитах, прискорюючи, таким чином, апоптоз, що призводить до виснаження клітин даного типу.

Значення апоптозу у розвитку організму і патологічних процесах

Апоптоз відіграє важливу роль у розвитку ссавців і в різних патологічних процесах. Функціонування bcl-2 потрібно для підтримки життєздатності лімфоцитів, меланоцитів, епітелію кишечника і клітин нирок під час розвитку ембріона. bcl-x необхідний для інгібування смерті клітин в ембріогенезі, особливо в нервовій системі. Bax необхідний для апоптозу тимоцитів і підтримки життєздатності сперматозоїдів під час їх розвитку. р53 є геном супресії пухлин, тому в ембріогенезі особливої ​​ролі не грає, але обов'язково необхідний для супресії пухлинного росту. Миші, в яких були відсутні обидва р53 гена, виявляли надзвичайно високу схильність до розвитку злоякісних пухлин у результаті повного або часткового порушення апоптозу передпухлинних клітин. Посилений синтез білка, що кодується bcl-2 геном, призводить до пригнічення апоптозу і, відповідно, розвитку пухлин; даний феномен виявлений в клітинах В-клітинної фолікулярної лімфоми.

При лімфопроліферативних захворюваннях і схожою на системний червоний вовчак хвороби у мишей спостерігається порушення функції Fas-ліганда або Fas-рецептора. Підвищений синтез Fas-ліганда може попереджати відторгнення трансплантата. Апоптоз є частиною патологічного процесу при інфікуванні клітини аденовірусами, бакуловіруси, ВІЛ і вірусами грипу. Інгібування апоптозу спостерігається при персистування інфекції, в латентному періоді, а при посиленій реплікації аденовірусів, бакуловіруси, можливо герпесвірусів, вірусу Епштейна-Барра та ВІЛ спостерігається активація апоптозу, що сприяє широкому поширенню вірусу. При нейродістрофіческіх захворюваннях відзначається порушення функції гена (iap-гена), схожого з інгібітором апоптозу бакуловіруси.