Принципи імуноферментного аналізу, основні види ІФА, застосування в діагностиці
Реферат
Самойлик Павло Володимирович інтерн кафедри «Клінічної лабораторної діагностики»
Російський державний медичний університет
2009
Введення.
Методи імунного аналізу широко увійшли в медичну практику. У всіх областях сучасної медицини використовується імунний аналіз, переважно, з діагностичною та аналітичної цілями. Особливо важливо, що вони дають можливість ідентифікувати біологічні компоненти (гормони, ферменти, нейропептиди, продукти імунної системи, антигени і т.д.) в низьких і дуже низьких концентраціях. Всі продукти, проти яких можливе отримання антитіл, виявляються цими методами.
Імунний аналіз грунтується на взаємодії антигену (АГ) і антитіла (АТ) з використанням різних варіантів мічення одного з компонентів (фермент, радіонуклід, флуоресцентний барвник та інші). Оцінка реакції проводиться автоматично на спеціальній апаратурі, що дозволяє стандартизувати ці методи.
Залежно від типу використовуваної мітки і умов роботи тесту імунний аналіз позначається як імуноферментний (ІФА), радіоімунний (РІА), імунофлуоресцентний та інші. При постановці реакцій в один або декілька етапів вони позначаються як прямі або непрямі. Має значення середовище, в якому проводиться реакція. Якщо реакція проводиться з реагентами, фіксованими на поверхні, то тест позначається як твердофазний, наприклад ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).
У даній роботі буде розглянуто тільки імуноферментний аналіз - метод широко поширений в біології та медицині, як практичної, так і фундаментальної.
Імуноферментний аналіз.
ІФА з'явився в середині 60-х років і спочатку був розроблений як метод для ідентифікації антигену в гістологічному препараті, а також для візуалізації ліній преципітації в тесті імунодифузії і імуноелектрофорез, а потім став використовуватися для кількісного визначення антигенів і антитіл в біологічних рідинах. У розробці методу брали участі Є. Енгвалл і Р. Пелман, а також незалежно від них В. Ван Вееман і Р. Шурс.
Малюнок 1. Основний прінцип ІФА.
1) Для виявлення антигенів. 2) Для виявлення антитіл.
Метод заснований на специфічному зв'язуванні антитіла з антигеном, при цьому один з компонентів кон'юговані з ферментом, в результатереакціі з відповідним хромогенних субстратом утворюється забарвлений продукт, кількість якого можна визначити спектрофотометрично (рис. 1).
Відкриття можливості іммобілізації антигену та антитіла на різних носіях із збереженням їх зв'язує активності дозволило розширити використання ІФА в різних галузях біології та медицини.
Поява моноклональних антитіл послужило подальшому розвитку ІФА, що дозволило підвищити його чутливість, специфічність і відтворюваність результатів.
Теоретично ІФА грунтується на даних сучасної імунохімії та хімічної ензимології, знанні фізико-хімічних закономірностей реакції антиген-антитіло, а також на головних принципах аналітичної хімії. Чутливість ІФА і час його проведення визначається декількома основними чинниками: кінетичними, термодинамічними характеристиками реакції антиген-антитіло, співвідношенням реагентів, активністю ферменту і роздільною здатністю методів його детекції. У загальному вигляді реакція антиген-антитіло може бути описана простою схемою:
[AT] + [АГ] ↔ [Атаги]
Різноманітність об'єктів дослідження від низькомолекулярних з'єднань до вірусів і бактерій, а також надзвичайно широке коло завдань, пов'язаних з різноманіттям умов застосування ІФА, обумовлюють розробку надзвичайно великого кількість варіантів цього методу.
Будь-який варіант ІФА містить 3 обов'язкові стадії:
1. стадія впізнавання тестованого з'єднання специфічним до нього антитілом, що веде до утворення імунного комплексу;
2. стадія формування зв'язку кон'югату з імунним комплексом або з вільними місцями зв'язування;
3. стадія перетворення ферментної мітки в реєстрований сигнал.
Класифікація ІФА.
В основу класифікації методів ІФА покладено кілька підходів:
1. За типом реагентів, присутніх на першій стадії ІФА, розрізняють конкурентний і неконкурентний методи.
А) У конкурентному ІФА на першій стадії в системі присутні одночасно аналізоване з'єднання і його аналог, мічений ферментному і конкуруючий за центри специфічного зв'язування з ним.
Б) Для неконкурентних методів характерна присутність в системі на першій стадії тільки аналізованого з'єднання і специфічних до нього центрів зв'язування.
2. Всі методи ІФА делют на гомогенні та гетерогенні.
Якщо всі три стадії ІФА проходять в розчині і між основними стадіями немає додаткових етапів поділу утворилися імунних комплексів від непрореагіровавшіх компонентів, метод належить до групи гомогенних.
В основі гомогенного ІФА, застосовуваного, як правило, для визначення низькомолекулярних субстанцій, лежить інгібування активності ферменту при його поєднанні з антигеном або антитілом. Активність ферменту відновлюється в результаті реакції антиген-антитіло.
При зв'язуванні антитіла з антигеном, що містить ферментну мітку, відбувається інгібування активності ферменту на 95% по відношенню до високомолекулярних субстрату, що обумовлено стеричним винятком субстрату з активного центру ферменту. У міру збільшення концентрації антигену зв'язується все більше антитіл і зберігається все більше вільних кон'югатів антиген-фермент, здатних гідролізувати високомолекулярний субстрат. Аналіз проводять дуже швидко, для одного визначення потрібно 1 хвилина. Чутливість методу досить висока. З його допомогою можна визначити речовину на рівні пікомолей.
Для гетерогенних методом характерно проведення аналізу в двофазної системі з участю твердої фази - носія, і обов'язкова стадія поділу імунних комплексів від непрореагіровавшіх компонентів (відмивання), які знаходяться в різних фазах (які утворилися імунні комплекси знаходяться на твердій фазі, а непрореагіровавшіх комплекси - в розчині) . Гетерогенні методи, в яких формування імунних комплексів на першій стадії протікає на твердій фазі, називають твердофазним методами.
Методи відносяться до гомогенно-гетерогенним, якщо 1 стадія - утворення специфічних комплексів відбувається в розчині, а потім для розділення компонентів використовують тверду фазу з іммобілізованими реагентом.
3. За принципом визначення тестованого речовини:
А) Пряме визначення концентрації речовини (антигену чи антитіла) за кількістю провзаімодействующіх з ним центрів зв'язування. У цьому випадку ферментна мітка буде знаходитися в утворився специфічному комплексі АГ-АТ. Концентрація визначається речовини буде прямо пропорційна реєстрованим сигналу.
Б) Визначення концентрації речовини за різницею загального числа місць зв'язування і залишилися вільними центрів зв'язування. Концентрація визначається речовини при цьому буде зростати, а реєстрований сигнал знижуватися, отже, в даному випадку простежується зворотна залежність від величини реєстрованого сигналу.
Характеристика компонентів, що використовуються в ІФА.
Ферменти.
Ферментні мітки володіють надзвичайно мощьний каталітичною дією, одна молекула ферменту може реагувати з великою кількістю молекул субстрату. Таким чином, фермент, присутній у незначних кількостях, можна виявити і кількісно визначити за освітою продуктів, що каталізується їм реакції. Інша перевага застосування ферментів в якості міток обумовлено наявністю в молекулі численних функціональних груп (сульфгідрильних, карбоксильних, залишків Тирозин та ін), через які можна ковалентно приєднати молекули ліганду.
Ферментні маркери, які використовуються в ІФА, повинні володіти наступними властивостями:
- Висока активність і стабільність ферменту за умов аналізу, при модифікації і в кон'югату з антитілами або іншими білками;
- Наявність чутливих субстратів і простота методу визначення продуктів або субстратів ферментативної реакції;
- Можливість адаптації субстратні систем до подальшого посилення;
- Відсутність ферменту і його інгібіторів в досліджуваній біологічної рідини.
У ІФА може використовуватися не менше 15 різних ферментів. Найбільше застосування, відповідно до вищезгаданими вимогами, знайшли пероксидаза хрону (ПХ), лужна фосфотаза (ЛФ) і β-D-галактозидаза (табл.1). Всі три стабільні і каталізують високочутливі реакції. Крім того, продукти, одержувані в результаті реакцій, що каталізуються цими ферментами, в залежності від використовуваного субстрату, можуть виявлятися не тільки колориметричними методами, але також флуоресцентними методами. Інші ферменти використовуються значно рідше. Це пояснюється їх більш низькою у порівнянні з ПХ і ЛФ питомою активністю.
Субстрати.
Вибір субстрату в першу чергу визначається використовуваним в якості мітки ферментом, так як реакція фермент-субстрат високо специфічна.
Основні вимоги до субстрату:
- Забезпечення високої чутливості методу при виявленні ферменту в кон'югату;
- Освіта добре врахованих (наприклад, забарвлених) продуктів реакції фермент-субстрат;
- Субстрат повинен бути безпечним, дешевим, доступним і зручним для застосування.
Таблиця 1.
Ферменти та їх субстрати найбільш широко використовувані в ІФА.
Найчастіше використовують хромогенні субстрати, які, руйнуючись, утворюють забарвлене речовина. Перспективним є використання високоенергетичних субстратів - флуоресцентних, хеміпюмінесцентних. Застосування таких субстратів дозволяє теоретично підвищити чутливість ІФА на два порядки.
Антигени та антитіла.
АГ і AT, використовувані в ІФА, повинні бути високоочішеннимі і високоактивними. Крім того, АГ повинні володіти високою антигенів, оптимальної щільністю і кількістю антигенних детермінант, чужорідне і гомогенністю. Багато синтетичних та рекомбінантні АГ вірусів і бактерій добре себе зарекомендували при використанні в ІФА. Це істотно підвищило специфічність і відтворюваність методу за рахунок зведення до мінімуму перехресних реакцій.
Одним з найбільш важливих реагентів в ІФА є антитіла. Чутливість ІФА залежить від концентрації, активності та специфічності використовуваних антитіл. Використовувані антитіла можуть бути полі-або моноклінальними, різного класу (IgG або IgM) і підкласу (IgGl, IgG2), антіаллотіпіческімі або антіідіотіпіческіе. При низькій афінності AT розпад комплексу АГ-АТ призводить до видалення пов'язаного АГ із системи. Чутливість і специфічність методу підвищується при використанні моноклональних антитіл. У цьому випадку з'являється можливість виявляти низькі концентрації АГ (AT) у випробовуваних зразках.
Освіта кон'югату
Кон'югат - це антиген або антитіло, мічені ферментної міткою. Освіта коньюгата - один з важливих етапів проведення ІФА.
При формуванні кон'югату підбирають такий оптимальний метод введення ферментної мітки, щоб обидва компоненти кон'югату зберігали свою біологічну активність: фермент - здатність взаємодіяти з субстратом, а антиген або антитіло - антигенність антигензв'язуючих активність, відповідно. Наявність міченого, високоочищеного антигену дозволяє використовувати конкурентні методи. У цьому випадку на кінцевому етапі можна вимірювати активність кон'югату, не пов'язаного з іммобілізованими антитілами, що дозволяє уникнути процедури відмивання і робить аналіз більш зручним. Однак антигени різноманітні за своїми фізико-хімічними властивостями і будовою, а значить неможливо розробити загальні механізми для отримання кон'югату з антигеном. У цьому випадку одержання кон'югату антигену з ферментом представляє собою окрему складну задачу. Приготування мічених антитіл для ІФА методично більш доступно.
Кон'югування ферменту з імунохімічних активними білками проводиться різними методами: хімічна зшивання, ковалентное зв'язування молекули ферменту з АГ або AT та освіта з'єднань через нековалентниє зв'язку, наприклад, коли зв'язок між ферментом і АГ або AT здійснюється імунологічно, через взаємодію антиген-антитіло.
Найбільш широке поширення одержали ковалентні способи приготування кон'югатів. Вибір реакції зв'язування визначається типом доступних функціональних груп в даних білкових молекулах. В якості реагентів, що використовуються для введення ферменту в молекули антигенів і антитіл, використовують глутаровий альдегід, перйодатом натрію і ін
Існує одноетапний і двоетапний методи отримання кон'югатів за допомогою глутарового альдегіду. Можуть утворюватися кон'югати різних розмірів з скороченої ферментативною активністю (15 - 60% від вільного ферменту). Утворився кон'югат великих розмірів може стерично ускладнювати визначення тестованого речовини. Кон'югати з відносно низькою молекулярною масою складаються з Fab-фрагменти та однієї молекули ферменту.
У результаті двохетапного синтезу, який полягає в поетапному отриманні спочатку модифікованого за допомогою агента, що зшиває ферменту, його виділення, а потім подальшому його взаємодії з антигеном (антитілом), утворюються молекули однорідного складу, які містять 1-2 молекули ферменту на молекулу імуноглобуліну і зберігають високу ферментативну і імунологічну активність. Однак кількість таких утворилися кон'югатів невелика (для пероксидази хрону становить 5 - 10%).
Найбільше практичне застосування знайшов метод отримання іммунопероксідазний кон'югатів, заснований на окисленні вуглеводного компонента ферменту перйодатом натрію (зв'язування пероксидази у кон'югат досягає 70-90% від початкового кількості ферменту).
Надійний кон'югат повинен володіти наступними властивостями:
- Високим антитільних тигром і високої афінністю до антигену, щоб його можна було використовувати у великому розведенні, і таким чином, зменшити неспецифічне зв'язування;
- Достатньою специфічністю в робочому розведенні;
- Переважанням мономерних форм над полімерними, тому що полімерні форми мають тенденцію до неспецифічної адгезії на пластику, що призводить до високого фонового рівня реакції;
- Оптимальним молярним співвідношенням між ферментом і антитілами (оптимальне співвідношення становить близько 1:1);
- Достатньою ферментативною активністю кон'югату. Це властивість визначається головним чином умовами кон'югації і співвідношенням молекул ферменту і антитіл в кон'югати.
Тверда фаза
В якості твердої фази для проведення ІФА можна застосовувати різні матеріали: полістирол, полівінілхлорид, поліпропілен та інші речовини. Твердою фазою можуть служити стінки пробірки, 96-ямковий та ін планшети, кульки, намистини, а також нітроцелюлозні і інші мембрани, активно сорбуючі білки.
Іммобілізація антигену або антитіл на твердій фазі можлива трьома шляхами:
- Пасивна адсорбція, заснована на сильних гідрофобних взаємодіях між білками і синтетичної поверхнею;
- Ковалентное прикріплення до твердої фази;
- Імунохімічної та ін (нековалентно і неадсорбціонное приєднання).
Пасивна адсорбція білків широко використовується при проведенні ІФА на платах для титрування, на нітроцелюлозних мембранах. Пасивна адсорбція відбувається за принципом насичення і корелює з молекулярною масою адсорбуються речовини. Адсорбційна поверхню мембран різного типу (нітроцелюлоза, нейлон тощо) у 100-1000 разів вище, ніж у пластика.
Полісахариди і сільноглікозілірованние білки часто мають низьку афінність для полістиролу. Необхідні інші методи для їх іммобілізації, наприклад, ковалентное приєднання за допомогою глутарового альдегіду. Ковалентное приєднання ефективно, якщо в якості твердої фази використовуються гідрофільні намиста (агарози) і полістиролові намисто.
Імунохімічні методи грунтуються на використанні попередньо адсорбованих «пасткових» антитіл для іммобілізації антигену або антитіл. Антиген, іммобілізований імунохімічних, в 10 разів активніше, ніж пасивно адсорбований антиген. Можуть використовуватися лектини або імуноглобулін-зв'язуючі білки бактерій, які легко адсорбуються на пластику або інших гідрофобних поверхнях, наприклад конканавалін А (Кон А) або стаффілококковий білок А. Кон А здатний іммобілізувати gp 120 - білок вірусу ВІЛ.
Вільні сайти на поверхні твердої фази, не пов'язані з сорбуємість агентом, можуть фіксувати в ході тесту інші молекули, у тому числі і кон'югати, що призводить до підвищення фонового сигналу. Для запобігання неспецифічного зв'язування після іммобілізації на тверду фазу основного матеріалу проводять обробку нейтральними для тесту речовинами. Найбільш популярні блокують агенти - бичачий сироватковий альбумін (БСА), казеїн і ін Вибір блокуючого агента і умови проведення цього етапу залежать від типу твердої фази, чутливості системи. Реферат
Самойлик Павло Володимирович інтерн кафедри «Клінічної лабораторної діагностики»
Російський державний медичний університет
2009
Введення.
Методи імунного аналізу широко увійшли в медичну практику. У всіх областях сучасної медицини використовується імунний аналіз, переважно, з діагностичною та аналітичної цілями. Особливо важливо, що вони дають можливість ідентифікувати біологічні компоненти (гормони, ферменти, нейропептиди, продукти імунної системи, антигени і т.д.) в низьких і дуже низьких концентраціях. Всі продукти, проти яких можливе отримання антитіл, виявляються цими методами.
Імунний аналіз грунтується на взаємодії антигену (АГ) і антитіла (АТ) з використанням різних варіантів мічення одного з компонентів (фермент, радіонуклід, флуоресцентний барвник та інші). Оцінка реакції проводиться автоматично на спеціальній апаратурі, що дозволяє стандартизувати ці методи.
Залежно від типу використовуваної мітки і умов роботи тесту імунний аналіз позначається як імуноферментний (ІФА), радіоімунний (РІА), імунофлуоресцентний та інші. При постановці реакцій в один або декілька етапів вони позначаються як прямі або непрямі. Має значення середовище, в якому проводиться реакція. Якщо реакція проводиться з реагентами, фіксованими на поверхні, то тест позначається як твердофазний, наприклад ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).
У даній роботі буде розглянуто тільки імуноферментний аналіз - метод широко поширений в біології та медицині, як практичної, так і фундаментальної.
Імуноферментний аналіз.
ІФА з'явився в середині 60-х років і спочатку був розроблений як метод для ідентифікації антигену в гістологічному препараті, а також для візуалізації ліній преципітації в тесті імунодифузії і імуноелектрофорез, а потім став використовуватися для кількісного визначення антигенів і антитіл в біологічних рідинах. У розробці методу брали участі Є. Енгвалл і Р. Пелман, а також незалежно від них В. Ван Вееман і Р. Шурс.
Малюнок 1. Основний прінцип ІФА.
1) Для виявлення антигенів. 2) Для виявлення антитіл.
Метод заснований на специфічному зв'язуванні антитіла з антигеном, при цьому один з компонентів кон'юговані з ферментом, в результатереакціі з відповідним хромогенних субстратом утворюється забарвлений продукт, кількість якого можна визначити спектрофотометрично (рис. 1).
Відкриття можливості іммобілізації антигену та антитіла на різних носіях із збереженням їх зв'язує активності дозволило розширити використання ІФА в різних галузях біології та медицини.
Поява моноклональних антитіл послужило подальшому розвитку ІФА, що дозволило підвищити його чутливість, специфічність і відтворюваність результатів.
Теоретично ІФА грунтується на даних сучасної імунохімії та хімічної ензимології, знанні фізико-хімічних закономірностей реакції антиген-антитіло, а також на головних принципах аналітичної хімії. Чутливість ІФА і час його проведення визначається декількома основними чинниками: кінетичними, термодинамічними характеристиками реакції антиген-антитіло, співвідношенням реагентів, активністю ферменту і роздільною здатністю методів його детекції. У загальному вигляді реакція антиген-антитіло може бути описана простою схемою:
[AT] + [АГ] ↔ [Атаги]
Різноманітність об'єктів дослідження від низькомолекулярних з'єднань до вірусів і бактерій, а також надзвичайно широке коло завдань, пов'язаних з різноманіттям умов застосування ІФА, обумовлюють розробку надзвичайно великого кількість варіантів цього методу.
Будь-який варіант ІФА містить 3 обов'язкові стадії:
1. стадія впізнавання тестованого з'єднання специфічним до нього антитілом, що веде до утворення імунного комплексу;
2. стадія формування зв'язку кон'югату з імунним комплексом або з вільними місцями зв'язування;
3. стадія перетворення ферментної мітки в реєстрований сигнал.
Класифікація ІФА.
В основу класифікації методів ІФА покладено кілька підходів:
1. За типом реагентів, присутніх на першій стадії ІФА, розрізняють конкурентний і неконкурентний методи.
А) У конкурентному ІФА на першій стадії в системі присутні одночасно аналізоване з'єднання і його аналог, мічений ферментному і конкуруючий за центри специфічного зв'язування з ним.
Б) Для неконкурентних методів характерна присутність в системі на першій стадії тільки аналізованого з'єднання і специфічних до нього центрів зв'язування.
2. Всі методи ІФА делют на гомогенні та гетерогенні.
Якщо всі три стадії ІФА проходять в розчині і між основними стадіями немає додаткових етапів поділу утворилися імунних комплексів від непрореагіровавшіх компонентів, метод належить до групи гомогенних.
В основі гомогенного ІФА, застосовуваного, як правило, для визначення низькомолекулярних субстанцій, лежить інгібування активності ферменту при його поєднанні з антигеном або антитілом. Активність ферменту відновлюється в результаті реакції антиген-антитіло.
При зв'язуванні антитіла з антигеном, що містить ферментну мітку, відбувається інгібування активності ферменту на 95% по відношенню до високомолекулярних субстрату, що обумовлено стеричним винятком субстрату з активного центру ферменту. У міру збільшення концентрації антигену зв'язується все більше антитіл і зберігається все більше вільних кон'югатів антиген-фермент, здатних гідролізувати високомолекулярний субстрат. Аналіз проводять дуже швидко, для одного визначення потрібно 1 хвилина. Чутливість методу досить висока. З його допомогою можна визначити речовину на рівні пікомолей.
Для гетерогенних методом характерно проведення аналізу в двофазної системі з участю твердої фази - носія, і обов'язкова стадія поділу імунних комплексів від непрореагіровавшіх компонентів (відмивання), які знаходяться в різних фазах (які утворилися імунні комплекси знаходяться на твердій фазі, а непрореагіровавшіх комплекси - в розчині) . Гетерогенні методи, в яких формування імунних комплексів на першій стадії протікає на твердій фазі, називають твердофазним методами.
Методи відносяться до гомогенно-гетерогенним, якщо 1 стадія - утворення специфічних комплексів відбувається в розчині, а потім для розділення компонентів використовують тверду фазу з іммобілізованими реагентом.
3. За принципом визначення тестованого речовини:
А) Пряме визначення концентрації речовини (антигену чи антитіла) за кількістю провзаімодействующіх з ним центрів зв'язування. У цьому випадку ферментна мітка буде знаходитися в утворився специфічному комплексі АГ-АТ. Концентрація визначається речовини буде прямо пропорційна реєстрованим сигналу.
Б) Визначення концентрації речовини за різницею загального числа місць зв'язування і залишилися вільними центрів зв'язування. Концентрація визначається речовини при цьому буде зростати, а реєстрований сигнал знижуватися, отже, в даному випадку простежується зворотна залежність від величини реєстрованого сигналу.
Характеристика компонентів, що використовуються в ІФА.
Ферменти.
Ферментні мітки володіють надзвичайно мощьний каталітичною дією, одна молекула ферменту може реагувати з великою кількістю молекул субстрату. Таким чином, фермент, присутній у незначних кількостях, можна виявити і кількісно визначити за освітою продуктів, що каталізується їм реакції. Інша перевага застосування ферментів в якості міток обумовлено наявністю в молекулі численних функціональних груп (сульфгідрильних, карбоксильних, залишків Тирозин та ін), через які можна ковалентно приєднати молекули ліганду.
Ферментні маркери, які використовуються в ІФА, повинні володіти наступними властивостями:
- Висока активність і стабільність ферменту за умов аналізу, при модифікації і в кон'югату з антитілами або іншими білками;
- Наявність чутливих субстратів і простота методу визначення продуктів або субстратів ферментативної реакції;
- Можливість адаптації субстратні систем до подальшого посилення;
- Відсутність ферменту і його інгібіторів в досліджуваній біологічної рідини.
У ІФА може використовуватися не менше 15 різних ферментів. Найбільше застосування, відповідно до вищезгаданими вимогами, знайшли пероксидаза хрону (ПХ), лужна фосфотаза (ЛФ) і β-D-галактозидаза (табл.1). Всі три стабільні і каталізують високочутливі реакції. Крім того, продукти, одержувані в результаті реакцій, що каталізуються цими ферментами, в залежності від використовуваного субстрату, можуть виявлятися не тільки колориметричними методами, але також флуоресцентними методами. Інші ферменти використовуються значно рідше. Це пояснюється їх більш низькою у порівнянні з ПХ і ЛФ питомою активністю.
Субстрати.
Вибір субстрату в першу чергу визначається використовуваним в якості мітки ферментом, так як реакція фермент-субстрат високо специфічна.
Основні вимоги до субстрату:
- Забезпечення високої чутливості методу при виявленні ферменту в кон'югату;
- Освіта добре врахованих (наприклад, забарвлених) продуктів реакції фермент-субстрат;
- Субстрат повинен бути безпечним, дешевим, доступним і зручним для застосування.
Таблиця 1.
Ферменти та їх субстрати найбільш широко використовувані в ІФА.
| Фрмент | Джерело отримання | М.М. (КДа) | Субстрат (рекомендована довжина хвилі при фотометрії, нм) | Кон'югуються реагент |
| Пероксидаза хрону | Хрін (Armoracia rusticana) | 40 | О-фенілендіаміндігідро-хлорид (ОФД, 492 нм) 5-аміносаліцилова кислота (450 нм), діамінобензідін, про-діанізідін. | Глутаральдегід Мета-перйодатом натрію N-сукцінімід-3 (2-піріділдітіо) пропіонат |
| β-D-Галак-тозідаза | E. Coli | 540 | О-нітрофеніл-β-D-галактозид (420 нм) | Мета-малеімідобензол-N-гідроксісукцінімідний ефір |
| Лужна фосфотаза | E. Coli, слизова кишечника теляти | 84-150 | Р-нітрофенілфосфат (405 нм), 5-Бром-4-хлоро-3-фосфат індоліл | Глутаральдегід |
Антигени та антитіла.
АГ і AT, використовувані в ІФА, повинні бути високоочішеннимі і високоактивними. Крім того, АГ повинні володіти високою антигенів, оптимальної щільністю і кількістю антигенних детермінант, чужорідне і гомогенністю. Багато синтетичних та рекомбінантні АГ вірусів і бактерій добре себе зарекомендували при використанні в ІФА. Це істотно підвищило специфічність і відтворюваність методу за рахунок зведення до мінімуму перехресних реакцій.
Одним з найбільш важливих реагентів в ІФА є антитіла. Чутливість ІФА залежить від концентрації, активності та специфічності використовуваних антитіл. Використовувані антитіла можуть бути полі-або моноклінальними, різного класу (IgG або IgM) і підкласу (IgGl, IgG2), антіаллотіпіческімі або антіідіотіпіческіе. При низькій афінності AT розпад комплексу АГ-АТ призводить до видалення пов'язаного АГ із системи. Чутливість і специфічність методу підвищується при використанні моноклональних антитіл. У цьому випадку з'являється можливість виявляти низькі концентрації АГ (AT) у випробовуваних зразках.
Освіта кон'югату
Кон'югат - це антиген або антитіло, мічені ферментної міткою. Освіта коньюгата - один з важливих етапів проведення ІФА.
При формуванні кон'югату підбирають такий оптимальний метод введення ферментної мітки, щоб обидва компоненти кон'югату зберігали свою біологічну активність: фермент - здатність взаємодіяти з субстратом, а антиген або антитіло - антигенність антигензв'язуючих активність, відповідно. Наявність міченого, високоочищеного антигену дозволяє використовувати конкурентні методи. У цьому випадку на кінцевому етапі можна вимірювати активність кон'югату, не пов'язаного з іммобілізованими антитілами, що дозволяє уникнути процедури відмивання і робить аналіз більш зручним. Однак антигени різноманітні за своїми фізико-хімічними властивостями і будовою, а значить неможливо розробити загальні механізми для отримання кон'югату з антигеном. У цьому випадку одержання кон'югату антигену з ферментом представляє собою окрему складну задачу. Приготування мічених антитіл для ІФА методично більш доступно.
Кон'югування ферменту з імунохімічних активними білками проводиться різними методами: хімічна зшивання, ковалентное зв'язування молекули ферменту з АГ або AT та освіта з'єднань через нековалентниє зв'язку, наприклад, коли зв'язок між ферментом і АГ або AT здійснюється імунологічно, через взаємодію антиген-антитіло.
Найбільш широке поширення одержали ковалентні способи приготування кон'югатів. Вибір реакції зв'язування визначається типом доступних функціональних груп в даних білкових молекулах. В якості реагентів, що використовуються для введення ферменту в молекули антигенів і антитіл, використовують глутаровий альдегід, перйодатом натрію і ін
Існує одноетапний і двоетапний методи отримання кон'югатів за допомогою глутарового альдегіду. Можуть утворюватися кон'югати різних розмірів з скороченої ферментативною активністю (15 - 60% від вільного ферменту). Утворився кон'югат великих розмірів може стерично ускладнювати визначення тестованого речовини. Кон'югати з відносно низькою молекулярною масою складаються з Fab-фрагменти та однієї молекули ферменту.
У результаті двохетапного синтезу, який полягає в поетапному отриманні спочатку модифікованого за допомогою агента, що зшиває ферменту, його виділення, а потім подальшому його взаємодії з антигеном (антитілом), утворюються молекули однорідного складу, які містять 1-2 молекули ферменту на молекулу імуноглобуліну і зберігають високу ферментативну і імунологічну активність. Однак кількість таких утворилися кон'югатів невелика (для пероксидази хрону становить 5 - 10%).
Найбільше практичне застосування знайшов метод отримання іммунопероксідазний кон'югатів, заснований на окисленні вуглеводного компонента ферменту перйодатом натрію (зв'язування пероксидази у кон'югат досягає 70-90% від початкового кількості ферменту).
Надійний кон'югат повинен володіти наступними властивостями:
- Високим антитільних тигром і високої афінністю до антигену, щоб його можна було використовувати у великому розведенні, і таким чином, зменшити неспецифічне зв'язування;
- Достатньою специфічністю в робочому розведенні;
- Переважанням мономерних форм над полімерними, тому що полімерні форми мають тенденцію до неспецифічної адгезії на пластику, що призводить до високого фонового рівня реакції;
- Оптимальним молярним співвідношенням між ферментом і антитілами (оптимальне співвідношення становить близько 1:1);
- Достатньою ферментативною активністю кон'югату. Це властивість визначається головним чином умовами кон'югації і співвідношенням молекул ферменту і антитіл в кон'югати.
Тверда фаза
В якості твердої фази для проведення ІФА можна застосовувати різні матеріали: полістирол, полівінілхлорид, поліпропілен та інші речовини. Твердою фазою можуть служити стінки пробірки, 96-ямковий та ін планшети, кульки, намистини, а також нітроцелюлозні і інші мембрани, активно сорбуючі білки.
Іммобілізація антигену або антитіл на твердій фазі можлива трьома шляхами:
- Пасивна адсорбція, заснована на сильних гідрофобних взаємодіях між білками і синтетичної поверхнею;
- Ковалентное прикріплення до твердої фази;
- Імунохімічної та ін (нековалентно і неадсорбціонное приєднання).
Пасивна адсорбція білків широко використовується при проведенні ІФА на платах для титрування, на нітроцелюлозних мембранах. Пасивна адсорбція відбувається за принципом насичення і корелює з молекулярною масою адсорбуються речовини. Адсорбційна поверхню мембран різного типу (нітроцелюлоза, нейлон тощо) у 100-1000 разів вище, ніж у пластика.
Полісахариди і сільноглікозілірованние білки часто мають низьку афінність для полістиролу. Необхідні інші методи для їх іммобілізації, наприклад, ковалентное приєднання за допомогою глутарового альдегіду. Ковалентное приєднання ефективно, якщо в якості твердої фази використовуються гідрофільні намиста (агарози) і полістиролові намисто.
Імунохімічні методи грунтуються на використанні попередньо адсорбованих «пасткових» антитіл для іммобілізації антигену або антитіл. Антиген, іммобілізований імунохімічних, в 10 разів активніше, ніж пасивно адсорбований антиген. Можуть використовуватися лектини або імуноглобулін-зв'язуючі білки бактерій, які легко адсорбуються на пластику або інших гідрофобних поверхнях, наприклад конканавалін А (Кон А) або стаффілококковий білок А. Кон А здатний іммобілізувати gp 120 - білок вірусу ВІЛ.
Варіанти постановки ІФА.
Загальний принцип.
В даний час використовується величезна кількість всіляких різновидів і модифікацій ІФА. Широке поширення одержали різні варіанти твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA).
Твердофазний ІФА був запропонований у 1971 році. Основні принципи твердофазного ІФА, незалежно від модифікації, полягають в наступному:
1. На 1 етапі реакції адсорбують антигени або антитіла на твердій фазі. При цьому ви не пов'язані з твердою фазою реагенти легко видаляються відмиванням.
2. У сенсибілізованих лунках інкубують досліджуваний зразок. У лунках з позитивним контролем - стандартні реагенти. При цьому на поверхні твердої фази формуються імунні комплекси. Незв'язаних компонентів видаляють відмиванням.
3. При додаванні кон'югату антитіло-фермент або антиген-фермент і зв'язуванні його з іммобілізованим імунним комплексом активний центр ферменту залишається доступним для подальшої взаємодії з субстратом. Інкубація субстрату в лунках з іммобілізованим кон'югатом призводить до розвитку кольорової реакції. Цю реакцію можна зупинити на потрібній стадії, вираженість фарбування можна оцінити візуально або за оптичної щільності.
Важливий етап будь-якого варіанту твердофазного аналізу - процедура відмивання від непов'язаних реагентів. Важливо не просто сполоснути фіксовані на твердій фазі компоненти, а видалити реагенти з усієї глибини шару. Це найбільш тривалі і трудомісткі етапи аналізу. Промивання проб може проводитися в автоматичному режимі за допомогою спеціального приладу - вошера або вручну, багатоканальної піпеткою. Для проведення ІФА необхідні:
- Полістироловий планшет або інші використовуються варіанти твердої фази;
- Відмивати розчин;
- Кон'югат (мічені ферментної міткою антигени або антитіла);
- Суміш використовуваних субстратів;
- Зупиняє розчин (Стоп-реагент - розчин для останавліванія реакції);
- Зразки, що використовуються для позитивного і / або негативного контролю;
- Стандартний антиген (для побудови калібрувальної кривої);
- Одно-і багатоканальні піпетки;
- Вошер (промивач);
- Оптичний прилад для визначення оптичної щільності досліджуваного розчину (ІФА-рідер, зчитувач, який послідовно Фотометрують всі лунки);
- 5-100 мкл досліджуваного біологічного матеріалу.
Прямий ІФА
1. У лунках панелей адсорбують антигени або антитіла (досліджуваний матеріал). Вище зазначалося, що антигени істотно розрізняються за здатністю адсорбуватися на різних видах пластику в залежності від того, до якого класу речовин (білків, вуглеводів або ліпопротеїнів) вони належать. Часто в прямому ІФА антиген, іммобілізований на твердій фазі, це клітини та інші корпускулярні антигени.
Контроль. В якості контролю використовують лунки з адсорбованим позитивним контрольним зразком, в якому обов'язково міститься шуканий антиген, і негативним контрольним зразком свідомо не містить досліджуваного антигену. При наявності очищеного стандартного антигену реакцію проводять у кількох розведеннях, так щоб можна було побудувати калібрувальну криву.
2. «Блокують вільні місця зв'язування, що залишилися на твердій фазі, за допомогою БСА казеїну та ін (для запобігання неспецифічної сорбції кон'югату на твердій фазі).
3. В лунки вносять мічені ферментом антитіла або антигени (кон'югат), інкубують. Зв'язування кон'югату з твердою фазою буде відбуватися лише у випадку комплементарності обох компонентів системи. Після інкубації з кон'югатів лунки відмивають, видаляючи, таким чином, не пов'язану частина кон'югату.
4. Потім у лунки вносять субстрат, специфічний для використовуваного ферменту, і інкубують. Після досягнення оптимального рівня фарбування в лунках з позитивним контролем, ферментативну реакцію зупиняють.
5. Облік реакції. Спочатку результати реакції враховують візуально. Для більш точного обліку результатів інтенсивність фарбування оцінюють на ІФА-рідері з відповідним світлофільтром. За результатами проведеного аналізу будують графік залежності оптичної плотносгі від концетраціі (рис. 2).
Малюнок 2. Прямий ІФА.
а) для виявлення антигену; б) для виявлення антитіл.
Непрямий ІФА
Цей варіант ІФА використовують зазвичай для виявлення специфічних антитіл. У лунках панелей адсорбують стандартний антиген і інкубують з зразками сироватки або іншого біологічного матеріалу, отриманого від хворого (спинномозкова рідина, слина та ін.) Специфічні антитіла, що зв'язалося з антигеном на твердій фазі, виявляють за допомогою антіглобуліновой кон'югату. Залежно від мети аналізу використовують різні антіглобуліновой реагенти, що виявляють антитіла всіх ізотипів, або специфічні до окремих класів і підкласів імуноглобулінів. Основна перевага методу полягає в універсальності кон'югату. Один і той же кон'югат може служити для виявлення антитіл людини до самих різних антигенів у будь-яких зразках. Реакція методично проста.
Основні етапи непрямого ІФА для визначення антитіл:
1. Антиген адсорбують на твердій фазі, потім відмивають від незв'язаних компонентів.
2. Блокують вільні месга зв'язування. Відмивають.
3. В лунки вносять досліджуваний матеріал, інкубують і потім проводять процедуру відмивання. Паралельно ставлять проби з позитивним і негативним контролями.
4. Додають антіглобуліновой кон'югат у робочому розведенні, інкубують, відмивають від незв'язаних компонентів.
5. Вносять субстрат, інкубують. Після досягнення оптимального рівня фарбування в лунках з позитивним контролем реакцію зупиняють, додаючи стоп-розчин.
6. Вимірюють кількість продукту реакції на ІФА-рідері (рис.3).
За оптимальних умов проведення аналізу метод високоспеціфічен і чутливий. Він дозволяє виявляти нанограммовие кількості антитіл у сироватках досліджуваних хворих. Для отримання задовільних результатів необхідна стандартизація реагентів і методичних прийомів. Цей варіант ІФА може також використовуватися для тестування моноклональних антитіл.
«Сендвіч» - варіант ІФА для виявлення антигенів.
Антигени, що визначаються за допомогою даного варіанту ІФА, повинні мати кілька епітопів, здатних зв'язувати антитіла, або володіти повторюваними, просторово розділеними епітопи однаковою специфічності.
При проведенні цього варіанту ІФА високоспецифічні полі-або моноклональні антитіла, адсорбовані на твердій фазі, інкубують з досліджуваним зразком. Після процедури відмивання в лунки вносять мічені ферментом антитіла (кон'югат) до того ж антигену і далі проводять всі інші етапи реакції. Ефективність освіти специфічного комплексу на кожній стадії аналізу залежить від константи зв'язування реакції антиген-антитіло.
Основні етапи аналізу:
1. На твердій фазі мобілізують моноклональні антитіла або афінно-очищені поліклональні антитіла.
2. У лунки панелей вносять досліджуваний зразок, паралельно ставлять позитивний контрольний зразок і негативний контрольний зразок у різних розведеннях. Інкубують і відмивають.
3. В лунки вносять мічені ферментом моноклональні або поліклональні антитіла - кон'югат. Після інкубації проводять відмивання.
4. Вносять субстрат, інкубують. Реакцію зупиняють при досягненні оптимального фарбування в лунках з позитивним контролем.
5. Облік результатів на ІФА-рідері.
Основною перевагою методу є висока чутливість, що перевершує можливості інших схем ІФА (рис. 4).
Малюнок 3. Непрямий ІФА для виявлення антитіл.
Конкурентний ІФА.
Цей варіант аналізу заснований на конкуренції мічених (кон'югат) і немічених (досліджуваних) антитіл за зв'язування з антигеном, адсорбованим на твердій фазі. Кількість ферменту, який приєднався до твердої фази, зменшиться пропорційно вмісту в суміші вільних антитіл. Для визначення антигену використовується той же варіант, але в цьому випадку шуканий антиген конкурує з міченим, стандартним антигеном за зв'язування з антитілами, іммобілізованими на поверхні твердої фази.
Конкурентний метод вимагає мінімального числа операцій, незначного витрати реагентів і легко може побут автоматизований. При проведенні конкурентного ІФА для виявлення антитіл краще використовувати мічені моноклінальних антитіла, тоді конкуренція кон'югату з досліджуваним зразком відбувається за єдиний епітопи адсорбованого на твердій фазі антигену. Цей варіант ІФА застосовується для визначення різних сполук, таких як імуноглобуліни людини, раково-ембріональний антиген, інсулін та ін Він дозволяє виявляти антитіла до діагностично значимим епітопів інфекційних агентів.
Основні етапи аналізу для виявлення антигену (рис.5):
1. На твердій фазі мобілізують специфічні для виявляється антиген моноклональні антитіла.
2. У лунки панелей вносять у відомій концентрації антиген, мічений ферментом, і досліджуваний зразок. Проводять інкубацію та відмивання. Паралельно в сусідніх лунках ставлять позитивний і негативний контролі. Для побудови калібрування використовують стандартний немічених антиген в різних розведеннях.
3. Додають субстрат, інкубують, зупиняють реакцію при розвитку оптимального фарбування в лунках з позитивним контролем.
4. Облік реакції на ІФА-рідері.
У цьому випадку кількість антигену в досліджуваному зразку назад пропорційно ферментативної активності на твердій фазі.
Інгібіторний ІФА.
У цьому варіанті ІФА антиген, присутній в досліджуваному зразку, зв'язується з моноклональними антитілами, міченими ферментної міткою, та інгібує їх взаємодія зі стандартним антигеном, іммобілізованим на твердій фазі. Присутність у зразку навіть слідових кількостей специфічного до кон'югату антигену буде пригнічувати зв'язування мічених антитіл з іммобілізованим антигеном. Ступінь інгібування прямо пропорційна вмісту антигену у розчині. Для проведення кількісного аналізу будують калі6ровочную криву за допомогою послідовних розведень стандартного антигену. Основні етапи інгібіторного ІФА для виявлення антигену (рис.6).
1. У лунках панелей адсорбують стандартний антиген. Підбирають робоче розведення мічених антитіл за допомогою титрування.
Малюнок 4. «Сендвіч» - варіант ІФА.
2. Проводять попередню інкубацію кон'югату в розведенні, що передує робітникові, з разведениями досліджуваного зразка, стандартного антигену і позитивних контрольних проб.
3. Суміш переносять в лунки панелей. Для контролю 100%-ного зв'язування в кілька лунок вносять тільки мічені антитіла, без інгібуючої антигену. Конфіденційність інкубують, потім проводять відмивання.
4. Додають субстрат.
5. Проводять облік результатів.
Концентрація визначається антигену в досліджуваному зразку обернено пропорційна ферментативної активності на твердій фазі.
ІФА може використовуватися не тільки для визначення розчинного антигену чи антитіла, але і клітин, що виробляють різні білки.
Метод імуноферментних плям (ELISPOT).
У 1983 році адаптували технологію твердофазного ІФА для визначення лімфоїдних клітин, які секретують антитіла або антигени (наприклад, цитокіни), in vitro. Метод отримав назву ELISPOT (метод імуноферментних зон або плям). Основний принцип методу:
1. На поверхні полистироловом лунки (використовують 24-х ямковий панелі для культивування клітин) сорбують антигени або антитіла, які служать «пасткових» реагентами.
2. Додають досліджувані лімфоїдні клітини, культивують кілька годин при 37 ° С, даючи їм можливість зайняти певне місце і виконати секреторну функцію. Антитіла або антигени, секретуються такими клітинами, уловлюються адсорбованими на твердій фазі реагентами.
3. Клітини видаляють, використовуючи для цього відмивають розчин з детергентом, лизирующие клітини.
4. Ділянки накопичення секреторних продуктів виявляють, додаючи пов'язані з ферментом антитіла (антіглобуліновой реагент).
5. Додають суміш субстрату з агарози (використовувані субстрати повинні розчинятися в агарози і утворювати нерозчинні продукти реакції), на поверхні твердої фази утворюються коричневі або блакитні плями (у залежності від використовуваних ферментів і субстратів), виявляючи ділянки, де розташовувалися клітини.
• Утворилися плями підраховують під мікроскопом, це і буде кількість секретирующих клітин.
В якості твердої фази може бути використана нітроцелюлозна мембрана У цьому випадку є ряд переваг: із-за високої адсорбційної здатності НЦМ потрібна значно менша кількість антигену, що використовується як «ловушечного» реагенту, крім того, відпадає необхідність у включенні агарози в субстрат.
При паралельному визначенні кількості секретують клітин та загальної кількості секретується антигену чи антитіла в лунці, що можливо при використанні іншого субстрату, можна виявити кількість секретується речовини одиничної клітиною.
Даний метод знайшов широке застосування для оцінки кількості клітин, які секретують антиген, вловлює адсорбованими антитілами, використовується для визначення кількості клітин, які секретують цитокіни (ІЛ-1, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, ІФН-у, ФНП-а) .
Системи посилення сигналу.
При використанні високоаффінних антитіл чутливість окремих варіантів ІФА дуже висока і теоретично дозволяє виявити поодинокі молекули антигену, але на практиці чутливість обмежується низкою факторів: активністю ферменту, інтенсивністю сигналу і методами обліку сигналу. Системи посилення сигналу дають можливість підвищувати чутливість різних варіантів ІФА. Розглянемо деякі такі системи:
На основі взаємодії авидин-біотин.
Молекули коферменту біотину (м.м. 244 Да) кон'югують з антитілами за допомогою біотин-N-гідроксісукціміда. Невеликих розмірів молекулу біотину простіше приєднати до імуноглобуліну або іншого білка без порушення його імунних або ферментативних властивостей. Фермент в цьому випадку пов'язують з глікопротеїном яєчного білка авидин. Аффінносгь зв'язування авидин з біотином дуже висока (константа дисоціації комплексу - 10-15 моль), кон'югат авидин-фермент міцно фіксується на комплексі антиген-антитіло-біотин. Після додавання відповідного субстрату проводять визначення продукту реакції спектрофотометрично або за інтенсивністю люмінесценції.
Одна молекула авидин складається з чотирьох ідентичних субодиниць, здатна взаємодіяти з чотирма молекулами біотину, що дозволяє використовувати його як сполучну молекулу між двома біотінсодержащімі сполуками. У цьому випадку фермент теж біотініліруют, а авидин виконує функцію містка, поєднуючи дві молекули, що містять залишки біотину. До комплексу, антиген-антитіло-біотин додають вільний авидин, а потім біотінілірованний фермент. Проводять облік реакції.
Білок авидин може неспецифічно сорбироваться на інших молекулах, тому все частіше використовують інший біотінсвязивающій білок - стрептавідин, виявлений в бактеріях Streptomyces avidinii. Стрептавідин також утворює міцний комплекс з біотином і складається з чотирьох ідентичних субодиниць.
Застосування авидин-біотінового комплексу дозволяє значно підвищити чутливість ІФА, тому що при синтезі кон'югату з однією молекулою АТ можна зв'язати десятки молекул біотину. Отримання кон'югатів (антитіл і ферментів з біотином) здійснюється досить легко і супроводжується мінімальними змінами їх імунологічної та ферментативної активності. Кон'югати ферментів з біотином можуть бути використані як універсальні реагенти.
Використання хемілюмінесцентних реакцій.
Хемілюмінесцентні реакції можна використовувати для отримання сигналу в ІФА, при цьому підвищується чутливість методу і скорочується час проведення аналізу. У якості мітки в ІФА широко застосовують пероксидазу хрону, для її виявлення можна використовувати і різні Хемілюмінесцентні реакції. Хемілюмінесцентні реакції засновані на здатності люмінолу світитися при окисленні перекисом водню. У прямому аналізі при ферментативної реакції утворюється перекис водню і окисляє люмінол, каталізатором цієї реакції виступає пероксидаза хрону. Для посилення сигналу використовуються різні сполуки, наприклад, люціферін, феноли, в цьому випадку інтенсивність люмінесценції посилюється в 10-100 разів, в окремих випадках у 500 разів (посилений хемілюмінесцентний аналіз). Люмінесцентний сигнал дуже стабільний, його рівень досягає максимуму за 30 с (для порівняння: кольорова реакція з ОФД як індикатор повністю розвивається лише за 30 хв).
При непрямому аналізі люмінолом або його похідними метится антитіло. Така мітка у вільному стані здатна окислюватися перекисом водню з виділенням світла. Якщо вона утворила комплекс, то втрачає здатність окислюватися.
На основі каскадних систем.
Для підвищення чутливості ІФА можна використовувати ферментні каскадні системи. У цьому випадку перший фермент, пов'язаний з антитілами, призводить до утворення відновлюваного субстрату для другої ферментної системи. Друга ферментна система може бути субстрат-циклічною чи редоксіцікліческой. Ферментними мітками в цьому випадку можуть служити фосфо-глюкоізомераза, альдолаза, лужна фосфатаза. Кінцевий продукт реакції визначають візуально або спектрофотометрично.
Системи ампліфікації в ІФА дозволяють домогтися високої чутливості. Такі ІФА-системи використовуються для визначення рівня гормонів (ти-реостімулірующего, прогестерону та ін.)
Практичне застосування ІФА.
ІФА знайшов широке застосування в різних областях медицини і біології завдяки відносній простоті і високої чутливості методу. ІФА успішно застосовується для:
• масової діагностики інфекційних захворювань (виявлення різних специфічних антигенів або антитіл до них);
• виявлення і визначення рівня гормонів та лікарських препаратів у біологічних зразках;
• визначення ізотипів (IgG, IgM та інші) антитіл проти конкретного антигену;
• виявлення імунних комплексів;
• виявлення онкомаркерів;
• визначення білків сироватки крові (феритин, фібронектину і ін);
• визначення загального IgE і специфічних IgE антитіл;
• скринінгу моіоклональних антитіл;
• визначення цитокінів в біологічних рідинах.
Чутливість методу
ІФА прийшов на зміну широко використовуваним раніше в клінічній практиці методам аглютинації, преципітації і РІА. У порівнянні з вищеназваними методами ІФА менш трудомісткий і менш тривалий за часом, зручний для виконання великого числа однотипних аналізів.
У ІФА поєднується унікальна специфічність иммунохимического аналізу з високою чутливістю визначення ферментної мітки. Чутливість методу (під чутливістю розуміють мінімальну виявляється кількість антитіл або антигену) визначається наступними факторами: афінності антитіл, краще використання моноклональних антитіл; специфічною активністю ферменту; інтенсивністю сигналу; чутливістю обліку сигналу. Різні варіанти ІФА різняться за своєю чутливості. Окремі варіанти твердофазного ІФА дозволяють виявляти в зразку поодинокі молекули. Середня чутливість ІФА - 10-9 - 10-12 моль.
Список літератури
Галактионов В.Г. Імунологія. Видавництво Московського університету, 1998 р.Кішкун А.А. Імунологічні дослідження та методи діагностики інфекційних захворювань в клінічній практиці. Медичне інформаційне агентство, 2009 р.
Кондратьєва І.А. Практикум з імунології. Навчальний посібник для ВНЗ. Академія, 2004 р.
Лефковітс І., Перніс Б. Імунологічні методи дослідження. Світ, 1988 р.
Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Імунологія. Світ, 2000 р.
Соколов Є.І. Клінічна імунологія. Медицина, 1998 р.
Фримель Г. Імунологічні методи. Медицина, 1987 р.
Хаитов Р. М. Імунологія. Медицина, 2000 р.
Шигіна Ю.В. Імунологія: Навчальний посібник. Видавництво РІОР, 2007 р.
Ярилин А.А. Основи імунології. Медицина, 1999 р.