Виявлення одиничних нуклеотидних замін в ДНК розщеплення РНКаз і денатуруючих градієнтний гель-електрофорез

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

Виявлення одиничних нуклеотидних замін в ДНК: розщеплення РНКаз і денатуруючих градієнтний гель-електрофорез

Введення

Методи виявлення нуклеотидних замін у геномної ДНК дозволили дослідникам розібратися в природі багатьох спадкових хвороб людини. Ці методи дають можливість ідентифікувати специфічні мутації, які призводять до захворювання, а також поліморфні ділянки ДНК, що використовуються в якості маркерів в генетичному аналізі. Завдяки розвитку методів виявлення нуклеотидних замін стала реальністю пренатальна діагностика багатьох спадкових хвороб людини. Якщо ген, що відповідає за захворювання, відомий, відповідну мутацію можна виявити в геномної ДНК або в РНК за допомогою блот-гібридизації з використанням мічених олігонуклеотидів в якості гібрідізаціонних зондів. У тому випадку, коли мутировавшая нуклеотидна послідовність невідома, заміни нуклеотидів можна визначити за поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів. ПДРФ виявляється по наявності або відсутності сайту рестрикції у фрагменті геномної ДНК при гібридизації міченого ДНК-зонда з обробленою рестріктазами геномної ДНК, расфракціонірованной за розміром в агарозному гелі і перенесеної на мембранний фільтр. Цей метод виявився дуже ефективним для виявлення як значущих мутацій, так і нейтрального поліморфізму в геномі людини та інших організмів. Однак більшу частину мутацій і поліморфних ділянок генома не вдається виявити за допомогою аналізу ПДРФ, оскільки ймовірність того, що заміна нуклеотиду змінить саме сайт рестрикції, низька. Так, наприклад, багато точкові мутації гена р-глобіну людини, що викликають таласемія, не змінюють сайтів рестрикції, а тому не можуть бути безпосередньо визначені отр аналізі ПДРФ. Крім того, виявилося, що в деяких ділянках геному ссавців поліморфізм незначний, що вкрай ускладнює виявлення в них ПДРФ навіть при використанні великої кількості різних рестриктаз. Кожен з них дозволяє ідентифікувати принаймні 50% всіх можливих замін нуклеотидів на ділянці ДНК Довжиною до 1000 пар основ

Завдання цієї роботи - докладно викласти суть нових методів, обговорити їх переваги та недоліки, розглянути деякі модифікації. Крім того, ми на прикладах покажемо, як можна використовувати запропоновані нами методи для дослідження фрагментів ДНК, отриманих при ампліфікації специфічних послідовностей в ході полімеразної ланцюгової реакції.

1. Загальний опис методів

1.1 РНКазное розщеплення

Одиничні нуклеотндние заміни у фрагментах геномної ДНК можна виявити при розщепленні неспарених ділянок в РНК-ДНК-дуплекс, обробляючи ці дуплекси РНКази А. Рис. 1 ілюструє послідовні етапи процедури.

1. Синтез рівномірно міченого одноланцюжковою РНК-зонда з використанням транскрипції in клонированного фрагмента ДНК. vitro клонованого фрагмента ДНК.

2. Гібридизація зонда з комплементарними послідовностями геномних ДНК - Якщо в гібріднзуемой ДНК є заміна нуклеотиду, що утворюють РНК-ДНК-дуплекси містять однонуклеотндние неспарені ділянки.

3. Обробка дуплексу РНКази А, що приводить до розщеплення ланцюга РНК з багатьох, хоча і не на всіх, неспареним нуклеотидам.

4. Аналіз мічених фрагментів РНК за допомогою денатуруючого гель-електрофорезу з наступною радіоавтографіей. У цьому випадку ефективне розщеплення за неспареним підставах призводить до появи на радіоавтографах двох мічених фрагментів РНК, розміри яких вказують на положення нуклеотидної заміни щодо решт фрагмента ДНК. Одиночний мічений фрагмент РНК, рівний по довжині фрагменту ДНК, спостерігається в тому випадку, якщо в останньому немає нуклеотидних замін або якщо існуючі заміни перешкоджають розщепленню РНК-ДНК-дуплекс РНКази.

На рис. 2 як приклад представлені результати реакцій РНКазного розщеплення. При такій обробці розщеплюється приблизно 30-40% від загального числа неспарених ділянок в РНК-ДНК-дуплексі. Тестування фрагмента ДНК у двох незалежних реакціях РНКазного розщеплення з двома зондами, комплементарними кожної з його ланцюгів, дозволяє виявити в ньому 60-70%: всіх можливих замін нуклеотидів, так як в цьому випадку виявляються навіть комплементарні заміни в обох ланцюгах.

Оптимальними, на наш погляд, є РНК-зонди і відповідно досліджувані на Однонуклеотидний заміни ділянки ДНК довжиною від 100 до 1000 нуклеотидів. У цьому випадку і сам зонд, і продукти його розщеплення легко виявляються за допомогою денатуруючого гель-електрофорезу в поліакриламідному гелі, аналогічному що використовується при секвенування ДНК. При цьому відношення сигналу до фону досить високо для отримання чітких результатів. Зовсім неважко напрацювати мічені одноланцюгові РНК-зонди набагато більшої довжини, але результати обробки таких довгих ланцюгів РНКази неоднозначні. Ще одна проблема, яка виникає при використанні зондів з довжиною ланцюга більше 1000 П.І., полягає в тому, що під дією РНКази поряд з розщепленням РНК-ДНК-дуплексів по неспареним ділянок може відбуватися розщеплення ланцюга РНК по комплементарно спареним ділянкам дуплексу. Крім того, аналіз продуктів розщеплення довгих РНК-зондів вимагає проведення денатуруючого електрофорезу в агарозному гелі. При цьому в ряді випадків не вдається повністю розділити гібриди РШ-ДШ і результати виходять суперечливими, оскільки фрагменти РНК, отримані при розщепленні її по неспареним ділянкам, але залишилися пов'язаними з ДНК, виявляються в гелі в зонах, відповідних довжині всього зонда. Для більш ефективного виявлення одиничних нуклеотидних замін шляхом РНКазного розщеплення ми використовували по кілька зондів у кожній реакції відпалу / розщеплення. Однак отримані таким способом результати часто дуже неоднозначні і практично не піддаються інтерпретації. У силу перерахованих причин при дослідженні фрагментів ДНК на поодинокі заміни ми б рекомендували використовувати в реакціях РНКазного розщеплення РНК-зонди довжиною від 100 до 1000 нуклеотидів.

Показано, що рибонуклеаза може розщеплювати неспарені ділянки і в дуплексу РНК-РНК. - ras -гене выявляются при расщеплении неспаренных участков дуплекса РНК–РНК, образованного мРНК гена H - ras За даними Перучо, поодинокі мутації в H - ras-гені виявляються при розщепленні неспарених ділянок дуплексу РНК-РНК, утвореного мРНК гена H - ras і його «антисмислової» мРНК. Наші дослідження показали, що природні мутації в гені р-глобіну і штучні мутації в промоторної ділянці гена р-інтерферону можна виявити при РНКазном розщепленні як РНК - ДНК-, так і РНК-РНК-дуплексів. На клонованої ДНК-матриці ми отримували рівномірно мічені одноланцюгові зонди «антисмислової РНК», ренатуріровалі їх з комплементарною мРНК, обробляли утворилися дуплекси РНКази, а потім ідентифікували продукти розщеплення денатуруючих електрофорезом в поліакриламідному гелі. Тому наведені нижче методики для дослідження зразків ДНК з рівним успіхом можуть використовуватися і при роботі з РНК.

1.2 денатуруючих градієнтний гель-електрофорез

Два фрагменти ДНК, що розрізняються лише делецій, інсерцій або заміною одного нуклеотиду, або єдиним неспареним нуклеотидом, можна легко розділити за допомогою денатуруючого градієнтного гель-електрофорезу, ДГГЕ. Принцип методу полягає у поділі дволанцюжкові фрагментів ДНК електрофорезом у стандартному акріламідном гелі з лінійним градієнтом денатуруючих факторів - сечовини, формамідом або температури. Нижче наводяться теоретичні основи методу. Тут відзначимо лише, що поділ дуже схожих фрагментів в гелі відбувається з-за різних температур плавлення їх ДНК.

1.2.1 Теоретичні основи методу ДГГЕ

При поступовому підвищенні температури або концентрації денатуруючого речовини відбувається плавлення дволанцюжкової ДНК, і для кожного фрагмента параметри цього процесу різні. Усередині фрагмента є так звані області плавлення - блоки послідовностей, плавящихся одночасно за певних дискретних значеннях температури, яка і є температурою плавлення даній області. Довжина таких областей складає від 25 до кількох сотень нуклеотидних пар. Два сусідніх домену можуть мати чітку межу і різнитися за Гт на кілька градусів. Фрагменти ДНК довжиною 100-1000 пар основ мають зазвичай від двох до п'яти областей плавлення. Температура плавлення доменів в рестрикційних фрагментах більшості зразків ДНК з природних джерел коливається від 65 до 80 ° С.

Загальновідомо, що нуклеотидний склад фрагментів ДНК впливає на температуру їх плавлення. Оптимальні умови для відпалу та відмивання нуклеїнових кислот в реакціях гібридизації підбирають виходячи з їх нуклеотидного складу. У набагато меншому ступені враховується внесок Стекінг-взаємодій в термодинамічну стабільність подвійної спіралі. А між тим енергія таких взаємодій між сусідніми нуклеотидами одного ланцюга ДНК, що утримують її у скрученому стані у фізіологічних розчинах, більше енергії водневих зв'язків комплементарного спаровування. Порядок чергування підстав визначає ступінь стекінгу і, отже, впливає на термостабільність фрагмента ДНК. Навіть одинична нуклеотидна заміна може так сильно позначитися на Стекінг-взаємодій, що Гт зміниться більш ніж на 1 ° С. Оскільки процес плавлення домену практично повністю визначається кооперативними взаємодіями, будь-яка одинична нуклеотидна заміна в будь-якій його точці буде міняти температуру плавлення,

Розроблений Лерманом і Фішером метод електрофоретичного розділення близьких послідовностей ДНК заснований на використанні відмінностей в температурі плавлення, обумовлених нуклеотидними замінами. Вони виходять з того факту, що послідовність підстав впливає на Тт області плавлення і що конформація фрагмента ДНК обумовлює його рухливість в гелі під дією електричного поля. Принцип методу - електрофорез ДНК в акріламідном гелі фіксованого концентрації з лінійно зростаючим до нижньої частини гелю градієнтом концентрації речовин, денатуруючих ДНК: зазвичай сечовини або формамідом. Електрофорезне камера нагрівається до температури приблизно 60 ° С.

Це трохи нижче температури плавлення самої легкоплавкой області у фрагменті ДНК - дволанцюжкова молекула ДНК входить в гель і просувається в ньому з швидкістю, пропорційною її молекулярній масі. Як тільки фрагмент досягає ділянки гелю, в якому температура камери і концентрація денатуруючих речовин створюють умови для плавлення першої, самої легкоплавкой області, він як би розгалужується: одна частина його залишається дволанцюжкової, а інша переходить у одноланцюжкову форму. Така розгалужена структура застряє в порах гелю, в результаті чого її рухливість знижується. Зниження електрофоретичної рухливості молекули корелює з співвідношенням довжин денатурованого і дволанцюжкової ділянок: чим довше самий легкоплавкий домен, тим сильніше знижується рухливість. Ділянка гелю, в якому молекула ДНК починає втрачати швидкість, відповідає самим легкоплавким доменам. Якщо концентрації денатуруючих речовин підібрані правильно, то два фрагменти ДНК, що розрізняються лише однієї нуклеотидної заміною і мають неоднакові значення Тт., Почнуть знижувати швидкість в різних ділянках гелю, і до кінця проходження через нього їх легко буде розділити. Раніше вважалося, що відокремити мутовані фрагменти від фрагмента ДНК дикого типу за рахунок різного ступеня зниження їх рухливості в ДГГЕ можна лише в тому випадку, якщо заміни відбулися в області з найнижчим значенням Тт. Однак аналіз великої кількості зразків ДНК, а також подальші теоретичні викладки показали, що в більшості випадків метод ДГГЕ дає можливість виявити нуклеотидні заміни в усіх областях плавлення, за винятком самих термостабільних. Заміни в областях з самої високою температурою плавлення зазвичай не виявляються, тому що по закінченні плавлення останнього домену ДНК повністю денатурує, а це призводить до порушення кореляції між конформацією молекули і швидкістю її просування. Важливо пам'ятати, що успіх при проведенні ДГГЕ з метою розділення мутованого фрагмента і фрагмента ДНК дикого типу визначається структурою фрагмента. Вона повинна бути розгалуженою, причому мутації повинні доводитися на області, які зазнали плавлення. -зажим». Для збільшення роздільної здатності методу до досліджуваного фрагменту ДНК «пришивали» послідовність з більш високою температурою плавлення ДНК, так званий «GC-затиск». При цьому всі області плавлення фрагмента, включаючи саму тугоплавку, ставали доступними для аналізу. -зажим». Ці досліди проводили з препаратами ДНК, клонованими в плазмідної векторі, що містить «GC-затиск». Щоб уникнути стадії клонування, фрагменти з «затискачами» можна отримати в полімеразної ланцюгової реакції.

Ще одним удосконаленням ДГГЕ слід вважати використання гетеродуплексних фрагментів, утворених мутованої ДНК і ДНК дикого типу. У попередніх дослідах порівнювали рухливість гомодуплексних фрагментів мутантної і початкової ДНК в паралельних доріжках при ДГГЕ. Робота з отриманими з них гетеродуплексамі дозволяє значно підвищити роздільну здатність методу і частку виявляються мутацій. Причина полягає в тому, що неспарені ділянки гетеродуплекса, в яких є Однонуклеотидний заміни, сильно знижують стзкінг-взаємодії підстав, дестабілізуючи вторинну структуру, а це, у свою чергу, призводить до зниження температури плавлення фрагмента ДНК-В ряді випадків заміна всього одного нуклеотиду обумовлювала зниження температури на цілих 6 ° С. Аналіз великого числа гетеродуплексов і теоретичні підрахунки показують, що всі можливі заміни нуклеотидів в легкоплавких доменах, що призводять до утворення неспарених ділянок у фрагменті ДНК, виявляються за допомогою ДГГЕ з імовірністю 100% за рахунок зміни рухливості. На частку легкоплавких областей у фрагментах ДНК від 100 до 1000 пар основ припадає в середньому понад 50% їх довжини, отже, використання гетеродуплексов таких фрагментів дозволяє виявити більше половини всіх можливих замін нуклеотидів. -зажимом» выявляются практически все замены нуклеотидов. У клонованих ж фрагментах ДНК з «GC-затиском» виявляються практично всі заміни нуклеотидів.

Гетеродуплекси дають можливість спостерігати зміну рухливості мутантних фрагментів ДНК в гелі, не виявляється при стандартних умовах проведення електрофорезу. Найчастіше поодинокі мутації можна виявити по викликуваним ними значних змін структури доменів у фрагменті ДНК-Зміни ці відбиваються і на характері плавлення ДНК: домени, що мали спочатку найвищу температуру плавлення, можуть стати найбільш легкоплавкими. Таким чином, коли замість гомодуплексов використовуються гетеродуплекси, ДГГЕ дозволяє виявляти заміни нуклеотидів навіть в самих тугоплавких доменах.

1.2.2 Практичне використання ДГГЕ

Наведені тут схеми ДГГЕ забезпечують більш високу роздільну здатність і ефективність виявлення мутацій за рахунок використання гетеродуплексов. Їх основні етапи наведені на рис. 4. Досліджувані препарати ДНК отжигают з міченим одноланцюговим ДНК-зондом, і якщо в них відбулася заміна нуклеотиду, що утворився гетеродуплекс буде мати Однонуклеотидний неспарений ділянку. Далі проводять електрофорез у денатуруючих гелі з наступною радіоавтографіей, використовуючи в якості контролю гомодуплекс ДНК дикого типу. Таким чином, в цьому випадку не потрібно стадії блотингу гелю. Крім одноланцюгових ДНК-зондів можна використовувати асиметрично мічені дволанцюжкові ДНК-зонди, а також мічені одноланцюгові РНК-зонди для тестування ДНК в гібридах РНК-ДНК або РНК в РНК-РНК-гібридах.

За допомогою ДГГЕ, також як і при РНКазном розщепленні, можна досліджувати фрагменти нуклеїнових кислот довжиною від 100 до 1000 пар основ Верхня межа значень довжин в деякій мірі визначається необхідністю використовувати поліакріламідний гель. Рухливість в ньому фрагментів ДНК довжиною понад 1000 п. н. різко знижується, а це значно збільшує час, необхідний для їх електрофоретичного поділу. Ще більш серйозну проблему представляє собою характер плавлення довгих фрагментів. Відомо, що чим довше фрагмент, тем. більше в ньому доменів плавлення. При проходженні такого фрагмента через гель дуже швидко настає різке зниження його рухливості, обумовлене плавленням одночасно великої кількості доменів, що робить доступною для виявлення заміни лише незначну частину довгого фрагмента. У силу вищезгаданих причин ми намагаємося працювати з фрагментами, довжина яких не перевищує 1000 п. і. Оскільки для більшості фрагментів ДНК більше половини їх довжини припадає на легкоплавкі домени, то денатуруючих електрофорез фрагмента в 1000 п. і. дозволяє тестувати на нуклеотидні заміни приблизно 500 нуклеотидів. Для підвищення інформативності аналізу можна використовувати ДНК-зонд довжиною 1000-2000 пар основ; отжигать його з геномної ДНК, обробляти відповідними рестріктазами і отримувати при цьому два-три фрагменти оптимального розміру.

Таблиця 1. Порівняльна характеристика методів градієнтного аналізу ПДРФ, рестріктазного розщеплення і денатуруючого гель-електрофорезу

1.3. Полімеразна ланцюгова реакція

РНКазное розщеплення і ДГГЕ можна використовувати для безпосереднього дослідження фрагментів геномної ДНК, минаючи стадію клонування. Працюючи з рівномірно міченими зондами, що володіють високою питомою активністю, можна будь-яким з цих методів отримати бажаний результат, маючи спочатку 5-10 мкг геномної ДНК людини і проводячи радіоавтографію 24 год Чим простіше організм, тим вище чутливість методів. Хоча отримані результати в більшості своїй можна оцінити високо, безпосереднє використання сумарною геномної ДНК ставить перед дослідником ряд проблем. Це, по-перше, нерідко низьке відношення сигналу до фону, особливо при РНКазном розщепленні. По-друге, активність рівномірно мічених фосфором зондів повинна бути настільки високою, щоб використовувати їх протягом дня або двох. По-третє, при проведенні деяких аналізів, особливо у випадку множинних тестів, лімітуючим фактором може стати кількість геномної ДНК. Будь-який тест тим краще, чим менша кількість ДНК вимагає.

У 1985 р. був описаний принципово новий метод, що дозволяє в мільйон разів ампліфікувати цікавлять послідовності в препараті геномної ДНК, - полімеразна ланцюгова реакція, ПЛР. Ідея методу і її втілення дуже прості. Спочатку синтезуються два дезоксиолігонуклеотидів довжиною 20-30 підстав, що представляють собою кінцеві послідовності цікавить фрагмента ДНК. Полярність обрано так, щоб після відпалу їх направлення 5'-3 'були звернені один до одного. Надлишкові кількості цих олігонуклеотидів змішують з геномної ДНК, і суміш нагрівають для денатурації останньої. Зниження температури призводить до реассоціаціі олігонуклеотидів з гомологічними ділянками геномної ДНК. Потім проводять нарощування ланцюга за участю ДНК-полімер ази та дезоксирибонуклеотидтрифосфатов. Така послідовність реакцій денатурації, реассоціаціі і нарощування ланцюга повторюється 20-30 разів. Вже після двох циклів серед продуктів реакції з'являються фрагменти ДНК, точно співпадаючі по довжині з вихідним фрагментом, обмеженим олігонуклеотидами. Ці фрагменти служать матрицею для подальших реакцій і ідентичні більшості кінцевих продуктів. Процес є по суті ланцюговим, так як продукти цієї реакції служать матрицею для подальших реакцій. Кількість знов утворюється ДНК зростає в геометричній прогресії, тому за 20 циклів при 100% - ний ефективності кожного з них можна отримати лютий 1920 молекул. На практиці ефективність кожного циклу ампліфікації становить 20-50%, тобто при проведенні достатнього числа циклів можна домогтися збільшення кількості специфічної послідовності кратного мільйону.

Якщо при ампліфікації геномної ДНК хребетних в якості праймерів для ПЛР використовують олігонуклеотиди довжиною 20 нуклеотидів і більше, то процес цей досить специфічний і ампліфікує тільки один фрагмент ДНК - Однак інколи серед продуктів реакції спостерігається накопичення фрагментів, походження яких важко пояснити. А оскільки ці фрагменти можуть заважати подальшому аналізу, то рекомендується провести ще одну серію ампліфікації, з використанням іншого набору олігонуклеотидних праймерів. Цей метод, що зветься «nested », состоит в следующем: продукт первичной полимеразной цепной реакции используется в качестве матрицы в последующих раундах ПЦР, но уже с двумя другими олигонуклеотидами, имеющими гомологии с участками ДНК внутри первичного амплифицированного фрагмента . Такая процедура позволяет получить большое количество индивидуальной последовательности ДНК, несколько более короткой, чем исходный фрагмент, и использовать ее для последующего анализа. oligo », полягає в наступному: продукт первинної полімеразної ланцюгової реакції використовується в якості матриці в наступних раундах ПЛР, але вже з двома іншими олігонуклеотидами, що мають гомології з ділянками ДНК всередині первинного ампліфікованої фрагмента. Така процедура дозволяє отримати велику кількість індивідуальної послідовності ДНК, дещо короткою, ніж вихідний фрагмент, і використовувати її для подальшого аналізу.

Маючи початково менше 1 мкг сумарної геномної ДНК хребетних, в ПЛР можна отримати кілька мікрограмів специфічного фрагмента. Добре амплифицируют фрагменти до 2000 п. н. В одній реакції можна ампліфікувати одночасно і кілька фрагментів. Ампліфікація специфічних фрагментів за допомогою ПЛР може застосовуватися і в діагностиці, і при клонуванні. Левінсон і Гітшейер використовували ампліфікованих в ПЛР геномної РНК і РНКазное розщеплення для виявлення однонуклеотидних замін в гені фактора VIII, що обумовлюють Х-зчеплену гемофілію А людину. Ми пояснюємо, як застосовувати ПЛР в поєднанні з РНКазним розщепленням і з ДГГЕ для виявлення однонуклеотидних замін у препаратах геномної ДНК.

3. Підготовчі процедури

Для проведення ПЛР, РНКазного розщеплення і ДГГЕ необхідні наступні попередні процедури.

1. Фрагмент ДНК, тестований на мутації або поліморфізм, необхідно клонувати в плазмідної векторі, що дозволяє синтезувати певні типи зондів.

2. Дуже корисно, а іноді й просто необхідно мати ре-реєстраційних карту такий клонованої вставки ДНК - Розташування сайтів рестрикції, особливо тих, що зустрічаються лише 1-2 рази в усій плазміді, можна визначити за допомогою стандартних методик рестрикційного картування. Для обох типів одноланцюгових зондів необхідно мати одиничний сайт рестрикції в ділянці тестованої ДНК, дистальному по відношенню до сайту зв'язування з РНК-полімеразою у разі РНК-зондів або з олігонуклеотидами у разі ДНК-зондів. Після реассоціаціі одноланцюжковою міченого ДНК-зонда з тестованої ДНК може виникнути необхідність розщепити гібридну послідовність ДНК на 2-3 фрагмента з оптимальною для ДГГЕ довжиною. У цьому випадку треба використовувати сайти рестрикції, наявні в тестованому фрагменті.

3. При використанні ПЛР необхідно визначити кінцеві нуклеотидні послідовності тестованої вставки ДНК. Звичайно потрібно секвенувати 40-50 п. н., Щоб отримати перший набір олігонуклеотидів довжиною 20-25 п. н. При роботі методом «nested » необходимо дополнительно просеквенировать любую последовательность внутри фрагмента ДНК, ограниченного первой парой олигонуклеотидов. oligo »необхідно додатково просеквеніровать будь-яку послідовність всередині фрагмента ДНК, обмеженого першою парою олігонуклеотидів.

4. Метод РНКазного розщеплення

Основну увагу приділено експериментальним особливостям кожної стадії процесу РНКазного розщеплення, включаючи одержання міченого РНК-зонда. Більшість етапів аналогічно описуваних в оригінальних роботах, але наведені й деякі модифікації. Обговорюються також можливі методичні труднощі і способи їх подолання.

Відзначимо, що для даного методу необов'язково, щоб кінцеві ділянки РНК-зонда та тестової зразка ДНК були суворо комплементарні. Виступаючі некомплементарние 5'ілі З "-кінці зонда не заважають аналізу, так як вони просто руйнуються РНКази в процесі реакції розщеплення. У принципі навіть корисно мати виступаючі кінці, що подовжують зонд на 5-10% в порівнянні з фрагментом ДНК - Це дозволяє розрізняти зонд і гібридний фрагмент дикого типу, що виникає при РНКазном розщепленні. Крім того, виступаючі кінці дають можливість перевірити активність РНКази: якщо фермент інактивована або активність його недостатня, то не відбувається їх ефективного видалення і вони виявляються при радіоавтографіі.

4.1 Матеріали

4.1.1 Реактиви для отримання РНК-зондів

Для отримання рівномірно мічених РНК-зондів необхідні ті ж реактиви, що і для реакцій РНКазного розщеплення. 6, Т7 и ТЗ. Тут ми наводимо умови використання РНК-поліме-раз і промоторів з бактеріофагів SP 6, Т7 і ТЗ. 6. Більш докладну інформацію з синтезу РНК-зондів можна отримати з оригінальних публікацій, присвячених системі SP 6.

Щоб попередити небажані наслідки активності чужорідних рибонуклеаза, слід дотримуватися певних запобіжних заходів при приготуванні розчинів, при роботі з пробірками, автоматичними піпетками і т.д. Розчини, що витримують нагрівання, необхідно автоклавування і зберігати в стерильному вигляді. Бичачий сироватковий альбумін, дітіотрейтол та інші розчини, що не витримують автоклавування, слід готувати на стерильній воді і зберігати в стерильних пробірках або бутлях. При роботі з РНК бажано також стерилізувати пластиковий посуд і регулярно чистити стрижні автоматичних піпеток. 1. Матрична ДНК. Фрагмент ДНК-мішені потрібно клонувати в плазмідної або фагової векторі в ділянці, що примикає до високоспецифічним послідовностей промотору бактеріофага. 6, Т7 и ТЗ. Як векторних систем зазвичай використовуються фаги SP 6, Т7 і ТЗ. 70 - cep ии , pGEM -серии, pBluescribe -серии. Є також вектори з одним або двома промоторами, зверненими до полілінії-кернів клонуючим сайтів, наприклад pSP 70 - cep ії, pGEM-серії, pBluescribe-серії. В ідеальному випадку послідовність-мішень вбудовується в полілінкер між промоторами так, щоб зворотні РНК-транскрипти можна було отримувати з обох її ланцюгів. Після клонування послідовності-мішені в векторної плазміди з двома промоторами обробіть 10-20 мкг плазмідної ДНК рестриктазою, що розрізає по одному з кінців мішені або всередині полілінкерной послідовності. У результаті ви отримаєте матрицю для зворотної транскрипції. Якщо як зонд має бути використовувати обидві ланцюга матричної ДНК, обробіть така ж кількість ДНК ще однієї рестриктазою, що розрізає по протилежного кінця послідовності-мішені. Екстрагують оброблену рестріктазами ДНК фенолом, осадити етанолом і перерастворіте в ТІ в концентрації 1000 мкг / мл.

6, Т7 и ТЗ выпускаются многими фирмами. 2. РНК-полімерази. Очищені РНК-полімерази з SP 6, Т7 і ТЗ випускаються багатьма фірмами. Вступники в продаж препарати зазвичай мають концентрацію 5-20 од. / мл.

3. Мічені нуклеотиди. Придбайте один з чотирьох нуклеозидтрифосфатів, мічений фосфором в альфа-положенні з питомою активністю 400 Кі / ммоль. и приводим методику получения зонда на основе именно этого нуклеотида. Ми рекомендуємо мічений GTP і наводимо методику отримання зонда на основі саме цього нуклеотиду. , изменив соответственно количество взятых в реакцию немеченых нуклеозидтрифосфатов. Можна одночасно використовувати і ще один мічений NTP, змінивши відповідно кількість взятих в реакцію немічених нуклеозидтрифосфатів.

. 2 мм раствор «холодного» GTP хранить при – 70°С. 4. Немічених GTP. 2 мм розчин «холодного» GTP зберігати при - 70 ° С.

5. . Для приготовления «3- NTP » используют 50 или 100 мм исходные растворы остальных трех нуклеотидов в ТЕ-буфере. Суміш 3 - NTP. Для приготування «3 - NTP» використовують 50 або 100 мм вихідні розчини інших трьох нуклеотидів в ТЕ-буфері. в смеси 10 мм. Концентрація кожного NTP в суміші 10 мм. Зберігати при - 70 ° С.

6. Для транскрипції. Для приготування 1 мл буфера необхідно:

, рН 7,5 400 мкл 1 М раствора 60 мм MgCl 2 60 мкл 1 М раствора 400 мм трис-HCl, рН 7,5 400 мкл 1 М розчину 60 мм MgCl лютого 1960 мкл 1 М розчину

20 мм спермідину 200 мкл 100 мм розчину 340 мкл Н 2 0

. Приготовьте 1,0 М исходный раствор DTT 7. Вихідний розчин DTT. Підготуйте 1,0 М вихідний розчин DTT у воді і зберігайте його при 20 о С.

8. Вихідний розчин БСА. Приготуйте водний розчин без РНКазного БСА в концентрації 1 мг / мл і зберігайте при -20 ° С.

9. Плацентарний інгібітор РНКази. Плацентарний інгібітор РНКази проводиться різними фірмами, в тому числі і фірмою Promega Biotec . Inc.

10. ДНКаза I. Придбайте надчистих, вільну від РНКази ДНКазу I і приготуйте водний розчин у концентрації 1 мг / мл. Зберігайте в аліквотах при - 20 ° С або -70 ° С. У своїй роботі ми користувалися ДНКазой фірми Cooper . Biochemical.

11. ДСН. Приготуйте 25%-ний вихідний розчин ДСН у воді. Якщо є можливість, використовуйте реактив «надчистої» кваліфікації. Чи не автоклавіруются. Зберігайте при кімнатній температурі.

12. ТРНК-носій. На деяких етапах процесу потрібно тРНК-носій, вільний від домішок РНКази і ДНКази. Ми рекомендуємо використовувати дріжджову тРНК, ретельно очищену наступним чином:

а) суспендують тРНК в ТІ з розрахунку 20 мг / мл, додайте ДСН до 0,1% і протеіназу К до кінцевої концентрації 100 КМГ / мл;

б) інкубують при 37 ° -50 ° С протягом ночі;

в) екстрагують 3-4 рази фенолом та діалізу протягом ночі проти кількох літрів ТІ;

г) доведіть концентрацію до 5 мг / мл і зберігайте в аліквотах при -70 ° С.

4.1.2 Реактиви для відпалу, розщеплення та аналізу гелів

Для відпалу, реакцій розщеплення та аналізу гелів у процесі РНКазного розщеплення потрібні такі реактиви:

1. Тестована ДНК - Тестувати можна геномну або клоновану ДНК, ампліфікованих в ПЛР, просто клоновану і неампліфіцірованную геномної ДНК - Отримання ДНК в ПЛР описано в розд. 4. Клоновану і неампліфіцірованную геномної ДНК слід попередньо обробити рестріктазами для подальшого кількісного обліку, а також для досягнення максимально ефективної денатурації і реассоціаціі із зондом. Обробіть ДНК рестріктазами, вищепляются тестований фрагмент, видаліть ферменти фенольної екстракцією, сконцентруйте ДНК, обложивши її етанолом. Ресуспендіруйте в ТЕ-буфері в концентрації 100 мкг / мл.

буфера, 1 мл 0,5 М PIPES , рН 6,4 рН 2. Буфер для гібридизації. Для приготування 10 мл необхідно: 80% формамідом 8 мл деіонізованої формамідом 50 мм PIPES буфера, 1 мл 0,5 М PIPES, рН 6,4 рН

Чи не автоклавіруются Примітка: купуйте формамід високої якості і деионизирующим, обережно перемішуючи з іонообмінної смолою Dowex 50 W AG 50 W або її аналогами протягом 30 хв при кімнатній температурі. Використовуйте приблизно 2 г смоли на 100 мл формамідом. Зберіть формамід, профільтрувати його через ватмановскую папір 1 ММ і зберігайте в щільно закритих пробірках при -20 ° С або -70 ° С.

Деякі партії формамідом містять домішки, що руйнують РНК, особливо при високих температурах. Це призводить до появи на радіоавтографах високого фону продуктів реакції РНКазного розщеплення. Якщо гостро постає проблема з фоном, рекомендуємо перекрісталлізовивают формамід перед використанням.

4.2 Методи

4.2.1 Синтез РНК-зондів

Описується синтез РНК-зондів шляхом транскрипції in клонированных ДНК, несущих фаговый промотор. vitro клонованих ДНК, що несуть фагової промотор. Зауважимо, що питома активність таких РНК-зондів нижче, ніж отриманих стандартним способом і традиційно використовуваних при тестуванні геномних ДНК. Такий активності достатньо для роботи з однієї десятої від загальної кількості ДНК, одержуваної в ПЛР, або з дуже невеликим обсягом клонованої ДНК - Перевага цих зондів полягає в тому, що вони зберігають стабільність більше 1 тижня. Крім того, довгі зонди з виступаючими кінцями легше синтезувати так як при цьому нуклеозидтрифосфат не лімітують реакцію транскрипції. Якщо досліджується геномна ДНК і не проводиться ПЛР, то слід використовувати зонди з високою питомою активністю. в начале транскрипции была не менее 10 мкМ, поэтому для синтеза высокоактивного зонда требуется 40–80 мкКи меченого NTP . Важливо, щоб концентрація міченого NTP на початку транскрипції була не менше 10 мкМ, тому для синтезу високоактивного зонда потрібно 40-80 мкКі міченого NTP.

1. У стерильною мікроцентріфужной пробірці змішайте в наступному порядку:

9 мкл води,

1 мкл рестріцірованной матричної ДНК,

, 1 мкл суміші 3 - NTP,

, 1 мкл «холодного» GTP,

, 1 мкл GTP,

, 2 мкл DTT,

2 мкл БСА,

2-5 одиниць плацентарного інгібітора РНКази, 2 мкл 10Х буфера для транскрипції.

2. 6, Т7 или ТЗ. До суміші додайте 3-5 одиниць РНК-полімерази фагів SP 6, Т7 або ТЗ.

3. Інкубують 1 год при 40 ° С, щоб пройшла транскрипція.

4. для разрушения матричной ДНК; инкубируйте 20 мин при 37? Додайте 1 мкл ДНКази I для руйнування матричної ДНК; інкубують 20 хв при 37? С.

5. . Додайте 10 мкг тРНК-носія, 10 мкл води і 20 мкл ацетату амонію та проекстрагіруйте один раз 2 FC.

6. Після екстракції водний шар осадити етанолом; ресуспендіруйте осад у 80 мл води, 20 мл ацетату амонію і знову обложити етанолом.

7. Ресуспендіруйте осад РНК в 200 мкл ТЕ-буфера, що містить 0,1% ДСН. Зберігайте при -20 ° С.

4.2.2 Реакції відпалу і розщеплення

Спочатку реакцію гібридизації між міченим РНК-зондом і невеликою кількістю комплементарних послідовностей з декількох мікрограм сумарною геномної ДНК проводили з молярним надлишком РНК - Зараз, коли за рахунок ампліфікації ДНК в ПЛР вдається отримувати великі кількості специфічних фрагментів ДНК, немає необхідності використовувати надлишок зонда. В описуваних нижче експериментах використовується по суті надлишок тестованої ДНК - Ця модифікація дозволяє збільшити відношення сигналу до фону, так як в цьому випадку вже не доводиться видаляти залишки довгого зонда за допомогою РНКазной обробки.

При постановці експерименту корисно мати такі контролі:

контроль 1: неспецифічна гібридизація зонда з тРНК-носієм;

контроль 2: позитивний контроль на дикий тип - реассоціація зонда з клонованою фрагментом ДНК дикого типу;

контроль 3: зонд реассоцііруют з відомим мутантним фрагментом геномної ДНК, клонованим або отриманим в ПЛР. Це дає можливість оцінити ефективність розщеплення неспарен, ділянок.

1. У стерильною мікроцентріфужной пробірці змішайте наступні компоненти:

1 мкл ампліфікованої в ПЛР геномної ДНК у концентрації приблизно 100 мкг / мл або 1 мкл рестріцірованной клонованої ДНК,

1 мкл міченого РНК-зонда, 30 мкл буфера для гібридизації.

2. Прогрійте суміш 10 хв при 95-100 ° С на киплячій водяній бані.

3. Скористайтеся микроцентрифуги, щоб зібрати конденсат на дні пробірки.

4. Інкубують суміш 60 хв при 40-45 ° С, щоб відбулася реассоціація між зондом і комплементарними йому послідовностями в тестованому фрагменті геномної ДНК.

Примітка: за оригінальною методикою гібридизацію проводять протягом 10-12 год Вважається, що за цей час реакція реассоціаціі між фрагментами геномної ДНК і РНК-зондом досягає насичення. У клонованих і ампліфікованих в ПЛР фрагментах геномної ДНК частка послідовностей-мішеней набагато більше, тому час гібридизації можна значно зменшити. Скорочення термінів інкубації полегшує проведення експерименту і зменшує деградацію зонда. 5. Додайте 350 мкл суміші РНКази з РНКазним буфером. Як слід перемішайте струшуванням. Ця суміш являє собою буфер для РНКазной реакції з розведеною в ньому до концентрації 40 мкг / мл кип'яченої РНКази А і тРНК-носієм у концентрації 20 мкг / мл. Розчин можна приготувати за кілька годин до використання і зберігати в льоду. На 5 мл суміші треба 5 мл буфера для РНКазной реакції, 100 мкл вихідного розчину прокипяченной РНКази А, 20 мкл тРНК. Примітка: у більшості наших дослідів по РНКазному розщепленню концентрація РНКази А була 40 мкг / мл. Однак, використовуючи фермент з іншої партії, ми виявили, що ця концентрація занадто велика - фермент в такій кількості руйнував гібриди РНК - ДНК - Позитивних результатів вдалося досягти, знизивши його концентрацію до 4 мкг / мл. Тому ми рекомендуємо кожну нову партію РНКази перед використанням калібрувати в межі концентрацій від 2 до 40 мкг / мл. Для калібрування бажано використовувати як мутантний контрольний зразок, так і контрольний зразок дикого типу. У оптимальної концентрації РНКаза А ефективно розщеплює неспарені ділянки в мутантним зразку і дає фоновий сигнал в контролі дикого типу.

6. Інкубують 60 хв при 25 ° С.

Примітка: за оригінальною методикою інкубацію проводили протягом 30 хв. За цей час РНКаза А розщеплює багато неспарені ділянки лише частково, що призводить до появи радіоактивних сигналів в ділянках гелю, відповідних фрагментами дикого типу. При більш тривалій обробці вдається розщепити ці вже частково розщеплені РНКази сайти повністю. Найлегше інтерпретувати результати РНКазной обробки, відбираючи в процесі реакції аліквотах після 30, ​​60 і 90 хв інкубації. У ряді випадків півторагодинна обробка буває надмірною і призводить крім іншого до деградації кінцевих областей фрагментів РНК. Тому якщо кінетика реакції не досліджена, то оптимальним часом обробки слід вважати приблизно 60 хв.

7. Зупиніть РНКазную реакцію додаванням 10 мкл ДСН і 10 мкл протеїнази К. инкубируют 30 хв при 37 ° С.

8. Додайте 10 мкг тРНК-носія.

9. . Екстрагують реакційну суміш один раз фенолом і один раз 2 FC. Після першої екстракції обережно відберіть тільки 300 мкл верхнього водного шару автоматичною піпеткою з пластиковим наконечником і перенесіть в іншу пробірку. Робиться це, щоб не допустити потрапляння РНКази з інтерфази між водним шаром і фенолом.

10. Осадити нуклеїнові кислоти етанолом. Промийте осад 70%-ним етанолом і висушіть.

11. Ресуспендіруйте осад РНК в 10-20 мкл насиченого розчину формамідом. Іноді буває важко повністю перерастворіть РНК в формамідом. Щоб прискорити процес, піпетуйте розчин кілька разів за допомогою автоматичної піпетки з пластиковим наконечником.

4.2.3 Аналіз

1. Перед нанесенням зразків проведіть преелектрофорез протягом 1-2 ч.

2. Прогрійте зразки 4 хв на водяній бані при 95-100 ° С, щоб розділити РНК-і ДНК-ланцюга.

3. Вимкніть джерело живлення і від'єднайте електроди.

4. Перед внесенням зразка в лунку промийте її за допомогою капілярної автоматичної піпетки або шприца для підшкірних ін'єкцій.

5. 5 мкл зразка безпосередньо з водяної бані перенесіть швидко в лунку гелю. Швидко продовжуйте процедуру, поки не завдасте всі зразки.

6. Приєднайте клеми до апарату для електрофорезу, увімкніть джерело живлення. Проводьте електрофорез при 15-20 В до тих пір, поки бромфеноловий синій не досягне краю гелю.

7. Після закінчення електрофорезу вимкніть джерело живлення, від'єднайте клеми, вийміть пластини з гелем з установок. Висушіть гель на аркуші ватмановской паперу 1 ММ або її аналога і експонують с.рентгеновской плівкою. Примітка: експозицію гелю з рентгенівською плівкою можна проводити без висушування. Перевага висушування в тому, що воно збільшує роздільну здатність.

Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Книга
125.7кб. | скачати


Схожі роботи:
Пульс-електрофорез і методи роботи з великими молекулами ДНК
Прийоми створення контекстуальних замін при перекладі
Золь-Гель технологія
Поліакріламідний гель ПААГ
Особливості гель-фільтрації
Електрофорез
Метод виділення одиничних викликаних потенціалів з електроенцефалограми без шаблону
Електрофорез і електроосмос
Медикаментозний електрофорез
© Усі права захищені
написати до нас