БІОТЕХНОЛОГІЯ
Метилотрофних бактерій - ДЖЕРЕЛА ізотопно - Мічені 2 Н-та 13 С-АМІНОКИСЛОТ.
@ О.В. Мосіна.
Московська державна академія тонкої хімічної технології ім. М.В. Ломоносова, 117571.
Вивчено можливість використання різних штамів метилотрофних бактерій для отримання амінокислот, мічених стабільними ізотопами 2 Н і 13 С, як секретується в культуральну рідину в процесі ферментації штамів-продуцентів, так і виділяються з гідролізатів сумарного білка біомаси. Представлені дані щодо адаптації L-фенілаланін-продукуючого штаму факультативних метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum до ростовим середах, містить 2 об.% С 2 Н 3 О 2 Н і 98 об.% 2 Н 2 О і біосинтезу L-фенілаланіну. Для L-лейцин-продукуючого штаму облігатних метилотрофних бактерій Methylobacillus flagellatum проведено культивування на середовищі, що містить 1 об.% 13 СН 3 ОН і 99 об.% Н 2 О. Рівні ізотопного включення 2 Н-та 13 С в амінокислоти були вивчені методом мас-спектрометрії електронного удару у вигляді метилових ефірів N-діметіламінонафталін-5-сульфонільного (дансільних) похідних амінокислот і бензілоксікарбонільних похідних (Z-похідних) амінокислот. Максимальні рівні включення стабільних ізотопів 2 Н-та 13 С в амінокислоти при зростанні метилотрофних бактерій на середовищах, що містять 2 об. % СН 3 ОН і 98 об.% 2 Н 2 O, і 1 об.% 13 CH 3 OH і 99 об.% Н 2 О складають 97,5% і 95% відповідно.
Ключові слова: Стабільні ізотопи. - Brevibacterium methylicum. - Methylobacillus flagellatum. - Культивування на 2 Н 2 О. - Ізотопно-мічені амінокислоти.
Зручними та дешевими джерелами ізотопно-мічених амінокислот можуть бути метилотрофних бактерій, біотехнологічний потенціал яких в даний час загальновизнаний [1,2]. Субстратом для росту метілотрофов при отриманні мічених амінокислот є метанол (або його мічені аналоги З 2 Н 3 О 2 Н / 13 СН 3 ОН), та інші низькомолекулярні з'єднання, наприклад, важка вода (2 Н 2 О) [3]. Однак, високі концентрації 2 Н 2 О в ростової середовищі можуть викликати інгібування росту і розвитку метілотрофов [3]. Незважаючи на негативний біостатичні ефект, що надається важкою водою на клітини, деякі бактерії стійкі до високих концентрацій важкої води в середовищі [4], в той час як рослинні клітини можуть нормально розвиваються при концентраціях не більше 50-75% 2 Н 2 О, а клітини тварин не більше 35% 2 Н 2 О [5]. На відміну від важкої води, при використанні 13 СН 3 ОН в якості джерела мітки немає необхідності проводити попередню адаптацію культури до ізотопного субстрату, так як показано, що ізотопний ефект 13 СН 3 ОН незначний [6]. Тому використання для отримання 13 С-амінокислот облігатних метилотрофних бактерій, які здатні асимілювати тільки метанол як єдине джерело вуглецю і енергії є дуже перспективним.
У плані раннє розпочатих досліджень з метілотрофамі з отримання амінокислот, мічених стабільними ізотопами, практичний інтерес представляє використання метилотрофних бактерій, особливо продуцентів амінокислот для отримання цільових сполук за рахунок біоконверсії низькомолекулярних мічених субстратів [7-10]. Традиційним підходом при отриманні амінокислот є культивування штамів - продуцентів на середовищах, що містять ізотопно-мічені субстрати і 2 Н 2 О з подальшим виділенням мічених амінокислот як з культуральної рідини після ферментації штамів-продуцентів, так і з гідролізатів загального білка біомаси.
Метою даної роботи було вивчення принципової можливості отримання 2 Н-та 13 С-амінокислот за рахунок використання штамів метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum і Methylobacillus flagellatum.
УМОВИ ЕКСПЕРИМЕНТУ.
Бактеріальні штами. Дослідження проводили з генетично маркованими штамами метилотрофних бактерій, отриманими з колекції культур Всеросійської колекції промислових мікроорганізмів (ВКПМ) Державного науково-дослідного інституту генетики та селекції промислових мікроорганізмів:
1. - Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, лейцінзавісімий штам факультативних метилотрофних бактерій, продуцент L-фенілаланіну.
2. - Methylobacillus flagellatum KT, ізолейцінзавісімий штам облігатних метилотрофних бактерій, продуцент L-лейцину.
У роботі використовували 2 Н 2 O (99,9% 2 Н), С 2 Н 3 О 2 Н (97,5% 2 Н) і 13 СН 3 ОН (97,5% 13 С), отримані з Російського науково-дослідного центру "Ізотоп" (Санкт-Петербург, РФ), а також N-діметіламінонафталін-5-сульфохлорид (дансілхлорід) (Sigma, CША), карбобензоксіхлорід (Войківський хімзавод, РФ).
Умови адаптації. Адаптацію штамів до дейтерію проводили на агаризованих середовищах (2%-ний агар), що містять важку воду. При цьому використовували розсівання культур до окремих колоній на середовищах, що містять східчасто збільшуються концентрації важкої води [9].
Культивування бактерій проводили на мінеральному середовищі М9 [11], як описано в роботі [9].
Гідроліз білка проводили з використанням 6 н. 2 НСl (у 2 Н 2 О) і 4 н. Ва (ОН) 2 (110 0, 24 год) [12].
Екстракцію ліпідів проводили сумішшю хлороформ-метанол (2:1) за методом Блай і Дайера [13].
Метилові ефіри дансіламінокіслот отримували як описано в роботі [8].
Бензілоксікарбонільние похідні амінокислот отримували як зазначено у роботі [14].
Аналітичне та препаративної поділ бензілоксікарбонільних похідних амінокислот культуральної рідини і білкових гідролізатів проводили методом обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) за раніше розробленою методикою [15].
Поділ метилових ефірів данс-амінокислот проводили методом обернено-фазової ВЕРХ на рідинному хроматографі "Knauer" (ФРН), обладнаним насосом "Knauer", УФ-детектором "2563" і інтегратором "С-R 3A" (Shimadzy, Японія). Використовували нерухому фазу: Separon SGX C 18, 7 мкм, 150 x 3,3 мм (Kova, Чехословаччина). Елюювання проводили в системі розчинників: (А) - ацетонітрил-трифторуксусной кислота (20:80 об / об) і (В) - ацетонітрил. Використовували градієнтне елюювання: від 20% В до 100% У протягом 30 хв, при 100% У протягом 5 хв, від 100% В до 20% У протягом 2 хв, при 20% У протягом 10 хв.
Іонообмінних хроматографію білкових гідролізатів проводили на приладі "Biotronic LC 5001" (ФРН), 230 x 3,2 мм, робочий тиск 50-60 атм, швидкість подачі цитратного буфера 18,5 мл / год, нингидрина 9,25 мл / год, детекція при 570 і 440 нм.
Кількісне визначення L-фенілаланіну в культуральній рідині проводили на приладі "Beckman DU-6" (США) при 540 нм, після обробки препаратів культуральної рідини нінгідрином.
Мас-спектри електронного удару похідних амінокислот отримані на приладі "MB-80A" (Hitachi, Японія) при енергії іонізуючих електронів 70 еВ.
РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ.
Отримання штамів - продуцентів амінокислот, адаптованих до максимальних концентрацій 2 Н 2 О в середовищі.
У рамках даної роботи була досліджена можливість адаптації різних штамів метилотрофних бактерій, продуцентів амінокислот до зростання на середовищах з максимальними концентраціями важкої води. Для цього були перевірені два з наявних в колекції "ДержНДІ Генетики" штамів метилотрофних бактерій: штам облігатних метилотрофних бактерій M. flagellatum, продуцент L-лейцину і штам факультативних метилотрофних бактерій B. methylicum, продуцент L-фенілаланіну.
Для проведення адаптації був обраний ступінчастий режим збільшення концентрації 2 Н 2 О в ростових середовищах, так як ми припустили, що поступове звикання організму до 2 Н 2 О буде позитивно впливати на адаптацію. Етапи адаптації метилотрофних бактерій до середах, що містить максимальні концентрації 2 Н 2 О показані на рис. 1 і схемою. Проте всупереч нашим очікуванням, штам облігатних метилотрофних бактерій M. flagellatum виявив підвищену чутливість до важкій воді (інгібування росту бактерій спостерігалося при концентраціях 2 Н 2 О в середовищі 74,5 об.%) [3]. Подальші експерименти щодо адаптації з даним штамом метилотрофних бактерій не проводилися. У зв'язку з цим у наших експериментах з вивчення рівнів включення дейтерію в амінокислоти використовувалися препарати культуральної рідини і біомаса M. flagellatum, отримана із середовища, що містить 74,5 об.% 2 Н 2 О і 1 об.% С 2 Н 3 О 2 Н.
Раннє нами був описаний метод адаптації штаму факультативних метилотрофних бактерій B. methylicum до зростання при збереженні здатності до біосинтезу фенілаланіну на максимально дейтерированного середовищі [7]. У даній роботі були досліджені зразки біомаси штаму B. Methylicum (рис.1), отримані в ході багатоступінчастої адаптації його до важкої воді на середовищах з різним вмістом 2 Н 2 О (від 0; 24,5; 49,0; 74,5; про% до 98 об% 2 Н 2 О). Оскільки даний штам метилотрофних бактерій вдалося адаптувати до максимальних концентрацій 2 Н 2 О в ростовий середовищі, дослідження рівнів включення дейтерію в амінокислоти сумарних білків біомаси уявлялося найбільш цікавим.
Факультативні метилотрофних Облігатні метилотрофних
бактерії B. methylicum-джерела бактерії M. flagellatum,
2 Н-амінокислот джерела 2 Н-та 13 С-
амінокислот
Багатоступенева адаптація бактерій до
2 Н 2 О на середовищах, що містять 0; 24,5; 49; 74,5; 98
об.% 2 H 2 O
B. methylicum, адаптований M. flagellatum,
до 98 об.% 2 Н 2 О і 2 об.% С 2 Н 3 О 2 Н уповільнення зростання на
середовищі, що містить 74,5 об.% 2 Н 2 О
Культивування на середовищах, Культивування на середовищі,
містять різні концентрації містить звичайну воду
2 Н 2 О і 1 об.% 13 СН 3 ОН
Культуральна рідина після біомаса біомаса Культуральна рідина після відділення від клітин відділення від клітин
2 Н-секретуються амінокислоти 13 С-секретуються амінокислоти
Гідроліз сумарних білків у
4н. Ва (ОН) 2 або 6 н. 2 НСl (у 2 Н 2 О)
2 Н-та 13 С-амінокислоти в
складі білкових гідролізатів
Обробка DnsCl і CH 2 N 2 Обробка ZСl
Оцінка рівнів ізотопного Звернення-фазова Звернення-фазова ВЕРХ
включення методом мас-ВЕРХ метилових Z-похідних амінокислот
спектрометрії метилових ефірів данс- амінокислот
ефірів данс-амінокислот амінокислот
Оцінка рівнів ізотопного
Вивчення ростових характеристик M. flagellatum на середовищах, що містять СН 3 ОН / С 2 Н 3 О 2 Н / 13 СН 3 ОН та 2 Н 2 О.
Дані по зростанню штаму М. flagellatum на мінімальних середовищах, з 1 об.% СН 3 ОН (С 2 Н 3 О 2 Н / 13 СН 3 ОН) і містять східчасто збільшуються концентрації важкої води наведено в таблиці 1. Як видно з таблиці 1, на середовищах, що містять звичайну воду і аналоги метанолу З 2 Н 3 О 2 Н і 13 СН 3 ОН виходи мікробної біомаси склали 81% і 72% відповідно, а на середовищах з 74,5 об.% 2 Н 2 Про вихід біомаси склав 29%, що в 3,4 рази нижче, ніж у контрольних експериментах, коли використовували просту воду і метанол (табл. 1, досліди 1, 3, 8). Як видно з таблиці 1, стійке зростання у M. flagellatum зберігався лише у середовищах, що містять менше ніж 74,5 об.% 2 Н 2 О. Вище цієї концентрації спостерігалося пригнічення росту.
Таблиця 1.
Вплив ізотопного складу середовища на ріст штаму M. flagellaum.
Як і слід з літературних даних, введення стабільного ізотопу 13 С не призводить до летальних наслідків для клітини, що ми і спостерігали у випадку з M. flagellatum. У цілому, отримані для M. flagellatum дані можуть свідчити про те, що адаптація до 2 Н 2 О визначається як видовий специфічністю метилотрофних бактерій, так і особливостями їх метаболізму.
Метилотрофних бактерій - ДЖЕРЕЛА ізотопно - Мічені 2 Н-та 13 С-АМІНОКИСЛОТ.
@ О.В. Мосіна.
Московська державна академія тонкої хімічної технології ім. М.В. Ломоносова, 117571.
Вивчено можливість використання різних штамів метилотрофних бактерій для отримання амінокислот, мічених стабільними ізотопами 2 Н і 13 С, як секретується в культуральну рідину в процесі ферментації штамів-продуцентів, так і виділяються з гідролізатів сумарного білка біомаси. Представлені дані щодо адаптації L-фенілаланін-продукуючого штаму факультативних метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum до ростовим середах, містить 2 об.% С 2 Н 3 О 2 Н і 98 об.% 2 Н 2 О і біосинтезу L-фенілаланіну. Для L-лейцин-продукуючого штаму облігатних метилотрофних бактерій Methylobacillus flagellatum проведено культивування на середовищі, що містить 1 об.% 13 СН 3 ОН і 99 об.% Н 2 О. Рівні ізотопного включення 2 Н-та 13 С в амінокислоти були вивчені методом мас-спектрометрії електронного удару у вигляді метилових ефірів N-діметіламінонафталін-5-сульфонільного (дансільних) похідних амінокислот і бензілоксікарбонільних похідних (Z-похідних) амінокислот. Максимальні рівні включення стабільних ізотопів 2 Н-та 13 С в амінокислоти при зростанні метилотрофних бактерій на середовищах, що містять 2 об. % СН 3 ОН і 98 об.% 2 Н 2 O, і 1 об.% 13 CH 3 OH і 99 об.% Н 2 О складають 97,5% і 95% відповідно.
Ключові слова: Стабільні ізотопи. - Brevibacterium methylicum. - Methylobacillus flagellatum. - Культивування на 2 Н 2 О. - Ізотопно-мічені амінокислоти.
ВСТУП
Розробка шляхів биосинтетического отримання амінокислот, мічених 2 Н і 13 С є актуальним завданням для сучасної біотехнології. Вартість отриманих у такий спосіб ізотопно мічених сполук значно нижче, ніж хімічно синтезованих, що становить інтерес для пошуку нових штамів - продуцентів амінокислот, здатних до росту і біосинтезу на ізотопно-мічених середовищах.Зручними та дешевими джерелами ізотопно-мічених амінокислот можуть бути метилотрофних бактерій, біотехнологічний потенціал яких в даний час загальновизнаний [1,2]. Субстратом для росту метілотрофов при отриманні мічених амінокислот є метанол (або його мічені аналоги З 2 Н 3 О 2 Н / 13 СН 3 ОН), та інші низькомолекулярні з'єднання, наприклад, важка вода (2 Н 2 О) [3]. Однак, високі концентрації 2 Н 2 О в ростової середовищі можуть викликати інгібування росту і розвитку метілотрофов [3]. Незважаючи на негативний біостатичні ефект, що надається важкою водою на клітини, деякі бактерії стійкі до високих концентрацій важкої води в середовищі [4], в той час як рослинні клітини можуть нормально розвиваються при концентраціях не більше 50-75% 2 Н 2 О, а клітини тварин не більше 35% 2 Н 2 О [5]. На відміну від важкої води, при використанні 13 СН 3 ОН в якості джерела мітки немає необхідності проводити попередню адаптацію культури до ізотопного субстрату, так як показано, що ізотопний ефект 13 СН 3 ОН незначний [6]. Тому використання для отримання 13 С-амінокислот облігатних метилотрофних бактерій, які здатні асимілювати тільки метанол як єдине джерело вуглецю і енергії є дуже перспективним.
У плані раннє розпочатих досліджень з метілотрофамі з отримання амінокислот, мічених стабільними ізотопами, практичний інтерес представляє використання метилотрофних бактерій, особливо продуцентів амінокислот для отримання цільових сполук за рахунок біоконверсії низькомолекулярних мічених субстратів [7-10]. Традиційним підходом при отриманні амінокислот є культивування штамів - продуцентів на середовищах, що містять ізотопно-мічені субстрати і 2 Н 2 О з подальшим виділенням мічених амінокислот як з культуральної рідини після ферментації штамів-продуцентів, так і з гідролізатів загального білка біомаси.
Метою даної роботи було вивчення принципової можливості отримання 2 Н-та 13 С-амінокислот за рахунок використання штамів метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum і Methylobacillus flagellatum.
УМОВИ ЕКСПЕРИМЕНТУ.
Бактеріальні штами. Дослідження проводили з генетично маркованими штамами метилотрофних бактерій, отриманими з колекції культур Всеросійської колекції промислових мікроорганізмів (ВКПМ) Державного науково-дослідного інституту генетики та селекції промислових мікроорганізмів:
1. - Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, лейцінзавісімий штам факультативних метилотрофних бактерій, продуцент L-фенілаланіну.
2. - Methylobacillus flagellatum KT, ізолейцінзавісімий штам облігатних метилотрофних бактерій, продуцент L-лейцину.
У роботі використовували 2 Н 2 O (99,9% 2 Н), С 2 Н 3 О 2 Н (97,5% 2 Н) і 13 СН 3 ОН (97,5% 13 С), отримані з Російського науково-дослідного центру "Ізотоп" (Санкт-Петербург, РФ), а також N-діметіламінонафталін-5-сульфохлорид (дансілхлорід) (Sigma, CША), карбобензоксіхлорід (Войківський хімзавод, РФ).
Умови адаптації. Адаптацію штамів до дейтерію проводили на агаризованих середовищах (2%-ний агар), що містять важку воду. При цьому використовували розсівання культур до окремих колоній на середовищах, що містять східчасто збільшуються концентрації важкої води [9].
Культивування бактерій проводили на мінеральному середовищі М9 [11], як описано в роботі [9].
Гідроліз білка проводили з використанням 6 н. 2 НСl (у 2 Н 2 О) і 4 н. Ва (ОН) 2 (110 0, 24 год) [12].
Екстракцію ліпідів проводили сумішшю хлороформ-метанол (2:1) за методом Блай і Дайера [13].
Метилові ефіри дансіламінокіслот отримували як описано в роботі [8].
Бензілоксікарбонільние похідні амінокислот отримували як зазначено у роботі [14].
Аналітичне та препаративної поділ бензілоксікарбонільних похідних амінокислот культуральної рідини і білкових гідролізатів проводили методом обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) за раніше розробленою методикою [15].
Поділ метилових ефірів данс-амінокислот проводили методом обернено-фазової ВЕРХ на рідинному хроматографі "Knauer" (ФРН), обладнаним насосом "Knauer", УФ-детектором "2563" і інтегратором "С-R 3A" (Shimadzy, Японія). Використовували нерухому фазу: Separon SGX C 18, 7 мкм, 150 x 3,3 мм (Kova, Чехословаччина). Елюювання проводили в системі розчинників: (А) - ацетонітрил-трифторуксусной кислота (20:80 об / об) і (В) - ацетонітрил. Використовували градієнтне елюювання: від 20% В до 100% У протягом 30 хв, при 100% У протягом 5 хв, від 100% В до 20% У протягом 2 хв, при 20% У протягом 10 хв.
Іонообмінних хроматографію білкових гідролізатів проводили на приладі "Biotronic LC 5001" (ФРН), 230 x 3,2 мм, робочий тиск 50-60 атм, швидкість подачі цитратного буфера 18,5 мл / год, нингидрина 9,25 мл / год, детекція при 570 і 440 нм.
Кількісне визначення L-фенілаланіну в культуральній рідині проводили на приладі "Beckman DU-6" (США) при 540 нм, після обробки препаратів культуральної рідини нінгідрином.
Мас-спектри електронного удару похідних амінокислот отримані на приладі "MB-80A" (Hitachi, Японія) при енергії іонізуючих електронів 70 еВ.
РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ.
Отримання штамів - продуцентів амінокислот, адаптованих до максимальних концентрацій 2 Н 2 О в середовищі.
У рамках даної роботи була досліджена можливість адаптації різних штамів метилотрофних бактерій, продуцентів амінокислот до зростання на середовищах з максимальними концентраціями важкої води. Для цього були перевірені два з наявних в колекції "ДержНДІ Генетики" штамів метилотрофних бактерій: штам облігатних метилотрофних бактерій M. flagellatum, продуцент L-лейцину і штам факультативних метилотрофних бактерій B. methylicum, продуцент L-фенілаланіну.
Для проведення адаптації був обраний ступінчастий режим збільшення концентрації 2 Н 2 О в ростових середовищах, так як ми припустили, що поступове звикання організму до 2 Н 2 О буде позитивно впливати на адаптацію. Етапи адаптації метилотрофних бактерій до середах, що містить максимальні концентрації 2 Н 2 О показані на рис. 1 і схемою. Проте всупереч нашим очікуванням, штам облігатних метилотрофних бактерій M. flagellatum виявив підвищену чутливість до важкій воді (інгібування росту бактерій спостерігалося при концентраціях 2 Н 2 О в середовищі 74,5 об.%) [3]. Подальші експерименти щодо адаптації з даним штамом метилотрофних бактерій не проводилися. У зв'язку з цим у наших експериментах з вивчення рівнів включення дейтерію в амінокислоти використовувалися препарати культуральної рідини і біомаса M. flagellatum, отримана із середовища, що містить 74,5 об.% 2 Н 2 О і 1 об.% С 2 Н 3 О 2 Н.
Раннє нами був описаний метод адаптації штаму факультативних метилотрофних бактерій B. methylicum до зростання при збереженні здатності до біосинтезу фенілаланіну на максимально дейтерированного середовищі [7]. У даній роботі були досліджені зразки біомаси штаму B. Methylicum (рис.1), отримані в ході багатоступінчастої адаптації його до важкої воді на середовищах з різним вмістом 2 Н 2 О (від 0; 24,5; 49,0; 74,5; про% до 98 об% 2 Н 2 О). Оскільки даний штам метилотрофних бактерій вдалося адаптувати до максимальних концентрацій 2 Н 2 О в ростовий середовищі, дослідження рівнів включення дейтерію в амінокислоти сумарних білків біомаси уявлялося найбільш цікавим.
Факультативні метилотрофних Облігатні метилотрофних
бактерії B. methylicum-джерела бактерії M. flagellatum,
2 Н-амінокислот джерела 2 Н-та 13 С-
амінокислот
Багатоступенева адаптація бактерій до
2 Н 2 О на середовищах, що містять 0; 24,5; 49; 74,5; 98
об.% 2 H 2 O
B. methylicum, адаптований M. flagellatum,
до 98 об.% 2 Н 2 О і 2 об.% С 2 Н 3 О 2 Н уповільнення зростання на
середовищі, що містить 74,5 об.% 2 Н 2 О
Культивування на середовищах, Культивування на середовищі,
містять різні концентрації містить звичайну воду
2 Н 2 О і 1 об.% 13 СН 3 ОН
Культуральна рідина після біомаса біомаса Культуральна рідина після відділення від клітин відділення від клітин
2 Н-секретуються амінокислоти 13 С-секретуються амінокислоти
Гідроліз сумарних білків у
4н. Ва (ОН) 2 або 6 н. 2 НСl (у 2 Н 2 О)
2 Н-та 13 С-амінокислоти в
складі білкових гідролізатів
Обробка DnsCl і CH 2 N 2 Обробка ZСl
Оцінка рівнів ізотопного Звернення-фазова Звернення-фазова ВЕРХ
включення методом мас-ВЕРХ метилових Z-похідних амінокислот
спектрометрії метилових ефірів данс- амінокислот
ефірів данс-амінокислот амінокислот
Оцінка рівнів ізотопного
Схема
Адаптація метилотрофних бактерій до середах, що містить максимальні концентрації 2 Н 2 О і отримання 2 Н-та 13 С-амінокислот.Вивчення ростових характеристик M. flagellatum на середовищах, що містять СН 3 ОН / С 2 Н 3 О 2 Н / 13 СН 3 ОН та 2 Н 2 О.
Дані по зростанню штаму М. flagellatum на мінімальних середовищах, з 1 об.% СН 3 ОН (С 2 Н 3 О 2 Н / 13 СН 3 ОН) і містять східчасто збільшуються концентрації важкої води наведено в таблиці 1. Як видно з таблиці 1, на середовищах, що містять звичайну воду і аналоги метанолу З 2 Н 3 О 2 Н і 13 СН 3 ОН виходи мікробної біомаси склали 81% і 72% відповідно, а на середовищах з 74,5 об.% 2 Н 2 Про вихід біомаси склав 29%, що в 3,4 рази нижче, ніж у контрольних експериментах, коли використовували просту воду і метанол (табл. 1, досліди 1, 3, 8). Як видно з таблиці 1, стійке зростання у M. flagellatum зберігався лише у середовищах, що містять менше ніж 74,5 об.% 2 Н 2 О. Вище цієї концентрації спостерігалося пригнічення росту.
Таблиця 1.
Вплив ізотопного складу середовища на ріст штаму M. flagellaum.
Номер Компоненти середовища, про% Величина Вихід Час досвіду лаг-фази біомаси генер. Н 2 О 2 Н 2 О СН 3 ОН З 2 Н 3 О 2 Н годинник% ч | |||||||
1 | 99,0 | 0 | 1,0 | 0 | 20,0 | 100 | 1,1 |
2 | 99,0 | 0 | 0,5 | 0,5 | 21,3 | 91,0 | 0,8 |
3 | 99,0 | 0 | 0 | 1,0 | 22,4 | 81,0 | 1,0 |
4 | 49,5 | 49,5 | 1,0 | 0 | 50,8 | 76,0 | 1,4 |
5 | 49,5 | 49,5 | 0,5 | 0,5 | 52,0 | 75,0 | 1,2 |
6 | 49,5 | 49,5 | 0 | 1,0 | 58,5 | 70,0 | 1,3 |
7 | 24,5 | 74,5 | 1,0 | 0 | 60,0 | 29,0 | 1,4 |
8 | 99,9 | 0 | 13 СН 3 ОН 1,0 | 0 | 20,8 | 72,0 | 1,0 |
Вивчення ростових і біосинтетичні характеристик B. methylicum на середовищах, що містять СН 3 ОН / З 2 Н 3 О 2 Н і 2 Н 2 О.
Дані по зростанню вихідного і адаптованого до 2 Н 2 О штаму B. methylicum і максимального рівня накопичення L-фенілаланіну в культуральній рідині на мінімальних середовищах, що містять 2 об.% СН 3 ОН (С 2 Н 3 О 2 Н) і східчасто збільшуються концентрації важкої води представлені в таблиці 2. Як видно з цих даних, за відсутності дейтерій-мічених субстратів тривалість лаг-фази не перевищувала 24 год (див. таблицю 2, досвід 1). Зі збільшенням концентрації 2 Н 2 О в середовищі тривалість лаг-фази збільшувалася до 64,4 год на середовищах з 98 об.% 2 Н 2 О і 2 об.% С 2 Н 3 О 2 Н (таблиця 2, досвід 10). Відзначено, що тривалість часу клітинної генерації зі збільшенням ступеня ізотопного насичення середовища дейтерієм поступово збільшується, досягаючи 4,9 годин на максимально дейтерированного середовищі. Як видно з табл. 2, досвід 2, С 2 Н 3 О 2 Н не викликав суттєвого інгібування росту і не впливав на виході мікробної біомаси, в той час як на середовищах з 98 об.% 2 Н 2 О мікробний зростання пригнічувався. Так, на середовищі, що містить 98 об.% 2 Н 2 О і 2 об.% С 2 Н 3 О 2 Н, вихід мікробної біомаси був знижений в 3,3 рази по-порівнянні з контролем. Важливо, що вихід мікробної біомаси, час клітинної генерації та рівень накопичення L-фенілаланіну в культуральній рідині при зростанні адаптованого до 2 H 2 O штаму B. methylicum на середовищі, що містить 98 об.% 2 Н 2 О і 2 об.% С 2 Н 3 О 2 Н змінюються незначно (табл. 2, досвід 10 ').
Таблиця 2.
Вплив ізотопного складу середовища на ріст штаму B. methylicum та рівень накопичення L-фенілаланіну в культуральній рідині.
Номер Компоненти середовища, про% Величина Вихід Час ген. Рівень досвіду лаг-фази біомаси годинник секреції Н 2 О 2 Н 2 О СН 3 ОН З 2 Н 3 О 2 Н годинник% L-Phe,% | ||||||||
1 | 98 | 0 | 2 | 0 | 24,0 | 100 | 2,2 | 100 |
2 | 98 | 0 | 0 | 2 | 30,3 | 92,3 | 2,4 | 99,1 |
3 | 73,5 | 24,5 | 2 | 0 | 32,1 | 90,6 | 2,4 | 96,3 |
4 | 73,5 | 24,5 | 0 | 2 | 34,7 | 85,9 | 2,6 | 97,1 |
5 | 49,0 | 49,0 | 2 | 0 | 40,5 | 70,1 | 3,0 | 98,0 |
6 | 49,0 | 49,0 | 0 | 2 | 44,2 | 60,5 | 3,2 | 98,8 |
7 | 24,5 | 73,5 | 2 | 0 | 45,8 | 56,4 | 3,5 | 90,4 |
8 | 24,5 | 73,5 | 0 | 2 | 49,0 | 47,2 | 3,8 | 87,6 |
9 | 0 | 98,0 | 2 | 0 | 60,5 | 32,9 | 4,4 | 79,5 |
10 | 0 | 98,0 | 0 | 2 | 64,4 | 30,1 | 4,9 | 71,5 |
10 ' | 0 | 98,0 | 0 | 2 | 39,9 | 87,0 | 2,9 | 95,0 |
Дані 10 'наведені для адаптування B. methylicum.
За рахунок використання даного штаму B. methylicum вдалося отримати десятки міліграм високомеченного дейтерієм фенілаланіну з 20 г клітинної біомаси.
Вивчення рівнів включення ізотопів 2 Н-та 13 С у секретуються амінокислоти метилотрофних бактерій.
Ефективність використання дансільних і Z-похідних амінокислот для мас-спектрометричних досліджень було показано раннє [10, 16]. У даній роботі рівні включення ізотопів 2 Н-та 13 С у мультикомпонентного суміші амінокислот у складі культуральної рідини і білкових гідролізатів визначали методом мас-спектрометрії електронного удару метилових ефірів данс-амінокислот або у вигляді Z-похідних амінокислот після їх препаративного поділу методом обернено-фазової ВЕРХ.
Похідні амінокислот отримували прямий обробкою препаратів культуральної рідини і гідролізатів сумарних білків біомаси карбобензоксіхлорідом (ZCl) або дансілхлорідом (DnsCl) і діазометаном (CH 2 N 2). Реакцію проводили в лужному середовищі у водно-органічному розчиннику в співвідношенні карбобензоксіхлорід (дансілхлорід)-амінокислота, рівним 2:1 (схема 1).
Для лізину, гістидину, тирозину, серину, треоніну та цистеїну поряд з монопроізводнимі було характерне утворення ді-Z-(Dns)-похідних: ді-Z, (Dns)-лізину, ді-Z, (Dns)-гістидину, О, N-ді-Z, (Dns)-тирозину, O, N-ді-Z, (Dns)-серину, O, N-ді-Z, (Dns)-треоніну та N, S-ді-Z, (Dns )-цистеїну (на схемі 1 ці проізодние не показані). Крім цього, з аргініну синтезувався три-Z, (Dns)-аргінін.
Летючість дансілпроізводних амінокислот при мас-спектрометричного аналізу підвищували за рахунок додаткової деріватізаціі по карбоксильної групи (етерифікації) діазометаном. Вибір діазометана як етеріфіцірующего реагенту був обумовлений необхідністю проведення реакції в м'яких умовах, що виключають ізотопний (1 Н-2 Н) обмін в ароматичних амінокислотах.
Дані мас-спектрометрії за рівнями включення стабільних ізотопів 2 Н-та 13 С в бензілоксікарбонільние похідні амінокислот у межах однакових концентрацій важкої води в середовищі не відрізнялися від таких, отриманих для метилових ефірів дансіламінокіслот (точність визначення рівнів ізотопного включення в амінокислоти даним методом становить +5). Дані за рівнями включення 2 Н-та 13 С секретуються амінокислоти досліджуваних штамів наведені в таблиці 3. Для введення дейтерію в амінокислоти B. methylicum використовували мінімальні середовища з 2 об.% СН 3 ОН і різним вмістом 2 Н 2 О в них, оскільки раннє було показано, що внесок З 2 Н 3 О 2 Н в рівні дейтерірованності амінокислот незначний [10].
13 С-амінокислоти були отримані за рахунок культивування штаму M. flagellatum на середовищі, що містить звичайну воду і 1 об.% до 13 CH 3 OH. У всіх аналізованих зразках культуральної рідини не залежно від роду штаму були присутні аланін, валін, лейцин (ізолейцин) і фенілаланін (див. табл. 3). У культуральної рідини M. flagellatum на додаток вищеназваним амінокислотам також накопичувався гліцин.
Таблиця 3.
Рівні включення 2 Н і 13 С в секретуються амінокислоти B. methylicum та M. flagellatum (дані отримані для Z-, і Dns-похідних амінокислот) *.
Амінокислоти | Зміст 2 Н 2 О в середовищі, про% 24,5 49,0 73,5 98,0 | 1% 13 СН 3 ОН | |||
Гліцин | - | - | - | - | 60,0 |
Аланін | 24,0 | 37,5 | 62,5 | 77,5 | 35,0 |
Валін | 20,0 | 46,3 | 43,8 | 58,8 | 50,0 |
Лейцин (ізолейцин) | 15,0 | 47,0 | 46,0 | 51,0 | 38,0 |
фенілаланін | 15,0 | 27,5 | 51,3 | 75,0 | 95,0 |
Дані щодо включення 13 С наведені для M. flagellatum при зростанні на середовищі, що містить 1 об.% 13 СН 3 ОН і 99 об.% Н 2 О.
У всіх дослідах спостерігалося специфічне зростання рівнів ізотопного включення дейтерію в індивідуальні амінокислоти культуральної рідини при ступінчастому збільшенні концентрацій важкої води в ростовий середовищі (табл. 3). Як видно з таблиці 3, для амінокислот з культуральної рідини, кількість включених атомів дейтерію з вуглецевого скелету молекули варіює в межах 49 об.%-Ної концентрації 2 Н 2 O і становить для фенілаланіну 27,5%, аланіну - 37,5%, валіну - 46,3%, лейцину (ізолейцин) - 47%.
Як і слід було очікувати, для отримання 13 С-амінокислот за рахунок мікробної біоконверсії 13 СН 3 ОН, попередня адаптація не є необхідним етапом, оскільки цей ізотопний субстрат не робить істотного впливу на ростові та біосинтетичні характеристики метілотрофов. Мас-спектр культуральної рідини M. flagellatum, отриманої після обробки дансілхлорідом і діазометаном з середи, що містить 1 об.% 13 СН 3 ОН і 99 об.% Н 2 О зображений на рис. 2, б (Мас-спектр наведено щодо контрольних умов, де використовували звичайну воду і метанол (а)). Як видно з рис. 2, б, в деріватізованной культуральної рідини М. lagellatum детектируются збагачені ізотопом 13 С піки молекулярних іонів похідних амінокислот з М +. при m / z 337,4; 368,5; 382,3; 420,5, які відповідають за масою аланіну, валін, лейцин (ізолейцин) і фенілаланіну. Так як відношення маси до заряду m / z для лейцину (ізолейцин) в мас-спектрах електронного удару метилових ефірів дансіламінокіслот збігаються, то внаслідок цього не можна точно ідентифікувати структуру сполуки даним методом. Крім вищеназваних піків молекулярних іонів, в мас - спектрі фіксується пік з М +. при m / z 323,2 (замість m / z 322,0 в контролі), відповідний метиловому ефіру данс-гліцину.
У зв'язку з тим, що штам B. methylicum був ауксотрофом по лейцину, а інший штам M. flagellatum - ауксотрофом по ізолейцин, було цікаво вивчити як змінюються рівні включення дейтерію в цих амінокислотах. Для цього лейцин додавали в ростовую середу B. methylicum, приготовану на основі 98 об.% 2 Н 2 О в немічених вигляді. У випадку з M. Flagellatum ізолейцин додавали в середу, приготовану з звичайної води і 1 об.% 13 СН 3 ОН. Як показали наші дослідження, в умовах ауксотрофності по лейцину (ізолейцин) рівень ізотопного збагачення лейцину (ізолейцин), а також метаболічно пов'язаних з ними амінокислот нижче, ніж для інших амінокислот. Так, при зростанні B. methylicum на середовищі, що містить 98 об.% 2 Н 2 О і немічених L-лейцин, рівні включення дейтерію в лейцин (ізолейцин) склали 51,0%, аланін - 77,5%, валін - 58,8% (табл. 3 ). Рівень включення дейтерію в фенілаланін в цих умовах склав 75%. Ця ж особливість проявляється при зростанні M. flagellatum на середовищі з 1 об.% 13 СН 3 ОН та добавкою немічених L-ізолейцин. Як видно з таблиці 3, на відміну від фенілаланіну (рівень ізотопного збагачення - 95%), рівні включення ізотопу 13 С в лейцин (ізолейцин), аланін і валін склали 38,0; 35,0; 50,0% відповідно. Рівень ізотопного збагачення гліцину склав 60%. Підсумовуючи отримані дані, можна зробити висновок про збереження мінорних шляхів метаболізму, пов'язаних з біосинтезом лейцину (ізолейцин) de novo.
Вивчення рівнів включення ізотопів 2 Н-та 13 С в амінокислоти сумарних білків метилотрофних бактерій.
2 Н-та 13 С-мічені амінокислоти у складі гідролізатів білка біомаси були отримані в умовах, аналогічних таким для секретується амінокислот (табл. 4). Хоча в таблиці 4 наведені дані тільки для 10 амінокислот, не викликає сумніву, що в інших амінокислотах рівні ізотопного включення порівнянні, хоча вони не детектируются даним методом. Це припущення підтверджується даними з розділення білкових гідролізатів метилотрофних бактерій методом іонообмінних хроматографії, де детектується вже 16 амінокислот (див. рис. 3).
Отримані дані свідчать про можливість досягнення максимальних рівнів включення стабільних ізотопів 2 Н-та 13 С в амінокислоти. Наприклад, у випадку з дейтерированного амінокислотами цього результату вдалося досягти за рахунок адаптації культури B. methylicum до зростання і біосинтезу на середовищі з максимальною концентрацією 2 Н 2 О. Як видно з табл. 4, при зростанні B. methylicum на даному середовищі, що містить 98 об.% 2 Н 2 О, рівні включення 2 Н в залишки гліцину, аланіну, і фенілаланіну становлять 90, 97,5, і 95% відповідно. Як і слід було очікувати, в цих умовах мітка розподілена рівномірно по всіх положень вуглецевого скелета молекул амінокислот.
В експериментах з отримання амінокислот за рахунок біоконверсії 13 СН 3 ОН метилотрофних бактерій M. flagellatum була показана ефективність мічення амінокислот 13 С. Так, в фенілаланіну детектувати 80,5% мітки, в аланін - 95%, в гліцин - 90% (див. табл. 4).
Таблиця 4.
Рівні включення 2 Н і 13 С в амінокислоти загальних білків біомаси B. methylicum та M. flagellatum (дані отримані для Z-і Dns-похідних амінокислот *).
Амінокислоти | Зміст 2 Н 2 О в середовищі, про% 24,5 49,5 73,5 98,0 | 1% 13 СН 3 ОН | |||
Гліцин | 15,0 | 35,0 | 50,0 | 90,0 | 90,0 |
Аланін | 20,0 | 45,0 | 62,5 | 97,5 | 95,0 |
Валін | 15,0 | 36,3 | 50,0 | 50,0 | 50,0 |
лейцин (ізолейцин) | 10,0 | 42,0 | 45,0 | 49,0 | 49,0 |
фенілаланін | 24,5 | 37,5 | 50,0 | 95,0 | 80,5 |
тирозин | 20,0 | 48,8 | 68,8 | 92,8 | 53,5 |
Серін | 15,0 | 36,7 | 47,6 | 86,6 | 73,3 |
аспарагінова кислота | 20,0 | 36,7 | 60,0 | 66,6 | 33,3 |
глутамінова кислота | 20,0 | 40,0 | 53,4 | 70,0 | 40,0 |
Лізин | 10,0 | 21,1 | 40,0 | 58,9 | 54,4 |
Дані щодо включення 13 С наведені для M. flagellatum при зростанні на середовищі, що містить 1 об.% 13 СН 3 ОН і 99 об.% Н 2 О.
У всіх експериментах рівні включення 2 Н і 13 С в метаболічно пов'язаних амінокислотах виявили певну коррелляцію. Так, рівні ізотопного збагачення валіну та лейцину, фенілаланіну і тирозину збігаються (див. табл. 4). Рівні ізотопного включення в гліцин і серин, аспарагінової та глутамінової в кислотах також мають близькі величини. Порівнюючи дані таблиці 3 і 4 можна зробити висновок, що рівні ізотопного збагачення секретується амінокислот та відповідних амінокислотних залишків сумарного білка в цілому також корелюють. Причина деяких можна побачити розбіжностей у рівні включення ізотопів у амінокислоти до кінця не з'ясована.
Як і у випадку з секретується амінокислотами, при зростанні бактерій на середовищах, що містять 98 об.% 2 Н 2 О або 1 об.% 13 СН 3 ОН, низькі рівні включення 2 Н-та 13 С у залишки лейцину (ізолейцин) і метаболічно пов'язані з ним амінокислоти, обумовлені ауксотрофностью бактерій в лейцин (ізолейцин).
Виділення ізотопно-мічених амінокислот з культуральної рідини і гідролізатів біомаси метилотрофних бактерій.
У ході виконання роботи було проведено препаративні поділ амінокислот культуральної рідини і гідролізатів біомаси метилотрофних бактерій методами обернено-фазової ВЕРХ у вигляді бензілоксікарбонільних похідних амінокислот. Так, дейтерій-мічений фенілаланін був виділений з культуральної рідини В. methylicum методом обернено-фазової ВЕРХ у вигляді Z-похідного з хроматографічної чистотою 99% і виходом 89%. Хроматографічних чисті 2 Н-та 13 С-амінокислоти були виділені з гідролізатів біомаси B. methylicum та M. flagellatum у вигляді їх Z-похідних в мілліграммових кількостях [8]. Окремі амінокислоти: фенілаланін і лейцин були також хроматографічно виділені з культуральних рідин даних штамів метилотрофних бактерій у вигляді метилових ефірів данс-амінокислот.
Іонообмінних хроматографія амінокислот на колонці "Dowex" добре зарекомендував себе як аналітичний метод для вивчення якісного і кількісного складу білкових гідролізатів метилотрофних бактерій. Хроматограмма гідролізату сумарних білків B. methylicum, отриманих при зростанні бактерій на середовищі, що містить 98 об.% 2 Н 2 О і 2 об.% С 2 Н 3 О 2 Н представлена на рис. 3. Як видно з рис.3, в цьому гідролізаті присутні 16 амінокислот. Оскільки пролін не детектується в даних умовах його визначали при довжині хвилі 440 нм.
Таким чином, проведені дослідження підтвердили ефективність використання метилотрофних бактерій для отримання 2 Н-та 13 С- амінокислот. Запропонований підхід передбачає комплексне використання метилотрофних бактерій, дозволяючи виділяти амінокислоти як з культуральної рідини після ферментації штамів продуцентів, так і з гідролізатів сумарних білків біомаси.
ЛІТЕРАТУРА.
1. Patel GB, Sprott GD, Ekiel I. / / Appl. Environ. Microbiol. - 1993. - V. 59. - N. 4. - P. 1099-1103.
2. John Colby, Howard Dalton. / / Ann. Rev. Microbiol. - 1979. - V. 33. - P. 481-517.
3. Skladnev DA, Baev MV, Shilova S.Yu., et al. / / Proceedings of 6th Europ. Conf. on Biomass for Energy. - Industry and Environment. - Athens. - 1991. - P. 47-51.
4. Katz J., and Crespi HL / / Pure Appl. Chem. - 1972. - V. 32. - P. 221-250.
5. Crespi HL / / Biosynthesis and uses of per-deuterated proteins. in: Synthesis and Applications of Isotopically labeled Compounds, Proceedings of the Second Inter. Symp. - Elsevier. - 1986. - P. 111-112.
6. Karnaukhova EN, Reshetova OS, Semenov SY, Skladnev DA, Tsygankov YD / / Amino Acids. - 1994. - V. 6. - P. 165-176.
7. Мосін О.В., Карнаухова Є.М., Пшеничникова О.Б., складні Д.А., Акімова О.Л. / / Біотехнологія. - 1993. - N. 9. - С. 16-20.
8. Єгорова Т.А., Мосін О.В., Єрьомін С.В., Карнаухова Є.М., Звонкова Є.М., Швець В.І. / / Біотехнологія. - 1993. - N. 8. - С. 21-25.
9. Karnaukhova EN, Mosin OV, Reshetova OS / / Amino Acids. - 1993. - V. 5. - P. 125.
10. Мосін О.В., складні Д.А., Єгорова Т.А., Юркевич А.М., Швець В.І. / / Біотехнологія. - 1996. - N. 3. (У пресі).
11. Міллер Дж. Експерименти в молекулярній генетиці. - М.: Мир, - 1976. - С. 393.
12. Звонкова Є.М., Зотчік Н.В., Філліпович Є.І., Митрофанова Т.К., Мягкова Г.І., Серебреннікова Г.А / / Хімія біологічно активних природних сполук. - М.: Хімія, 1970. - С. 65-68.
13. Bligh EG, Dyer WJ / / Can. J. Biochem. Physiol. - 1959. - V. 37. - N. 8. - P. 911-918.
14. Єгорова Т.А., Єрьомін С.В., Мітснер Б.І., Звонкова Є.М., Швець В.І. / / Біотехнологія. - N5. - 1993. - С. 30-35.
15. Egorova TA, Eremin SV, Mitsner BI, Zvonkova EN, Shvets VI / / J. of Chromatography B. - 1995. - V. 665. - P. 53-62.
16. Daniely B. et al. / / J. Org. mass spectrometry. - 1989. - 24. - P. 225-229.
О.V. MOSIN
Moscow State Academy of Fine Chemical Technology named after MV Lomonosov, 117571.
METHYLOTROPHIC BACTERIA - AS THE SOURCES OF ISOTOPICALLY LABELED 2 H - AND 13 C- AMINO ACIDS.
A possibility of using the various strains of methylotrophic bacteria for the divparation of amino acids labeled with stable isotopes 2 Н і 13 С, both secreted into culture medium and obtaining from protein hydrolysates is investigated. The data on adaptaition of L-phynylalanine producing strain of facultative methylotrophic bacteria Brevibacterium methylicum to growth media containing 2 v / v.% З 2 Н 3 О 2 Н and 98 v / v.% 2 Н 2 О and biosynthesis of L-phenylalanine are divsented. For L-leucine producing strain of obligate methylotrophic bacteria Methylobacillus flagellatum the cultivation was carried out on a medium containing the ordinary water and 1 v / v.% 13 З 1 Н 3 ОН. The levels of 2 Н-and 13 С incorporation in amino acids were studied using the electron impact mass-spectrometry method of methyl esters of dansyl-and carbobenzoxychloride - derivatives of amino acids. The levels of 2 Н-and 13 C incorporation into amino acids while growing of methylotrophic bacteria on media containing 2 v / v CH 3 OH and 98 v / v.% 2 Н 2 O, and 1 v / v.% 13 CH 3 OH and 99 v / v. H 2 O were found to vary from 97,5% to 95%.