Метилотрофних бактерій - ДЖЕРЕЛА ізотопно - Мічені 2 Н-та 13 С-АМІНОКИСЛОТ.
@ О.В. Мосіна.
Московська державна академія тонкої хімічної технології ім. М.В. Ломоносова, 117571.
Вивчено можливість використання різних штамів метилотрофних бактерій для отримання амінокислот, мічених стабільними ізотопами 2 Н і 13 С, як секретується в культуральну рідину в процесі ферментації штамів-продуцентів, так і виділяються з гідролізатів сумарного білка біомаси. Представлені дані щодо адаптації L-фенілаланін-продукуючого штаму факультативних метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum до ростовим середах, містить 2 об.% С 2 Н 3 О 2 Н і 98 об.% 2 Н 2 О і біосинтезу L-фенілаланіну. Для L-лейцин-продукуючого штаму облігатних метилотрофних бактерій Methylobacillus flagellatum проведено культивування на середовищі, що містить 1 об.% 13 СН 3 ОН і 99 об.% Н 2 О. Рівні ізотопного включення 2 Н-та 13 С в амінокислоти були вивчені методом мас-спектрометрії електронного удару у вигляді метилових ефірів N-діметіламінонафталін-5-сульфонільного (дансільних) похідних амінокислот і бензілоксікарбонільних похідних (Z-похідних) амінокислот. Максимальні рівні включення стабільних ізотопів 2 Н-та 13 С в амінокислоти при зростанні метилотрофних бактерій на середовищах, що містять 2 об. % СН 3 ОН і 98 об.% 2 Н 2 O, і 1 об.% 13 CH 3 OH і 99 об.% Н 2 О складають 97,5% і 95% відповідно.
Ключові слова: Стабільні ізотопи. - Brevibacterium methylicum. - Methylobacillus flagellatum. - Культивування на 2 Н 2 О. - Ізотопно-мічені амінокислоти.
ВСТУП
Розробка шляхів биосинтетического отримання амінокислот, мічених 2 Н і 13 С є актуальним завданням для сучасної біотехнології. Вартість отриманих у такий спосіб ізотопно мічених сполук значно нижче, ніж хімічно синтезованих, що становить інтерес для пошуку нових штамів - продуцентів амінокислот, здатних до росту і біосинтезу на ізотопно-мічених середовищах.
Зручними та дешевими джерелами ізотопно-мічених амінокислот можуть бути метилотрофних бактерій, біотехнологічний потенціал яких в даний час загальновизнаний [1,2]. Субстратом для росту метілотрофов при отриманні мічених амінокислот є метанол (або його мічені аналоги З 2 Н 3 О 2 Н / 13 СН 3 ОН), та інші низькомолекулярні з'єднання, наприклад, важка вода (2 Н 2 О) [3]. Однак, високі концентрації 2 Н 2 О в ростової середовищі можуть викликати інгібування росту і розвитку метілотрофов [3]. Незважаючи на негативний біостатичні ефект, що надається важкою водою на клітини, деякі бактерії стійкі до високих концентрацій важкої води в середовищі [4], в той час як рослинні клітини можуть нормально розвиваються при концентраціях не більше 50-75% 2 Н 2 О, а клітини тварин не більше 35% 2 Н 2 О [5]. На відміну від важкої води, при використанні 13 СН 3 ОН в якості джерела мітки немає необхідності проводити попередню адаптацію культури до ізотопного субстрату, так як показано, що ізотопний ефект 13 СН 3 ОН незначний [6]. Тому використання для отримання 13 С-амінокислот облігатних метилотрофних бактерій, які здатні асимілювати тільки метанол як єдине джерело вуглецю і енергії є дуже перспективним.
У плані раннє розпочатих досліджень з метілотрофамі з отримання амінокислот, мічених стабільними ізотопами, практичний інтерес представляє використання метилотрофних бактерій, особливо продуцентів амінокислот для отримання цільових сполук за рахунок біоконверсії низькомолекулярних мічених субстратів [7-10]. Традиційним підходом при отриманні амінокислот є культивування штамів - продуцентів на середовищах, що містять ізотопно-мічені субстрати і 2 Н 2 О з подальшим виділенням мічених амінокислот як з культуральної рідини після ферментації штамів-продуцентів, так і з гідролізатів загального білка біомаси.
Метою даної роботи було вивчення принципової можливості отримання 2 Н-та 13 С-амінокислот за рахунок використання штамів метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum і Methylobacillus flagellatum.
УМОВИ ЕКСПЕРИМЕНТУ.
Бактеріальні штами. Дослідження проводили з генетично маркованими штамами метилотрофних бактерій, отриманими з колекції культур Всеросійської колекції промислових мікроорганізмів (ВКПМ) Державного науково-дослідного інституту генетики та селекції промислових мікроорганізмів:
1. - Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, лейцінзавісімий штам факультативних метилотрофних бактерій, продуцент L-фенілаланіну.
2. - Methylobacillus flagellatum KT, ізолейцінзавісімий штам облігатних метилотрофних бактерій, продуцент L-лейцину.
У роботі використовували 2 Н 2 O (99,9% 2 Н), С 2 Н 3 О 2 Н (97,5% 2 Н) і 13 СН 3 ОН (97,5% 13 С), отримані з Російського науково-дослідного центру "Ізотоп" (Санкт-Петербург, РФ), а також N-діметіламінонафталін-5-сульфохлорид (дансілхлорід) (Sigma, CША), карбобензоксіхлорід (Войківський хімзавод, РФ).
Умови адаптації. Адаптацію штамів до дейтерію проводили на агаризованих середовищах (2%-ний агар), що містять важку воду. При цьому використовували розсівання культур до окремих колоній на середовищах, що містять східчасто збільшуються концентрації важкої води [9].
Культивування бактерій проводили на мінеральному середовищі М9 [11], як описано в роботі [9].
Гідроліз білка проводили з використанням 6 н. 2 НСl (у 2 Н 2 О) і 4 н. Ва (ОН) 2 (110 0, 24 год) [12].
Екстракцію ліпідів проводили сумішшю хлороформ-метанол (2:1) за методом Блай і Дайера [13].
Метилові ефіри дансіламінокіслот отримували як описано в роботі [8].
Бензілоксікарбонільние похідні амінокислот отримували як зазначено у роботі [14].
Аналітичне та препаративної поділ бензілоксікарбонільних похідних амінокислот культуральної рідини і білкових гідролізатів проводили методом обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) за раніше розробленою методикою [15].
Поділ метилових ефірів данс-амінокислот проводили методом обернено-фазової ВЕРХ на рідинному хроматографі "Knauer" (ФРН), обладнаним насосом "Knauer", УФ-детектором "2563" і інтегратором "С-R 3A" (Shimadzy, Японія). Використовували нерухому фазу: Separon SGX C 18, 7 мкм, 150 x 3,3 мм (Kova, Чехословаччина). Елюювання проводили в системі розчинників: (А) - ацетонітрил-трифторуксусной кислота (20:80 об / об) і (В) - ацетонітрил. Використовували градієнтне елюювання: від 20% В до 100% У протягом 30 хв, при 100% У протягом 5 хв, від 100% В до 20% У протягом 2 хв, при 20% У протягом 10 хв.
Іонообмінних хроматографію білкових гідролізатів проводили на приладі "Biotronic LC 5001" (ФРН), 230 x 3,2 мм, робочий тиск 50-60 атм, швидкість подачі цитратного буфера 18,5 мл / год, нингидрина 9,25 мл / год, детекція при 570 і 440 нм.
Кількісне визначення L-фенілаланіну в культуральній рідині проводили на приладі "Beckman DU-6" (США) при 540 нм, після обробки препаратів культуральної рідини нінгідрином.
Мас-спектри електронного удару похідних амінокислот отримані на приладі "MB-80A" (Hitachi, Японія) при енергії іонізуючих електронів 70 еВ.
РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ.
Отримання штамів - продуцентів амінокислот, адаптованих до максимальних концентрацій 2 Н 2 О в середовищі.
У рамках даної роботи була досліджена можливість адаптації різних штамів метилотрофних бактерій, продуцентів амінокислот до зростання на середовищах з максимальними концентраціями важкої води. Для цього були перевірені два з наявних в колекції "ДержНДІ Генетики" штамів метилотрофних бактерій: штам облігатних метилотрофних бактерій M. flagellatum, продуцент L-лейцину і штам факультативних метилотрофних бактерій B. methylicum, продуцент L-фенілаланіну.
Для проведення адаптації був обраний ступінчастий режим збільшення концентрації 2 Н 2 О в ростових середовищах, так як ми припустили, що поступове звикання організму до 2 Н 2 О буде позитивно впливати на адаптацію. Етапи адаптації метилотрофних бактерій до середах, що містить максимальні концентрації 2 Н 2 О показані на рис. 1 і схемою. Проте всупереч нашим очікуванням, штам облігатних метилотрофних бактерій M. flagellatum виявив підвищену чутливість до важкій воді (інгібування росту бактерій спостерігалося при концентраціях 2 Н 2 О в середовищі 74,5 об.%) [3]. Подальші експерименти щодо адаптації з даним штамом метилотрофних бактерій не проводилися. У зв'язку з цим у наших експериментах з вивчення рівнів включення дейтерію в амінокислоти використовувалися препарати культуральної рідини і біомаса M. flagellatum, отримана із середовища, що містить 74,5 об.% 2 Н 2 О і 1 об.% С 2 Н 3 О 2 Н.
Раннє нами був описаний метод адаптації штаму факультативних метилотрофних бактерій B. methylicum до зростання при збереженні здатності до біосинтезу фенілаланіну на максимально дейтерированного середовищі [7]. У даній роботі були досліджені зразки біомаси штаму B. Methylicum (рис.1), отримані в ході багатоступінчастої адаптації його до важкої воді на середовищах з різним вмістом 2 Н 2 О (від 0; 24,5; 49,0; 74,5; про% до 98 об% 2 Н 2 О). Оскільки даний штам метилотрофних бактерій вдалося адаптувати до максимальних концентрацій 2 Н 2 О в ростовий середовищі, дослідження рівнів включення дейтерію в амінокислоти сумарних білків біомаси уявлялося найбільш цікавим.
Факультативні метилотрофних Облігатні метилотрофних
бактерії B. methylicum-джерела бактерії M. flagellatum,
2 Н-амінокислот джерела 2 Н-та 13 С-
амінокислот
Багатоступенева адаптація бактерій до
2 Н 2 О на середовищах, що містять 0; 24,5; 49; 74,5; 98
об.% 2 H 2 O
B. methylicum, адаптований M. flagellatum,
до 98 об.% 2 Н 2 О і 2 об.% С 2 Н 3 О 2 Н уповільнення зростання на
середовищі, що містить 74,5 об.% 2 Н 2 О
Культивування на середовищах, Культивування на середовищі,
містять різні концентрації містить звичайну воду
2 Н 2 О і 1 об.% 13 СН 3 ОН
Культуральна рідина після біомаса біомаса Культуральна рідина після відділення від клітин відділення від клітин
2 Н-секретуються амінокислоти 13 С-секретуються амінокислоти
Гідроліз сумарних білків у
4н. Ва (ОН) 2 або 6 н. 2 НСl (у 2 Н 2 О)
2 Н-та 13 С-амінокислоти в
складі білкових гідролізатів
Обробка DnsCl і CH 2 N 2 Обробка ZСl
Оцінка рівнів ізотопного Звернення-фазова Звернення-фазова ВЕРХ
включення методом мас-ВЕРХ метилових Z-похідних амінокислот
спектрометрії метилових ефірів данс- амінокислот
ефірів данс-амінокислот амінокислот
Оцінка рівнів ізотопного
Схема
Адаптація метилотрофних бактерій до середах, що містить максимальні концентрації 2 Н 2 О і отримання 2 Н-та 13 С-амінокислот.
Вивчення ростових характеристик M. flagellatum на середовищах, що містять СН 3 ОН / С 2 Н 3 О 2 Н / 13 СН 3 ОН та 2 Н 2 О.
Дані по зростанню штаму М. flagellatum на мінімальних середовищах, з 1 об.% СН 3 ОН (С 2 Н 3 О 2 Н / 13 СН 3 ОН) і містять східчасто збільшуються концентрації важкої води наведено в таблиці 1. Як видно з таблиці 1, на середовищах, що містять звичайну воду і аналоги метанолу З 2 Н 3 О 2 Н і 13 СН 3 ОН виходи мікробної біомаси склали 81% і 72% відповідно, а на середовищах з 74,5 об.% 2 Н 2 Про вихід біомаси склав 29%, що в 3,4 рази нижче, ніж у контрольних експериментах, коли використовували просту воду і метанол (табл. 1, досліди 1, 3, 8). Як видно з таблиці 1, стійке зростання у M. flagellatum зберігався лише у середовищах, що містять менше ніж 74,5 об.% 2 Н 2 О. Вище цієї концентрації спостерігалося пригнічення росту.
Таблиця 1.
Вплив ізотопного складу середовища на ріст штаму M. flagellaum.
Номер Компоненти середовища, про% Величина Вихід Час досвіду лаг-фази біомаси генер. Н 2 О 2 Н 2 О СН 3 ОН З 2 Н 3 О 2 Н годинник% ч | |||||||
1 | 99,0 | 0 | 1,0 | 0 | 20,0 | 100 | 1,1 |
2 | 99,0 | 0 | 0,5 | 0,5 | 21,3 | 91,0 | 0,8 |
3 | 99,0 | 0 | 0 | 1,0 | 22,4 | 81,0 | 1,0 |
4 | 49,5 | 49,5 | |||||