Лекція 1. Структура геномів про-і еукаріотів. Генетичний код
1. 1928р. Досліди Фредеріка Гріффіта
Гріффіт працював з пневмококами - бактеріями, що викликають пневмонію. Він брав два штами пневмококів: капсульний і бескапсульний. Капсульний - патогенний (вірулентний), при інфікуванні таким штамом миші гинуть, бескапсульний - непатогенні. При введенні мишам суміші убитих нагріванням (і, отже, втратили вірулентність) капсульних пневмококів і живих бескапсульних невірулентних бактерій, тварини гинули в результаті розмноження капсульних вірулентних форм. Виявлене явище Гріффіт інтерпретував як трансформацію.
У 1944р. цей експеримент був повторений Освальдом Ейвері, Коліном Мак-Леода і Маклін Мак-Карті у варіанті змішування бескапсульних пневмококів до взятих від капсульних білками, полісахаридами або ДНК. У результаті цього експерименту була виявлена природа трансформуючого фактора.
Трансформирующим фактором виявилася ДНК.
2. 1952р. Експеримент Альфреда Херші і Марти Чейз
Фаги (бактеріофаги) - це віруси, що розмножуються в бактеріях.
E. сoli - кишкова паличка (еубактеріі).
Суть досвіду: фаги, у яких білкова оболонка була мечена радіоактивної сіркою (S35), а ДНК - радіоактивним фосфором (Р32), инкубировали з бактеріями. Потім бактерії відмивали. У змивних водах не виявляли Р32, а в бактеріях - S35 Отже, всередину потрапила тільки ДНК. Через кілька хвилин з бактерії виходили десятки повноцінних фагів, що містять і білкову оболонку, і ДНК.
Звідси випливав однозначний висновок про те, що саме ДНК виконує генетичну функцію - несе інформацію як про створення нових копій ДНК, так і про синтез фагових білків 1957р. Досліди Френкеля - Конрат
Френкель-Конрат працював з вірусом тютюнової мозаїки (ВТМ). У цьому вірусі міститься РНК, а не ДНК. Було відомо, що різні штами вірусу викликають різну картину ураження листя тютюну. Після зміни білкової оболонки "переодягнені" віруси викликали картину поразки, характерну для того штаму, чия РНК була покрита чужим білком.
Отже, не тільки ДНК, але і РНК може служити носієм генетичної інформації
Молекулярна біологія - це наука про механізми зберігання, відтворення, передачі і реалізації генетичної інформації, про структуру та функції нерегулярних біополімерів - нуклеїнових кислот і білків.
Нуклеотиди
Принципи будови ДНК
1. Нерегулярність.
Існує регулярний сахарофосфатним остов, до якого приєднані азотисті основи. Їх чергування нерегулярно.
2. Антипараллельно.
ДНК складається з двох полінуклеотидних ланцюжків, орієнтованих антипараллельно. 3 `-кінець однієї розташований навпроти 5` - кінця іншої.
3. Комплементарність (доповнення).
Кожному азотистій підставі одного ланцюга відповідає строго певне азотна основа іншого ланцюга. Відповідність задається хімією. Пурин і піримідин в парі утворюють водневі зв'язки. У парі A-Т два водневі зв'язки, в парі Г-Ц - три.
4. Наявність регулярної вторинної структури.
Дві комплементарні, антипараллельно розташовані полінуклеотидні ланцюга утворюють праві спіралі зі спільною віссю.
Форми подвійної спіралі ДНК
В основній - У-формі на виток припадає 10 комплементарних пар. Площини азотистих основ перпендикулярні осі спіралі. Сусідні комплементарні пари повернені один щодо одного на 36 . Діаметр спіралі 20 Å, причому пуриновий нуклеотид займає 12 Å, а піримідинових - 8 Å. А-форма - 11 пар азотистих основ на виток. Площини азотистих основ відхилені від нормалі до осі спіралі на 20
. Звідси випливає наявність внутрішньої порожнечі діаметром 5 Å. Висота витка 28 Å. Такі ж параметри у гібрида з одного ланцюга ДНК і одного ланцюга РНК.
З-форма - крок спіралі 31 Å, 9.3 пар основ на виток, кут нахилу до перпендикуляру 6 .
Всі три форми - правозакручена спіралі.
Є ще кілька форм правих спіралей і всього одна ліва спіраль (Z-форма). Висота витка в Z-формі -44.5 Å, на виток припадає 12 пар нуклеотидів. Ні А-, ні Z-форми не можуть існувати у водному розчині без додаткових впливів (білки або суперспіралізацію).
Відмінності між ДНК і РНК
ДНК | РНК | |
Цукор | Дезоксирибоза | Рибоза |
Азотисті основи | А, Т, Г, Ц | А, У, Г, Ц |
Кількість ланцюжків в молекулі | 99.99% подвійна спіраль 0.01% одноланцюжкова. | 99.99% одноланцюжкова |
Форма молекули | Всі одноланцюгові-кільцеві. Більшість дволанцюжкові - лінійні, частина-кільцеві. | Лінійні молекули |
Сюрпризи мітохондріального геному
Незважаючи на те, що в геномах мітохондрій ссавців і дріжджів міститься приблизно однакова кількість генів, розміри дріжджового геному в 4-5 разів більше - близько 80 тис. пар нуклеотидів. Хоча кодують послідовності мтДНК дріжджів високо гомологічних відповідним послідовностей у людини, дріжджові мРНК додатково мають 5'-лідерних і 3'-некодуючих області, як і більшість ядерних мРНК. Ряд генів містить ще й інтрони. Так, в гені box, що кодує цитохромоксидазу b, є два інтрони. З первинного РНК-транскрипту автокаталитически (без участі будь-яких білків) вирізається копія більшої частини першого інтрони. Залишилася, РНК служить матрицею для утворення ферменту матурази, що бере участь у сплайсинг. Частина її амінокислотної послідовності закодована в останніх копіях інтронів. Матураза вирізає їх, руйнуючи свою власну мРНК, копії екзонів зшиваються, і утворюється мРНК для цитохромоксидази b. Відкриття такого феномена змусило переглянути уявлення про інтрони, як про "нічого не кодують послідовностях".
Сверхспіралізація.
Освіта сверхспіральной ДНК відбувається у всіх прокаріотичних та еукаріотичних клітинах і в багатьох віруси, що вражають еукаріот. Понад галактика (сверхскрученная) ДНК утворюється при введенні в подвійну спіраль ДНК додаткових витків (сверхвітков). У результаті в молекулі виникає напруга, яка проявляється, зокрема в тому, що вісь подвійної спіралі сама закручується в спіраль (спіралізуются) - див на прикладі кільцевої замкнутої двуцепочечной ДНК (прозрачка). Отримана таким чином суперспіральная ДНК повинна бути стабілізована, оскільки в результаті більш щільного впакування негативно заряджені фосфатні групи виявляються в безпосередній близькості один від одного. Взаємне відштовхування їх компенсується шляхом зв'язування їх з позитивно зарядженими білками (є не у всіх вірусів, але у всіх про-і-еукаріоти) і з малими молекулами, що представляють собою поліаміни, наприклад, спермідин (їх немає тільки у вірусах).
Упаковка ДНК в клітинах прокаріотів.
Сверхспіральний ділянку ДНК у комплексі з гістоноподобнимі білками, що володіють спорідненістю до ДНК, і поліаміни утворює «намистину» діаметром близько 12 нм. Усередині намистини вісь подвійної спіралі ДНК перекручена і утворює приблизно 6 витків. Намистини з'єднані між собою ділянками ДНК, в яких сверхспіральность відсутній, і об'єднуються таким чином у структуру, що нагадує намисто. Така ДНК утворює далі великі петлі, які стабілізуються і остаточно конденсуються завдяки взаємодії з відповідними білками і РНК.
Упаковка ДНК в клітинах еукаріот
Включає в себяассоціацію сверхспіралізованной ДНК з різними білками (гістонами-основні білки, 11,3-21 кДа, всередині намистини Н2А, Н2В, Н3 і Н4), в результаті якої утворюється комплекс, званий хроматином. Хроматин в свою чергу утворює соленоідоподобную структуру, з якої зв'язуються хромосомні структурні білки (вони утворюють каркас на якому йде остаточна конденсація хроматину, цей білковий остов не руйнується навіть після видалення всіх гістонів); вийшов у результаті комплекс - хромосома.
Хроматин складається з двуцепочечной ДНК, яка обвивається навколо гранул, що складаються з гістонів. Така структура схожа на намисто - хроматиновой волокно. Кожна намистина - це нуклеосоми (діаметр її близько 10 нм, вперше встановив її структуру Клуг з працівниками). Нуклеосоми з'єднуються за допомогою гистона Н1, ДНК цих сполучних ділянок - з'єднувальна (або лінкерная) ДНК. Н1 не бере участь у стабілізації структури хромосоми, а скоріше відіграє роль в регуляції транскрипционной активності хроматину. У результаті конденсації в хроматин поздовжні розміри ДНК зменшуються в 5-6 разів.
Топоізомерази. Переходи в молекулах ДНК, пов'язані зі зміною ступеня сверхспіралізаціі (топологічні ізомери ДНК), каталізується ферментами топоізомеразами. Одні топоізомерази викликають релаксацію сверхспіральной ДНК, а інші навпаки, призводять до появи в ній поза витків. . Coli переводит двуцепочечную кольцевую ДНК в состояние с отрицательной сверхспирализацией.
Так наприклад, ДНК-гіраза E. Coli переводить двуцепочечную кільцеву ДНК в стан з негативною сверхспіралізаціей. Це необхідно для зняття позитивних сверхвітков, що виникають при реплікації (і транскрипції) через розкручування подвійної спіралі ДНК. (Див. дію антибіотиків).Гени. Структурний ген - це найменший проміжок ДНК або РНК, що кодує повну амінокислотну послідовність будь-якого білка. У клітці вищих організмів може міститися до 100 000 генів (за останніми даними їх істотно менше). Однак ДНК в клітині стільки, що її вистачило б на освіту в 10 разів більшої кількості генів. «Зайва ДНК» - у складі інтронів, спейсерной ДНК, наприклад. У віруси може бути лише 5-6 генів, а геном прокаріотів становить приблизно 0,1% від генома вищих.
Хромосома прокаріотів. Структурні гени поділяються на три основних типи: незалежні гени (транскрибуються без будь-яких механізмів регуляції транскрипционной активності), транскрипційні одиниці (транскріптони - група наступних один за одним генів, транскрипційного спільно, зазвичай це гени білків або н.к., пов'язаних між собою у функціональному відношенні ), і опрерони (група наступних підряд структурних генів, що знаходяться під контролем ділянки ДНК - оператора). Крім того Прокаріотична клітці можуть перебувати більш дрібні реплицируются одиниці - плазміди (кільцеві молекули ДНК, в них є ділянки здатні до переміщення - транспозони, вони часто містять гени резистентності до антибіотиків, переміщаючись з однієї клітини в іншу в процесі кон'югації, гени резистентності швидко поширюються в популяції бактерій).
Клітини еукаріот використовують як генетичного матеріалу лише двуцепочечную ДНК. -РНК повторятся много сотен раз, причем повторы следуют вплотную друг за другом) и кластерные гены (это локализованные в определенных участках – локусах – хромосомы группы различных генов с родственными функциями, иногда также в виде повторов, например, кластер гистоновых генов в геноме человека повторяются 10-20 раз).
Структурні гени в них поділяються на незалежні гени (їх транскрипція не пов'язана з транскрипцією інших генів, їх активність регулюється, наприклад гормонами), повторювані гени (наприклад, ген рибосомной 5 S-РНК повторяться багато сотень разів, причому повтори слідують впритул один за одним) та кластерні гени (це локалізовані в певних ділянках - локусах - хромосоми групи різних генів із спорідненими функціями, іноді також у вигляді повторів, наприклад, кластер гістонових генів в геномі людини повторюються 10-20 разів). У кодують послідовності цих генів можуть вклинюватися некодуючі - інтрони (розбивають кодує - експресуються частину гена - отже для отриманої з цієї матриці мРНК потрібен сплайсинг). Крім того, між генами можуть бути ділянки ДНК з великим числом повторів (сателітної ДНК - в теломерна і центромірних ділянках хромосоми - функція цієї ДНК поки неясна, ймовірно структурна) і спейсерной ДНК (розташовується між генами), транскрипційного і нетранскрібіруемой.Неядерні геноми. ДНК мітохондрій і хлоропластів.
Відмітна особливість клітин еукаріот полягає в тому, що частина генетичної інформації в них криється у молекулах, що знаходяться поза хромосом, локалізованих в ядрі. Існує два таких типу цитоплазматичних ДНК: одні - в мітохондріях еукаріотів, інші - у хлоропластах зелених рослин і водоростей. Як і всі цитоплазматичні елементи, вони успадковуються по материнській лінії, а не за законами Менделя.
ДНК мітохондрій. Це замкнуті кільцеві сверхспіральние дуплексні ДНК (прозрачка). Розмір у тварин близько 20 т.п.н., у дріжджів - 80 т.п.н., у рослин - від кількох сотень до кількох тисяч т.п.н. Мітохондріальна ДНК еволюціонує швидше, ніж ядерна, і мутації в ній відбуваються майже в десять разів частіше. Розглянемо на прикладі мітохондріальної ДНК дріжджів. Є гени, що кодують білки, гени кодують РНК, вставні послідовності, є сайти початку реплікації, що кодують субодиниці АТФ-азного комплексу.
ДНК хлоропластів схожа з ДНК мітохондрій. Ця ДНК - кільцевої дуплекс (прозрачка), що містить якусь кількість (але далеко не всі) генів, істотних для функціонування (наприклад, кодування фрагмента ключового ферменту фотосинтезу - рибулезо-1 ,5-біфосфат карбоксилазою) і підтримки структури хлоропластів, і має достатньо велику довжину - 120-180 т.п.н. на відміну від ДНК мітохондрій в межах виду досить консервативна.
Є приклади межгеномного обміну: перенесення сегментів хлоропластної ДНК в ядерну ДНК, мітохондріальної ДНК в ядерну ДНК (дріжджі, сарана, пацюк), хлоропластної ДНК в мітохондріальну ДНК. Механізм таких переносів поки не встановлений.
Лекція 2. Структура хроматину. Поліморфізм ДНК
У живих організмах молекули ДНК є або дуже довгі, або замкнуті в кільце двоспіральні молекули, тому будь-який процес, пов'язаний із передачею спадкової інформації, повинен натрапляти на серйозні топологічні проблеми: виникнення позитивної (+) або негативною (-) сверхспіралізаціі ДНК, освіта катенанів або вузлів.
Сверхспіралізованная ДНК володіє значним запасом енергії в порівнянні з її релаксувати формою. Отже, локальне розплітання подвійної спіралі ДНК з негативними сверхвіткамі буде приводити до скидання напруги сверхспіралізаціі і тому енергетично вигідно. -форму.
Це чітко проявляється в тому, що негативна сверхспіралізація помітно стимулює перехід ДНК з правої По-форми в ліву Z-форму. Негативна сверхспіралізація ДНК полегшує зв'язування з нею білків, розкручують її подвійну спіраль.Вирішення названих топологічних проблем забезпечують ДНК-топоізомерази - ферменти, що змінюють топологію ДНК (рис. 49). Топоізомерази релаксують сверхспіралізованние молекули ДНК, знімаючи їх внутрішнє напруження шляхом внесення одне й дволанцюгових розривів з подальшим їх відновленням лігування). и II .
За механізмом дії розрізняють ДНК-топоізомерази двох типів - I і II.— мономерные белки, релаксируют ДНК без затраты энергии путем внесения одноцепочечных разрывов.
ДНК-топоізомерази I - мономірні білки, релаксують ДНК без витрати енергії шляхом внесення одноланцюгових розривів. функционируют в виде димеров (у эукариот) и тетрамеров (у прокариот), осуществляя АТР-зависимое расщепление обеих цепей ДНК с последующим переносом цепей через разрыв и его лигированием. ДНК-топоізомерази II функціонують у вигляді димерів (в еукаріот) і тетрамеров (у прокаріот), здійснюючи АТР-залежне розщеплення обох ланцюгів ДНК з подальшим перенесенням ланцюгів через розрив і його лігування.Для внесення одноланцюжковою розриву в ДНК все ДНК-топоізомерази використовують залишок тирозину, який здійснює нуклеофільних атаку фосфатної групи ДНК з утворенням фосфотірозіна. У результаті ферменти виявляються ковалентно пов'язаними з 5'-або З "-кінцями ДНК в одноланцюгових розриві.
Топоізомерази підтипу 1-5 'зв'язуються переважно з одноланцюжковий ділянками ДНК,
здійснюючи її розрив з утворенням 5'-фосфодіефірних зв'язку з тірозіном активного центру ферменту. Через утворився розрив проходить або одноланцюжкова ДНК (зняття витка), або двуцепочечной (появу вузла або Катена). Ферменти цього типу знімають тільки негативну суперспіралізацію. Характерні для прокаріотів.
Топоізомерази підтипу 1-3 'зв'язуються з двуцепочечной ДНК, розривають один ланцюг з утворенням З "-фосфодіефірних зв'язку з тірозіном активного центру ферменту. Через розрив проходить другий ланцюг дуплексу, зменшуючи щільність суперспіралізацію ДНК; знак суперспіралізацію істотної ролі не грає. Характерні для еукаріот.
Топоізомерази типу II зв'язуються з двуцепочечной ДНК і здійснюють розрив обох ланцюгів з утворенням двох 5'-фосфодіефірних зв'язків з тирозину активного центру. , изменяющих число супервитков на единицу за шаг). У щілину, що утворилася проходить друга двуцепочечной ДНК, і результатом є зміна числа позитивних чи негативних супервитки на 2 (на відміну від ферментів типу I, що змінюють число супервитки на одиницю за крок).
Цей фермент здатний катеніровать, декатеніровать і розв'язувати вузли інтактною ДНК. Для багаторазового повторення циклу потрібно АТР (рис. 50).
Топоізомераза II Є. coli , но не требует АТР. (ДНК-гіраза) відноситься до ферментів типу II, але не вимагає АТР. Вона індукує утворення негативних супервитки в релаксувати кільцевих ДНК. Гіраза взаємодіє з ДНК таким чином, що остання намотується навколо білка. При цьому виникає позитивна сверхспіралізація в тих місцях молекули ДНК, які пов'язані з білком. Потім фермент розриває обидві нитки ДНК і переносить подвійну нитку з внутрішньої сторони на зовнішню, після чого скріплює обидва розриву, перетворюючи позитивну петлю в негативну (рис. 51). Це особливо важливо для ініціації реплікації, а також необхідно для її елонгації і термінації.
является жизненно важным ферментом любого эукариотического организма.
ДНК-топоізомераза II є життєво важливим ферментом будь-якого еукаріотичного організму. З'ясовано роль ДНК-топоізомерази у формуванні вищих рівнів структури хроматину, а саме, участю ферменту в освіті петель хроматину під час конденсації хромосом.Гістони складають більшість основних білків хроматину і знаходяться приблизно в тій же кількості, що і ДНК. За відносній частці основних амінокислот кожного типу, яку висловлюють ставленням лізин / аргінін, спочатку охарактеризували п'ять типів гістонів. Слід цієї класифікації до цих пір залишається в назвах гістонів. Практично у всіх еукаріотів виявляють одні й ті ж класи гістонів. Їх властивості підсумовані в табл. 29.1.
Гістони чотирьох класів прямо взаємодіють з ДНК і утворюють в хроматині серію частинок першого рівня організації. Консервативність типів гістонів протягом еволюції можна пояснити необхідністю збереження цієї найважливішої реакції. П'ятий клас гістонів бере участь у взаємодіях між частинками. Сталість класів гістонів дозволяє припускати, що взаємодії типу ДНК-гістони, гістон-гістони та гістон-негістонових білки можуть бути в основному схожими в різних видів. Звідси ми можемо зробити висновок про загальні механізми освіти як первинних частинок, так і наступних структур більш складного порядку, що складаються з серій частинок.
Гістони перших чотирьох класів мають значну кількість як кислих, так і основних амінокислот. Тому ці білки несуть високий заряд. Ставлення основних амінокислот до кислих знаходиться в діапазоні 1,4-2,5. Ці гістони поділяються на дві групи.
До аргінін-багатим відносяться два види гістонів: Н3 і Н4. Вони належать до найбільш консервативним з усіх відомих білків. Амінокислотні послідовності цих білків ідентичні навіть у таких віддалених видів, як корова і горох. У гистонах Н3 і Н4 інших видів виявлені тільки рідкісні амінокислотні заміни. Консервативність цілої послідовності говорить про те, що всі її амінокислоти мають істотне значення для виконання функції білка. За логікою речей ця функція повинна бути однаковою у величезної більшості різних видів, що свідчить на користь концепції про загальну основу для структури хроматину.
До гістонів, помірно збагаченим лізином, відносяться два білки. Їх називають Н2А і Н2В (на противагу їх номенклатурного позначенню це не споріднені, а незалежні білки). У різних еукаріот знаходять ті ж самі два типи гістонів, але у них виявлено помітні міжвидові варіації в амінокислотної послідовності.
П'ятий клас представлений гістонами, дуже багатими лізином; він складається з декількох досить близькоспоріднених білків з перекриваються послідовностями амінокислот. Це гістони H1 (в еритроцитах птахів існує варіант, названий Н5). У цих гістонів виявлені значні міжвидові і міжтканинні варіації (у дріжджів, мабуть, гістонів даного класу немає). Хоча ці гістони є самими основними гістонами, їх легко можна виділити з хроматину, повністю розчинивши в сольовому розчині (0,5 М).
Як і випливає з назви, негістони - це всі інші білки хроматину. Передбачається тому, що вони володіють великими видовими і тканинними відмінностями, хоча строгих даних про ступінь їх різноманітності поки немає. Ці білки складають меншу частку від усієї маси білків хроматину, ніж гістони. Крім того, сюди відноситься набагато більше число білків, так що будь-який індивідуальний білок присутній у значно меншій кількості, ніж будь-який гістон.
В клас негістонових білків можуть потрапити білки, пов'язані з експресією генів, і білки, що беруть участь в організації структур вищого порядку. Так, в числі найбільш видатних негістонов можна назвати РНК-полімеразу. HMG-білки (високомобільна група) складають окремий, добре помітний підклас негістонов. Основна проблема, що виникає при роботі з іншими негістонових білками - їх забруднення іншими ядерними білками
Гістони видаляють шляхом конкурентного заміщення поліаніона декстрансульфатом і гепарином.
Нуклеосоми
Якщо інтерфазних ядра суспендованих в розчині з низькою іонною силою, вони розбухнуть і в місцях розривів з них вивільняться нитки хроматину. На рис. 29.1 показано спеціалізовані ядро, з якого випливають нитки. У деяких місцях нитки хроматину складаються з плотноупакованной матеріалу, але в тих місцях, де вони витягнуті, можна бачити, що вони складаються з окремих частинок. Ці частинки називають нуклеосомами. В особливо витягнутих ділянках видно, що індивідуальні нуклеосоми з'єднані тонкою ниткою - це вільна дволанцюжкова ДНК. Таким чином, безперервна дволанцюжкова ДНК проходить через серію частинок.
Індивідуальні нуклеосоми можна отримати, обробивши хроматин ферментом нуклеаз мікрококів. Це ендонуклеаза, яка розрізає нитку ДНК в місцях з'єднання між нуклеосомами. Спочатку звільняються групи частинок, а потім окремі нуклеосоми. Мономірні нуклеосоми чітко видно на рис. 29.2 у вигляді компактних часток (справжнє форма яких схожа на диск; див. нижче). Вони седіментіруют приблизно зі швидкістю 11S, що відповідає загальній масі в діапазоні 250000-300000 дальтон. Ставлення білок / ДНК становить близько 1,25. Димери, тримери і т.д. мають відповідні властивості при біохімічному аналізі чи при спостереженні під електронним мікроскопом.
Мономірні нуклеосоми містять ДНК (~ 200 п. н.), Пов'язану з гістоновими октамер. Цей октамер містить гістони Н2А, Н2В, НЗ і Н4 - по дві копії кожного. Іноді їх називають гістоновими серцевиною (гістоновими кором). Такі комплекси схематично зображені на рис. 29.3.
Нуклеосома - білковий комплекс, що складається з гістонів складу [2H2A, 2H2B, 2H3, 2H4].
Характеристика нуклеосоми
Нуклеосома 5,5 x11нм | 146пн |
Нуклеосома + H1 | 166пн |
Нуклеосома + H1 + лінкер (ділянка м-у н.) | 200пн |
ДНК в B-формі перекручена на 0,25-0,35 пн на виток спіралі, при цьому крок спіралі 10,2 пн / виток (у В-форми в розчині - 10,5 пн / виток). Така ДНК робить 1,75 лівих обороту навколо нуклеосоми. Комплекс не руйнується при руйнуванні плечей гістонів. N-кінцеві домени Н3 контактують з ДНК на вході в корову частку і вихід з неї, Н4 зв'язується з внутрішньою частиною ДНК нуклеосоми H1 - лінкерний гістон і виконує функцію зв'язування нуклеосом між собою, однак у дріжджів H1 не виявлений, а його аналог Hho1p не виконує видимої ролі у згортанні ДНК і взаємодії нуклеосом між собою.
Будь-яке додаткове збільшення вмісту білка залежить від присутності невеликої кількості негістонових білків, які зв'язуються з нуклеосомами.
Нуклеосомную ДНК можна розділити на дві частини.
ДНК мінімальної нуклеосоми має постійну довжину 146 пар основ і щодо стійка до розщеплення нуклеазами. (Інші нуклеази, в тому числі і Нуклеази мікрококів, зупиняються перед цим відрізком ДНК.)
Лінкерная ДНК містить в собі залишок повторюваної одиниці. Її довжина може варіювати in vivo від такого малого розміру, як 8 п. н., До такої великої, як 114 пар основ, на 1 нуклеосому.
Розглядаючи модель, зображену на рис. 29.8 у вигляді поперечного перерізу, можна бачити, що два витка ДНК лежать близько один до іншого. Це, можливо, має функціональне пояснення. Один виток навколо нуклеосоми захоплює 80 пар основ, так що точки, віддалені на це відстань у вільній подвійної спіралі, можуть виявитися розташованими досить близько один до одного на нуклеосоме. Таким чином, якщо ДНК-зв'язуючий білок одночасно контактує з двома витками ДНК, як показано на рис. 29.9, впізнавані їм послідовності можуть відстояти на подвійній спіралі ДНК набагато далі, ніж величина з'єднує їх ділянки в білку. Часто обговорюється питання про те, чи може стартова точка транскрипції знаходитися поблизу від становища - 80 так щоб обидві ланцюга одночасно контактували з РНК-полімеразою. (Це внесло б конкретну деталь в узагальнену модель, показану на рис. 11.8).
Щільність упаковки окремої нуклеосоми дорівнює приблизно 6 (так як 67 нм ДНК упаковані в частку довжиною близько 11 нм). Можна упакувати серію нуклеосом досить щільно, щоб зберегти це відношення. Безліч робіт з вивчення наборів нуклеосом було виконано на вірус SV40.
Важливим параметром в описі структури хроматину є ступінь суперспіралізацію, яка може виникнути на декількох рівнях:
суперспіралізацію може бути результатом упаковки ДНК на нуклеосоме.
суперспіралізацію може бути наслідком укладання нуклеосом в структуру більш високого рівня.
Стан суперспіралізацію багато в чому може утримуватися білками (за принципом, описаному в гол. 28). Прямі вимірювання густини суперспіралізацію дозволять дізнатися середня напруга скручування ДНК, що виникає в результаті утворення вільних супервитки, але таким чином можна виявити суперспіралізацію, яка утримується в ході упаковки ДНК.
Для міні-хромосоми вірусу SV40 можна прямо виміряти ступінь суперспіралізацію в самій нуклеосоме. Міні-хромосома може мати вільні супервитки в гірлянді нуклеосом, а також супервитки, утримувані на нуклеосоме. Процедура вимірювання суперспіралізацію, обумовлена лише структурою нуклеосом, показана на рис. 29.10. Спочатку звільняються вільні супервитки самої міні-хромосоми, так що гірлянда нуклеосом утворює кільце з нульовою суперспіралізацію. Потім екстрагують гістоновими октамер. У результаті цієї процедури звільнилася ДНК вільно розправляється. Таким чином кожен супервіток, який стримується в міні-хромосомі, проявиться в депротеінізований ДНК як - 1 оборот. Так можна виміряти загальне число супервитки в ДНК вірусу SV40.
Організація нуклеосом (гістонів) і ДНК
До цих пір ми розглядали конструкцію нуклеосоми, виходячи з того, як організовані повторювані одиниці довжини ДНК на поверхні нуклеосом.
яким чином гістони взаємодіють один з одним і з ДНК. Взаємодіють чи гістони тільки в присутності ДНК або здатні незалежно збиратися в октамер?
Ми ще багато чого не знаємо про структуру індивідуальних гістонів в нуклеосоме, але вже стала прояснюватися їх відносна локалізація. Більшість даних про взаємодії гістонів отримано при вивченні здатності до агрегації і до утворення перехресних зшивок у нуклеосоме.
Здатність гістонів агрегувати один з одним вивчена добре. Гістони, багаті аргініном, можна одержувати у вигляді добре помітного тетрамера (Н3 2 Н4 2). Гістони, помірно багаті лізином, утворюють продукт, який менш чітко охарактеризований, але який, очевидно, утворює димер (Н2А • Н2В), що має тенденцію до подальшої агрегації. Однією з форм утворюється агрегату може бути тетрамер (Н2А 2 • Н2В 2). Два зазначених тетрамера називають гомотіпіческімі (назва відображає те, що кожен з них містить тільки гістони, відносяться до одного з початкових класів).
Інтактні октамер гістонів можна отримати або екстракцією хроматину, або (з великими труднощами) шляхом з'єднання гістонів in vitro в умовах високої концентрації солі і білка. Октамер може диссоциировать з утворенням гексамери гістонів і вільного димеру Н2А • Н2В. У результаті відділення другого димеру Н2А • Н2В утворюється тетрамер Н32Н42. Всі ці форми можна екстрагувати з хроматину. Виходячи з цих даних, можна зробити висновок, що в нуклеосоме є центральне «ядро» (kernel), що складається з тетрамера Н3 2 Н4 2, пов'язаного з двома незалежними димерами Н2А • Н2В.
Перехресні зшивки дозволяють встановити, які пари гістонів лежать ближче один до одного в нуклеосоме. (Складність в інтерпретації цих даних полягає в тому, що зшивається тільки невелика частина гістонів. Тому слід оцінювати результати з обережністю, враховуючи типовість більшості взаємодій.) На основі отриманих даних була сконструйована модель організації нуклеосоми.
Збірка нуклеосом
1 спосіб. зумовлений здатністю тетрамера Н32Н42 організовувати ДНК в частинки, які трохи нагадують мінімальну нуклеосому (за їх чутливості до нуклеаз мікрококів). При додаванні димеру Н2А • Н2В ці тільця можуть перетворюватися на мінімальну нуклеосому. Саме звідси виникла ідея про те, що в структурі нуклеосоми існує «ядро» з аргінін-багатих гістонів. Можливо, такий шлях використовується in vivo, оскільки це узгоджується із спостереженням, що гістони НЗ і Н4 включаються до реплицируются хроматин, до того як у його склад входять гістони Н2А і Н2В.
2. спосіб. Дані отримані при використанні поперечно-зшитих гістонових октамер, які не можуть диссоциировать на окремі білки, але тим не менш зберігають здатність зв'язувати ДНК з утворенням мінімальної нуклеосоми. Це говорить про те, що в принципі ДНК може обвивається навколо попередньо сформованого октамеру.
З ооцитів Xenopus виділений білок збірки.
Це пентамер, що містить ідентичні субодиниці по 29000 дальтон.
Це білок, що переважає в ооцитах, і локалізований він у нуклеоплазмі.
Антитіла, отримані проти цього білка, реагують з білками нуклеоплазми багатьох еукаріот. Отже, можна припустити, що цей білок відповідає еволюційно якоїсь універсальної функції, закріпленої в процесі еволюції. Він був названий нуклеоплазміном.
У присутності нуклеоплазміна гістони можуть зв'язуватися з ДНК, утворюючи у фізіологічних умовах (низька концентрація солі) частинки.
Проте самого по собі нуклеоплазміна недостатньо для утворення нуклеосом зі специфічним інтервалом.
Яка функція нуклеоплазміна?
Це кислий білок, який не зв'язується ні з вільною ДНК, ні з інтактними нуклеосомами, але при цьому він зв'язується з усіма індивідуальними гістонами
Реакція насичується на рівні, рівному одному пентамеру нуклеоплазміна на октамер гистона.
Нуклеоплазмін, можливо, відіграє роль «молекулярного супроводжуючого», зв'язуючись з гістонами і передаючи їх ДНК більш регульованим чином, ніж було б можливо без такого конкурента. Тобто контролює спорідненість гістонів до ДНК На користь цього припущення говорить той факт, що кисла поліглутаміновая кислота, а також РНК можуть діяти подібним чином як факторів збірки.
Фейзінг. Терміном "фазування" позначають невипадкове розташування нуклеосом щодо конкретної послідовності нуклеотидів ДНК в певних ділянках генома. Позиціонування йде в тому числі за допомогою спеціальних послідовностей ДНК, які володіють тим властивістю, що вони більш податливі до вигину подвійної спіралі ДНК в цьому місці. Перед активацією гена нуклеосоми присутні як у вищерозташованих регуляторних послідовностях ДНК, так і в самому промоторі. ‚ связывающиеся с ТАТАбоксом), связываясь с ДНК, прямо или косвенно вызывают разрушение нуклеосомной структуры соответствующих участков ДНК.
Під час індукції транскрипції такого гена регуляторні фактори (TF, що зв'язуються з ТАТАбоксом), зв'язуючись з ДНК, прямо або побічно викликають руйнування нуклеосомной структури відповідних ділянок ДНК.Існують області, в яких немає нуклеосом. Такі області можуть бути пов'язані з контролем експресії генів або ж з утворенням структур більш високого рівня організації хроматину. (Льюин)
Нуклеосоми при реплікації і транскрипції
При електронно-мікроскопічному дослідженні реплікується хроматину було виявлено, що обидві новостворені фібрили містять нуклеосоми. Якщо врахувати швидкість синтезу ДНК еукаріотів (20 нм / с), то нові нуклеосоми при подвоєнні хромосомних фібрил повинні виникати зі швидкістю 3-4 с. Така висока швидкість утворення нуклеосом пов'язана з тим, що в момент синтезу ДНК вже існує пул синтезованих гістонів всіх класів, готових увійти до складу нуклеосом. Гістоновими гени, пов'язані з фракції помірно повторюваних послідовностей ДНК, представлені у вигляді множинних копій для кожного гистона. Вони активуються разом з початком синтезу ДНК, тому в міру просування репликационной вилки нові ділянки ДНК можуть відразу взаємодіяти з новосинтезованих гістонами. Новосинтезовані гістони і старі гістони в складі попередніх нуклеосом не змішуються при утворенні нуклеосом під час реплікації ДНК. Замість цього октамер гістонів, присутні до реплікації, залишаються інтактними і переходять на дочірній дуплекс ДНК, у той час як нові гістони збираються в абсолютно нові кор-частинки на вільних від нуклеосом ділянках ДНК. Старі і нові октамер гістонів розподіляються між дочірніми дуплексу ДНК випадковим чином.
Що відбувається зі старими нуклеосомами у вилці реплікації ДНК, до кінця не ясно. Згідно з однією з гіпотез, кожна з нуклеосом при підході до неї реплікативної вилки як би розщеплюється на дві «полунуклеосоми», а нуклеосомная ДНК розгортається, щоб дати пройти ця ділянка ДНК-полімеразі. Після цього новосинтезованих ланцюг ДНК зв'язується з вільними гістонами, які є в надлишку в ядрі, і утворюються нові нуклеосоми на другий ланцюга ДНК.
Як вже згадувалося, для активно функціонуючих зон хроматину характерно деконденсірованное, дифузне, стан. На цій властивості хроматину заснований один з методів отримання фракцій активного хроматину, коли за допомогою центрифугування вдається осадити конденсований хроматин з гомогенатов ядер, відокремивши його тим самим від дифузного хроматину, що володіє високою транскрипционной активністю. ), повышенным содержанием некоторых негистоновых белков.
Фракції активного хроматину мають ряд характерних властивостей: підвищеною чутливістю до нуклеазами, підвищеним рівнем модифікації гістонів (особливо ацетилюванням гистона HI), підвищеним вмістом деяких негістонових білків.Біохімічні дані показують, що під час транскрипції частина нуклеосомних білків залишається пов'язаної з ДНК. Нуклеосоми як частки видно на хроматиновий фібрила як до місця отхожде-ня транскрипту, так і після нього при рідкісної посадці РНК-поліме-рази - ферменту, вдвічі більшого, ніж нуклеосоми. При частій посадці цього ферменту (наприклад, при транскрипції рибосомних генів або генів в інших активних локусах) частки РНК-полімерази розташовуються тісно один до одного і між ними нуклеосоми не видно (см, рис. 101). Найімовірніше, нуклеосомние білки при проходженні РНК-полімерази не втрачають зв'язку з ДНК, а сама ДНК у складі нуклеосоми розгортається. Пропонуються два варіанти зміни структури нуклеосом при синтезі РНК. При одному з них Нуклеосома «розщеплюється» на дві полунуклеосоми, а ДНК розгортається; при іншому - нуклеосоми, частково декомпактізіруясь, зберігає тетра-заходів (НЗ-Н4) 2, а два димеру Н2А-Н2В тимчасово відходять, а потім, після проходження РНК -полімерази, повертаються, при цьому відновлюється вихідна нуклеосоми.
Другий рівень компактизації ДНК - фібрила діаметром 30 нм
Таким чином, перший, нуклеосомний, рівень компактизації хроматину грає як регуляторну, так і структурну роль, забезпечуючи щільність упаковки ДНК приблизно в 6-7 разів.
Однак у багатьох електронно-мікроскопічних дослідженнях було показано, що як в мітотичних хромосомах, так і в інтерфазних ядрах виявляються фібрили хроматину діаметром 30 нм (рис. 57, в і 62). Хроматіновие фібрили такого діаметра було видно як на ультратонких зрізах після фіксації глутарового альдегіду, так і на препаратах виділеного хроматину та виділених хромосом в розчинах, що містять хоча б низькі концентрації двовалентних катіонів. Показано, що фібрила хроматину діаметром 30 нм може оборотно змінювати свій діаметр: стає фібрил товщиною 10 нм, якщо препарати хроматину перевести в деіонізованої воду або в розчини, що містять хелатон ЕДТА. У той же час навіть часткова екстракція гистона Н1 переводить вихідні фібрили хроматину (30 нм) в нитки діаметром 10 нм, мають типовий нуклеосомний рівень організації. При додаванні до них гистона Н1 відновлюється первісний діаметр фібрил.
Все це говорило про те, що нуклеосомние ланцюжка хроматину якимось специфічним чином укладені так, що виникає не хаотична агрегація нуклеосом, а правильна нитчатая структура діаметром 30 нм.
Щодо характеру упаковки нуклеосом у складі фібрили хроматину діаметром 30 нм існують, принаймні, дві точки зору. Одна з них захищає так званий соленоїдний тип укладання нуклеосом. Відповідно до цієї моделі, нитка щільно упакованих нуклеосом діаметром 10 нм утворює в свою чергу спіральні витки з кроком спіралі близько 10 нм. На один виток такий суперспирали припадає шість нуклеосом (див. рис. 62). У результаті такої упаковки виникає фібрила спірального типу з центральною порожниною, яка іноді на негативно забарвлених препаратах буває видно як вузький «канал» у центрі фібрили. При частковому розгортанні, декомпактізаціі такий фібрили і нанесення її на підкладку добре видно «зигзагообразное» розташування нуклеосом вздовж фібрили. обеспечивает взаимодействие между соседними нуклеосомами, не только сближая и связывая их друг с другом, но и способствуя образованию кооперативной связи между нуклеосомами, благодаря чему возникает довольно плотная спираль из фибриллы диаметром 10 нм.
Вважається, що гістон HI забезпечує взаємодію між сусідніми нуклеосомами, не тільки зближуючи і зв'язуючи їх один з одним, але і сприяючи утворенню кооперативної зв'язку між нуклеосомами, завдяки чому виникає досить щільна спіраль з фібрили діаметром 10 нм. вызывает переход фибриллы диаметром 30 нм в фибриллу диаметром 10 нм, а при полном удалении его происходит разворачивание последней в структуру типа «бусин на нити». Видалення, навіть часткове, гистона HI викликає перехід фібрили діаметром 30 нм в фибриллу діаметром 10 нм, а при повному видаленні його відбувається розгортання останньої у структуру на кшталт «намистин на нитки». Такий соленоїдний тип упаковки ДНК призводить до щільності упаковки, що дорівнює приблизно 40 (тобто на кожен мікрометр нитки припадає 40 мкм ДНК). Ці уявлення отримали підтвердження при аналізі структури хроматину за допомогою дифракції рентгенівських променів і нейтронів. Тут необхідно зазначити, що подання про соленоїдних типі укладання отримано з аналізу вдруге конденсованого хроматину. Спочатку були отримані препарати хроматину в присутності ЕДТА або виділялися в розчинах низької іонної сили в присутності іонів магнію. У всіх цих випадках спочатку хроматин деконденсіровался до рівня «намистин на нитки», де відсутня або дестабілізується контакт між нуклеосомами.Якщо ж досліджувати хроматин у складі ядер або у вигляді виділених препаратів, але при підтримці певної концентрації двовалентних катіонів (не нижче 1мМ), то можна бачити дискретність у складі фібрил хроматину діаметром 30 нм: вона складається як би з зближених глобул того ж розміру - з нуклеомеров. У зарубіжній літературі такі 30-нанометрових глобули, йди нуклеомери, отримали назву сверхбусін («супербіди») (див. рис. 57, в і 62). Виявлено, що якщо в умовах, коли нуклеомерная структура фібрил хроматину зберігається, препарати хроматину піддати нук-леазной обробці, то частина хроматину розчиняється. , в растворах, содержащих 1 мМ магния.
При цьому в розчин виходять частинки, що мають розмір близько 30 нм, з коефіцієнтом седиментації, рівним 45 S, в розчинах, що містять 1 мМ магнію. Якщо такі виділені нуклеомери обробити ЕДТА, видалити іони магнію, то вони розгортаються в нуклеосомние ланцюжка, що містять 6-8 нук-Леоса. Таким чином, до складу одного нуклеомера входить відрізок ДНК, відповідний 1600 парам підстав, або 8 нуклеосоми..
Компактність нуклеомера залежить від концентрації іонів магнію і наявності гистона HI. Негістонових білки в конформаційних перетвореннях нуклеомеров не беруть участь.Отже, основна фібрила хроматину діаметром 30 нм представляє собою лінійне чергування нуклеомеров вздовж компактізованной молекули ДНК (див. рис. 62). , находясь в центральной зоне этой крупной частицы и взаимодействуя друг с другом, поддерживают ее целостность.
Ймовірно, гістони HI, перебуваючи у центральній зоні цієї великої частки і взаємодіючи один з одним, підтримують її цілісність. в группе по 6—8 молекул. На користь цього говорять дані про кооперативний зв'язуванні гістонів HI в групі з 6-8 молекул.Протиріччя між соленоїдний і нуклеомерной моделями упаковки нуклеосом у складі фібрил хроматину може бути знято, якщо прийняти модель нерегулярного соленоїда: число нуклеосом на виток спіралі не є строго постійною величиною, що може призвести до чергування ділянок з більшим чи меншим числом нуклеосом на виток.
Нуклеомерний рівень укладання хроматину забезпечує 40-кратне ущільнення ДНК, що важливо не тільки для досягнення цілей ком-пактізаціі гігантських молекул ДНК. Компактизації ДНК у складі фібрил хроматину діаметром 30 нм може накладати додаткові функціональні обмеження. Так, виявлено, що у складі фібрили хроматину діаметром 30 нм ДНК стає практично недоступною для взаємодії з таким ферментом, як метилаза ДНК. Крім того, різко падає здатність хроматину зв'язуватися з РНК-полімеразою та поруч регуляторних білків. Таким чином, другий рівень компактизації ДНК може грати роль фактора, інакті-вірующего гени.
На закінчення необхідно ще раз нагадати, що як нуклеосомний, так і нуклеомерний (супербідний) рівні компактизації ДНК хроматину здійснюються за рахунок гістонових білків, які беруть участь не тільки в освіті нуклеосом, але і в їх кооперативному об'єднанні у вигляді фібрил ДНП, де ДНК зазнає додаткову сверхспіралізацію. Всі інші рівні компактизації пов'язані з подальшим характером укладання фібрил діаметром 30 нм в нові ком-пактізаціонние рівні, де провідну роль відіграють негістонових білки.