Рекомбінація і генетичний аналіз бактеріофагів

-и r -мутантами фага Т2. Механізм «розрив - возз'єднання» вперше сформульований А. Херші у зв'язку з аналізом потомства змішаного зараження h-і r-мутантами фага Т2. + r + и hr , он предположил, что геном бактериофага состоит из расположенных в линейном порядке генов, каждый из которых несет генетическую информацию о каком-либо признаке вируса. Виявивши, що в цьому потомство крім частинок двох батьківських типів присутні частинки h + r + і hr, він припустив, що геном бактеріофага складається з розташованих в лінійному порядку генів, кожен з яких несе генетичну інформацію про будь-яке ознаці вірусу. +-признаки, и последующего перекрестного воссоединения фрагментов. При змішаному зараженні бактеріальної клітини два «співіснуючих» фагових генома можуть обмінюватися між собою гомологічними ділянками в результаті розриву двох лінійних структур в точно відповідних точках між генами, що визначають р + - і h +-ознаки, і наступного перехресного возз'єднання фрагментів. Такий перехрест або кросинговер генетичного матеріалу може відбуватися в будь-якій точці двох різних генетичних структур.

. Holliday , Н. Potter , D . Dressier предложили универсальную модель одно- и двухцепочечного обмена между двумя линейными молекулами (рис. 1), согласно которой рекомбинация — такой же многоэтапный процесс, как и мутация. Гіпотеза «розрив - возз'єднання» була підтверджена пізніше на дослідах за змішаним зараженню міченим фагом. R. Holliday, Н. Potter, D. Dressier запропонували універсальну модель одно-і дволанцюжкової обміну між двома лінійними молекулами (рис. 1), згідно з якою рекомбінація - такий же багатоетапний процес, як і мутація. Вона починається з розриву ланцюгів ДНК кожного партнера за допомогою нуклеаз, на цьому місці відбуваються перехрещування ланцюгів і зшивання кінців, потім точки схрещування переміщуються за рахунок розплітання та сплетення спіралей і обертаються навколо точки перетину, створюючи при цьому симметрическую структуру - «хі»-інтермедіату. У залежності від того, на яку вісь інтермедіату (вертикальну або горизонтальну) діють нуклеази, утворений після поділу і зшивання рекомбінантів буде гетерозиготним або по одній, або за двома ланцюгах.

З ДНК-вірусів з лінійною молекулою геному рекомбінаційний процес добре вивчений герпес-і аденовірусів, які рекомбінують як з близькоспорідненими, так і неспорідненими вірусами.

Генетична рекомбінація між аденовірусами людини відбувається з високою частотою при продуктивної інфекції культур клітин. Причому рекомбінація спостерігається усередині одного серотипу або між близькоспорідненими серотипами однієї підгрупи, що пов'язують з відсутністю гомологічних послідовностей в геномах вірусів різних підгруп, хоча загальна їх організація схожа. +- pe комбинантов Ad 5 и Ad 2 предполагаемые сайты находятся в фрагменте размером около 20 п. н., занимающем участок соединения С-конца гена PV 1 и N -конца гексонового гена. Було опрделено, що на рестрикційної карті ts + - pe комбінантов Ad 5 і Ad 2 передбачувані сайти перебувають у фрагменті розміром близько 20 п. н., Що займає ділянку з'єднання С-кінця гена PV 1 і N-кінця гексонового гена. Порівняльне секвенування аналогічних фрагментів трьох незалежних схрещувань виявило, що в кожному разі безпосередню участь у рекомбінаційну процесі брала лише невелика його частина (від 45 до 156 п. н. В довжину), відповідна ділянкам повної гомології ДНК.

Герпесвіруси займають більш вигідне становище: ДНК різних серотипів здатні однаковою мірою трансфіціровать культури клітин, мають значні ділянки гомології і рекомбінують з великою частотою. . Thompson котрансфекцией ДНК одного штамма с разными рестрикционными фрагментами другого получили рекомбинант, позволивший локализовать функцию повышения нейровирулентности. Створювалися як межтіповие, так і внутритиповой рекомбінантів, за допомогою яких картировал генні функції, контролюючі реплікацію вірусу, морфологію бляшок, резистентність до антивірусних ліків. R. Thompson котрансфекціей ДНК одного штаму з різними рестрикційних фрагментів іншого отримали рекомбінантів, що дозволив локалізувати функцію підвищення нейровірулентності.

. Agol с сотрудниками на основе коинфицирования клеток gs -мутантом одного серотипа и gr -мутантом другого с последующей селекцией gr -клона из урожая двойной инфекции. Метод отримання межтіпових рекомбінантів поліовірусов розроблений V. Agol із співробітниками на основі коінфіцірованія клітин gs-мутантом одного серотипу та gr-мутантом іншого з подальшою селекцією gr-клону з урожаю подвійний інфекції. Таким способом отримана серія межтіпових рекомбінантів, сайти схрещування яких були локалізовані в центральній частині геному між локусом антигенної специфічності (5'-сторона) та чутливістю до гуанідину (3'-сторона). Визначено первинні структури схрещується регіонів, довжина яких варіює між 2 і 32 нуклеотидами. Сайти схрещування виявилися розподіленими по геному нерівномірно. Так, всередині гена поліпептиду 2А виявлений тільки один такий ділянку, в той час як в інших регіонах виявлялися явні їх скупчення, що вказувало на існування бажаних сайтів для рекомбінації.

. Agol е. Використовуючи той же принцип, V. Agol тобто а. (1984) отримували внутритиповой рекомбінантів між аттенуіровані і нейровірулентним штамами поліовірусов, зміни нейровірулентності яких визначили інтрацеребральні зараженням мавп. Показано, що рекомбінантів, що успадкували 5'-половину генома від вірулентного батька, проявили нейровірулентний фенотип незалежно від походження 3'-половини, а рекомбінантів з 5'-геномної половини від аттенуированного батька мали аттенуіровані фенотип. Отже, великі детермінанти нейровірулентності знаходяться на 5'-половині геному, а на 3'-половині - мінорні або модулирующие детермінанти.

Таким чином, детальний аналіз межтіпових і внутритиповой рекомбінантів поліовірусов представив остаточні докази істинності рекомбінації, спростував випадковість процесу, показав, що схрещування відбуваються в певних, хоча і багатьох сайтах.

Інтромолекулярная рекомбінація зафіксована і у вірусу грипу. Були виявлені послідовності сегментів ДІ РНК, складені з послідовностей від двох нормальних геномних сегментів.

е. Крім того, К. Shimizu тобто а. -мутантами вируса гриппа. представили докази існування внутрішньосегментний комплементації між ts-мутантами вірусу грипу. -мутанта образовывали 13 комплементационных групп и 8 рекомбинационных. За їх даними, 83 ts-мутанта утворювали 13 комплементаціонних груп і 8 рекомбінаційних. -локуса. При цьому чотири рекомбінаційні групи включали віруси, які представляють більше ніж одну комплементаціонную групу, а група Н - у кожному комплементаціонном члені мала по чотири ts-локусу. , P 2, NA , NP и NS ). Мутації з внутрішньосегментний комплементації виявлені в більшості генів (РЗ, PI, P 2, NA, NP і NS).

Щодо механізму внутрішньосегментний комплементації висловлювалися різні гіпотези. , M 2 и NS 1, NS 2, но, внутрисегментная комплементация отмечена и при мутациях в генах, содержащих информацию для единственных белков) ; 2) если множественный белок состоит из смеси аллельных белковых субъединиц, кодируемых двумя комплементарными родительскими генами; 3) если родительские комплементарные вирусы несут мутации в генах, кодирующих белки с несколькими функциональными доминантами. Вважалося, що вона проявляється: 1) якщо сегмент Поліцистронна (відомо, що два сегменти (7, 8) геному вірусу грипу А кодують по два білки Ml, M 2 і NS 1, NS 2, але, внутрішньосегментний комплементації відзначена і при мутаціях в генах, що містять інформацію для єдиних білків), 2) якщо множинний білок складається з суміші алельних білкових субодиниць, що кодуються двома комплементарними батьківськими генами, 3) якщо батьківські комплементарні віруси несуть мутації в генах, що кодують білки з декількома функціональними домінантами.

Багато незрозумілого залишається і в іншому механізмі рекомбінації вірусів людини і тварин - реассортіменте. У вірусів з сегментованим геномом кожен сегмент - це незалежна і самостійна молекула. Вважають, що в заражених клітинах існує активний механізм, регулюючий, щоб кожен віріон отримав з клітинного пулу по одній копії всіх сегментів. Можна припускати, що перекомбінація генів здійснюється на стадії морфогенезу вірусів і цей процес також залежить від клітинних факторів. До того ж виявити участь в цьому процесі віріони білків або будь-яких послідовностей нуклеотидів, що сприяють йому, не вдалося.

З вірусів з сегментованим геномом рекомбінаційний процес найбільш детально вивчений у ортоміксовірусів і реовірусів. . Burnet (1960) еще задолго до установления сегментированности их генома. Дослідження на ортоміксовірусів розпочаті F. Burnet (1960) ще задовго до встановлення сегментировании їх геному. Він отримав ряд основних даних, аж до пророкування структури генома. ) был нейротропным, оказалось способным вызывать смертельную инфекцию при заражение мышей в мозг, но имело серологическую характеристику пневмотропного MEL штамма. У цих дослідах потомство змішаної інфекції двома штамами, один з яких (WSN) був нейротропним, виявилося здатним викликати смертельну інфекцію при зараження мишей в мозок, але мало серологічну характеристику пневмотропні MEL штаму. При прямій і зворотній рекомбінації цих штамів, що розрізняються по семи ознаками, обмін відбувається як би по двох зчепленим ознаками. Одну групу зчеплення становили ознаки, що визначають серологічну специфічність, термостабільність гемаглютинінів, ставлення до ингибирующем дії муцину вівці і патогенність для мишей при интраназальном зараженні. Інша група включала ставлення до ингибирующем дії овомуціна, патогенність для курячих ембріонів і нейропатогенность для мишей.

. Hirst высказывал предположение, что вирусы гриппа могут скрещиваться по двум механизмам: 1) обмен полноценными сегментами с высокой частотой рекомбинации; 2) кроссинговер гомологичными сегментами с низкой частотой рекомбинации. G. Hirst висловлював припущення, що віруси грипу можуть схрещуватися з двох механізмів: 1) обмін повноцінними сегментами з високою частотою рекомбінації; 2) кросинговер гомологічними сегментами з низькою частотою рекомбінації. Тепер є безліч прямих доказів здатності вірусу грипу використовувати при рекомбінації як інтрамолекулярного механізм, так і перекомбинирование генів. Вони засновані на порівняльному вивченні електрофоретичної рухливості сегментів геному та його продуктів, а також на їх секвенування.

. Вперше антигенні гібриди з вірусу різного серотипу виділені в лабораторіях М. І. Соколова та Є. Kilbourne. Всі рекомбінантів виявилися асиметричними в «антигенної реактивності», тобто виявляли велику антигенність, успадковану від одного з батьківських штамів. , N. Pereira представили доказательства рекомбинации между вирусами гриппа человека А2 и птиц АО. Незалежно від цих досліджень В. Tumova, N. Pereira представили докази рекомбінації між вірусами грипу людини А2 і птахів АТ. Подвійна антигенність потомства встановлювалася в вирусспецифической реакції зв'язування комплементу. Р. Вебстер отримав антигенні гібриди при змішаному зараженні курячих ембріонів різними штамами вірусів грипу А ссавців і птахів. Поверхневі антигени цих вірусів складалися з нейрамінідази одного батьківського штаму і гемаглютиніну іншого.

Лабораторні докази антигенної гібридизації серед різних підтипів вірусів грипу А послужили основою гіпотетичних механізмів, що пояснюють антигенну лабільність і потенціал надзвичайної мінливості цього агента.

Рекомбінація непошкоджених ділянок генетичного матеріалу лежить в основі та іншого генетичного взаємодії - множинної реактивації, що полягає у формуванні повноцінного вірусу за рахунок взаємного обміну активними ділянками генома. Таким чином, якщо кроссреактівація включає «ремонт» порушень чи неадекватності геному генетичним внеском від інфекційного вірусу, то множинна реактивація увазі взаємну допомогу або «кооперацію» двох уражених геномів без участі інфекційного вірусу. 2 и ОВ-40. Ці типи реактивації показані в різних вірусних системах і спостерігаються між близькоспорідненими вірусами та різними штамами одного і того самого вірусу, між вірусами різних серотипів і неспорідненими вірусами, наприклад Adl 2 і ОВ-40. Прикладом межтіповой множинної рекомбінації служить результат досвіду з опроміненими реовирусами ссавців трьох серотипів. В основі феномену, скоріше, лежить обмін непошкодженими сегментами генома, а не внутрішньомолекулярний рекомбінація, причому перерозподіл сегментів геномів різних серотипів може бути джерелом антигенних варіантів. -мутанты З серотипа реовируса млекопитающих и птичьи реовирусы не взаимодействовали в клетках L , что указывает на их генетические различия. А ts-мутанти З серотипу реовіруси ссавців і пташині реовіруси не взаємодіяли в клітинах L, що вказує на їх генетичні відмінності.

Рекомбінантні механізми лежать в основі виникнення та гетерозигот. У класичній генетиці цим терміном визначають організм, в диплоїдний набір хромосом якого містяться два різних алелі будь-якого гена. У більшості вірусів тварин такого роду гетерозиготність не спостерігається, оскільки їх геноми гаплоїдний. Гетерозиготними по всіх маркерами можуть бути ретровіруси, що містять дві копії геномної РНК. Гетерозиготність ретровірусів пов'язують з рекомбінаційним процесом. У деяких ДНК-вірусів (наприклад, герпесу), є повторювані послідовності і ці віруси частково диплоїдні. У цих диплоїдних локусах також може виникати гетерозиготність. Так, виділено кілька типів рекомбінантів при схрещуванні вірусів герпесу типу 1 і 2, які містили гетерозиготні термінальні повторювані послідовності.

2. Генетичний аналіз бактеріофагів

Генетика бактеріофагів пов'язана з генетичними особливостями бактерій-господарів. Ознаки бактеріофагів, доступні генетичному аналізу - це перш за все швидкість і повнота лізису інфікованих клітин і коло бактерій-господарів, слабости фагами. Широке поширення в генетичному аналізі бактеріофагів отримали мутанти з умовним проявом. Це мутанти, чутливі до підвищення і зниження температури, - так звані термочутливі (ts) і холодочувствітельние (cs). Вони нормально розмножуються і лізують клітини тільки при перміссівной температурі (37 ° С). Як умовні використовують також мутанти, чутливі до дії певних супресорів, що знаходяться в геномі бактерій. Це клас так званих sus (від англ. Suppressor sensitive) мутантів. Sus-мутанти можна отримати практично з будь-якого гену, що кодує білок. Генетичний аналіз бактеріофагів заснований на спільному зараженні клітини генетично различающимися частками бактеріофага. Повні фагових геноми, проникаючи в клітину, експресують закладену в них інформацію подібно гомологічним хромосомами, і таким чином стає можливим дослідження взаємодії алелей і неалельних генів. Якщо два температурочувствітельних мутанта, проникли в бактеріальну клітину, несуть зміни, здатні взаємодіяти комплементарно, то в неперміссівних умовах клітини лізуються. У ході реплікації геномів можлива рекомбінація, в результаті чого з'являться рекомбінантів дикого типу. Їх можна врахувати, висіваючи фагової потомство на чутливі бактерії в умовах неперміссівних для батьківських бактеріофаговГенетіческій аналіз бактеріофагів пов'язаний з рядом труднощів, обумовлених особливостями їх розвитку в клітці. Реплікація геномів Т-парних фагів йде експоненціально з часом генерації 2-3 хв. Аж до освіти кількості фагової ДНК, еквівалентного 50 повним геномам, зрілі частки фага в клітині не виявляються. Потім із загального фонду синтезується ДНК фагів геноми починають витрачатися на освіту зрілих частинок. При лізису клітини в ній залишається ще стільки ж ДНК, скільки включилося в головки фагів. У процесі реплікації фагових геноми зазнають неодноразові цикли спаровування, рекомбінації і реплікації. В результаті спостережувана частота рекомбінації завжди вище очікуваної. У подібних багаторазових циклах реплікації фагових геномів генетичні події повинні бути проаналізовані з позицій популяційної генетики. Такий підхід розробили Н. Вісконті та М. Дельбрюк. При цьому вони виходили з наступних основних положень: 1) у загальному фонді ДНК батьківські геноми фагів повністю перемішані; 2) кожен геном фага аналогічний цілої хромосомі; 3) при реплікації відбуваються неодноразові спарювання та рекомбінації. Відповідно до цих допущеннями виходить, що геноми Т-парних бактеріофагів проходять близько 5 циклів парування та рекомбінації. Однак викликає сумнів універсальність і надійність вихідних припущень. Так, множинність інфекції однієї клітини (співвідношення батьківських часток) може коливатися до 10 разів. Лізис індивідуальних заражених клітин виявляє нерівність реципрокних класів рекомбінантів. Тим не менше всі ці труднощі переборні, якщо жорстко контролювати співвідношення вводяться в клітку геномів фага і час реплікації та рекомбінації. При цьому можна застосовувати стандартну логіку аналізу рекомбінації у двох-і трехмаркерних схрещуваннях. На основі цього підходу побудовані генетичні карти бактеріофагів ф XI74, ф 80, X, які представляють собою кільце, відповідне кільцевої структурі генома цих бактеріофагів. Завдяки знанню генетики двох близьких помірних бактеріофагів Я і ф 80 вдалося отримати їх гібриди, які поєднують властивості як X, так і ф 80. Кільцева карта рекомбінації побудована і для Т-парного фага Т4, у якого геном в дійсності представлений лінійної молекулою ДНК. Цей парадокс пояснюється тим, що геноми Т4, упаковані в частки фага, мають так звану кінцеву надмірність, що допускає кільцеві перестановки, або кільцеві пермутації генів. Справа в тому, що в головці Т4 укладено ДНК приблизно на 1% більше, ніж відповідає одному геному фага. Додаткові, кінцеві, ділянки фагової ДНК і складають фізичну основу кінцевий надмірності. При зараженні клітки між молекулами такий ДНК відбуваються рекомбінації з об'єднанням декількох геномів у конкатемери. Довгі молекули ДНК, що складаються з декількох геномів, далі реплицируются і рекомбінують знову. При дозріванні бактеріофага Т4 працює принцип «наповнення голівки". При цьому нарізаються молекули ДНК, в яких спостерігаються кінцева надмірність і кільцеві пермутації генів. У молекулах ДНК, отриманих з різних джерел, зустрічаються модифіковані підстави, наприклад, 5-метилцитозин, 6-метіламінопурін та ін Вони не включаються в ДНК при реплікації як такі, а з'являються в результаті ферментативної модифікації синтезованих молекул, починаючи зі стадії фрагментів Окадзакі. При цьому модифікуються підстави, що займають певне положення в молекулі. Ці реакції здійснюють ферменти, що представляють собою частина єдиної системи рестрикції - модифікації. Модифікація певних підстав охороняє ДНК від руйнування рестріктірующімі ендонуклеаза, які мають спорідненість до тих же послідовності нуклеотидів, що і ферменти модифікації. Ферменти модифікації захищають ДНК хазяїна від дії ендонуклеаз рестрикції. При цьому одна і та ж молекула може зазнавати різні типи модифікації ДНК. Методом центрифугування в градієнті щільності в лізата таких клітин можна виявити частинки бактеріофага, що несуть одну з батьківських ланцюгів ДНК і що сполучають типи модифікації, характерні для штаму К і для штаму В. Структура багатьох сайтів рестрикції - модифікації в даний час розшифрована. Ці сайти представлені короткими нуклеотидними послідовностями, характерна риса яких - їх симетричність. Система рестрикції - модифікації - це своєрідний бар'єр, який охороняє клітину від включення до її генетичний матеріал чужорідних молекул ДНК. Виникнення мутантів, позбавлених здатності до рестрикції, відкриває додаткові можливості для мінливості за рахунок асиміляції клітиною чужорідної генетичної інформації. Крім того, деякі рестріктази (наприклад, Eco RI) можуть здійснювати сайтспецифической рекомбінацію плазмід в клітинах Е. coli. Успіхи генетичного аналізу у мікроорганізмів, особливо у бактерій і бактеріофагів, зіграли революціонізуючу роль в методах вивчення структури і функцій генетичного матеріалу. Організація геномів бактерій та шляхи, що ведуть до їх рекомбінації, виявилися, на перший погляд, абсолютно відмінними від того, до чого звикли генетики, які працювали з еукаріотами. У бактерій були відкриті додаткові (до хромосомі) генетичні елементи: плазміди і еф. Деякі еф існують у вільній формі. Це бактеріофаги, вся структура яких пристосована до перенесення геному між клітинами. Інші плазміди здатні тільки до реплікації в бактеріальній клітині. Між цими крайніми формами є проміжні варіанти. Саме існування таких додаткових елементів геному поставило питання про можливість їх використання для перенесення генетичного матеріалу і не тільки між клітинами бактерій.

Висновок

Перспективи практичного застосування рекомбинационной мінливості багато в чому пов'язані з отриманням живих рекомбінантних вакцин. Дуже актуальним вважається одержання рекомбінантних вакцин проти грипу, збудник якого відрізняється великою мінливістю. Принцип рекомбінації сучасних епідемічних вірусів з добре вивченим донором аттенуаціі забезпечує швидкість формування клонів з такими корисними властивостями, як термочутливість і нешкідливість при збереженні іммунізуючої здібності епідемічних штамів.

Але підставі всіх перерахованих вище відомостей можна зробити висновок, що генетична рекомбінація є найбільш зручним методом перетворення біологічних властивостей вірусів, зокрема бактеріофагів. Але в даний час рекомбінація з успіхом використовується лише для передачі ознаки ослабленою патогенності. -мутантов для конструирования живых вакцин. На цьому грунтується новий напрямок застосування ts-мутантів для конструювання живих вакцин. Закономірності ж передачі та наслідування інших «корисних» властивостей вивчені ще недостатньо. Існують неодноразові вказівки на великі труднощі у використанні рекомбінації для швидкого виведення високоврожайних штамів, придатних для виробництва грипозних вакцин і вірусних діагностикумів. Поки немає будь-якої колекції мутантів, які несуть ознака високої репродуктивної активності.

Список літератури

1. Айала Ф., Кайгер Дж. Сучасна генетика / Ф. Айала, Дж. Кайгер .- М.: Світ, 1987 .- 368 с.

2. Бив Д., Ноулз Д. Внеядерная спадковість / Д. Бив, Д. Ноулз .- М.: Світ, 1981 .- 138 с.

3. Захаров І.А. Курс генетики мікроорганізмів / І.А. Захаров .- Мінськ: Вища школа, 1978 .- 192 з ..

4. Крилов В.М. Геном бактеріофагів / В.М. Крилов .- М.: Наука, 1989 .- 317 с.

5. Хейс У. Генетика бактерій і бактеріофагів / У. Хейс. - М.: Наука, 1965 .- 254 с.