Контрольна робота з біології
2009
Зміст
"1-1" 1. Біосинтез антитіл
2. Структура та специфічність антигенів
3. Загальна структурна характеристика молекул імуноглобулінів
1. Біосинтез антитіл
Імунна система, відповідальна за біосинтез антитіл, складається з низки органів, основними з яких є тимус, селезінка і периферичні лімфоїдні структури в яких формуються три основних типи клітин: Т-і В-лімфоцити і макрофаги.
Антитіла виробляються В-лімфоцитами, на поверхні яких вже є рецептори, специфічно зв'язують антиген. У цей же комплекс включаються Т-лімфоцити і макрофаги. У результаті міжклітинної кооперації відбувається активація В-лімфоцитів та їх трансформації в плазматичні клітини. Велика частина утворилися плазматичних клітин синтезує антитіла, аналогічні по специфічності рецепторів на поверхні В-лімфоцитів, і секретує їх у кров. Інша частина перетворюється в клітини «імунологічної пам'яті», здатні виділяти антитіла при повторному введенні антигену.
Кожен По-лімфоцит містить на поверхні близько 100 тис. рецепторів однаковою специфічності. Антиген, зустрічаючись в кровотоку з комплементарним рецептором, проводить відбір відповідного По-лімфоцита, який потім, трансформуючись у плазматичну клітину і багаторазово ділячись, утворює клон клітин. Ця теорія біосинтезу антитіл, вперше сформульована П. Ерліхом, а потім модифікована відповідно до рівня розвитку науки Ф. Бернетом, отримала назву клонально-селекційної. Важливо зазначити, що кожен клон плазматичних клітин секретує гомогенні по своїй структурі антитіла. Однак так як антиген активує в крові відразу кілька типів В-лрмфоцітов, які містять рецептори різного ступеня специфічності по відношенню до вихідного антигену, такий імунну відповідь називається поліклональних, а антитіла - поліклональними.
Сироватку тварини, що містить специфічні до даного антигену антитіла, називають антисироватки. При цьому зазвичай вказують, проти якого антигену вона вироблена. Наприклад, коли говорять про антисироватки кролика проти еритроцитів людини, мають на увазі, що у відповідь на введення в кров кролика еритроцитів людини утворюються специфічні до них антитіла. Принципово важливим є те, що поліклональні антитіла навіть проти однієї-єдиної антигенної детермінанти гетерогенні як за структурою активного центру, так і за фізико-хімічними властивостями. У тому випадку, якщо антиген полівалентен, наприклад білок, то в сироватці крові утворюються антитіла, спрямовані проти кожної індивідуальної детермінанти, що ще більше ускладнює складу антитіл. Склад антитіл залежить від виду тварини, а також стадії імунного процесу.
Всі перераховані вище фактори впливають на гетерогенність антитіл і обумовлюють певні труднощі як у вивченні їх структури, так і в отриманні відтворюваних стандартних препаратів антисироваток. Роботи Келера і Мільштейна по гібридизації тварин клітин відкрили принципово новий шлях отримання антитіл. Суть методу полягає в тому, що з організму імунізованих тваринного виділяються лімфоцити, які спеціальним чином «зливаються» з мієломні клітинами. Утворені клітини отримали назву гібридом.
Особливістю таких клітин є їх здатність розмножуватися і продукувати антитіла в штучних умовах поза організмом. За допомогою спеціальних методів клонування можна виділити одну гібридну клітину, яка, розмножуючись, буде секретувати в необмежених кількостях антитіла тільки одного виду - моноклональні антитіла. Підкреслимо, що моноклональні антитіла гомогенні як по специфічності, так і за фізико-хімічними властивостями. Питання, пов'язані з отриманням поліклональних і моноклоіальних а
2. Структура та специфічність антигенів
Поняття антигенна детермінанта включає в себе послідовність утворюючих її хімічних функціональних груп та його просторове розташування.
Білки. У молекулах білків антигенна детермінанта утворюється сукупністю амінокислотних залишків. Розмір антигенної детермінанти білків може варіювати від 5-7 до 20 амінокислотних залишків. У випадку довгих антигенних детермінант, мабуть, тільки частина з них включається у власне антигенну структуру, а інші відповідальні за її конформацію.
Антигенні детермінанти білків бувають двох типів - секвенційні, тобто вдають із себе послідовність амінокислотних залишків у поліпептидному ланцюзі, і конформаційні, утворені амінокислотними залишками з різних частин білкового ланцюга, але зближені в просторовій конфігурації білкової глобули. Обидва типи антигенних детермінант-мають важливе значення для характеристики «іммунного.портрета» білків. У багатьох випадках одинична заміна амінокислоти в структурі антигенної детермінанти або зміна конформації білкової глобули є достатніми для зміни антигенної специфічності макромолекули.
Термін «специфічність антигену» використовується у двох значеннях: по-перше, як здатність вибірково реагувати зі специфічними антитілами, по-друге, оскільки білкові антигени полівалентних, як набір певних антигенних детермінант. Якщо два антигени мають тільки частина однакових антигенних детермінант, їх називають перехресно реагують антигенами. Прикладами таких антигенів є гомогенні білки близькоспоріднених видів тварин.
Деякі антигенні детермінанти у білків з четвертинної структурою можуть бути утворені фрагментами поліпептидних ланцюгів різних субодиниць, як, наприклад, в імуноглобуліну та гемоглобіні. Як вже зазначалося вище, антигенна детермінанта білків утворена групою амінокислотних залишків, серед яких можна виявити іммунодомінантную групу. Прикладом такої групи є С-кінцевий аргінін декапептид білка вірусу тютюнової мозаїки.
Найбільш характерно ефект іммунодомінантной групи виявляється при модифікації окремих амінокислотних залишків хімічними сполуками, наприклад дінітрофенільной групою. Антитіла, які утворюються в такий модифікованої антигенної детермінанті, здатні реагувати не тільки з нею, але і з іншими амінокислотними залишками, до яких буде «пришита» дінітрофенільная група. Більш того, якщо в розчин, що містить модифікований білок і антитіла, додати вільний динітрофенол, то він буде інгібувати утворення комплексу антиген - антитіло. Це явище, яке вперше було описано і детально вивчено К-Ландштейнером, послужило основою для отримання антитіл проти різних гаптенов.
Істотний внесок у розуміння структури антигенних детермінант внесли роботи з вивчення антигенності синтетичних пептидів. Класичним прикладом є роботи по синтезу пептидного петлі лізоциму, яка є самостійною антигенною детермінантою. Було показано, що ця петля, що містить внутрішню дисульфідні зв'язки, взаємодіє з антитілами, одержуваними як проти лізоциму, так і самої петлі, проте освіта комплексу не відбувається, якщо дисульфідний зв'язок відновлено. Це свідчить про те, що структура антигенної детермінанти та її специфічність залежать як від амінокислотної послідовності, так і від конформації даного фрагмента. Спільним для антигенних детермінант є те, що вони, як правило, знаходяться на поверхні білкової глобули та утворені жорсткими а-спіральними ділянками.
У роботах М. Села було показано, що гомополімери, що складаються з однакових амінокислот, не володіють антигенною структурою, в той час як гетерополімери містять антигенні детермінанти, причому чим складніше складу поліпептиду, тим більше різних антигенних детермінант він утворює. Важливими тут є два чинники: жорсткість конформації поліпептидного глобули та її амінокислотний склад.
Існує кілька шляхів дослідження структури антигенних детермінант. Один з них заснований на штучному синтезі фрагментів первинної структури, в яких проводяться заміщення окремих амінокислот. Інший шлях - вивчення впливу виборчої модифікації окремих амінокислотних залишків. Ще один спосіб - порівняння між собою гомологічних антигенів. Ефективним методом є також використання обмеженого протеолта і виявлення фрагментів, що містять антигенні детермінанти. Хоча жоден з цих шляхів не дає однозначних результатів, проте сукупність даних дозволяє побудувати «антигенний портрет» даного білка.
Виняткову важливість знання такого «портрета» для иммунохимического аналізу можна продемонструвати на прикладі вивчення антигенних детермінант раково-ембріонального антигену і антигенно споріднених йому білків. РЕА представляє гликопротеид з Мг = 180 000, який містить за масою близько 50% вуглеводів. Він має 9 різних епітопів, більшість з яких конформаційно залежні пептидні детермінанти. У сироватці крові міститься ще ціла група білків, перехресно реагують з РЕА, що ускладнює використання цього антигену для діагностичних цілей. В даний час за допомогою моноклональних антитіл виділено три антигенні детермінанти, які є абсолютно специфічними для РЕА.
Знання антигенної специфічності є виключно важливою умовою для створення діагностичних іммунохіміче-ських наборів, тому що дозволяє проводити визначення даної речовини в присутності близькоспоріднених сполук.
У ролі антигенів можуть виступати і самі імуноглобуліни. У цьому випадку організм виробляє антитіла, які часто називають вторинними. Наприклад, при імунізації кролика імуноглобулінами іншого виду тварини виробляються вторинні антитіла. У імуноферментному аналізі існує велика група методів, в яких використовують мічені ферментом вторинні антитіла.
Узагальнюючи дані про структуру антигенної детермінанта білків, можна виділити її таку характерну особливість: жорсткий ділянку поверхні білкової глобули, утворений одним або кількома фрагментами поліпептидного ланцюга, що містять іммунодомінантную групу.
Нуклеїнові кислоти. Структура антигенних детермінант нуклеїнових кислот залишається до цих пір малозрозумілою. Це обумовлено тим, що самі по собі нуклеїнові кислоти практично не імуногенні, але в комплексі з білками до них можуть бути напів-влено антитіла. Як і у випадку білків, важливу роль грає жорсткість структури полінуклеотидів. До складу антигенної детермінанти входять три-і тетрануклеотидом. Вони можуть бути утворені як двоспіральні, так і односпіральнимі ділянками. Розуміння структури антигенних детермінант має важливе значення не тільки в плані імунохімічної діагностики різних патологічних процесів, а й у зв'язку з активним розвитком гібридизації ДНК, в яких антитіла виступають в ролі детектуючих систем.
Полісахариди. Полісахариди - вельми складна за своїм складом і структурою група антигенів, що входить в структуру стінок мікроорганізмів і багатьох інших клітин і визначає їх специфічність. Полісахариди входять до складу багатьох білків і також грають роль антигенних детермінант. У більшості випадків полісахаридні антигени представляють собою довгий ланцюг, до якої приєднані бічні короткі олігосахариди, що містять 4-б залишків Сахаров, фактично є антигенними детермінантами. В одних випадках олігосахаридних угруповання ідентичні і тоді весь полісахаридний комплекс являє собою чергуються антигенні детермінанти. В інших випадках бічні ланцюги можуть сильно відрізнятися між собою. Як правило, в антигенну детермінанту входять залишки Сахаров, розташовані на кінці бічних ланцюгів, що містять заряджену групу, яка є іммунодомінантной групою.
На специфічність олігосахаридних антигенних детермінант у структурі білків впливає найближче оточення по-ліпептідіой ланцюга білка-носія і тип зв'язку між цукрами.
У разі полісахаридних гомополімерів, таких, як декстран, антигенна детермінанта може складатися з фрагментів, що містять до восьми залишків.
Ліпіди, що входять до складу комплексів з багатьма полісахаридами, не володіють антигенної специфічністю, мабуть, через високу конформаційної рухливості. Таким чином, структура полісахаридних антигенних детермінант представляє собою олігосахаридних ланцюга довжиною 4-6 залишків, специфічність яких визначається хімічним складом, типом глікозидних зв'язків та залишками, що знаходяться в найближчому оточенні.
Гаптени. Гаптени - це речовини, які самі не викликають імунної відповіді, але, будучи кон'юговані з носіями, мають здатність стимулювати синтез проти них антитіла. Зазвичай прийнято вважати, що гаптени - це низькомолекулярні сполуки, проте це не зовсім вірно. Наприклад, нуклеїнові кислоти, поліпептиди D-амінокислот мають високу молекулярну масу, але антитіла проти ііх виникають тільки після кон'югування їх з білками. У цьому випадку гаптени в кон'югату з білком виступають в ролі іммунодомінантной групи і тому в подальшому можуть взаємодіяти з антитілами незалежно від білка носія.
Структура та антигенна специфічність гаптенов визначається цілою низкою чинників. Як гаптенов можуть виступати найрізноманітніші органічні речовини з Мг> 100. З практичної точки зору важливими є стероїдні і пептидні гормони, широке коло лікарських сполук, пестициди, різні продукти промислового органічного синтезу, що володіють алергенним дією.
Антигенна специфічність гаптенов сильно залежить від їх хімічної структури. Так, введення додаткових груп може сильно спотворити «антигенний портрет» того або іншого з'єднання. Наприклад, тироксин і трийодтиронін відрізняються тільки одним залишком I, чого цілком достатньо, щоб антитіла проти цих гормонів сильно різнилися перехресної реактивністю. Класичними прикладами стали дослідження з пара-, орто-і мета-амінобензойної кислотами, які практично не дають перехресних реакцій при порівнянних концентраціях.
Важливим моментом є стереоспеціфічность гаптенов; антитіла проти олігопептидів з D-амінокислот не реагують з олігопептиди з L-амінокислот.
На антигенну специфічність сильний вплив надають амінокислотний залишок білка носія, до якого пришитий гап-тен, а також молекулярні розміри гаптену. Так, в довгих олі-гопептідних гаптеном заміна амінокислотних залишків, які розташовані близько до білка-носія, чинить менший вплив, ніж у коротких. Навпаки, заміни у віддалених від носія амінокислотних залишках виявляються драматичними для антигенної структури незалежно від розмірів гаптену. Аналогічні з-акономерності для олігосахаридів.
Антигенна специфічність гаптенов залежить не тільки від їх хімічної структури, але і від способу пришивки до білка-носія, зокрема від того, яка функціональна група гаптену була використана для кон'югування. Часто, при отриманні кон'югатів для імунізації гаптени пришивають не безпосередньо до молекули білка-носія, а через просторову «ніжку», що містить зазвичай 4-6 вуглецевих атомів. У цьому випадку сама «ніжка» в комплексі з гаптеном виступає в якості складової антигенної детермінанти і утворюються антитіла можуть володіти меншою ефективністю зв'язування з нативним гаптеном, ніж з таким пов'язаним через «ніжку» гаптеном.
У деяких видах імуноферментного аналізу в якості одного з реагентів використовують гаптен, мічений ферментом. Якщо зв'язування в такому кон'югату аналогічно способу пришивки в кон'югату гаптену з білком-іосітелем для отримання антитіл, то говорять, що в аналізі використовують гомологічні антитіла. Якщо ж структура «ніжки» і спосіб пришивки гаптену в обох випадках різні, то говорять про гетерологічних антитіла. Застосування того чи іншого виду антитіл або кон'югатів в імуноферментному аналізі може дуже сильно позначатися на його чутливості та деяких інших характеристиках.
Дуже істотним чинником для специфічності є хімічна структура «нодаски», зокрема її довжина і найближче оточення гаптену. Всі ці моменти вкрай важливо враховувати при розробці методів иммунохимического аналізу гаптенов.
Сильний вплив різних чинників на антигенну структуру і специфічність гаптенов, мабуть, пояснюється їх обмеженими розмірами і особливостями структури активних центрів антитіл.
Знання антигенної структури та специфічності гаптенов має важливе значення для створення методів иммунохимического визначення різних фізіологічно активних сполук, так як багато хто з них зазнають різні біохімічні перетворення, в результаті чого утворюється група близькоспоріднених метаболітів.
3. Загальна структурна характеристика молекул імуноглобулінів
Антитіла в організмі виконують дві основні функції. Перша - це розпізнавання і специфічне зв'язування відповідних антигенів, друга - ефекторна, що полягає в індукції найважливіших фізіологічних процесів, спрямованих на знищення антигену: лізис чужорідних клітин через активацію системи комплементу, стимуляція спеціалізованих імунокомпетентних клітин, виділення фармакологічно активних речовин і т.д.
Розвиток імунохімії протягом останніх 25 років дозволило встановити будову антитіл, виявити стереохімічні основи їх функціонування. Особливу увагу було приділено вивченню структури активних центрів антитіл, що призвело до створення поліцентровой моделі зв'язування антигену. Дослідження динамічних структурних властивостей імуноглобулінів сприяло встановленню характеру зв'язку між антигензв'язуючих і ефекторними функціями.
Імуноглобуліни по своїй хімічній структурі відносяться до великого класу природних сполук - глікопротеїди, високомолекулярних сполук, що складається з послідовності L-амінокислот, з'єднаних між собою пептидними зв'язками.
Окремі амінокислоти відрізняються між собою бічними заступниками R. До складу білків, у тому числі імуноглобулінів, входять двадцять амінокислотних залишків.
Поліпептидна ланцюжок за рахунок утворення водневих зв'язків між карбонільним атомом кисню та атомом водню аміногруп окремих амінокислотних залишків здатна певним чином укладатися в просторі, утворюючи так звані а-спіральні ділянки і структуру. Така локальна упорядкована конформація окремих ділянок поліпептидного ланцюга отримала назву вторинної структури.
В цілому вся поліпептидний ланцюг утворює компактну тривимірну структуру - третинну структуру: В одному розчині молекула білка згортається так, щоб неполярні, або гідрофобні, бічні ланцюги амінокислотних залишків знаходилися у внутрішній, малодоступною для молекул води області, а полярні, або іонізовані, групи утворювали зовнішній контактує з водою шар. Таке розташування амінокислотних залишків поліпептидного ланцюга є термодинамічним найбільш вигідним станом, причому слід зазначити, що це згортання пептидного ланцюга є високоспецифічним і обумовлено первинної структурою молекули.
Крім розглянутих причин згортання білків, обумовлених так званими гідрофобними взаємодіями, певний внесок у 'стабілізацію тривимірної структури вносять дисперсійні сили Лондона, що виникають в результаті комплементарного розподілу електронних хмар окремих, поруч розташованих атомів. Енергія цього типу взаємодій сильно залежить від відстані між атомами і максимальна при так званому ван дер Ваальсових відстані контакту, що дорівнює сумі ван-дер-ваальсових радіусів взаємодіючих атомів.
Додатковий внесок у підтримання тривимірної структури молекул білків дають водневі і електростатичні зв'язки між бічними групами амінокислот, а також ковалентні зв'язки між окремими частинами поліпептидного ланцюжка, наприклад дисульфідні, або S-S-зв'язку, що виникають між двома залишками цистеїну.
Деякі молекули білків складаються з незв'язаних між собою ковалентно окремих субодиниць. Така просторова організація отримала назву четвертинної структури білків.
Незважаючи на величезну різноманітність антитіл та їх гетерогенність, всі вони володіють деякими загальними структурними елементами, що забезпечують виконання їх основних функцій.
За своїм антигенним, ефекторним властивостями і структурним особливостям імуноглобуліни поділяються на п'ять основних класів: IgM, IgG, IgA, IgD та IgE.
Таблиця 1 - Основні амінокислоти, що входять до складу білків
Загальною структурною одиницею всіх імуноглобулінів є комплекс із чотирьох поліпептидних ланцюгів - двох ідентичних між собою легких ланцюгів з молекулярною масою 23000 кожна і важкий з молекулярної масою по 53000.
Кожна з легких ланцюгів міцно з'єднана з кінцевими ділянками важких ланцюгів завдяки наявності межцепочечних ді-сульфідних зв'язків і безлічі слабких гідрофобних, електростатичних та інших міжатомних взаємодій. Аналогічні зв'язки існують і між вільними ділянками важких ланцюгів. У цілому структура такого комплексу нагадує латинську букву «V» або «Т» і характерна для імуноглобулінів класів IgG, IgD та IgE.
При дії протеолитического ферменту папаїну молекула IgG розпадається на три фрагменти, два з яких ідентичні і зберігають здатність зв'язувати антигени і третій, здатний до кристалізації. Саме Fc-фрагмент відповідальний за ефекторних функцію антитіл - зв'язування білка комплементу Clq, транспорт через мембрани, взаємодія з мембранними рецепторами і т.д.
Інший протеолітичний фермент пепсин "розриває пептидний зв'язок, розташовану ближче до СООН-кінця ланцюга, від S-S-зв'язку між Н-ланцюгами в Fc-фрагменті. У результаті утворюються так званий pFc-фрагмент, що є залишками важких ланцюгів, і з'єднані дисульфідними зв'язками два Fа-фрагмента, що позначаються як ¥ 2-фрагмент. Останній також зберігає здатність до зв'язування антигенів.
Антигензв'язуючих центр розташований у Н2-кінцевих частинах Н-та L-ланцюгів. Таким чином, кожна молекула IgG, а також Р2-фрагменти містять по два антигензв'язуючих центру, а Fab-фрагмент - один.
Необхідною умовою для використання антитіл в імуноферментному аналізі є збереження їх здатності специфічно взаємодіяти з відповідними антигенами.
Тому часто використовують не цілі молекули антитіл, а лише їх фрагменти F2 або Fab, повністю зберігають цю здатність. Такий підхід дозволяє в деяких випадках усунути неспецифічні реакції, зумовлені, зокрема, взаємодією Fc-фрагментів антитіл з поверхнями носіїв.
Молекули антитіл мають велике число S-S-зв'язків, які можна розділити на 3 категорії: межцепочечние зв'язку, утворені всередині структурної одиниці між Н-і L-ланцюгами і між Н-і Н-ланцюгами, внутріцепочечние S-S-зв'язку, що виникають у межах однієї і тієї ж легкої або важкої ланцюга, і зв'язки між Н-ланцюгами окремих четирехцепочечних комплексів, що обумовлюють утворення полімерних молекул - IgM та IgA.
Структура імуноглобулінів різних класів обумовлена кількістю та розміщенням S-S-зв'язків у молекулах, а також кількістю четирехцепочечних елементів. На рис. 2 наведено схематичне зображення молекул імуноглобулінів різних класів.
IgM присутній в сироватці у вигляді пентамера четирехцепочечних комплексів, з'єднаних S-S-зв'язками між Н-ланцюгами. Деяка кількість IgA сироватки також присутня у вигляді димерной і тетрамерной форми. Полімерні IgA і IgM містять Невелику поліпептидний ланцюг з Мг = 14 000-1500 0, яка, мабуть, стабілізує полімерну структуру. Крім того, в димерной IgA входить секреторний компонент-великий гликопротеид з Мг = 80 000.
Легкі ланцюги імуноглобулінів бувають тільки двох типів-К або х. і є загальними для всіх п'яти класів, у той час як важкі ланцюги мають структурними, імунологічними і хімічними особливостями, характерними для кожного класу імуноглобулінів.
Для позначення важких ланцюгів, які належать до класів IgG, IgM, IgA, IgD та IgE, використовують відповідні грецькі букви-у, ц, а, б і е. На підставі відмінностей в хімічному будову Н-ланцюгів в межах класу можна виділити підкласи імуноглобулінів: 4 - для IgG, 2 - для IgA і 2 - для IgM. У молекулі імуноглобуліну будь-якого класу легкі ланцюги відносяться тільки до одного типу.
2009
Зміст
"1-1" 1. Біосинтез антитіл
2. Структура та специфічність антигенів
3. Загальна структурна характеристика молекул імуноглобулінів
1. Біосинтез антитіл
Імунна система, відповідальна за біосинтез антитіл, складається з низки органів, основними з яких є тимус, селезінка і периферичні лімфоїдні структури в яких формуються три основних типи клітин: Т-і В-лімфоцити і макрофаги.
Антитіла виробляються В-лімфоцитами, на поверхні яких вже є рецептори, специфічно зв'язують антиген. У цей же комплекс включаються Т-лімфоцити і макрофаги. У результаті міжклітинної кооперації відбувається активація В-лімфоцитів та їх трансформації в плазматичні клітини. Велика частина утворилися плазматичних клітин синтезує антитіла, аналогічні по специфічності рецепторів на поверхні В-лімфоцитів, і секретує їх у кров. Інша частина перетворюється в клітини «імунологічної пам'яті», здатні виділяти антитіла при повторному введенні антигену.
Кожен По-лімфоцит містить на поверхні близько 100 тис. рецепторів однаковою специфічності. Антиген, зустрічаючись в кровотоку з комплементарним рецептором, проводить відбір відповідного По-лімфоцита, який потім, трансформуючись у плазматичну клітину і багаторазово ділячись, утворює клон клітин. Ця теорія біосинтезу антитіл, вперше сформульована П. Ерліхом, а потім модифікована відповідно до рівня розвитку науки Ф. Бернетом, отримала назву клонально-селекційної. Важливо зазначити, що кожен клон плазматичних клітин секретує гомогенні по своїй структурі антитіла. Однак так як антиген активує в крові відразу кілька типів В-лрмфоцітов, які містять рецептори різного ступеня специфічності по відношенню до вихідного антигену, такий імунну відповідь називається поліклональних, а антитіла - поліклональними.
Сироватку тварини, що містить специфічні до даного антигену антитіла, називають антисироватки. При цьому зазвичай вказують, проти якого антигену вона вироблена. Наприклад, коли говорять про антисироватки кролика проти еритроцитів людини, мають на увазі, що у відповідь на введення в кров кролика еритроцитів людини утворюються специфічні до них антитіла. Принципово важливим є те, що поліклональні антитіла навіть проти однієї-єдиної антигенної детермінанти гетерогенні як за структурою активного центру, так і за фізико-хімічними властивостями. У тому випадку, якщо антиген полівалентен, наприклад білок, то в сироватці крові утворюються антитіла, спрямовані проти кожної індивідуальної детермінанти, що ще більше ускладнює складу антитіл. Склад антитіл залежить від виду тварини, а також стадії імунного процесу.
Всі перераховані вище фактори впливають на гетерогенність антитіл і обумовлюють певні труднощі як у вивченні їх структури, так і в отриманні відтворюваних стандартних препаратів антисироваток. Роботи Келера і Мільштейна по гібридизації тварин клітин відкрили принципово новий шлях отримання антитіл. Суть методу полягає в тому, що з організму імунізованих тваринного виділяються лімфоцити, які спеціальним чином «зливаються» з мієломні клітинами. Утворені клітини отримали назву гібридом.
Особливістю таких клітин є їх здатність розмножуватися і продукувати антитіла в штучних умовах поза організмом. За допомогою спеціальних методів клонування можна виділити одну гібридну клітину, яка, розмножуючись, буде секретувати в необмежених кількостях антитіла тільки одного виду - моноклональні антитіла. Підкреслимо, що моноклональні антитіла гомогенні як по специфічності, так і за фізико-хімічними властивостями. Питання, пов'язані з отриманням поліклональних і моноклоіальних а
2. Структура та специфічність антигенів
Поняття антигенна детермінанта включає в себе послідовність утворюючих її хімічних функціональних груп та його просторове розташування.
Білки. У молекулах білків антигенна детермінанта утворюється сукупністю амінокислотних залишків. Розмір антигенної детермінанти білків може варіювати від 5-7 до 20 амінокислотних залишків. У випадку довгих антигенних детермінант, мабуть, тільки частина з них включається у власне антигенну структуру, а інші відповідальні за її конформацію.
Антигенні детермінанти білків бувають двох типів - секвенційні, тобто вдають із себе послідовність амінокислотних залишків у поліпептидному ланцюзі, і конформаційні, утворені амінокислотними залишками з різних частин білкового ланцюга, але зближені в просторовій конфігурації білкової глобули. Обидва типи антигенних детермінант-мають важливе значення для характеристики «іммунного.портрета» білків. У багатьох випадках одинична заміна амінокислоти в структурі антигенної детермінанти або зміна конформації білкової глобули є достатніми для зміни антигенної специфічності макромолекули.
Термін «специфічність антигену» використовується у двох значеннях: по-перше, як здатність вибірково реагувати зі специфічними антитілами, по-друге, оскільки білкові антигени полівалентних, як набір певних антигенних детермінант. Якщо два антигени мають тільки частина однакових антигенних детермінант, їх називають перехресно реагують антигенами. Прикладами таких антигенів є гомогенні білки близькоспоріднених видів тварин.
Деякі антигенні детермінанти у білків з четвертинної структурою можуть бути утворені фрагментами поліпептидних ланцюгів різних субодиниць, як, наприклад, в імуноглобуліну та гемоглобіні. Як вже зазначалося вище, антигенна детермінанта білків утворена групою амінокислотних залишків, серед яких можна виявити іммунодомінантную групу. Прикладом такої групи є С-кінцевий аргінін декапептид білка вірусу тютюнової мозаїки.
Найбільш характерно ефект іммунодомінантной групи виявляється при модифікації окремих амінокислотних залишків хімічними сполуками, наприклад дінітрофенільной групою. Антитіла, які утворюються в такий модифікованої антигенної детермінанті, здатні реагувати не тільки з нею, але і з іншими амінокислотними залишками, до яких буде «пришита» дінітрофенільная група. Більш того, якщо в розчин, що містить модифікований білок і антитіла, додати вільний динітрофенол, то він буде інгібувати утворення комплексу антиген - антитіло. Це явище, яке вперше було описано і детально вивчено К-Ландштейнером, послужило основою для отримання антитіл проти різних гаптенов.
Істотний внесок у розуміння структури антигенних детермінант внесли роботи з вивчення антигенності синтетичних пептидів. Класичним прикладом є роботи по синтезу пептидного петлі лізоциму, яка є самостійною антигенною детермінантою. Було показано, що ця петля, що містить внутрішню дисульфідні зв'язки, взаємодіє з антитілами, одержуваними як проти лізоциму, так і самої петлі, проте освіта комплексу не відбувається, якщо дисульфідний зв'язок відновлено. Це свідчить про те, що структура антигенної детермінанти та її специфічність залежать як від амінокислотної послідовності, так і від конформації даного фрагмента. Спільним для антигенних детермінант є те, що вони, як правило, знаходяться на поверхні білкової глобули та утворені жорсткими а-спіральними ділянками.
У роботах М. Села було показано, що гомополімери, що складаються з однакових амінокислот, не володіють антигенною структурою, в той час як гетерополімери містять антигенні детермінанти, причому чим складніше складу поліпептиду, тим більше різних антигенних детермінант він утворює. Важливими тут є два чинники: жорсткість конформації поліпептидного глобули та її амінокислотний склад.
Існує кілька шляхів дослідження структури антигенних детермінант. Один з них заснований на штучному синтезі фрагментів первинної структури, в яких проводяться заміщення окремих амінокислот. Інший шлях - вивчення впливу виборчої модифікації окремих амінокислотних залишків. Ще один спосіб - порівняння між собою гомологічних антигенів. Ефективним методом є також використання обмеженого протеолта і виявлення фрагментів, що містять антигенні детермінанти. Хоча жоден з цих шляхів не дає однозначних результатів, проте сукупність даних дозволяє побудувати «антигенний портрет» даного білка.
Виняткову важливість знання такого «портрета» для иммунохимического аналізу можна продемонструвати на прикладі вивчення антигенних детермінант раково-ембріонального антигену і антигенно споріднених йому білків. РЕА представляє гликопротеид з Мг = 180 000, який містить за масою близько 50% вуглеводів. Він має 9 різних епітопів, більшість з яких конформаційно залежні пептидні детермінанти. У сироватці крові міститься ще ціла група білків, перехресно реагують з РЕА, що ускладнює використання цього антигену для діагностичних цілей. В даний час за допомогою моноклональних антитіл виділено три антигенні детермінанти, які є абсолютно специфічними для РЕА.
Знання антигенної специфічності є виключно важливою умовою для створення діагностичних іммунохіміче-ських наборів, тому що дозволяє проводити визначення даної речовини в присутності близькоспоріднених сполук.
У ролі антигенів можуть виступати і самі імуноглобуліни. У цьому випадку організм виробляє антитіла, які часто називають вторинними. Наприклад, при імунізації кролика імуноглобулінами іншого виду тварини виробляються вторинні антитіла. У імуноферментному аналізі існує велика група методів, в яких використовують мічені ферментом вторинні антитіла.
Узагальнюючи дані про структуру антигенної детермінанта білків, можна виділити її таку характерну особливість: жорсткий ділянку поверхні білкової глобули, утворений одним або кількома фрагментами поліпептидного ланцюга, що містять іммунодомінантную групу.
Нуклеїнові кислоти. Структура антигенних детермінант нуклеїнових кислот залишається до цих пір малозрозумілою. Це обумовлено тим, що самі по собі нуклеїнові кислоти практично не імуногенні, але в комплексі з білками до них можуть бути напів-влено антитіла. Як і у випадку білків, важливу роль грає жорсткість структури полінуклеотидів. До складу антигенної детермінанти входять три-і тетрануклеотидом. Вони можуть бути утворені як двоспіральні, так і односпіральнимі ділянками. Розуміння структури антигенних детермінант має важливе значення не тільки в плані імунохімічної діагностики різних патологічних процесів, а й у зв'язку з активним розвитком гібридизації ДНК, в яких антитіла виступають в ролі детектуючих систем.
Полісахариди. Полісахариди - вельми складна за своїм складом і структурою група антигенів, що входить в структуру стінок мікроорганізмів і багатьох інших клітин і визначає їх специфічність. Полісахариди входять до складу багатьох білків і також грають роль антигенних детермінант. У більшості випадків полісахаридні антигени представляють собою довгий ланцюг, до якої приєднані бічні короткі олігосахариди, що містять 4-б залишків Сахаров, фактично є антигенними детермінантами. В одних випадках олігосахаридних угруповання ідентичні і тоді весь полісахаридний комплекс являє собою чергуються антигенні детермінанти. В інших випадках бічні ланцюги можуть сильно відрізнятися між собою. Як правило, в антигенну детермінанту входять залишки Сахаров, розташовані на кінці бічних ланцюгів, що містять заряджену групу, яка є іммунодомінантной групою.
На специфічність олігосахаридних антигенних детермінант у структурі білків впливає найближче оточення по-ліпептідіой ланцюга білка-носія і тип зв'язку між цукрами.
У разі полісахаридних гомополімерів, таких, як декстран, антигенна детермінанта може складатися з фрагментів, що містять до восьми залишків.
Ліпіди, що входять до складу комплексів з багатьма полісахаридами, не володіють антигенної специфічністю, мабуть, через високу конформаційної рухливості. Таким чином, структура полісахаридних антигенних детермінант представляє собою олігосахаридних ланцюга довжиною 4-6 залишків, специфічність яких визначається хімічним складом, типом глікозидних зв'язків та залишками, що знаходяться в найближчому оточенні.
Гаптени. Гаптени - це речовини, які самі не викликають імунної відповіді, але, будучи кон'юговані з носіями, мають здатність стимулювати синтез проти них антитіла. Зазвичай прийнято вважати, що гаптени - це низькомолекулярні сполуки, проте це не зовсім вірно. Наприклад, нуклеїнові кислоти, поліпептиди D-амінокислот мають високу молекулярну масу, але антитіла проти ііх виникають тільки після кон'югування їх з білками. У цьому випадку гаптени в кон'югату з білком виступають в ролі іммунодомінантной групи і тому в подальшому можуть взаємодіяти з антитілами незалежно від білка носія.
Структура та антигенна специфічність гаптенов визначається цілою низкою чинників. Як гаптенов можуть виступати найрізноманітніші органічні речовини з Мг> 100. З практичної точки зору важливими є стероїдні і пептидні гормони, широке коло лікарських сполук, пестициди, різні продукти промислового органічного синтезу, що володіють алергенним дією.
Антигенна специфічність гаптенов сильно залежить від їх хімічної структури. Так, введення додаткових груп може сильно спотворити «антигенний портрет» того або іншого з'єднання. Наприклад, тироксин і трийодтиронін відрізняються тільки одним залишком I, чого цілком достатньо, щоб антитіла проти цих гормонів сильно різнилися перехресної реактивністю. Класичними прикладами стали дослідження з пара-, орто-і мета-амінобензойної кислотами, які практично не дають перехресних реакцій при порівнянних концентраціях.
Важливим моментом є стереоспеціфічность гаптенов; антитіла проти олігопептидів з D-амінокислот не реагують з олігопептиди з L-амінокислот.
На антигенну специфічність сильний вплив надають амінокислотний залишок білка носія, до якого пришитий гап-тен, а також молекулярні розміри гаптену. Так, в довгих олі-гопептідних гаптеном заміна амінокислотних залишків, які розташовані близько до білка-носія, чинить менший вплив, ніж у коротких. Навпаки, заміни у віддалених від носія амінокислотних залишках виявляються драматичними для антигенної структури незалежно від розмірів гаптену. Аналогічні з-акономерності для олігосахаридів.
Антигенна специфічність гаптенов залежить не тільки від їх хімічної структури, але і від способу пришивки до білка-носія, зокрема від того, яка функціональна група гаптену була використана для кон'югування. Часто, при отриманні кон'югатів для імунізації гаптени пришивають не безпосередньо до молекули білка-носія, а через просторову «ніжку», що містить зазвичай 4-6 вуглецевих атомів. У цьому випадку сама «ніжка» в комплексі з гаптеном виступає в якості складової антигенної детермінанти і утворюються антитіла можуть володіти меншою ефективністю зв'язування з нативним гаптеном, ніж з таким пов'язаним через «ніжку» гаптеном.
У деяких видах імуноферментного аналізу в якості одного з реагентів використовують гаптен, мічений ферментом. Якщо зв'язування в такому кон'югату аналогічно способу пришивки в кон'югату гаптену з білком-іосітелем для отримання антитіл, то говорять, що в аналізі використовують гомологічні антитіла. Якщо ж структура «ніжки» і спосіб пришивки гаптену в обох випадках різні, то говорять про гетерологічних антитіла. Застосування того чи іншого виду антитіл або кон'югатів в імуноферментному аналізі може дуже сильно позначатися на його чутливості та деяких інших характеристиках.
Дуже істотним чинником для специфічності є хімічна структура «нодаски», зокрема її довжина і найближче оточення гаптену. Всі ці моменти вкрай важливо враховувати при розробці методів иммунохимического аналізу гаптенов.
Сильний вплив різних чинників на антигенну структуру і специфічність гаптенов, мабуть, пояснюється їх обмеженими розмірами і особливостями структури активних центрів антитіл.
Знання антигенної структури та специфічності гаптенов має важливе значення для створення методів иммунохимического визначення різних фізіологічно активних сполук, так як багато хто з них зазнають різні біохімічні перетворення, в результаті чого утворюється група близькоспоріднених метаболітів.
3. Загальна структурна характеристика молекул імуноглобулінів
Антитіла в організмі виконують дві основні функції. Перша - це розпізнавання і специфічне зв'язування відповідних антигенів, друга - ефекторна, що полягає в індукції найважливіших фізіологічних процесів, спрямованих на знищення антигену: лізис чужорідних клітин через активацію системи комплементу, стимуляція спеціалізованих імунокомпетентних клітин, виділення фармакологічно активних речовин і т.д.
Розвиток імунохімії протягом останніх 25 років дозволило встановити будову антитіл, виявити стереохімічні основи їх функціонування. Особливу увагу було приділено вивченню структури активних центрів антитіл, що призвело до створення поліцентровой моделі зв'язування антигену. Дослідження динамічних структурних властивостей імуноглобулінів сприяло встановленню характеру зв'язку між антигензв'язуючих і ефекторними функціями.
Імуноглобуліни по своїй хімічній структурі відносяться до великого класу природних сполук - глікопротеїди, високомолекулярних сполук, що складається з послідовності L-амінокислот, з'єднаних між собою пептидними зв'язками.
Окремі амінокислоти відрізняються між собою бічними заступниками R. До складу білків, у тому числі імуноглобулінів, входять двадцять амінокислотних залишків.
Поліпептидна ланцюжок за рахунок утворення водневих зв'язків між карбонільним атомом кисню та атомом водню аміногруп окремих амінокислотних залишків здатна певним чином укладатися в просторі, утворюючи так звані а-спіральні ділянки і структуру. Така локальна упорядкована конформація окремих ділянок поліпептидного ланцюга отримала назву вторинної структури.
В цілому вся поліпептидний ланцюг утворює компактну тривимірну структуру - третинну структуру: В одному розчині молекула білка згортається так, щоб неполярні, або гідрофобні, бічні ланцюги амінокислотних залишків знаходилися у внутрішній, малодоступною для молекул води області, а полярні, або іонізовані, групи утворювали зовнішній контактує з водою шар. Таке розташування амінокислотних залишків поліпептидного ланцюга є термодинамічним найбільш вигідним станом, причому слід зазначити, що це згортання пептидного ланцюга є високоспецифічним і обумовлено первинної структурою молекули.
Крім розглянутих причин згортання білків, обумовлених так званими гідрофобними взаємодіями, певний внесок у 'стабілізацію тривимірної структури вносять дисперсійні сили Лондона, що виникають в результаті комплементарного розподілу електронних хмар окремих, поруч розташованих атомів. Енергія цього типу взаємодій сильно залежить від відстані між атомами і максимальна при так званому ван дер Ваальсових відстані контакту, що дорівнює сумі ван-дер-ваальсових радіусів взаємодіючих атомів.
Додатковий внесок у підтримання тривимірної структури молекул білків дають водневі і електростатичні зв'язки між бічними групами амінокислот, а також ковалентні зв'язки між окремими частинами поліпептидного ланцюжка, наприклад дисульфідні, або S-S-зв'язку, що виникають між двома залишками цистеїну.
Деякі молекули білків складаються з незв'язаних між собою ковалентно окремих субодиниць. Така просторова організація отримала назву четвертинної структури білків.
Незважаючи на величезну різноманітність антитіл та їх гетерогенність, всі вони володіють деякими загальними структурними елементами, що забезпечують виконання їх основних функцій.
За своїм антигенним, ефекторним властивостями і структурним особливостям імуноглобуліни поділяються на п'ять основних класів: IgM, IgG, IgA, IgD та IgE.
Таблиця 1 - Основні амінокислоти, що входять до складу білків
Загальною структурною одиницею всіх імуноглобулінів є комплекс із чотирьох поліпептидних ланцюгів - двох ідентичних між собою легких ланцюгів з молекулярною масою 23000 кожна і важкий з молекулярної масою по 53000.
Кожна з легких ланцюгів міцно з'єднана з кінцевими ділянками важких ланцюгів завдяки наявності межцепочечних ді-сульфідних зв'язків і безлічі слабких гідрофобних, електростатичних та інших міжатомних взаємодій. Аналогічні зв'язки існують і між вільними ділянками важких ланцюгів. У цілому структура такого комплексу нагадує латинську букву «V» або «Т» і характерна для імуноглобулінів класів IgG, IgD та IgE.
При дії протеолитического ферменту папаїну молекула IgG розпадається на три фрагменти, два з яких ідентичні і зберігають здатність зв'язувати антигени і третій, здатний до кристалізації. Саме Fc-фрагмент відповідальний за ефекторних функцію антитіл - зв'язування білка комплементу Clq, транспорт через мембрани, взаємодія з мембранними рецепторами і т.д.
Інший протеолітичний фермент пепсин "розриває пептидний зв'язок, розташовану ближче до СООН-кінця ланцюга, від S-S-зв'язку між Н-ланцюгами в Fc-фрагменті. У результаті утворюються так званий pFc-фрагмент, що є залишками важких ланцюгів, і з'єднані дисульфідними зв'язками два Fа-фрагмента, що позначаються як ¥ 2-фрагмент. Останній також зберігає здатність до зв'язування антигенів.
Антигензв'язуючих центр розташований у Н2-кінцевих частинах Н-та L-ланцюгів. Таким чином, кожна молекула IgG, а також Р2-фрагменти містять по два антигензв'язуючих центру, а Fab-фрагмент - один.
Необхідною умовою для використання антитіл в імуноферментному аналізі є збереження їх здатності специфічно взаємодіяти з відповідними антигенами.
Тому часто використовують не цілі молекули антитіл, а лише їх фрагменти F2 або Fab, повністю зберігають цю здатність. Такий підхід дозволяє в деяких випадках усунути неспецифічні реакції, зумовлені, зокрема, взаємодією Fc-фрагментів антитіл з поверхнями носіїв.
Молекули антитіл мають велике число S-S-зв'язків, які можна розділити на 3 категорії: межцепочечние зв'язку, утворені всередині структурної одиниці між Н-і L-ланцюгами і між Н-і Н-ланцюгами, внутріцепочечние S-S-зв'язку, що виникають у межах однієї і тієї ж легкої або важкої ланцюга, і зв'язки між Н-ланцюгами окремих четирехцепочечних комплексів, що обумовлюють утворення полімерних молекул - IgM та IgA.
Структура імуноглобулінів різних класів обумовлена кількістю та розміщенням S-S-зв'язків у молекулах, а також кількістю четирехцепочечних елементів. На рис. 2 наведено схематичне зображення молекул імуноглобулінів різних класів.
IgM присутній в сироватці у вигляді пентамера четирехцепочечних комплексів, з'єднаних S-S-зв'язками між Н-ланцюгами. Деяка кількість IgA сироватки також присутня у вигляді димерной і тетрамерной форми. Полімерні IgA і IgM містять Невелику поліпептидний ланцюг з Мг = 14 000-1500 0, яка, мабуть, стабілізує полімерну структуру. Крім того, в димерной IgA входить секреторний компонент-великий гликопротеид з Мг = 80 000.
Легкі ланцюги імуноглобулінів бувають тільки двох типів-К або х. і є загальними для всіх п'яти класів, у той час як важкі ланцюги мають структурними, імунологічними і хімічними особливостями, характерними для кожного класу імуноглобулінів.
Для позначення важких ланцюгів, які належать до класів IgG, IgM, IgA, IgD та IgE, використовують відповідні грецькі букви-у, ц, а, б і е. На підставі відмінностей в хімічному будову Н-ланцюгів в межах класу можна виділити підкласи імуноглобулінів: 4 - для IgG, 2 - для IgA і 2 - для IgM. У молекулі імуноглобуліну будь-якого класу легкі ланцюги відносяться тільки до одного типу.